專(zhuān)利名稱(chēng)：高效表達(dá)重組人胰島素原及其類(lèi)似物的新型c肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用重組技術(shù)制備胰島素原及其類(lèi)似物的新型C肽。
人體內(nèi)成熟的活性胰島素分子量是5808道爾頓，由A鏈和B鏈兩條氨基酸肽鏈組成。A鏈有21個(gè)氨基酸，B鏈有30個(gè)氨基酸。A-B鏈之間有兩個(gè)二硫鍵相連。胰島素最初是以一條單鏈分子的前體形式合成的，即胰島素原(Proinsulin)。胰島素原是由B-C-A三條肽鏈連接而成，C肽的C末端通過(guò)兩個(gè)堿性氨基酸殘基(Lys Arg)與胰島素A鏈的N末端相連，N末端通過(guò)另外兩個(gè)堿性氨基酸殘基(Arg Arg)與胰島素B鏈的C末端相連。在細(xì)胞高爾基體中，胰島素原被貯存在儲(chǔ)存顆粒內(nèi)，并在肽酶的催化下，切去C肽而形成活性胰島素?；钚砸葝u素與C肽以相等分子分泌進(jìn)入血液。由此可見(jiàn)，C肽的存在是胰島素實(shí)現(xiàn)其正確空間結(jié)構(gòu)并保證生物活性的必然條件。
以往認(rèn)為，C肽含有使胰島素二硫鍵正確配對(duì)的足夠結(jié)構(gòu)信息，沒(méi)有C肽將A鏈和B鏈連接在一起，活性胰島素就無(wú)法使其兩條鏈彎曲成適當(dāng)?shù)慕嵌纫孕纬啥蜴I的連接。近期在研究胰島素的結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，C肽在胰島素A、B鏈正確配對(duì)時(shí)，可能只起柔性連結(jié)肽作用，使得雙分子反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)。單獨(dú)的A或B鏈本身就具有一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在溶液中二者按一定的方式相互作用正確配對(duì)，從而導(dǎo)致重組胰島素的產(chǎn)率較高。用蛋白二硫鍵異構(gòu)酶處理二硫鍵錯(cuò)接的胰島素衍生物，可以重新生成胰島素，C肽對(duì)這一反應(yīng)無(wú)影響。與胰島素原相似，用簡(jiǎn)單的交聯(lián)劑連接A、B鏈的交聯(lián)胰島素，也可以把二硫鍵錯(cuò)接的產(chǎn)物以很高的產(chǎn)率生成二硫鍵正確連接的交聯(lián)胰島素。這些化學(xué)交聯(lián)劑與胰島素原中的C肽不同，它們的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單而種類(lèi)繁多，不同的化學(xué)交聯(lián)劑中是不可能含有胰島素結(jié)構(gòu)信息的。因此，形成正確連接二硫鍵的結(jié)構(gòu)信息只能存在于胰島素的A及B鏈中。既然A、B鏈包含了足夠的使二硫鍵正確配對(duì)的信息，然而基因工程重組胰島素原和天然人胰島素原的A及B鏈?zhǔn)墙?jīng)細(xì)胞一次性表達(dá)并連接在一起的肽鏈，A、B鏈之間必須串聯(lián)一個(gè)一定長(zhǎng)度的肽段把兩者的空間位置撐開(kāi)到適當(dāng)程度，才能形成由二硫鍵正確連接的胰島素。由此可見(jiàn)，C肽的存在、長(zhǎng)短將對(duì)A、B鏈的重組產(chǎn)生影響。以往文獻(xiàn)和相關(guān)專(zhuān)利提供了胰島素A、B、C鏈的串聯(lián)表達(dá)方式，即B-C-A，在每個(gè)肽鏈的連接區(qū)設(shè)計(jì)含胰蛋白酶敏感酶切位點(diǎn)，如Arg-Glu、Arg-Gly。
本發(fā)明還涉及下面一個(gè)問(wèn)題，即C肽的氨基酸序列對(duì)于A(yíng)鏈和B鏈的正確折疊具有怎樣的影響？天然人胰島素原的C肽由35個(gè)氨基酸組成，基本序列為NH-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-COO。本專(zhuān)利將N端第4-12位氨基酸(斜體部分)用組氨酸替換后，對(duì)A鏈和B鏈的正確折疊無(wú)明顯影響。新型C肽N端第1位氨基酸用于與B鏈的B(30)Thr和相連形成Arg-Arg-Glu的胰蛋白酶切位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)第12-35位氨基酸被替換或缺失縮短后，A鏈和B鏈無(wú)法則形成正確的折疊或折疊效率顯著降低。本發(fā)明利用這些特點(diǎn)，對(duì)天然人C肽的N端第4-12位氨基酸(Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val)進(jìn)行了氨基酸的替換改造。改造的目的在于提高A、B鏈間二硫鍵正確折疊和胰島素原的重組表達(dá)及純化效率。
本專(zhuān)利所發(fā)明的新型利于更便捷高效地獲得基因工程重組胰島素，涉及到不同給藥間隔的快速、中效和長(zhǎng)效胰島素制品的重組制備。其中包括了各種不同的人胰島素類(lèi)似物，如甘精胰島素、谷甘胰島素、賴(lài)脯胰島素、三精胰島素等。
選擇對(duì)天然人C肽的N末端4-12位氨基酸進(jìn)行4-8個(gè)組氨酸替換形成本發(fā)明的新型C肽，序列如下NH2-Glu-(0-4)X-(4-8)His-(0-4)Y-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-CooH。序列中X、Y為任意氨基酸，(4-8)His定義為4到8個(gè)連續(xù)的組氨酸序列，(0-4)X定義為0到4個(gè)連續(xù)的任意氨基酸序列，(0-4)Y定義為0到4個(gè)連續(xù)的任意氨基酸序列。替換組氨酸后的新型C肽由33個(gè)氨基酸組成。該新型C肽具有二個(gè)創(chuàng)新特點(diǎn)其一是不影響人胰島素原及其類(lèi)似物的空間結(jié)構(gòu)，與天然C肽具有相同的作用，保證了A鏈和B鏈的正確折疊；其二是利用4到8個(gè)連續(xù)的組氨酸序列，對(duì)原核細(xì)胞及真核細(xì)胞重組表達(dá)的人胰島素原及其類(lèi)似物等蛋白質(zhì)可用金屬離子鎳鏊和層析純化，在經(jīng)胰蛋白酶或/和羧肽酶B酶切后的新型C肽、未酶切及酶切不徹底帶C肽的片段，可利用金屬離子鎳鏊和層析去除，從而顯著提高相應(yīng)活性胰島素的純度和回收率。
對(duì)本專(zhuān)利上述方案都可以進(jìn)行多種多樣的改動(dòng)，最顯著的改動(dòng)是對(duì)天然人C肽的N末端4-12位氨基酸組氨酸以外的替換，以利用其它親和層析或非親和層析方法制備人胰島素及其類(lèi)似物。
以下的實(shí)例用于理解及如何實(shí)施本發(fā)明，這些實(shí)例僅僅在一個(gè)側(cè)面說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，決不對(duì)本發(fā)明所涉及的范圍進(jìn)行限制。
實(shí)例1.用于原核細(xì)胞表達(dá)的含新型C肽重組甘精胰島素原基因序列設(shè)計(jì)甘精胰島素結(jié)構(gòu)為20A-Gly21和30B-Arg31-Arg32，即將人胰島素A鏈的第21位Asn替換成Gly，B鏈第30位氨基酸后加入2個(gè)Arg而成。重組甘精胰島素原由A(21)鏈、B(32)鏈和新型C(33)肽共96個(gè)氨基酸組成。在B鏈和A鏈之間含5個(gè)組氨酸(Glu1-Val2-Pro3-His(4-8)-C肽)的新型C肽(由33個(gè)氨基酸組成)，并在B鏈前加入由10個(gè)氨基酸組成的疏水性引導(dǎo)肽。最終的表達(dá)產(chǎn)物為96個(gè)氨基酸組成的融合重組甘精胰島素原，線(xiàn)性序列為Fus(10)-B(32)-C(33)-A(21)。
重組甘精胰島素原各組成部分的氨基酸序列如下Seq1Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr ArgSeq2Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg ArgSeq3Glu Ala Glu His His His His His Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala GlySer Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgSeq4Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr CysGly其中，Seq1為引導(dǎo)肽的10個(gè)氨基酸序列。Seq2為B鏈的32個(gè)氨基酸序列。Seq3為新型C肽的33個(gè)氨基酸序列，是將人胰島素C肽的6-10位氨基酸Asp-Leu-Gln-Val-Gly由串聯(lián)的5個(gè)His替換而成。Seq4為A鏈的21個(gè)的氨基酸序列。
根據(jù)上述重組甘精胰島素原的Fus(10)-B(32)-C(33)-A(21)氨基酸序列，按大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，分別在其5’端引入限制性核酸內(nèi)切酶Nde I酶切識(shí)別位點(diǎn)“CTAATG”，3’端引入終止密碼子TAA和限制性核酸內(nèi)切酶BamH I酶切識(shí)別位點(diǎn)“GGATCC”。甘精胰島素原的cDNA序列如下Seq55’-CTA ATG GCT ACA ACC TCT ACA GCT ACC ACA CGT TTC GTT AACCAG CAC CTG TGC GGT TCT CAC CTG GTT GAA GCT CTG TAC CTGGTT TGC GGT GAA CGT GGT TTC TTC TAC ACC CCG AAA ACC CGT
CGT GAA GTT CCG CAC CAT CAC CAT CAC CAG GTT GAA CTG GGTGGT GGT CCG GGT GCT GGT TCT CTG CAG CCG CTG GCT CTG GAAGGT TCT CTG CAG AAA CGT GGT ATC GTT GAA CAG TGC TGC ACCTCT ATC TGC TCT CTG TAC CAG CTG GAA AAC TAC TGC GGT TAAGGA TCC-3’對(duì)上述設(shè)計(jì)的核苷酸序列進(jìn)行全基因人工合成并測(cè)序正確后用于進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建。
實(shí)例2.含新型C肽重組甘精胰島素原大腸桿菌表達(dá)工程菌的獲得一、重組甘精胰島素原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將全基因人工合成的重組甘精胰島素原cDNA片段插入測(cè)序質(zhì)粒pUC18中，命名為pUC18-ProINsa轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，進(jìn)行測(cè)序。劃線(xiàn)接種在LA(含100ug/ml氨芐青霉素的LB)瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行活化。挑取單克隆接種于含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中(即LA培養(yǎng)基)，37℃，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)。以20％甘油和LA培養(yǎng)基保存菌種。按照小劑量質(zhì)粒提取試劑盒提供的方法提取質(zhì)粒pUC18-ProINsa。因質(zhì)粒pUC18多克隆位點(diǎn)上游第185位有Nde I識(shí)別位點(diǎn)，為在瓊脂糖凝膠中更明顯地區(qū)分，先用BamHI和Sac I雙酶切pUC18-ProINsa，1％的低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收320bp左右的小片段，再用Nde I單切小片段并回收310bp左右的片段待連接用。
將質(zhì)粒pET-3c用Nde I和BamHI進(jìn)行雙酶切，1％的低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收大片段，與上述已經(jīng)回收的310bp左右的片段在T4連結(jié)酶的作用下4℃過(guò)夜連結(jié)。氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，平鋪LA瓊脂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日挑取8個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，從6個(gè)菌落中提取到質(zhì)粒。接著對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行了BamH I、Nde I、Xba I單酶切和BamH I/Nde I、BamH I/Xba I雙酶切的鑒定。結(jié)果顯示，經(jīng)BamH I、Nde I、Xba I單酶切后，2％瓊脂糖電泳可見(jiàn)所提質(zhì)粒單酶切后呈線(xiàn)性。經(jīng)BamH I/Nde I、BamH I/Xba I雙酶切后，1％瓊脂糖電泳可見(jiàn)質(zhì)粒被酶切開(kāi)，形成4300bp左右和310bp左右兩個(gè)線(xiàn)性片段。鑒定正確后的質(zhì)粒即為重組甘精胰島素原的重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET-ProINsa。
二、重組甘精胰島素原表達(dá)質(zhì)粒的篩選和鑒別將鑒定后的pET-ProINsa質(zhì)粒用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)PlysS，從中隨機(jī)選10個(gè)克隆進(jìn)行表達(dá)。即用單克隆用牙簽接種于含100ug/ml氨芐青霉素的LA培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過(guò)夜。按1∶10接種于LA培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，測(cè)培養(yǎng)基OD600值為0.6時(shí)，加入IPTG使終濃度為0.5mM繼續(xù)同樣條件誘導(dǎo)4小時(shí)，取樣進(jìn)行15％的SDS-PAGE電泳。其目的蛋重組甘精胰島素類(lèi)似物應(yīng)在10KD分子量處。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示每個(gè)克隆菌中均有目的蛋白表達(dá)，其中4個(gè)克隆菌表達(dá)最高，目的蛋白表達(dá)量達(dá)40％左右。保存菌株，命名為pET-ProINsa/BL21(DE3)PlysS。
保存的菌種進(jìn)行LA斜面活化后，再?gòu)幕钚孕泵嫔线M(jìn)行種子培養(yǎng)(37℃，180rpm，LA培養(yǎng)基)。按1∶10接種1000ml LA培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)基OD600值0.6左右時(shí)加入0.2mM IPTG誘導(dǎo)(37℃，250rpm)1，2，3，4小時(shí)，分別取樣，進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示3小時(shí)其表達(dá)量已達(dá)到最高。
以1g菌體與10ml破菌緩沖液(50mM Tris-Hcl pH 9.0、5mM EDTA、1％Triton-X100、2M尿素)的比例懸浮菌體，室溫震蕩混勻，經(jīng)超聲處理后離心收集上清和沉淀，沉淀用8M尿素溶解。上清和沉淀均進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示表達(dá)的目的蛋白95％以上在沉淀中，證明重組甘精胰島素原主要以包涵體形式表達(dá)。
實(shí)例3.大腸桿菌表達(dá)含新型C肽重組甘精胰島素原純化和活性重組甘精胰島素制備一、重組甘精胰島素原的發(fā)酵取-70℃保存菌種劃線(xiàn)接種于LA(1％Trypton，0.5％Yeast extract，1％NaCl，AMP100ug/ml)斜面，置37℃恒溫孵箱15hr進(jìn)行pET-ProINsa/BL21(DE3)PlysS的活化。挑取單克隆菌落接種到50ml LA中37℃，150rpm培養(yǎng)8-10hr，以1∶10接種1000mlLA中37℃，150rpm培養(yǎng)12-14hr，加入9L M9YT(M9YT 10L體系Na2HPO4·7H2O1758，KH2PO430g，NH4Cl 10g，NaCl 5g，Trypton 50g，Yeast extract 30g，MgSO4·7H2O10g)培養(yǎng)基中。調(diào)節(jié)發(fā)酵啟始參數(shù)為300rpm、37℃、pH7.0、DO100％、通氣量1vvm。50％氨水自動(dòng)維持pH7.0，通過(guò)提高轉(zhuǎn)速和提高氧氣維持DO≥30％。葡萄糖接近被消耗完時(shí)開(kāi)始流加營(yíng)養(yǎng)液，維持葡萄糖終濃度0.3％至OD600＝15，停止補(bǔ)料。DO曲線(xiàn)上升至約50-60％，加入終濃度0.3mM IPTG誘導(dǎo)，維持葡萄糖終濃度為0.3％至結(jié)束。誘導(dǎo)3小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束。4℃、7000rpm離心15min收集菌體，-20℃保存。
二、重組甘精胰島素原的復(fù)性和純化以1G菌體10ml破菌緩沖液(50mM Tris-Hcl PH 9.0、5mM EDTA、1％Triton-X100、2M尿素)懸浮菌體，待完全溶解，經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)30-40Mpa/2-3次破菌，12000rpm/15min離心收集沉淀。用25mM Tris-HCl pH 9.0、5mM EDTA、1M NaCl、2M尿素?cái)嚢柘礈彀w30min，12000rpm/15min離心收集沉淀。將沉淀用50mM Tris-Hcl pH 10.5、5mMEDTA、1/1000 β-Me、8M Urea溶解，攪拌洗滌30min，12000rpm/15min離心收集上清。以25mMTris-HCl pH 10.5、0.5g/L L-Cysteine hydrochloride復(fù)性液逐步稀釋復(fù)性(4℃中，100rpm攪拌下)，經(jīng)3KD超濾濃縮20倍。
10mM乙酸-乙酸鈉pH3.0平衡S.P.Seplarose FF層析柱，乙酸調(diào)樣品pH 3.0后上樣，10mM乙酸-乙酸鈉pH6.0洗脫雜峰，50mM Tris pH 10.0洗脫目的峰。S.P.SepharoseFF層析柱洗脫峰加入終濃度0.3M NaCl，調(diào)pH9.0，上樣25mM Tris pH 9.0和0.3M NaCl平衡后的Ni+層析柱(Ni-Chelating Sepharose)，25mM Tris pH 9.0/0.5M NaCl/50mM咪唑洗脫雜峰，25mM TrisPH 9.0/200mM咪唑洗脫重組甘精胰島素原。
三、重組甘精胰島素的制備重組甘精胰島素原蛋白用1M HCl調(diào)pH7.0沉淀，離心后用25mM Tris pH 9.0溶解，調(diào)成10mg/ml蛋白濃度。按1∶1000(質(zhì)量比)加入胰蛋白酶(TPCK處理，Sigma產(chǎn)品)，25℃水浴，50rpm共1小時(shí)，1M HCl調(diào)pH 3.0終止反應(yīng)。酶切后樣品加入緩沖液A(5％乙氰/0.1％TFA)平衡的C18反向?qū)游鲋?5％緩沖液B(70％乙氰/0.2％TFA)洗脫雜質(zhì)峰，35％-45％緩沖液B梯度洗脫重組甘精胰島素。抽濾除去乙氰后調(diào)成含50mM Tris pH 9.0的溶液，上樣相同緩沖體系平衡的Ni+層析柱。收集Ni+層析柱穿透峰，1M HCl調(diào)pH7.0，10000rpm離心30分鐘收集沉淀。用pH4.0，10mM乙酸-乙酸鈉緩沖溶解沉淀，即得精制得重組甘精胰島素。
四、重組甘精胰島素高效液相(HPLC)分析方法采用C18高效液相色譜柱(4.6mm×250mm)，流動(dòng)相A磷酸鹽緩沖液(pH2.5)∶乙腈∶水∶氯化鈉＝250ml∶250ml∶400ml∶18.4g，加水至1000ml，0.45um濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B磷酸鹽緩沖液(pH2.5)∶乙腈∶水∶氯化鈉＝250ml∶650ml∶50ml∶3.2g，加水至1000ml，0.45um濾膜過(guò)濾。流速1.0ml/min。洗脫梯度4％B 0-20min，17％B 20-30min，37％B 30-40min，4％B 40min。柱溫35℃。檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。
結(jié)果經(jīng)純化所得重組甘精胰島素純度大于99％。
實(shí)例4.大腸桿菌表達(dá)重組甘精胰島素的延緩降糖作用一、材料和方法試驗(yàn)動(dòng)物雄性家兔18只，2.0-3.0kg/只。
受試藥物重組甘精胰島素，3.64mg/ml/支。加入溶劑使成10ml，每支含30mcg鋅離子、2.7mg甲酚、20mg 85％甘油，鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.0左右。用生理鹽水將胰島素配制成1.2IU/ml，4-8℃保存不超過(guò)5天。
對(duì)照藥物重組甘精胰島素(商品名為L(zhǎng)antus，Aventis公司)，規(guī)格為100IU/3.6378mg/10ml/支。每支含30mcg鋅離子、2.7mg甲酚、20mg 85％甘油，鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4.0左右。用生理鹽水將胰島素配制成1.2U/ml，用前配制。
國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)胰島素，264IU/10.0mg//支，用受試藥物和對(duì)照藥物的配方配制成1.2IU/ml。用生理鹽水將胰島素配制成0.06-0.12U/ml。用前配制。
方法將家兔分為受試藥物組、對(duì)照藥物組和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品組共3組，每組6只。給藥前分別自右側(cè)耳緣靜脈取血1.0ml，檢測(cè)血糖濃度。2小時(shí)之后家兔單次左側(cè)耳緣靜脈注射配制好的受試藥物、對(duì)照藥物和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品各1.0ml。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品組在給藥后2小時(shí)和6小時(shí)，受試藥物組在給藥后6小時(shí)和9小時(shí)，再分別自右側(cè)耳緣靜脈取血1.0ml，檢測(cè)血糖濃度。
二、結(jié)果所有家兔未發(fā)生痙攣和死亡。各試驗(yàn)組用藥后降低血糖濃度降低的比例見(jiàn)下表各試驗(yàn)組用藥后2小時(shí)降低血糖濃度的比例(％)
證明本專(zhuān)利方法制備的重組甘精胰島素與國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品的降血糖生物作用一致，其生物比活性經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品胰島素測(cè)定為30IU/mg。


圖1中的“Ni+層析(Ni-Chelating Sepharose)純化甘精胰島素原前后的非還原SDS-PAGE凝膠電泳圖”圖2中的“純化后所得重組甘精胰島素經(jīng)反相高效液相(HPLC)分析結(jié)果”以及“分析結(jié)果表分析結(jié)果表峰號(hào)峰名保留時(shí)間峰高 峰面積 含量1 9.490 520694.250 11458496.00099.60482 11.892 1201.533 38462.777 0.33433 12.620 349.015 6998.6000.0608總計(jì)522244.799 11503957.377100.0000經(jīng)Ni+鏊合層析后，C18反向HPLC分析重組甘精胰島素純度大于99％?！?
電子可讀序列-glargine專(zhuān)利高效表達(dá)重組人胰島素原及其類(lèi)似物的新型C肽序列表Organization Applicant----------------------Street重慶市石橋鋪科園四街70號(hào)City重慶市State重慶市Country中華人民共和國(guó)PostalCode400041PhoneNumber023-68888852FaxNumber023-68699676EmailAddressfankai1963@yahoo.com.cn<110>OrganizationName重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司Application Project-------------------<120>Title高效表達(dá)重組人胰島素原及其類(lèi)似物的新型C肽<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate<160>4<170>PatentIn version 3.2SequenceSeq1--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringMet Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg 10<212>TypePRT<211>Length10SequenceName重組人胰島素原引導(dǎo)肽氨基酸序列Feature-------<221>FeatureKeymat_peptide<222>LocationFrom1<222>LocationTo10Other Information重組人胰島素原引導(dǎo)肽氨基酸序列CDS JoinYesSequenceSeq2--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringPhe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 30Arg Arg 32<212>TypePRT<211>Length32SequenceName重組甘精胰島素B鏈氨基酸序列Feature-------<221>FeatureKeymat_peptide<222>LocationFrom1<222>LocationTo32Other Information重組甘精胰島素B鏈氨基酸序列CDS JoinNoSequenceSeq3--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringGlu Val Pro His His His His His Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly 15Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 30Gln Lys Arg 33<212>TypePRT<211>Length33
電子可讀序列-glargine專(zhuān)利SequenceName重組甘精胰島素原新型C肽氨基酸序列Feature-------<221>FeatureKeymat_peptide<222>LocationFrom1<222>LocationTo33Other Information重組甘精胰島素原新型C肽氨基酸序列CDS JoinNoSequenceSeq4--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 15Leu Glu Asn Tyr Cys G1y 21<212>TypePRT<211>Length21SequenceName重組甘精胰島素A鏈氨基酸序列Feature-------<221>FeatureKeymat_peptide<222>LocationFrom1<222>LocationTo21Other Information重組甘精胰島素A鏈氨基酸序列CDS JoinNoSequenceSeq5--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringCTAATGGCTA CAACCTCTAC AGCTACCACA CGTTTCGTTA ACCAGCACCT GTGCGGTTCT60CACCTGGTTG AAGCTCTGTA CCTGGTTTGC GGTGAACGTG GTTTCTTCTA CACCCCGAAA120ACCCGTCGTG AAGTTCCGCA CCATCACCAT CACCAGGTTG AACTGGGTGG TGGTCCGGGT180GCTGGTTCTC TGCAGCCGCT GGCTCTGGAA GGTTCTCTGC AGAAACGTGG TATCGTTGAA240CAGTGCTGCA CCTCTATCTG CTCTCTGTAC CAGCTGGAAA ACTACTGCGG TTAAGGATCC300<212>TypeDNA<211>Length300SequenceName用于原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的重組甘精胰島素原cDNA序列Feature-------<221>FeatureKeycDNA<222>LocationFrom1<222>LocationTo300Other Information用于原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的重組甘精胰島素原cDNA序列CDS JoinNo
權(quán)利要求
1.本專(zhuān)利涉及一種用重組制備胰島素原及其類(lèi)似物的新型C形肽。
2.條款1中所述新型C肽的特征為人胰島素原C肽的N末端4-12位氨基酸經(jīng)4-8個(gè)組氨酸替換而成。其序列表現(xiàn)形式為Glu-His(4-8)-C肽。
3.條款2中所述新型C肽的第1位氨基酸為Glu。第2-10位氨基酸用4-8個(gè)His串聯(lián)替換人胰島素原相對(duì)應(yīng)的氨基酸，同時(shí)包括任意替換相對(duì)應(yīng)的氨基酸，未替換的氨基酸同人胰島素C肽的氨基酸序列。
4.條款2中所述新型C肽替換組氨酸后由33個(gè)氨基酸組成。
5.條款1中所述新型C肽適用于重組人胰島素原的高效表達(dá)。
6.條款1中所述新型C肽適用于重組人胰島素原類(lèi)似物的高效表達(dá)。
7.條款6中的重組人胰島素原類(lèi)似物包括甘精胰島素、三精胰島素、谷甘胰島素、賴(lài)脯胰島素、精蛋白鋅胰島素等。
8.含新型C肽重組表達(dá)的人胰島素原及其類(lèi)似物用金屬離子鏊和層析純化。
9.經(jīng)胰蛋白酶或/和羧肽酶B酶切后的新型C肽用金屬離子鏊和層析去除。
10.本專(zhuān)利所述新型C肽適用于原核及真核表達(dá)體系表達(dá)重組人胰島素原及其類(lèi)似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于重組制備胰島素原及其類(lèi)似物的新型C肽。應(yīng)用本發(fā)明提供的新型C肽構(gòu)建重組表達(dá)胰島素原，具有高表達(dá)量、易純化和高回收率等優(yōu)點(diǎn)，適用于重組胰島素及其類(lèi)似物的制備。
文檔編號(hào)C07K14/62GK1663960SQ200410007170
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者范開(kāi), 黃洪濤, 張益 , 范可夫, 石延賓 申請(qǐng)人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司