專利名稱：：一種升麻總苷的提取方法及其抗腫瘤作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物升麻地上部分總苷的提取制備及其在腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：升麻是毛莨科升麻屬(CimicifugeaeS.I.)植物，包括升麻或西升麻(Cimicifugafoetida)、北升麻或興安升麻(Cimicifugadahurica)以及總狀升麻(Cimicifuga.racemosa)。興安升麻是我國(guó)特有品種，與總狀升麻(又稱歐洲升麻)同屬不同種。升麻族植物多以地下部分入藥。據(jù)記載，升麻藥材具有清熱解毒、升舉陽氣、發(fā)表透疹的功能，主治風(fēng)熱頭痛、齒痛、咽喉腫痛、子宮脫垂等癥。興安升麻(C.dahurica)的根莖作為常用中藥已載入中國(guó)藥典(2000版)，而地上部分通常作為廢棄物。近一兩年才開始對(duì)地上部分化學(xué)成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明，三萜及其皂甙是其主要成分。然而地上部分的藥理研究幾乎為一空白?？偁钌楹蛧?guó)產(chǎn)升麻(C.foetida)的總?cè)萍捌湓磉翱商岣呷?shì)大鼠血清雌二醇水平，而使黃體生成激素(LH)濃度降低，并能抑制由于內(nèi)分泌紊亂、雌激素缺乏而引起的骨質(zhì)疏松和更年期綜合癥。升麻中的阿魏酸、異阿魏酸等具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用，咖啡酸及其衍生物具有抗氧化活性。同時(shí)服用總狀升麻根莖的40％異丙醇提取物，可以增強(qiáng)雌激素依賴性腫瘤治療中的抗雌激素作用，在體外可增強(qiáng)他莫西芬對(duì)人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞的增殖抑制作用。另外，總狀升麻提取物還適用于治療良性及惡性前列腺肥大。含有升麻，黃連和Zanthoxylin的提取物可以用作口腔癌的替代療法。從總狀升麻根莖中提取的化合物升麻醇3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖(cimigenol3-O-a-L-arabinopyranoside)和23-O-乙酰升麻醇-3-O-a-L-吡喃阿拉伯糖(23-O-acetylshengmanol3-O-a-L-arabinopyranoside)對(duì)人口腔鱗狀細(xì)胞癌(HSC-2)有抑制作用，半數(shù)抑制率分別為30um和18um。提取自興安升麻地上部分的23-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷(23-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranoside)，24-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷(24-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranoside)，25-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷(25-O-acetylcimigenol-3-O-β-D-xylopyranoside)在體外具有抗腫瘤作用，能夠抑制人肝細(xì)胞癌(HepG2)，人肝細(xì)胞癌耐藥株(HepG2-R)，人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)，及原代培養(yǎng)正常小鼠肝細(xì)胞，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和HL-60細(xì)胞凋亡和周期阻滯，以及抗自由基氧化作用。本發(fā)明的目的是提取制備興安升麻地上部分總苷并在研究其細(xì)胞毒性、對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期、自由基氧化和DNA損傷的影響的基礎(chǔ)上，提供其在腫瘤臨床預(yù)防治療中的實(shí)際應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所說的興安升麻地上部分總苷提取自興安升麻(cimicifugadahurica)地上部分。原材料于1999年9月采自內(nèi)蒙古自治區(qū)喀喇泌旗茅荊壩，經(jīng)鑒定為升麻屬植物興安升麻(CimicifugadahuricaThurezMaxim)的地上部分。所說總苷的提取制備工藝是將原材料粉碎過篩后，進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)。研究結(jié)果表明，興安升麻地上部分主要含有三萜皂甙類成分?？傇碥盏奶崛》椒ù_定如下將升麻地上部分藥材粉碎過篩后，以10倍量的80％乙醇加熱回流提取3次，每次1小時(shí)。提取完畢，過濾，濾液減壓濃縮至波密度為1.12時(shí)加入吸附劑(硅膠或硅藻土)進(jìn)行柱層析。先以工業(yè)己烷洗去油脂，然后用乙酸乙酯洗脫，得到的乙酸乙酯部分經(jīng)減壓濃縮得總苷，收率為6-7％。由總苷分離的30個(gè)三萜類化合物在總苷中所占比例編號(hào)化合物在總苷中所占比例(％)1升麻內(nèi)酯A1.02升麻內(nèi)酯1.43興安升麻苷C2.34興安升麻苷D1.75興安升麻苷E1.76興安升麻苷F1.77興安升麻苷G5.08興安升麻苷H1.29興安升麻苷I1.610興安升麻苷J(rèn)1.71123-O-乙酰升麻醇木糖苷1.71225-O-乙酰-7，8-二脫氫升麻1.2醇木糖苷1325-O-乙酰升麻醇木糖苷6.614升麻苷H-21.01525-脫水升麻醇木糖苷1.01624-epi-7，8-二脫氫升麻醇木1.2糖苷17升麻醇木糖苷5.8187，8-二脫氫升麻醇木糖苷1.21925-O-甲基升麻醇木糖苷1.72015a-羥基升麻苷H-21.0217β-羥基升麻醇木糖苷2.02212β-羥基升麻醇木糖苷1.02324-O-乙酰-7，8-二脫氫升麻1.2醇木糖苷2424-O-乙酰升麻醇木糖苷2.02525-O-甲基-24-O-乙酰升麻醇2.0木糖苷2612β-O-乙酰小升麻苷A8.42712β-O-乙酰小升麻苷B4.228小升麻苷A1.529小升麻苷B1.830升麻醇1.7將興安升麻地上部分總苷用DMSO溶解配成2.50g/ml的濃縮液，分別進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)試驗(yàn)、細(xì)胞周期試驗(yàn)、DPPH自由基清除試驗(yàn)(抗氧化)、羥自由基清除試驗(yàn)、羥自由基引起的DNA損傷試驗(yàn)、環(huán)氧酶2蛋白表達(dá)試驗(yàn)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，興安升麻地上部分總苷對(duì)血液瘤、實(shí)體瘤均有較好的抑瘤作用。細(xì)胞毒強(qiáng)度與已獲得專利申請(qǐng)?zhí)柕?3-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷，24-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷，25-氧-乙酰升麻醇-3-氧-β-D-木糖苷相當(dāng)。對(duì)小鼠正常肝細(xì)胞的IC50值均大于其它腫瘤細(xì)胞株，說明興安升麻地上部分總苷在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較低。細(xì)胞形態(tài)學(xué)試驗(yàn)和細(xì)胞周期試驗(yàn)結(jié)果表明，興安升麻地上部分總苷主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和G0/G1細(xì)胞周期阻滯來起作用的。興安升麻地上部分總苷有很好的清除自由基的作用，并可有效抑制羥自由基對(duì)DNA造成的損傷。因此，本發(fā)明中的興安升麻地上部分總苷可望用作臨床腫瘤預(yù)防和治療藥物。發(fā)明效果本發(fā)明涉及的興安升麻地上部分總苷在體外對(duì)血液瘤(HL-60)和實(shí)體瘤(HepG2，SF-268，MCF-7)均有良好的殺傷作用，而對(duì)正常小鼠肝細(xì)胞損傷作用相對(duì)微弱；細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞周期試驗(yàn)證明，興安升麻地上部分總苷主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G0/G1阻滯來起作用，而環(huán)氧酶-2是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G0/G1阻滯的機(jī)制之一；興安升麻地上部分總苷有很好的清除自由基以及DNA損傷保護(hù)作用，可以預(yù)防自由基氧化對(duì)生物大分子的損傷及其可能導(dǎo)致的癌變。興安升麻地上部分總苷的細(xì)胞毒性與從中提取的三個(gè)單體化合物的作用強(qiáng)度相當(dāng)，但清除自由基和DNA損傷保護(hù)作用強(qiáng)于三個(gè)單體化合物，而且與三個(gè)單體化合物相比，升麻總苷的提取工藝簡(jiǎn)單，收率提高(約達(dá)6-7％)，成本顯著降低(較單體化合物成本降低10倍以上)，更有利于其在制備腫瘤預(yù)防和治療藥物中的實(shí)際應(yīng)用。下面所列實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1細(xì)胞毒性試驗(yàn)1、材料人肝癌細(xì)胞株(HepG2)，人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(SF-268)，人急性早幼粒白血病細(xì)胞株(HL-60)，均夠自美國(guó)ATCC(AmericanTypeCultureCollection)。小鼠肝細(xì)胞分離自昆明種小鼠(購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)廣東省科委實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)所合格證)肝臟，經(jīng)原代培養(yǎng)獲得。培養(yǎng)基RPMI1640，DMEM，胎牛血清均購(gòu)自Gibico公司。四氮唑溴MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)為AMRESCO公司產(chǎn)品，由上海生物工程有限公司分裝，批號(hào)0481B50.2、小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)小鼠麻醉后消毒暴露肝臟，門靜脈插管，依次用肝素、前灌液、膠原酶灌流，取下肝臟用無鈣鎂Hanks液清洗兩次，然后轉(zhuǎn)移至一潔凈培養(yǎng)皿中將肝細(xì)胞抖落于膠原酶溶液中，過篩離心，以DMEM培養(yǎng)基洗3次，然后用DMEM10％胎牛血清重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞率在80％以上。3.組織培養(yǎng)HepG2，MCF-7，SF-268和HL-60細(xì)胞均用RPMI1640培養(yǎng)基加10％胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)傳代。接種細(xì)胞到96孔板，接種密度為10000-20000/孔。小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基加10％胎牛血清，接種密度為8000個(gè)/孔。5％CO2孵箱37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，按常規(guī)加藥，對(duì)照組加等容積的DMSO。繼續(xù)在5％CO2和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加MTT，終濃度為50ug/ml。5％CO2孵箱37℃孵育4小時(shí)后，Bio-RADModel680MicroPlateReader上測(cè)定吸光度值。計(jì)算抑制率。4.結(jié)果興安升麻地上部分總苷能夠抑制HepG2，MCF-7，SF-268，HL-60以及小鼠正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖1)，IC50見表1。由表1可知興安升麻地上部分總苷對(duì)HepG2，MCF-7，SF-268，HL-60的IC50相近，說明其對(duì)血液瘤、實(shí)體瘤均有較好的抑瘤作用。興安升麻地上部分總苷對(duì)小鼠正常肝細(xì)胞的IC50大于其它腫瘤細(xì)胞株，說明興安升麻地上部分總苷在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒性較弱。表1.升麻地上總苷對(duì)五個(gè)細(xì)胞株的IC50(μg/ml)值實(shí)施例2細(xì)胞形態(tài)學(xué)試驗(yàn)(細(xì)胞凋亡)1、方法35*10mm培養(yǎng)皿中加入400ul吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)溶液(100ug/mlAO溶液，100ug/mlEB溶液，用PBS配制)，1∶1混均，立即在40*10熒光倒置顯微鏡下觀察。AO對(duì)活細(xì)胞及死細(xì)胞均能染色，EB只對(duì)失去膜整合性的細(xì)胞染色，活細(xì)胞仍呈現(xiàn)均勻的綠色。早期凋亡細(xì)胞呈綠色，由于染色質(zhì)凝聚及核裂解，其細(xì)胞核中有鮮綠色的斑點(diǎn)。凋亡晚期細(xì)胞可被EB染成橙色，但與死細(xì)胞不同，凋亡晚期細(xì)胞的核凝聚并常常裂解。壞死細(xì)胞染成橙色，但具備活細(xì)胞樣的核形態(tài)，沒有染色質(zhì)凝聚。2、結(jié)果觀察興安升麻地上部分總苷對(duì)HepG2和HL-60細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)在25μg/ml和50μg/ml對(duì)兩個(gè)細(xì)胞株均能引起凋亡的形態(tài)學(xué)變化，陽性藥三尖杉酯堿也能引起相似的凋亡形態(tài)學(xué)變化(圖2-7)。實(shí)施例3細(xì)胞周期試驗(yàn)1、材料RNaseA，USB公司產(chǎn)品，81。4units/mg，批號(hào)110266-007；碘化丙啶(PI，propidiumiodide)，sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)042k3655.2、方法常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2和HL-60細(xì)胞，給藥后收集細(xì)胞，用PBS洗兩次后以70％酒精固定過夜。1000rpm/10min離心去乙醇，用含1％胎牛血清的PBS洗兩次，再以2ml含1％胎牛血清的PBS重懸，加RNase酶(終濃度0.5mg/ml)消化1小時(shí)，然后加PI(2.5ug/ml)染色，冰上放置20min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。3、結(jié)果興安升麻地上部分總苷在50μg/ml，作用24小時(shí)后，可使HepG2停止在G0/G1期。在25μg/ml，12小時(shí)使HL-60細(xì)胞停止在G0/G1期(表2)及(圖8-11)。表2.興安升麻地上部分總苷對(duì)HepG2和HL-60細(xì)胞周期的影響實(shí)施例4二苯代苦味肼基(DPPH)自由基清除抗氧化試驗(yàn)1、材料與方法DPPH(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)是一種比較穩(wěn)定的自由基，其N上有1個(gè)游離電子，因此在517nm處有最大的吸收蜂，其甲醇溶液呈紫色。加入抗氧化劑以后，DPPH捕捉1個(gè)電子與游離電子配對(duì)，在517nm處的吸收消失，紫色褪去。因此通過測(cè)定加入抗氧化劑后，DPPH在517nm處吸收值的下降可以看出抗氧化劑對(duì)DPPH的清除作用。加興安升麻地上部分總苷至DPPH(濃度為2.4mg/mlMeOH)中，反應(yīng)1.5小時(shí)后，在UV上測(cè)定其吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為515nm。空白樣品+甲醇對(duì)照二甲基亞砜(DMSO)+DPPH樣品樣品+DPPH自由基清除率SR＝(1-A1/A0)*100％A1樣品的吸光度A0對(duì)照的吸光度2、結(jié)果興安升麻地上部分總苷能使吸光度值降低，有很好的清除自由基的作用，且呈劑量依賴關(guān)系(圖12)。實(shí)施例5羥自由基清除及其DNA損傷保護(hù)試驗(yàn)1、材料TOPCOUNT發(fā)光測(cè)定儀、PH測(cè)定儀、BMG96孔板、鄰菲羅啉(3500uM)、硫酸銅(500Um)、維生素C(3500uM)、過氧化氫(3％)、DNA，Sigma產(chǎn)品、醋酸、醋酸鈉其他試劑均為市售分析純2、方法Cu2+-抗壞血酸-H2O2作用可產(chǎn)生羥自由基，后者與鄰菲羅啉(phen)作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。在這一體系中加入DNA，羥自由基同時(shí)可與DNA作用，引起DNA結(jié)構(gòu)損傷，并且伴隨這一過程在445-450nm有一大于與phen單獨(dú)作用時(shí)發(fā)光強(qiáng)度的特征性發(fā)光。因此，分別檢測(cè)加入DNA前后的發(fā)光強(qiáng)度，可間接反映藥品對(duì)羥自由基的清除能力及其對(duì)DNA損傷的保護(hù)程度。取BMG96孔黑色不透光板一塊，放置冰塊上預(yù)冷。分別加入預(yù)冷的Cu2+-phen10μl/孔，Vc10μl/孔，DNA(10ug/ml)10μl/孔(測(cè)羥自由基清除試驗(yàn)時(shí)不加)，H2O220ul/孔，(空白孔不加H2O2)，待篩樣品10μl/孔(對(duì)照孔加等量溶劑)，各孔用醋酸緩沖液(0.1M，PH5.5)補(bǔ)至100ul。充分混勻，立即上Topcount測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度值。并計(jì)算抑制率。抑制率(％)＝(對(duì)照-樣品)/(對(duì)照-空白)*100％。丹酚酸B作為陽性對(duì)照。3、結(jié)果以發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，記錄樣本發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果見圖13-16。加入DNA后可見反應(yīng)的峰值較未加前有明顯升高。興安升麻地上部分總苷和陽性藥丹酚酸B都能使發(fā)光曲線發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為發(fā)光強(qiáng)度峰值和曲線下面積的顯著降低。表明興安升麻地上部分總苷和陽性藥丹酚酸B對(duì)羥自由基有明顯的清除作用并且能有效防止羥自由基造成的DNA損傷(表3，圖13-16)。表3.興安升麻地上部分總苷對(duì)羥自由基清除及其DNA損傷的保護(hù)作用實(shí)施例6升麻地上總苷抑制還氧酶-2的表達(dá)1、材料兔多克隆抗環(huán)氧酶-2抗體，抗兔IgG抗體，均購(gòu)自SantaCruzBiotechnology，Inc.(SantaCruz，CA).蛋白酶抑制劑(Proteaseinhibitorcocktailtablets)，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(BenchMarkTMPre-standProteinladder)購(gòu)自Invitrogen.蛋白質(zhì)雜交檢測(cè)試劑(ECL)購(gòu)自AmershamPharmaciaBiotech.硝酸纖維素膜購(gòu)自Schleicher&Schuell(Keene，NH).，其他試劑均為市售分析純。2、方法在HepG2細(xì)胞70％匯合時(shí)加入不同濃度的待測(cè)藥品，以溶劑作對(duì)照。5％CO2孵箱37℃培養(yǎng)4.5小時(shí)后以冰冷的磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞兩次，然后用裂解液裂解細(xì)胞，挑出大DNA，收集裂解液以bradford法測(cè)定蛋白含量。10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白上樣量25ug。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素抹上。將硝酸纖維素膜依次與一抗和二抗孵育，加入ECL檢測(cè)試劑，在Bio-RadchemiDoc上檢測(cè)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。3、結(jié)果升麻地上部分總苷在25，50，100/ml作用4.5小時(shí)后，均能抑制環(huán)氧酶-2的表達(dá)，與對(duì)照相比蛋白條帶明顯減弱，表達(dá)下降(圖17)。圖1-升麻地上部分總苷的細(xì)胞毒作用圖2-HepG2正常對(duì)照?qǐng)D3-HepG2-三尖杉酯堿-20μM-6hr陽性對(duì)照?qǐng)D4-HepG2-升麻地上部分總苷-50μg-24hr圖5-HL-60-正常對(duì)照?qǐng)D6-HL-60-三尖杉酯堿-20μM-6hr圖7-HL-60-興安升麻地上部分總苷-25μg/ml-12hr圖8-HepG2-正常對(duì)照?qǐng)D9-HepG2-興安升麻地上部分總苷-50μg/ml-24hr圖10-HL-60-正常對(duì)照?qǐng)D11-HL-60-興安升麻地上部分總苷-25μg/ml-12hr圖12-興安升麻地上部分總苷對(duì)DPPH自由基的清除及抗氧化作用圖13-丹酚酸對(duì)羥自由基的清除作用圖14-興安升麻地上部分總苷對(duì)羥自由基的清除作用圖15-丹酚酸對(duì)羥自由基造成的DNA損傷的保護(hù)作用圖16-興安升麻地上部分總苷對(duì)羥自由基造成的DNA損傷的保護(hù)作用圖17-興安升麻地上部分總苷對(duì)環(huán)氧酶-2表達(dá)的抑制作用權(quán)利要求1.一種升麻總苷，其特征在于所說總苷是由興安升麻地上部分提取的，主要含有三萜皂甙類成分。2.如權(quán)利要求1所說升麻總苷的制備方法，其特征在于所說方法是將升麻地上部分藥材粉碎過篩后，以10倍量的80％乙醇加熱回流提取3次，提取完畢，過濾，濾液減壓濃縮，加入吸附劑(硅膠或硅藻土)進(jìn)行柱層析，先以工業(yè)己烷洗去油脂，再用乙酸乙酯洗脫，得到的乙酸乙酯部分經(jīng)減壓濃縮得總苷，收率為6-7％。3.如權(quán)利要求1所說升麻總苷在制備腫瘤治療藥物及清除自由基腫瘤化學(xué)預(yù)防藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種興安升麻地上部分總苷及其在腫瘤治療和腫瘤預(yù)防抗氧化損傷中的應(yīng)用，所說總苷是將升麻地上部分藥材粉碎過篩后，用80％乙醇加熱回流提取，過濾，減壓濃縮，加入吸附劑(硅膠或硅藻土)進(jìn)行柱層析，先以工業(yè)己烷洗去油脂，然后用乙酸乙酯洗脫，得到的乙酸乙酯部分經(jīng)減壓濃縮得總苷，工藝簡(jiǎn)單，收率提高，成本降低，極有利于工業(yè)化生產(chǎn)，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，所說總苷可望用于制備腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療藥物。文檔編號(hào)C07G3/00GK1580062SQ20041000899公開日2005年2月16日申請(qǐng)日期2004年3月23日優(yōu)先權(quán)日2004年3月23日發(fā)明者肖培根,田澤,斯建勇,陳迪華,潘瑞樂申請(qǐng)人:肖培根