專利名稱：含有胡麻苷的黃酮類提取物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來自中藥原料藥的黃酮類提取物，尤其涉及來自甘青青蘭原料藥的含有胡麻苷的黃酮類提取物；本發(fā)明還涉及這類提取物在治療腦缺血和腦缺氧疾病中的應用以及含有該提取物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
藏藥甘青青蘭為唇形科植物甘青青蘭(唐古特青蘭)Dracocephalumtanguticum Maxim的干燥地上部分，藏名譯音為知羊高、知羊故。分布甘肅西南部、青海東部、四川西部和西藏東南部等地區(qū)，生于海拔1900-4600m的高山灌叢林地、松林邊緣、礫石草坡、干燥河谷兩岸。本品具有清熱祛濕，疏風解表，舒肝和胃，清肝熱、胃熱，止血，愈瘡，干黃水的功能，用于頭暈，肝炎、胃炎、肝熱病、胃熱病，黃水病，便血，關(guān)節(jié)炎，癰瘡等疾病的治療。有關(guān)甘青青蘭的化學成分，研究報道的很少。
在含有黃酮類化合物的文獻中，有關(guān)甘青青蘭的報道為其主要含揮發(fā)油成分、黃酮類化合物和微量元素等。據(jù)1993年版《中藥大辭典》中報道，甘青青蘭中含的有效成分包括黃酮、揮發(fā)油、氨基酸和甾體化合物等。張曉峰等從唐古特青蘭分離到5個黃酮類化合物，經(jīng)化學和光譜分析鑒定為茵芋甙，大波斯菊甙，胡麻素，胡麻甙，胡麻甙-6″-乙酸酯，但未能明確測定其黃酮類提取物中胡麻苷的含量及其生物活性；其他的藥理功效尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在對甘青青蘭中的黃酮類提取物進行研究中發(fā)現(xiàn)，所得到的含有胡麻苷的黃酮類提取物對腦缺血和腦缺氧有治療效力，因而完成了本發(fā)明的內(nèi)容。
本發(fā)明提供的中藥黃酮類提取物，尤其是中藥甘青青蘭中提取的含有胡麻苷的黃酮類提取物，與現(xiàn)有的藥物相比無毒副作用。
本發(fā)明提供了一種來自中藥中藏藥原料藥甘青青蘭的黃酮類提取物，其中至少含有胡麻苷成分，該提取物中胡麻苷的含量以重量百分數(shù)計至少不低于5％，優(yōu)選10％，但不超過95％，該提取物可用于腦缺血和腦缺氧的治療。
本發(fā)明尤其提供了來自藏藥甘青青蘭的上述黃酮類提取物，進而提出了甘青青蘭有效成分的新的醫(yī)藥用途。
本發(fā)明還提供了來自甘青青蘭原料藥的上述提取物的提取方法，應用大孔吸附樹脂和堿提酸沉的提取方法，可以得到有效成分尤其是胡麻苷含量較高的提取物。
在對上述黃酮類提取物的研究中，本發(fā)明還提供了以該提取物為有效成分的藥物組合物，其可用于腦缺血和腦缺氧的治療。
根據(jù)本發(fā)明提供的黃酮類提取物，其中至少含有胡麻苷，每克含有總黃酮成分的提取物中的胡麻苷以不少于50毫克。尤其是，每克提取物中含有胡麻苷不少于100毫克。
本發(fā)明提取物可以來自任何含有所述胡麻苷成分的原料藥，優(yōu)選來自藏藥甘青青蘭原料藥中的黃酮類有效成分。
通過對成分及藥物效果的試驗摸索，本發(fā)明尤其提供了應用經(jīng)過篩選的大孔吸附樹脂和堿提酸沉的提取方法得到的甘青青蘭提取物，具有比較高的黃酮類有效成分(即胡麻苷)含量，并且保持了天然原料的成分。
通過藥效學研究，證明本發(fā)明的上述提取物(或稱黃酮類有效部位)可用于腦缺血和腦缺氧的治療。所以本發(fā)明還提供了用于治療腦缺血和腦缺氧的藥物組合物，其包括了治療有效量的上述中藥黃酮類提取物及藥劑學中可接受的藥物輔料。
本發(fā)明所稱“黃酮類”是指以黃酮為母核的具有不同取代基的化合物。
根據(jù)前面所述，本發(fā)明的提取物來自中藥甘青青蘭，除含有胡麻苷外，還可以包括任何黃酮類有效部位，例如其有效成分還包括但不限于茵芋甙，大波斯菊甙，胡麻素，胡麻甙-6″-乙酸酯等中的一種或數(shù)種。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，該提取物來自甘青青蘭原料藥中黃酮類有效成分。
本發(fā)明的提取物可以是通過任何可行的方法得到，優(yōu)選地可以是采用大孔吸附樹脂、聚酰胺吸附和堿提酸沉(例如調(diào)PH值)精制得到，使產(chǎn)物具有比較高的純度和收率。
本發(fā)明可采用原料生藥，也可采用飲片。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法，采用甘青青蘭飲片或未加工的甘青青蘭生藥為原料，如果是未加工的甘青青蘭生藥，可進行清洗、晾曬和切片等加工作為前期處理，提取方法如下甘青青蘭藥材粉碎，有機溶媒(例如乙醇)提取，回收溶劑，濃縮沉淀，上大孔吸附樹脂，用有機溶媒(例如醇，優(yōu)選乙醇、甲醇)梯度洗脫，收集10％～100％濃度洗脫下來的成分，優(yōu)選20％～90％濃度洗脫下來的成分，更優(yōu)選30％～70％濃度洗脫下來的成分，上聚酰胺柱，以醇-水梯度洗脫，得到的組分接著上Toyopearl HW-40(4*40cm)、Sephadex LH-20(3*40cm)、MCI gel(3*40cm)柱，以醇-水為洗脫溶劑，分離得到化合物胡麻苷。
結(jié)構(gòu)鑒定胡麻苷(Pedaliin)淡黃色粉末(MeOH)，mp251～253℃。UV(λmaxMeOH)274，347nm。ESI/MS(m/z)1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm13.10(1H，s，5-OH)，10.04(1H，s，4`-OH)，9.40(1H，s，3`-OH)，7.47(1H，d，J＝8.5Hz，6`-H)，7.46(1H，s，2`-H)，6.91(1H，d，J＝8.5Hz，5`-H)，6.89(1H，s，8-H)，6.88(1H，s，3-H)，5.06(1H，d，J＝6.9Hz)，4.31(1H，brs)，3.92(3H，s，-OCH3)，3.60(1H，d，J＝11.0Hz)，4.20～3.00(suger)。
13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)δppm182.11(C-4)，164.19(C-2)，158.51(C-7)，152.57(C-9)，151.70(C-5)，149.78(C-4`)，145.76(C-3`)，128.13(C-6)，121.47(C-1`)，119.03(C-6`)，115.94(C-5`)，113.52(C-2`)，104.88(C-10)，102.70(C-3)，102.01(C-1``)，91.52(C-8)，77.26(C-5``)，76.55(C-3``)，74.14(C-2``)，69.93(C-4``)，60.89(C-6``)，56.53(-OCH3)。與文獻對照基本一致，故確定該化合物為胡麻苷，見附圖1-4。
除以上所述，實施本發(fā)明方法的過程中所涉及的其它操作，例如提取液的揮發(fā)，可以采用加溫揮發(fā)，也可以直接常溫自然揮發(fā)或其它可行的方法，分取和揮干過程的具體操作屬于本領(lǐng)域的基本技能，而涉及到的中藥飲片加工、粉碎、過篩和萃取等，均可采用本領(lǐng)域常規(guī)操作或其它可行的操作，本發(fā)明沒有特別限定。得到的提取物可以通過任何常規(guī)的檢測分析方法得知其是否符合要求，如薄層色譜法、紫外分光光度法以及其他如《中國藥典》2000年版一部附錄所收載的分析方法，以上屬于本領(lǐng)域常規(guī)操作，本發(fā)明亦沒有特別限定。
從甘青青蘭藥材中分離精制的總黃酮及其主要成分胡麻苷，藥效學試驗表明其具有抗缺氧保護神經(jīng)細胞的作用，因此作為甘青青蘭的有效部位和有效成分之一。本文建立的HPLC法用來測定甘青青蘭藥材和有效部位中胡麻苷的含量，分離效果好，方法快速準確，重現(xiàn)性好。
1.儀器與試藥儀器Waters2695高效液相色譜儀，Waters2695聯(lián)盟系統(tǒng)，Waters2696二極管矩陣檢測器，Mellennium32色譜工作站；(美國Waters公司)，KQ-250超聲波清洗器。
試劑甲醇為色譜純，磷酸等為分析純。
對照品胡麻苷為自行提取精制，并經(jīng)UV、IR、1H-NMR、13C-NMR鑒定結(jié)構(gòu)，高效液相法測定純度大于98％。
藥材藥材為購于青海省西寧市，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學李家實教授鑒定為為唇形科植物甘青青蘭Dracocephalum tanguticum Maxim的干燥地上部分。
2.方法與結(jié)果2.1色譜條件 色譜柱Symmetry Shield Rp18(4.6×250mm，5μm)，流動相甲醇-0.025mol/L磷酸(45∶55)；柱溫30℃；流速0.7mL/min；檢測波長347nm。在以上色譜條件下，樣品液相色譜圖中，胡麻苷與其它組分的色譜峰分離度良好。見附圖5～15。
柱效與分離度計算n＝5.54×(tR/Wh/2)/2＝8105R＝2*(tR2-tR1)/(W1+W2)＝7.52.2供試品溶液的制備 選用50％甲醇做溶劑，采取超聲波提取做為樣品制備的方法，試驗中主要考察了最佳超聲提取時間，試驗結(jié)果表明提取時間為40min時，提取比較完全。因此，確定提取時間為40min。
表1 超聲提取時間考察時間(min)峰面積20 7764530 287833040 307588950 3040321取本品粉末(通過60目)約0.5g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，加50％甲醇25ml，稱重，超聲提取40min，取出，放冷，再稱定重量用50％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.3對照品溶液的制備 精密稱取胡麻苷對照品適量，加50％甲醇制成每1mL含0.198mg的溶液，作為對照品溶液。
2.4線性范圍試驗 精密量取胡麻苷對照品溶液1.0，3.0，5.0，7.0，10.0μl注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定色譜峰面積，以對照品的進樣量X(μg)對峰面積的積分值Y進行線性回歸，結(jié)果表明，胡麻苷進樣量在0.198～1.98μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y＝4391035X-379568相關(guān)系數(shù)r＝0.9998表2 線性范圍考察結(jié)果對照品(μg) 0.198 0.594 0.9901.386 1.980色譜峰面積 5485952198567 3869423 5764074 83265482.5穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試液，按0、2、4、6、8h時間間隔，分別測定峰面積，試驗結(jié)果表明，供試品溶液制備后8h內(nèi)測定，色譜峰面積無明顯變化，RSD小于2％，表明在此時間內(nèi)供試品化學性質(zhì)穩(wěn)定。
表3 穩(wěn)定性試驗測定結(jié)果時間(小時)02 4 68 X RSD(％)色譜峰面積3060963 298873230543213110320 303045730489591.462.6精密度試驗 取胡麻苷對照品溶液，同法連續(xù)測定5次，測定對照品對應的色譜峰峰面積，計算其RSD為0.24％。
表4 精密度試驗測定結(jié)果次 數(shù)1 2 3 4 5 XRSD(％)色譜峰面積386942338447323851721383844938743313855731 0.402.7重復性試驗 取5份有效部位樣品，平行操作，測定胡麻苷的含量，計算其RSD為4.60％。
表5 重復性試驗測定結(jié)果序號 1 2 3 4 5 X RSD(％)胡麻苷(％) 0.440.420.410.390.430.418 4.602.8加樣回收率試驗 取本品已知準確含量(0.44％)的樣品(產(chǎn)地青海)粗粉0.25g，精密稱定，置50mL量瓶中。精密加入胡麻苷對照品溶液(10mL)，按樣品含量測定項下方法操作，計算其回收率，平均值為98.0％，RSD為2.27％。
表6 回收率試驗測定結(jié)果樣品稱 樣品含量對照品加峰面積實測總量 回收率 均值(％) RSD量(g) (mg)入量(mg) (mg) (％) (％)0.2581 1.136 1.188 7900322.32299.800.2532 1.114 1.188 7741232.27597.700.2568 1.130 1.188 7688332.25995.10 98.0 2.270.2601 1.144 1.188 7812542.29696.900.2522 1.120 1.188 7843552.305100.602.9樣品測定 取本品粉末(通過60目)約0.5g，有效部位取0.1g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，藥材加入50％甲醇25mL，有效部位加50ml，超聲提取40min，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與有效部位供試品溶液5μl，藥材10μl注入液相色譜儀測定，計算即得，結(jié)果見表7。
表7 甘青青蘭藥材及其部位中胡麻苷含量測定結(jié)果(50％甲醇溶劑提取，n＝3)編號樣品名稱及其批號 胡麻苷(％)1 藥材200109010.442 藥材200110010.423 藥材200110150.424 藥材200102010.425 藥材200102020.496 有效部位2002110111.267 有效部位2003040110.078 有效部位2003050113.413.討論3.1 胡麻苷為甘青青蘭中主要的黃酮苷類成分且其具有抗缺氧保護神經(jīng)細胞作用，因此以胡麻苷為指標對甘青青蘭藥材的質(zhì)量進行評價具有重要的意義。同時不同批次甘青青蘭藥材中黃酮苷類成分含量較接近，本品按干燥品計算，含胡麻苷(C22H22O12)不得少于0.40％。
3.2 以胡麻苷為指標考察了有效部位總黃酮的質(zhì)量，通過考察三批中試樣品，結(jié)果表明，有效部位的總黃酮的變化差異較大，因此以胡麻苷為指標控制有效部位的質(zhì)量，本品按干燥品計算，含胡麻苷(C22H22O12)不得少于11.24％。
總之，本發(fā)明人在對甘青青蘭的研究中意外地發(fā)現(xiàn)，上述黃酮類有效部位對腦缺血和腦缺氧的治療有效，進一步藥效試驗證實了甘青青蘭黃酮類有效部位在治療腦缺血和腦缺氧疾病中的用途，尤其可用于治療腦缺血。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了該黃酮類提取物在制備治療腦缺血疾病的藥物中的用途。
在上述研究基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了可用于治療腦缺血和腦缺氧的藥物組合物，包括治療有效量的中藥黃酮類提取物及藥劑學中可接受的藥物輔劑，其中黃酮類提取物以胡麻苷計在組合物中重量比至少不低于5％，優(yōu)選不低于10％，更優(yōu)選15％以上，不超過95％。
上述藥物組合物包括藥學可接受的任何劑型，如注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑和口服液等，上述藥物輔劑也包括藥學可接受的任何輔料，以及各劑型的制備工藝均為本領(lǐng)域常規(guī)操作，在此不加贅述。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，該黃酮類有效部位還可與其它中藥成分復配達到更好的治療效果，所述中藥成分可以是例如葛根、人參、銀杏、三七、燈盞花、丹參等原料藥中的有效成分，其可來自任何提取方法。


圖1 胡麻苷化學結(jié)構(gòu)式(Pedaliin)圖2 胡麻苷UV圖譜(Pedaliin-UV spectra)圖3 胡麻苷1H-NMR圖譜(Pedaliin--1H-NMR spectra)圖4 胡麻苷13C-NMR圖譜(Pedaliin--13C-NMR spectra)圖5 甘青青蘭藥材(批號20010901)HPLC色譜6 甘青青蘭藥材(批號20011001)HPLC色譜7 甘青青蘭藥材(批號20011015)HPLC色譜8 甘青青蘭有效部位(批號20021101)HPLC色譜9 甘青青蘭有效部位(批號20030401)HPLC色譜10 甘青青蘭有效部位(批號20030501)HPLC色譜11 胡麻苷對照品HPLC色譜12 甘青青蘭藥材HPLC指紋圖譜(批號20010901)圖13 甘青青蘭藥材HPLC指紋圖譜(批號20011001)圖14 甘青青蘭藥材HPLC指紋圖譜(批號20011015)圖15 甘青青蘭藥材(三批)HPLC疊加指紋圖譜圖16 甘青青蘭有效部位HPLC指紋圖譜(批號20021101)圖17 甘青青蘭有效部位HPLC指紋圖譜(批號20030401)圖18 甘青青蘭有效部位HPLC指紋圖譜(批號20030501)圖19 甘青青蘭有效部位(三批)HPLC疊加指紋圖譜。
具體實施例方式
關(guān)于本發(fā)明的具體實施和治療效果，將結(jié)合優(yōu)選實施例及附圖進行詳細闡述，需要說明的是本發(fā)明所采用的術(shù)語“黃酮類提取物”、“黃酮類有效部位”及“總有效部位”的含義是相同的。
甘青青蘭黃酮類有效成分胡麻苷的提取(一)藥材2.5kg粉碎成粗粉，加70％乙醇提取三次(8倍量、2小時；6倍量、1小時；6倍量、1小時)合并提取液，回收乙醇至無醇味(4000ml)，沉淀析出，濾過，得A部分173g。
取提取液(4000ml)中2200ml上大孔吸附樹脂Dianion HP-20柱(5*55cm)吸附充分，以H2O(B部分)、10％EtOH(C部分)、30％EtOH(D部分)、50％EtOH(E部分)、90％EtOH(F部分)分別進行洗脫，得B部分89.123g、C部分17.052g、D部分28.617g、E部分16.126g、F部分8.014gD部分(25g)拌樣上聚酰胺柱(5*50cm)，以乙醇-水梯度洗脫，得到D1-D5不同的部位，每個部位反復上Toyopearl HW-40(4*40cm)、Sephadex LH-20(3*40cm)、MCI gel(3*40cm)柱，以甲醇-水，乙醇-水為洗脫溶劑，分離得到化合物DT-D-1、DT-D-4、DT-D-5、DT-D-6，其中DT-D-1即為胡麻苷。
甘青青蘭黃酮類有效部位的提取(二)
1.大孔吸附樹脂的處理1.1 預處理取AB-8型大孔吸附樹脂，用丙酮加熱回流洗脫，洗脫至洗脫液蒸干后無殘留物。
1.2 裝柱以乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇沖柱，不時檢查流出液，至與水混合不呈白色混濁為止(乙醇液∶水＝1∶5)。然后以大量的蒸餾水洗去乙醇，備用。
1.3 再生樹脂使用一次后，一般用95％的乙醇洗脫至無色時，樹脂柱即已再生，然后以大量水洗去乙醇，即可進行下一次的分離。經(jīng)反復使用后，吸附樹脂顏色變深，吸附效果下降時，可用0.1％～0.5％NaOH和HCl進行酸堿交替處理或浸泡適當?shù)臅r間，至樹脂接近原顏色為宜，繼續(xù)用水洗至中性即可再用。
2.藥材的提取取藥材甘青青蘭，粉碎成粗粉，用50％乙醇回流提取3次(8倍量，2小時；6倍量，1小時；6倍量，1小時)，濾過，合并濾液，低溫減壓回收乙醇至無醇味，以水調(diào)節(jié)至每毫升藥液相當于1.59g生藥。
2.1 洗脫溶媒的定性選擇取提取液加到已處理好的AB-8型大孔吸附樹脂柱(3*15cm)上，依次用蒸餾水、10％、30％、50％、70％、90％乙醇梯度洗脫，分段收集，減壓回收乙醇加以濃縮，聚酰胺薄層色譜及其HPLC色譜定性檢查胡麻苷和黃酮類成分。結(jié)果顯示10％、70％、90％中含有黃酮較少，同時結(jié)合藥效學實驗結(jié)果，30％、50％乙醇洗脫的藥效結(jié)果較好，因此確定提取液在AB-8型大孔吸附樹脂吸附后，水和10％乙醇洗脫除去水溶性雜質(zhì)，50％乙醇洗脫富集青蘭中黃酮類成分。
2.2 50％乙醇洗脫量的確定取樣品溶液20ml上柱，靜置后，先用蒸餾水、10％乙醇洗脫至無色，再用50％乙醇洗脫，每50ml為一份，每份稍加濃縮，薄層色譜法定性檢測胡麻苷，結(jié)果顯示第16份時檢測不出胡麻苷，故確定洗脫溶媒用量為900mL。
2.3 富集程度考察取樣品液20ml，按上述條件上柱洗脫，收集水洗脫液濃縮干燥至恒重，收集50％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，并減壓干燥至恒重。另取提取液20ml減壓干燥至恒重，分別測定總固物的含量。并按含量測定法測定上柱前和上柱后的含量，結(jié)果見表8。
總固體物(g)胡麻苷量(mg)胡麻苷含量(％)上柱前 6.28 156.35 2.49上柱后 1.19 120.65 10.13水洗脫物4.09 4.020.10胡麻苷保留率(％)- 77.17 -結(jié)果表明，以AB-8型大孔吸附樹脂為吸附劑，上樣與洗脫前后的總固型物和胡麻苷的含量為指標，AB-8型大孔吸附樹脂可以有效的去除雜質(zhì)，使胡麻苷為主要成分的黃酮類成分的含量大幅度提高，而且的保留率接近，說明AB-8型大孔吸附樹脂可用于青蘭中有效部位黃酮類成分的富集。
以胡麻苷為指標評價AB-8型大孔吸附樹脂富集青蘭中有效部位黃酮類成分的上樣量，結(jié)果表明大孔吸附樹脂100mL最大吸附量為20ml青蘭藥液為佳。
甘青青蘭有效部位HPLC指紋圖譜(三)(見附圖16-19)1.儀器與試劑Waters2695聯(lián)盟系統(tǒng)(2996二極管矩陣檢測器，Mellennium32色譜工作站，柱溫箱，自動進樣，氦氣脫氣，美國Waters公司)，Symmetry ShieldRp185μm(4.6mm×25cm)色譜分析柱。KQ-250型超聲清洗器。
所用甲醇為色譜純，水為重蒸水，磷酸為分析純。
對照品胡麻苷為本實驗室自制，經(jīng)HPLC檢查純度大于99％。
2.實驗樣品的制備藥材經(jīng)粉碎機粉碎后過40目篩，取各批藥材粉末0.5g，精密稱定，置于50mL具塞錐形瓶中，加25ml 50％甲醇，超聲提取30min，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
取有效部位DT 0.1g，精密稱定，置于50mL容量瓶中，加適量50％甲醇，超聲溶解30min，放冷后，50％甲醇定容，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
3.色譜條件色譜柱Symmetry Shield Rp18(5μm 4.6mm×250mm)流動相甲醇(A)-0.025mol/L磷酸(B)梯度，0min40(A)60(B)60min50(A)50(A)檢測波長347nm柱溫30℃流速0.5mL/min進樣量10μl藥理學實驗研究甘青青蘭提取物總黃酮和胡麻苷對大鼠大腦中動脈血栓模型的離體實驗一.實驗材料1.動物SD大鼠，雄性，體重350±20g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
2.藥物受試藥物胡麻苷、總黃酮，均為本實驗室提供。
(2)陽性對照藥海得琴(甲磺酸雙氫麥角毒堿片)，片劑，規(guī)格1mg/片，人日用量為3～6mg，臨用時以0.5％cmc配制。由瑞士山德士藥廠與國營天津華津制藥廠合作生產(chǎn)，批號971166。適應癥主要用于與老年化有關(guān)的精神退化的癥狀和體征，急慢性腦血管病后的功能、智力減退的癥狀。
(3)其他藥品與試劑FeCl3·6H2O(A·R)北京市朝陽區(qū)通惠化工廠生產(chǎn)，用1mol/L鹽酸配制成50％溶液。紅四氮唑化學純，由中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司提供。批號H20010305。余均為市售分析純。
3.儀器設(shè)備(1)XTL-I型連續(xù)變倍體視顯微鏡，由北京電子光學設(shè)備廠生產(chǎn)。
(2)AEG-200型電子分析天平，日本島津產(chǎn)。
小型三用水箱，北京市醫(yī)用設(shè)備廠生產(chǎn)。
Df-206型電熱鼓風干燥箱，北京京通設(shè)備廠生產(chǎn)。
LG-R-80A型自動沖洗血液粘度儀和LG-B-190型紅細胞變形/聚集測試儀，均由北京世帝科學儀器公司提供。
二.方法與結(jié)果1.大鼠大腦中動脈血栓模型的制備及分組給藥方法來源劉小光、徐理鈉。一種能評價溶栓藥和抗栓藥的大鼠大腦中動脈血栓模型。藥理學報，1995；30662實驗用大鼠，以水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，按Tamura等的方法，稍加改進。大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點作一長1.5cm的弧形切口，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處向鼻側(cè)1mm處作一直徑2.5mm的骨窗，暴露大腦中動脈，將吸有10μl 50％FeCl3液的小片濾紙敷在大腦中動脈上，手術(shù)在體視顯微鏡下進行。待30min后大腦中動脈變黑，取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合。假手術(shù)組不敷FeCl3，余同模型組。實驗分為5組假手術(shù)組、模型組、以上2組均給予等量蒸餾水。陽性對照藥海得琴0.6mg/kg組、胡麻苷組、總黃酮組。術(shù)前灌胃給藥7天。
3.對模型大鼠缺血性腦損傷的影響3.1 對神經(jīng)癥狀的影響在術(shù)后不同時間(6h、24h、32h、48)，對動物神經(jīng)癥狀進行評分，評分標準參考Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M等.Rat middlecerebral artery occlusionevaluation of the mode and development of aneurologic examination.Stroke，1986，17472具體如下(1)大鼠被提尾懸空時，兩前肢對稱伸向地面，記0分，如不平行，手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)肩屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕肘屈曲又有內(nèi)旋者，根據(jù)損傷程度不同分別記為1-3分；(2)置大鼠于平滑地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，手感左右推動阻力相等，記0分，如向手術(shù)對側(cè)推動時阻力下降者，依程度不同記為1-3分；(3)將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，用力向后拉，觀察兩前肢的肌張力，對等且有力者記0分，手術(shù)對側(cè)前肢肌張力下降者，依程度不同記1-3分；(4)提鼠尾離開地面，動物有不停的向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈者，記1分。
據(jù)以上標準，滿分10分，分數(shù)越高，動物行為障礙越嚴重。結(jié)果組間比較，進行t檢驗。結(jié)果見表9。
3.2 對腦梗塞范圍的影響實驗方法參考Lundy EF，Solik BS，F(xiàn)rank RS et al.Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils.J Pharmacol Method，1986；16201動物經(jīng)末次神經(jīng)癥狀評分后，斷頭取腦，除掉嗅球、小腦和低位腦干，將其余部分冠狀切成厚度相同的7片，置5ml染色液中(含4％紅四氮唑1.5ml，1mol/L KH2PO4 0.1ml及雙蒸水3.4ml)，37℃避光溫孵30min，正常組織染成紅色，梗塞組織為白色，將白色組織仔細分離并稱重，以梗塞組織重量占總腦重量的百分比作為腦梗塞范圍，結(jié)果如表10所示。
3.3 對血液流變學的影響動物處死前，經(jīng)腹主動脈取血0.8ml，抗凝，用血液粘度儀進行檢測，以高切(200S-1)、中切(30S-1)和低切(5S-1)時血液粘度表示全血粘度；另取抗凝血以2000轉(zhuǎn)離心8min，其上清液即為血漿，取0.8ml血漿用血液粘度儀測試100S-1時的血漿粘度。結(jié)果組間比較，進行t檢驗，如表11、表12所示。
表9 總黃酮、胡麻苷對24小時大腦中動脈血栓模型神經(jīng)癥狀評分的影響劑 量神經(jīng)癥狀評分組別(mg/kg) 例數(shù) 6h24h假手術(shù)組 -12 0±0**0±0**模型組 -12 6.67±1.03 5.83±1.07海得琴組 0.6 8 4.00±0.50**3.75±0.66**總黃酮組 150 10 4.60±0.92**4.10±1.14*胡麻苷組 20 10 4.40±1.28**3.60±0.80**注X±SD；各組與模型組相比較*P＜0.05；**P＜0.01表10 總黃酮、胡麻苷對大腦中動脈血栓模型腦梗塞范圍的影響劑量腦梗塞范圍(％)組別(mg/kg) 例數(shù)24h假手術(shù)組-12 0±0**模型組 -12 4.12±1.29海得琴組0.6 8 2.11±1.46*總黃酮組150 10 2.35±1.19**胡麻苷組20 10 2.61±1.10*注X±SD；與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01
表11 總黃酮、胡麻苷對24h大腦中動脈血栓模型血液粘度的影響全血粘度血漿粘度劑量組別例數(shù)mg/kg高切(200S-1) 中切(30S-1) 低切(1S-1) 100S-1正常組 - 12 4.89±0.45*7.06±1.1226.27±5.51**1.25±0.11*模型組 - 12 5.37±0.40 7.93±1.0434.69±4.031.40±0.14海得琴組0.610 4.93±0.38*7.16±1.2029.55±3.95*1.18±0.14**總黃酮組15010 5.26±0.35 8.28±0.9425.20±5.65**1.16±0.06**胡麻苷組20 10 5.37±0.62 8.83±1.2630.17±5.75 1.18±0.10**注X±SD；各組與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01，表12 總黃酮、胡麻苷對24h大腦中動脈血栓模型血液流變學的影響血小板聚集率(％)劑量組別例數(shù)(mg/kg)ADP 膠原正常組- 12 55.33±8.53*59.4±16.4模型組- 12 67.08±7.64 63.67±12.93海得琴組 0.68 31.00±12.22**23.11±11.86**總黃酮組 1508 64.30±8.94 50.30±11.05胡麻苷組 20 8 64.90±4.08 55.80±7.90注X±SD；各組均與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01；[總結(jié)](1)大腦中動脈血栓模型可以比較客觀地模擬臨床腦梗塞多發(fā)生在大腦中動脈這一事實，易控制局部條件，對全身影響小，復制成功率高，且與臨床腦血栓形成的病理過程相似，血栓部位固定，于24h出現(xiàn)偏癱樣癥狀，TTC染色可見明顯的腦梗塞灶。
(2)總黃酮、胡麻苷能改善大鼠的神經(jīng)癥狀，降低缺血大鼠腦梗塞范圍，此種結(jié)果提示藥物有改善腦缺血的作用。
(3)大鼠形成大腦中動脈血栓后，可引起血小板聚集率升高，全血粘度(高切200S-1、中切30S-1和低切5S-1)及血漿粘度(100S-1)增加，說明在腦缺血的發(fā)生過程中，血液流變學呈粘、濃、凝、聚狀態(tài)的變化。
總黃酮、胡麻苷均能降低血小板聚集率。能降低全血粘度和血漿粘度。提示對血液流變學的改善作用是其抗腦缺血作用的機制之一。
藥物組合物實施例1注射劑含有胡麻苷的黃酮類提取物 10g苯甲醇10g注射用水 加至1000ml共制成注射劑1000ml。
實施例2片劑含有胡麻苷的黃酮類提取物 10g淀粉 50g糖粉 20g糊精 20g常規(guī)壓片，壓制1000片，每片0.1g。
實施例3膠囊劑含有胡麻苷的黃酮類提取物 10g糊精 20g糖粉 20g淀粉 100g共制成1000粒。
實施例4顆粒劑含有胡麻苷的黃酮類提取物10g糊精100g糖粉200g淀粉690g常規(guī)方法制成顆粒劑1000g，裝袋，每袋10g。
以上描述了本發(fā)明優(yōu)選實施方式，然其并非用以限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對在此公開的實施方案可進行不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進和變化。
權(quán)利要求
1.一種黃酮類提取物，其特征在于所述提取物至少含有胡麻苷，每克該黃酮提取物中含有胡麻苷不少于50毫克。
2.如權(quán)利要求1所述的黃酮類提取物，其中含有胡麻苷的黃酮類提取物來自甘青青蘭原料藥。
3.如權(quán)利要求1所述的黃酮類提取物，其中，每克提取物中含有胡麻苷以重量百分數(shù)計不少于100毫克。
4.如權(quán)利要求3所述的黃酮類提取物，其中該提取物為甘青青蘭中提取的黃酮類提取物，所述的提取物中含有胡麻苷以重量百分數(shù)計不少于100毫克，該含有胡麻苷的黃酮類提取物具有如圖16～18之一所顯示的指紋圖譜。
5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的黃酮類提取物的制備方法，其中依次為醇水提取、上大孔吸附樹脂，20％～100％醇洗脫，吸附除雜、濃縮、干燥步驟。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其中用30％～70％的乙醇洗脫。
7.如權(quán)利要求1-4任一項所述的黃酮類提取物在制備治療腦缺血和腦缺氧疾病的藥物中的應用。
8.藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1-4任一項中的黃酮類提取物及藥劑學可接受的藥物輔料。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中黃酮類提取物的重量比例至少不低于5％。
10.如權(quán)利要求8或9所述的藥物組合物，其中黃酮類提取物的重量比例為5％～95％。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來自中藥原料藥的黃酮類提取物，其中含有胡麻苷，本發(fā)明還涉及這類提取物在治療腦缺血和腦缺氧中的應用。本發(fā)明尤其提供了來自甘青青蘭原料藥中的黃酮類提取物，和該提取物的提取方法。本發(fā)明還提供了利用該提取物的藥物組合物的應用。本發(fā)明的提取方法簡單實用，提純效果良好，組合物療效確切，在治療腦血管病和腦卒中方面具有全新的用途。
文檔編號C07D311/30GK1563028SQ200410008460
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者杜樹山, 張文生, 史培軍, 王永炎 申請人:北京師范大學