專利名稱：一種人工合成的對鞘翅目害蟲高毒力的Bt cry8基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明的背景技術(shù)蟲害是世界農(nóng)作物減產(chǎn)的一個重要因素，平均每年因此損失糧食總產(chǎn)量的9％，直接經(jīng)濟損失達57億美元(James C，ISAAA Briefs，2003，vii)。金龜子類幼蟲(俗稱蠐螬，本發(fā)明以下也簡稱為“蠐螬”)是一類重要的世界性分布地下害蟲，可危害糧食、棉花、油料、蔬菜、糖料、煙草、牧草、花卉、草坪草、果樹等多種植物。為控制蠐螬的危害，一般采用農(nóng)業(yè)、化學(xué)和物理等綜合防治策略，但這些防治雖有一定成效，卻難以達到持續(xù)控制的效果。因此，克隆對蠐螬高毒力的基因，培育殺蠐螬的轉(zhuǎn)基因植物就是一條值得探索的新的生物技術(shù)防治途徑。
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌。它在形成芽孢的同時，能產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的伴孢晶體(parasporal crystal)，對鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf，E.et al.，1998，Microbiol.And Molecular BiologyReview，62(3)775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)，對人畜無害，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了廣泛應(yīng)用。
目前人們已經(jīng)克隆了300多種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬135種模式基因。其中，有12種克隆的cry8類基因，它們對金龜子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有殺蟲作用。1992年，Ohba等人在世界上首次從Bt菌株中篩選出對金龜子幼蟲具有特異殺蟲活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba M et al.，1992，Letters inApplied Microbiology，1454-57)；1994年，Sato等從中克隆了一種新的殺蟲基因cry8Ca1(Sato R et al.，1994，Curr Microbiol，2815-19)。由于cry8類基因具有很大的潛在應(yīng)用價值，大多數(shù)基因都已經(jīng)申請專利，如杜邦公司克隆的對西方玉米根葉甲(Western cornrootworm)具有顯著殺蟲效果的cry8Bb1、cry8Bc1基因已申請專利(專利號為WO0234774-A3和WO 0234774-A2)并已用于轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的開發(fā)；日本Asano等克隆的cry8Da1、cry8Da2和cry8Da3也已在日本申請專利(專利號為JP 2002045186-A 1/2)。我國河北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)近年來先后篩選獲得多株對黃褐麗金龜(Anomala exoleta)和銅綠麗金龜(A.corpulenta)幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株(馮書亮等，2000，《中國生物防治》，16(2)74-77；王容燕等，2003，《植物保護學(xué)報》，30(2)223-225)，其中包括HBF-1菌株。該菌株對黃褐麗金龜幼蟲具有特異高殺蟲活性，對銅綠麗金龜也表現(xiàn)出較高的殺蟲活性。本發(fā)明克隆的cry8Ca2基因即來自HBF-1菌株。
1987年，Vaeck等人首次將Bt殺蟲晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草，開創(chuàng)了人類利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治害蟲的先河(Vaeck，et al，1987，Nature，32833-37)。但是在轉(zhuǎn)基因研究中人們發(fā)現(xiàn)將來源于Bt的殺蟲蛋白基因直接轉(zhuǎn)入植物，存在著表達產(chǎn)物不穩(wěn)定、表達量少的缺陷(vanAarssen，et al，1995，Plant Mol Biol，28513-524)。一般地，對Bt基因進行改造，應(yīng)用植物偏好的密碼子，可以提高Bt基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達量。本發(fā)明即克隆了對鞘翅目害蟲高毒力的cry8基因，對該基因進行了密碼子優(yōu)化，這樣一方面可以解決國內(nèi)轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中殺蟲基因種類單一的不足，拓寬轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的殺蟲譜，另一方面通過將改造的基因轉(zhuǎn)化植物，可以提高基因表達量，增強殺蟲效果。
本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是提供一種對鞘翅目地下害蟲具有極高毒力的新型Bt基因，并對克隆的cry8Ca基因進行人工改造，以利用植物偏好的密碼子序列，提高cry8Ca基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達量；并通過突變Cry8Ca蛋白的兩個氨基酸位點，提高cry8Ca基因?qū)瘕斂坪οx的毒性。進一步，本發(fā)明利用組成型表達的啟動子和組織特異性啟動子構(gòu)建一種新的植物表達載體，尤其是根特異性啟動子構(gòu)建植物表達載體，以使毒蛋白在根部特異表達，以毒殺地下害蟲和減少轉(zhuǎn)基因安全性問題。
本發(fā)明的技術(shù)方案1.在HBF-1菌株中進行cry8Ca2基因的克隆馮書亮等從河北省土壤中分離獲得一株蘇云金芽孢桿菌新分離株HBF-1，通過對該菌株的殺蟲活性研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對黃褐麗金龜幼蟲和銅綠麗金龜幼蟲具有特異的殺蟲活性(馮書亮等，2000，《中國生物防治》，16(2)74-77)。人們通過利用cry基因的CAPS鑒定體系，可以鑒定Bt菌株中所包含的基因類型(Kuo，W.S.& Chak，K.F.，Appl.Envir.Micro.1996，621369-1377；宋福平等，《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)》，1998，31(3)13-18)。本發(fā)明對HBF-1菌株進行cry8類基因的鑒定，方法為利用cry8類基因的通用引物S5un85′-CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3′S3un85′-CTGACTGATTTCCACCATCACG-3′進行PCR擴增，可以擴增出1212bp的陽性條帶，用EcoO109I和DraI雙酶切的PCR產(chǎn)物有四條帶，分別是613bp、310bp、197bp和92bp；回收PCR產(chǎn)物構(gòu)建至T-載體(T-vector)，測序結(jié)果與已知cry8Ca1基因的同源性非常高，證明在HBF-1菌株中含有cry8Ca基因。根據(jù)GenBank上公布的cry8Ca1基因序列設(shè)計出全長引物對s8ca5/s8c3，用于載體pET21b的克隆與表達。引物對s8ca5/s8c3的序列如下BamHIS8Ca55′-CGCGGATCCGAAATGAGTCCGAATAATCAG-3′SalIS8C35′-ACGCGTCGACCTCTTCTTCTAACACGAGTT-3′以菌株HBF-1的總DNA為模板，用pfuDNA聚合酶，PCR擴增出3.5Kb條帶，與載體pET21b連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110，得到陽性轉(zhuǎn)化子pSAS001、pSAS002。對陽性克隆做限制性內(nèi)切酶分析及PCR檢測，結(jié)果如附圖3所示。pSAS001由北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司(中國北京市)測序，得到全長基因序列(GenBank登錄號為AY518201)，該基因編碼區(qū)為3483bps，編碼1160個氨基酸，分子量為130KD。將克隆的新基因在GenBank通過blastn比較，結(jié)果表明該基因與上述日本亞種BuiBui的cry8Ca1基因有一個堿基(第2315個堿基)發(fā)生變化，對應(yīng)的氨基酸(第772個氨基酸)S也由N取代，可知新基因與已知基因的同源性超過99％。該基因被Bt命名委員會命名為cry8Ca2基因。
2.在Bt無晶體突變株中表達Cry8Ca蛋白本實驗室保存有Bt-E.coli穿梭表達載體pSXYkm(該載體來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所生物技術(shù)實驗室，該實驗室可以向公眾提供該質(zhì)粒)，該載體具有cry3A的啟動子和pET21b的多克隆位點，使得外源基因特別是Bt中的基因可以穩(wěn)定大量表達，選用的卡那霉素抗性基因可以使目標(biāo)菌株得到環(huán)境安全釋放。本實驗室保存的無晶體突變株HD73-(該突變株來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所生物技術(shù)實驗室，可以向公眾提供)可以使外源晶體殺蟲蛋白通過鏡檢檢出。
用SalI/BamHI消化pSAS001，回收3.4Kb的基因片段，用SalI/BamHI消化載體過夜，以便消化完全，回收載體。連接載體與目的片段，轉(zhuǎn)化JM110，得到穿梭表達載體pSK001的轉(zhuǎn)化子。
提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化方法見美國Bio-Rad公司電穿孔儀說明書)SCS110進行修飾，提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化HD73-，得到的轉(zhuǎn)化子可表達cry8Ca2基因。1/2LB培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)36小時，鏡檢可以看到球型晶體，SDS-PAGE分析可以檢測到130KD的蛋白。
3.在Bt中表達的Cry8C蛋白的生物活性檢測Bt菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，刮下并懸浮于無菌水中，采用乳糖懸浮丙酮沉淀的方法，制成粉劑備用。將上述粉劑按照2倍等比級差梯度濃度稀釋，加入到均勻粗細(xì)土豆絲的滅菌細(xì)土中混勻，以20天齡銅綠麗金龜幼蟲作為供試蟲主，每個處理接蟲20頭，重復(fù)3次，以加入清水的處理作為空白對照，感染飼養(yǎng)7天、14天檢查死蟲數(shù)，計算校正死亡率和體重增長率。
4.cry8Ca2基因的隨機突變研究利用普通Taq酶在PCR擴增中易產(chǎn)生突變。本發(fā)明對cry8Ca2基因進行了隨機突變研究。以質(zhì)粒pSAS001為模板，用引物對s8ca5/s8c3進行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物構(gòu)建至Bt-E.coli穿梭表達載體pSXYkm，得到一系列不同的克隆，提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化SCS110進行修飾，提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化HD73-，得到的轉(zhuǎn)化子可以表達cry8Ca2基因。對轉(zhuǎn)不同轉(zhuǎn)化子的HD-73-菌的殺蟲活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中有兩個位點的突變可以提高Cry8Ca2蛋白的殺蟲活性，分別是第439位的Q(Gln)突變?yōu)镻(Pro)和第642位的E(Glu)突變?yōu)镚(Gly)。
5.cry8Ca2基因的人工改造根據(jù)微生物和植物對密碼子偏好的不同，本發(fā)明對cry8Ca2基因的1-2040bp的序列進行人工優(yōu)化改造。人工優(yōu)化改造序列與cry8Ca2基因序列的比較見附圖7。本發(fā)明按照cry8Ca2基因的人工改造序列進行了全基因合成，新基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。改造的cry8Ca2基因即mcry8Ca(modified cry8Ca)缺失了cry8Ca2基因3’端的1.5Kb的序列，與cry8Ca2基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原來cry8Ca2的37％提高為46％(附圖8)。本發(fā)明調(diào)整Cry8Ca蛋白的氨基酸密碼子使用頻率，使mCry8Ca蛋白的氨基酸密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近。在人工改造的序列中，突變了原來Cry8Ca2蛋白的兩個氨基酸位點，分別把第439位的Q(Gln)突變?yōu)镻(Pro)和第642位的E(Glu)突變?yōu)镚(Gly)，新氨基酸序列見SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。將mcry8Ca基因連接至pUC19載體，兩端引入BamHI和KpnI位點，把得到的質(zhì)粒命名為pUCmcry8。
6.植物表達載體的構(gòu)建本發(fā)明用BamHI和KpnI雙酶切pUCmcry8，回收2.0Kb的基因片段，同樣用BamHI和KpnI雙酶切質(zhì)粒pGEM-3Zf(+)(該質(zhì)粒為常用質(zhì)粒，GenBank登錄號為X65304，可在美國Promega公司購買到)，連接，轉(zhuǎn)化JM110，把得到的陽性轉(zhuǎn)化子命名為p3Zmcry8；本發(fā)明用可在根癌農(nóng)桿菌和大腸桿菌中穿梭的雙元載體pBI121(該載體為常用載體，GenBank登錄號為AF485783。見Chen PY，et al，2003，Mol.Breed，11287-293)，用BamHI和SacI雙酶切質(zhì)粒pBI121，回收12Kb的片段，同樣用BamHI和SacI雙酶切質(zhì)粒p3Zmcry8，回收2.0Kb的片段，將兩個片段連接，轉(zhuǎn)化JM110，得到陽性轉(zhuǎn)化子，把此新構(gòu)建質(zhì)粒命名為pBSmCN。該質(zhì)粒含有組成型表達的啟動子CaMV35S(即一段DNA序列，可以驅(qū)動所連接的基因片段進行轉(zhuǎn)錄，進而翻譯成蛋白質(zhì)，組成型表達的啟動子可以調(diào)控基因在生長發(fā)育的任何階段和任何組織都有表達)、mcry8Ca基因和NOS終止子(一段DNA序列，含有基因表達的終止信號)。對質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果如附圖9所示；構(gòu)建圖譜見附圖10。
根據(jù)文獻報道克隆煙草根特異性啟動子(只驅(qū)動基因在根中表達，在其它組織沒有表達)TobRB7(Yamamoto Y，1991，The plant cell，3371-382；南蘭等，2002，《科學(xué)通報》，47(1)49-53)。首先根據(jù)TobRB7已知序列設(shè)計一對引物XbaITobRB7-P1F5′-ATTCTAGACACCCGAAAGGAAATGATTCGTTCBamHITobRB7-P1R5′-ATGGATCCGTTCTCACTAGAAAAATGCCCCAA提取煙草的基因組DNA做模板，應(yīng)用PCR方法克隆啟動子序列，其反應(yīng)條件為94℃，1分鐘；54℃，1分鐘；72℃，1分鐘；共30個循環(huán)。電泳檢測可見一740bp的產(chǎn)物帶，回收電泳條帶，用XbaI和BamHI雙酶切，載體同樣用XbaI和BamHI雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化JM110，把得到的陽性轉(zhuǎn)化子進行酶切鑒定(見附圖11)；構(gòu)建圖譜見附圖12。把得到的質(zhì)粒命名為p3Zpro。測序結(jié)果表明克隆的啟動子序列與報道序列(Yamamoto Y，1991，The PlantCell，3371-382)只有一個堿基差別，同源性在99％以上。
用SacI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pBI121，回收0.26Kb的小片段，同樣雙酶切質(zhì)粒pGEM-3Zf(+)，連接，把得到的陽性轉(zhuǎn)化子命名為p3Z-Nos；用XbaI和BamHI酶切p3Zpro，回收啟動子740bp的片段，連接到進行過同樣酶切的載體p3Z-Nos中，構(gòu)建得到質(zhì)粒p3ZPN；用SalI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒p3ZPN，回收1Kb的小片段，并把農(nóng)桿菌-大腸桿菌穿梭的雙元載體pBin19(該載體為常用載體，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所生物技術(shù)實驗室保存，該實驗室可以向公眾提供該載體)用SalI和EcoRI雙酶切，與回收的1Kb小片段連接，把得到的轉(zhuǎn)化子命名為pBPN；用BamHI和KpnI雙酶切質(zhì)粒pUCmcry8，回收2.0Kb的片段，把質(zhì)粒pBPN同樣用BamHI和KpnI雙酶切，回收大片段，連接，轉(zhuǎn)化JM110，把得到的重組質(zhì)粒命名為pBTmCN。其酶切鑒定和構(gòu)建圖譜分別見附圖13和附圖14。
7.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化取兩管200μl農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，分別加入1μg pBTmCN或者pBSmCN質(zhì)粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37℃恢復(fù)培養(yǎng)5分鐘，加入1ml YEB液體培養(yǎng)基，28℃慢速振蕩(＜100rpm)4小時，1,000rpm離心30秒種，棄上清，加入100μl YEB液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素100μg/ml和鏈霉素125μg/ml的YEB培養(yǎng)基的平板上，28℃培養(yǎng)48小時。將YEB抗性培養(yǎng)基平板上的克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR方法檢測陽性克隆。
8.煙草轉(zhuǎn)化將含有pBTmCN和pBSmCN質(zhì)粒的農(nóng)桿菌克隆接種于含有卡那霉素100μg/ml和鏈霉素125μg/ml的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，1/50接種于MS鹽(pH7.0)中；將煙草無菌苗切成0.4×0.6cm2的小塊，將煙草葉片浸入MS鹽中，農(nóng)桿菌侵染10分鐘；取出煙草葉片，用滅菌濾紙吸干菌液，放置到鋪有一層濾紙的MS培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)3天，3天后將煙草葉片轉(zhuǎn)移至MS篩選分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+100μg/ml卡那霉素+500μg/ml羧芐霉素+3mg/ml 6-BA+0.2mg/mlNAA)，28℃，光/暗＝16小時/8小時，2周后，在葉片邊緣有綠色愈傷點出現(xiàn)，1周后，愈傷點分化成小植株，將小植株切下移至生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+100μg/ml卡那霉素+500μg/ml羧芐霉素)生根，根部發(fā)育健壯后，移至花盆在土中繼續(xù)生長(普通土∶營養(yǎng)土∶蛭石＝2∶1∶1)。
9.轉(zhuǎn)化煙草的分子檢測提取轉(zhuǎn)化煙草的基因組DNA，取1μg基因組DNA做模板，引物序列如下30595′-GCTAATTCTCGTATCGCTGTTGAGT30605′-TTGCGACCCTGAGATTGATAACTTGPCR擴增的反應(yīng)條件為94℃，5分鐘，1個循環(huán)；94℃，1分鐘，56℃，1分鐘，72℃，2分鐘，30個循環(huán)。把產(chǎn)物電泳。
10.轉(zhuǎn)基因煙草的生物活性檢測從田間采集銅綠麗金龜(Anomala corpulenta)、黃褐麗金龜(A.exoleta)兩種在我國北方危害比較嚴(yán)重的金龜子成蟲群體，帶回室內(nèi)，分別放入40×40×50cm的飼養(yǎng)盒中，盒底放5-8cm厚的潮濕過篩細(xì)土，飼喂新鮮榆樹葉片，26-28℃飼養(yǎng)。待其產(chǎn)卵后，將卵挑出，放在潮濕土中使孵化。將剛孵化的幼蟲挑出，每個小飼養(yǎng)盒(Φ8cm，H5cm)放幼蟲5頭，飼喂土豆塊和新鮮的玉米嫩根，待幼蟲長到一定齡期后供生物檢測用。
采用群體種植和群體接蟲的方法，進行生物測定。在大田土中分別種植轉(zhuǎn)pBSmCN和轉(zhuǎn)pBI121載體的煙草植株以及混合種植轉(zhuǎn)pBSmCN、pBI121、pBTmCN、pBTGN(TobRB7啟動子+GUS基因)載體的轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)化植株，每種處理12株。
將轉(zhuǎn)基因煙草12株分別種植在48×33×13cm的塑料盒子中，土壤深度12cm。每個植株接20天齡的黃褐麗金龜幼蟲5頭或15天齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭。
金龜子類幼蟲對煙苗危害程度的分級標(biāo)準(zhǔn)為0級植株生長健壯，根系發(fā)達；1級無明顯危害情況，主根、須根危害的程度占整個植株的20％以下；2級危害明顯，根系不發(fā)達，主根、須根危害的程度占整個植株的20％-50％；3級植株危害嚴(yán)重，須根少，主根、須根危害的程度占整個植株的50％-70％；4級植株萎蔫，甚至死亡，主根、須根危害的程度占整個植株的70％以上 在接蟲15天時，按照上述分級標(biāo)準(zhǔn)，對各種煙草植株進行統(tǒng)一分級，并計算危害率和危害指數(shù)。
按照建立的危害程度分級標(biāo)準(zhǔn)，黃褐麗金龜幼蟲對供試轉(zhuǎn)基因植物的危害程度、危害指數(shù)見附圖17、18。轉(zhuǎn)pBSmCN植株的危害率為62.5％，危害指數(shù)為21.9；轉(zhuǎn)pBTmCN植株危害率為80％，危害指數(shù)為35；轉(zhuǎn)pBI121植株危害率100％，危害指數(shù)為76，與未轉(zhuǎn)化植株的危害指數(shù)61.4相當(dāng)。轉(zhuǎn)pBSmCN植株和轉(zhuǎn)pBTmCN植株表現(xiàn)出了良好的抗黃褐麗金龜幼蟲的特性。
銅綠麗金龜幼蟲對供試轉(zhuǎn)基因植物的危害程度、危害指數(shù)見附圖19、20。轉(zhuǎn)pBSmCN植株危害率為70％，危害指數(shù)為25.0；轉(zhuǎn)pBTmCN植株危害率為50％，危害指數(shù)為12.5，低于轉(zhuǎn)pBSmCN植株；轉(zhuǎn)pBI121植株危害率為100％，危害指數(shù)為62.8，與未轉(zhuǎn)化植株危害指數(shù)75.0相當(dāng)。從附圖21可見轉(zhuǎn)pBTmCN植株和轉(zhuǎn)pBI121植株相比表現(xiàn)出了良好的抗銅綠麗金龜幼蟲的特性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明涉及對鞘翅目害蟲高毒力的Bt cry8Ca基因。通過對cry8Ca基因的人工改造，使該基因更適于在植物中表達，并且將兩個氨基酸位點突變后，顯著提高了Cry8Ca蛋白的殺蟲活性；將該基因構(gòu)建植物表達載體，轉(zhuǎn)化各種農(nóng)作物、草坪草和花卉，可以提高植物抗地下害蟲的能力，解決地下害蟲不易防治的難題。如果將cry8Ca基因與cry1Ab、cry1Ba等基因構(gòu)建雙抗載體，將擴大對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲的殺蟲譜，并且可以克服或延緩昆蟲對轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。
此外，將根特異性啟動子與mcry8Ca基因相連構(gòu)建植物表達載體，使基因在根組織特異表達，而在地上部分沒有表達，這樣可以避免更多的轉(zhuǎn)基因生物安全性問題，有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的cry8Ca基因序列，可以廣泛應(yīng)用于煙草、花生、馬鈴薯、玉米、草坪草等雙子葉植物和單子葉植物的轉(zhuǎn)基因研究和生產(chǎn)，提高轉(zhuǎn)基因植物對地下有關(guān)害蟲的毒性。


圖1為HBF-1菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果。其中，道1為菌株HBF-1；道2為標(biāo)準(zhǔn)Marker依次為1440，961，736，585，481，341，258，159，105bp。
圖2為HBF-1菌株P(guān)CR產(chǎn)物EcoO109I/DraI雙酶切電泳圖。其中，道1菌株HBF-1；道2為標(biāo)準(zhǔn)Marker。
圖3為pSAS001的限制酶切檢測與PCR鑒定。其中，道1為pSAS001的PCR產(chǎn)物；道2為pSAS001的BamHI與SalI的酶切產(chǎn)物；道3為pSAS001的BamHI的酶切產(chǎn)物；道4為pSAS002的PCR產(chǎn)物；道5為pSAS002的BamHI與SaLI的酶切產(chǎn)物；道6為pSAS002的BamHI的酶切產(chǎn)物；道M為Lamda DNA/Eco1301 Marker，依次為19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925，421，71bp。
圖4為pSK001表達載體的酶切分析。其中，道1為M1λDNA-Eco130I；道2為pSK001BamHI/SalI酶切；道3為pSAS001 BamHI/SalI酶切。
圖5為HD73-和pSK001營養(yǎng)體、芽孢形態(tài)和晶體形態(tài)。其中，左為HD73-無晶體突變株營養(yǎng)體和芽孢形態(tài)；右為pSK001轉(zhuǎn)入表達載體pSK001后有晶體產(chǎn)生時的形態(tài)。
圖6為表達載體在BT中表達蛋白的SDS-PAGE分析。其中，道1為大分子量蛋白Marker；道2為載體pSK001；
道3為CK HD73-。
圖7為cry8Ca2基因與mcry8Ca基因的序列比較。
圖8為cry8Ca基因與mcry8Ca基因GC含量比較。
圖9為pBSmCN質(zhì)粒的酶切鑒定。其中，道1為λ/Eco130I；道2為p3Z-mCry8 plasmid；道3為pBSmCN/HindIII+EcoRI；道4為pBSmCN/BamHI+EcoRI。
圖10為pBSmCN質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜。
圖11為p3Zpro質(zhì)粒的酶切鑒定。其中，道1為λ/Ecol30I；道2為TobRB7啟動子PCR擴增；道3為3Z/XbaI+BamHI；道4為p3z-pro/XbaI+BamHI；道5為質(zhì)粒p3z-pro。
圖12p3Zpro質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜。
圖13為pBTmCN質(zhì)粒的酶切鑒定。其中，道1為λ/Eco130I；道2為p3Z-Nos/EcoRI+SacI；道3為pp3Z-PN/XbaI+BamHI；道4為p3Z-PN/SalI+EcoRI；道5為pBPN/SalI+EcoRI；道6為pBPN/HindIII+EcoRI；道7為pBTmCN/HindIII+EcoRI；道8為pBTmCN/SalI+EcoRI。
圖14為pBTmCN質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜。
圖15為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化鑒定。其中，道1為λ/Eco130I；道2-道9為提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒的PCR鑒定；道10為CK-。
圖16為轉(zhuǎn)化煙草植株的PCR檢測結(jié)果。其中，道1-道3為轉(zhuǎn)化煙草的PCR檢測；道4為λ/Eco130I；道5為CK-；道6-道10為轉(zhuǎn)化煙草的PCR檢測；道11為CK+。
圖17為黃褐麗金龜幼蟲對轉(zhuǎn)mcry8Ca基因煙草各級危害程度比較。
圖18為黃褐麗金龜幼蟲對轉(zhuǎn)mcry8Ca基因煙草危害指數(shù)比較。
圖19為銅綠麗金龜幼蟲對轉(zhuǎn)mcry8Ca基因煙草各級危害程度比較。
圖20為銅綠麗金龜幼蟲對轉(zhuǎn)mcry8Ca基因煙草危害程度比較。
圖21為銅綠麗金龜對轉(zhuǎn)基因煙草的危害程度比較。其中，A.轉(zhuǎn)pBI121載體的煙草；B.轉(zhuǎn)pBTmCN載體的煙草。
具體實施方案以下敘述本發(fā)明的實施例。應(yīng)該說明，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。
實施例1、cry8Ca2基因的鑒定與克隆本發(fā)明通過利用cry基因的CAPS鑒定體系，鑒定了Bt菌株HBF-1中包含cry8類基因。利用cry8類基因的通用引物進行PCR擴增，可以擴增出1212bp的陽性條帶(見附圖1)；用EcoO109I和DraI雙酶切PCR產(chǎn)物有四條帶，分別為613bp、310bp、197bp和92bp(見附圖2)，該帶型與已知的cry8Ca1基因的帶型一致，證明在菌株HBF-1中含有cry8C基因。
提取菌株HBF-1的總DNA，以總DNA為模板，以cry8Ca1基因序列的5’端和3’端序列設(shè)計全長引物，用pfuDNA聚合酶PCR擴增，得到3.5Kb的片段，連接載體pET21b，得到質(zhì)粒pSAS001，測序結(jié)果表明，新克隆片段與cry8Ca1基因在2315位由G變?yōu)锳，相應(yīng)的氨基酸由S變?yōu)镹，氨基酸的同源性為99.91％(見表1)。
表1基因cry8Ca1和基因cry8Ca2的比較結(jié)果基因 GenBank中的 GenBank中的 第2314-2316 第772個氨 核苷酸同蛋白質(zhì)同核苷酸編號 蛋白質(zhì)編號核苷酸 基酸 源性源性cry8Ca1U04366 AAA21119 AGT S(Ser) 99.97％ 99.91％cry8Ca2AY518201 AAR98783 AAT N(Asn)實施例2、cry8Ca2基因在Bt中表達為驗證克隆的cry8Ca2基因是否具有殺蟲活性，將cry8Ca2基因的全基因片段在大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體pSXYkm中表達。用SalI/BamHI消化pSAS001，回收3.4kb的基因片段，用SalI/BamHI同樣消化載體，回收載體。連接載體與目的片段，轉(zhuǎn)化JM110，得到穿梭表達載體pSK001的轉(zhuǎn)化子。表達載體限制性內(nèi)切酶酶切分析見附圖4。
提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化SCS110進行修飾，提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化HD73-，得到的轉(zhuǎn)化子可以表達cry8Ca基因。1/2LB培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)36hrs，鏡檢可以看到球型晶體(見附圖5)，SDS-PAGE分析可以檢測到130KD的蛋白(見附圖6)。
實施例3、cry8Ca2基因的生物活性檢測如下表2所示，Bt菌株HBF-1對銅綠麗金龜幼蟲的殺蟲毒力最高，14天調(diào)查結(jié)果是當(dāng)濃度為80μg/g土?xí)r其死亡率為100％，轉(zhuǎn)cry8Ca基因的HD-73-菌的殺蟲毒力低于HBF-1菌株，當(dāng)濃度為160μg/g土?xí)r其14天校正死亡率達63.3％，但顯著高于無晶體突變株HD-73-，說明克隆的cry8Ca2基因?qū)︺~綠麗金龜幼蟲具有殺蟲活性。
表2 Cry8Ca蛋白對銅綠麗金龜幼蟲的生物活性菌株濃度μg/g土7天14天校正死亡率(％)校正死亡率(％)8050.0 100HBF-1 4053.3 85.72030.0 43.31038.3 43.35 13.3 28.3160 38.3 63.3HD-73-(cry8Ca) 8025.0 51.7
40 25.0 36.720 13.3 28.310 15.0 28.31608.3 13.3HD-73-(受體菌) 8008.340 05.020 0010 00空白對照(水)- --實施例4、cry8Ca2基因的隨機突變以質(zhì)粒pSAS001為模板，用引物對s8ca5/s8c3 PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物構(gòu)建至Bt-E.coli穿梭表達載體pSXYkm，得到一系列不同的克隆，提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化SCS110進行修飾，提取質(zhì)粒，純化，電擊轉(zhuǎn)化HD73-，得到的轉(zhuǎn)化子可以表達cry8Ca基因。對轉(zhuǎn)不同轉(zhuǎn)化子的HD-73-菌的殺蟲活性進行檢測，其中有兩個位點的突變可以提高Cry8Ca蛋白的殺蟲活性，分別是第439位的Q(Gln)突變?yōu)镻(Pro)和第642位的E(Glu)突變?yōu)镚(Gly)。
實施例5、cry8Ca2基因的人工改造根據(jù)植物和微生物密碼子偏好性不同、微生物核苷酸序列中有多個ATTTA多聚核苷酸加尾信號和不同密碼子的使用頻率的差異，根據(jù)本發(fā)明上述方法對cry8Ca2基因進行了人工改造，改造的cry8Ca2基因缺失了cry8Ca2基因3’端的1.5Kb的序列，核苷酸的同源性只有86.88％，G+C含量也由原來cry8Ca2的37％提高為46％(附圖8)，密碼子的使用頻率得到了優(yōu)化(表3)。
表3密碼子在植物、蘇云金芽孢桿菌和改造基因中的使用頻率比較



實施例6、植物表達載體的構(gòu)建本發(fā)明在人工改造的mcry8Ca基因兩端引入了BamHI和KpnI位點，連在pUC19載體上。本發(fā)明構(gòu)建了兩個植物表達載體pBSmCN和pBTmCN，構(gòu)建圖譜見附圖10、14，電泳檢測結(jié)果見附圖9、13。pBmCN的構(gòu)建方法是把組成型啟動子CaMV35S、改造的mcry8Ca基因和NOS終止子構(gòu)建到雙元載體pBI121上，并由mcry8Ca基因替換原來載體上的GUS基因。
pBTmCN載體的構(gòu)建過程是首先根據(jù)本發(fā)明以上所述的文獻報道的煙草根特異性啟動子TobRB7序列設(shè)計引物，5’引物在基因的-669至-646位，3’引物在基因的+48至+71位，且為方便以后的構(gòu)建工作，在引物的兩端分別引入XbaI位點和BamHI位點，引物序列如下XbaITobRB7-P1FATTCTAGACACCCGAAAGGAAATGATTCGTTCBamHITobRB7-P1RATGGATCCGTTCTCACTAGAAAAATGCCCCAA以煙草基因組DNA為模板，PCR擴增得到740bp的條帶，回收，用XbaI和BamHI酶切，構(gòu)建至質(zhì)粒pGEM 3Zf(+)，得到質(zhì)粒p3Zpro。測序結(jié)果表明，克隆的TobRB7啟動子與報道的TobRB7基因相比，在-340位少了一個A，-359位中的A被T代替。通過啟動子-報告基因檢測啟動子活性，可以看到新克隆的TobRB7啟動子可以驅(qū)動報告基因GUS在轉(zhuǎn)基因煙草的根中特異表達，證明新克隆的TobRB7啟動子具有驅(qū)動活性，并具有組織特異性。
用SacI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pBI121，回收0.26Kb的小片段，同樣雙酶切質(zhì)粒pGEM-3Zf(+)，連接，把得到的陽性轉(zhuǎn)化子命名為p3Z-Nos；用XbaI和BamHI酶切p3Zpro，回收啟動子740bp的片段，連接到同樣酶切的載體p3Z-Nos中，構(gòu)建得到質(zhì)粒p3Zpronos；用SalI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒p3Zpronos，回收1Kb的小片段，農(nóng)桿菌-大腸桿菌穿梭的雙元載體pBin19用SalI和EcoRI雙酶切，與回收的1Kb小片段連接，把得到的轉(zhuǎn)化子命名為pBpronos；用BamHI和KpnI雙酶切質(zhì)粒pUCmcry8，回收2.0Kb的片段，質(zhì)粒pBpronos同樣用BamHI和KpnI雙酶切，回收大片段，連接，轉(zhuǎn)化JM110，把得到的重組質(zhì)粒命名為pBTmCN。
實施例7、植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌采用凍融直接轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的質(zhì)粒pBTmCN、pBSmCN轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。轉(zhuǎn)化子在卡那霉素100μg/ml和鏈霉素125μg/ml的雙抗性YEB培養(yǎng)基的平板上篩選。隨機選取轉(zhuǎn)化得到的克隆，少量提取質(zhì)粒DNA進行PCR擴增驗證，證明兩種質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(附圖15)。
實施例8、植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草煙草轉(zhuǎn)化采用葉盤法(Horsch RB，1986，Proc Natl Acad SciU S A.83(8)2571-5)，轉(zhuǎn)化外植體取培養(yǎng)的煙草無菌苗頂部幼嫩葉片。共培養(yǎng)三天后，轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+100μg/ml Kn+500μg/ml Cb+3mg/ml 6-BA+0.2mg/ml NAA)進行見光分化，2周后，在葉片邊緣有綠色愈傷點出現(xiàn)，而大部分轉(zhuǎn)化體則可以直接分化出抗性芽，抗性芽長到2-3cm時，移至生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+100μg/ml Kn+500μg/ml Cb)生根，約2周后可生出細(xì)嫩小根，逐漸成苗。
實施例9、轉(zhuǎn)化煙草的分子檢測提取轉(zhuǎn)化煙草的基因組DNA，取1μg基因組DNA做模板，引物序列如下30595′-GCTAATTCTCGTATCGCTGTTGAGT30605′-TTGCGACCCTGAGATTGATAACTTGPCR擴增的反應(yīng)條件為94℃，5分鐘，1cycle；94℃，1分鐘，56℃，1分鐘，72℃，2分鐘，30個循環(huán)，電泳結(jié)果如附圖16所示。
實施例10、轉(zhuǎn)基因煙草的生物活性檢測將銅綠麗金龜(Anomala corpulenta)和黃褐麗金龜(A.exoleta)兩種在我國北方危害比較嚴(yán)重的金龜子采用群體種植和群體接蟲的方法，進行生物測定。在大田土中采用分別種植轉(zhuǎn)pBSmCN和轉(zhuǎn)pBI121載體的煙草植株以及混合種植轉(zhuǎn)pBSmCN、pBI121、pBTmCN、pBTGN(TobRB7啟動子+GUS基因)載體的轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)化植株的種植方法，每個處理12株。
將轉(zhuǎn)基因煙草12株分別種植在48×33×13cm的塑料盒子中，土壤深度12cm。每個植株接20天齡的黃褐麗幼蟲5頭或15天齡的銅綠麗金龜幼蟲5頭。
在接蟲15天時，按照本發(fā)明上述的分級標(biāo)準(zhǔn)，對各種煙草植株進行統(tǒng)一分級，并計算危害率和危害指數(shù)。
按照建立的危害程度分級標(biāo)準(zhǔn)，黃褐麗金龜幼蟲對供試轉(zhuǎn)基因植物的危害程度、危害指數(shù)見附圖17、18。可見轉(zhuǎn)pBSmCN植株的危害率為62.5％，危害指數(shù)為21.9；轉(zhuǎn)pBTmCN植株危害率為80％，危害指數(shù)為35；轉(zhuǎn)pBI121植株危害率100％，危害指數(shù)為76，與未轉(zhuǎn)化植株的危害指數(shù)61.4相當(dāng)。轉(zhuǎn)pBSmCN植株和轉(zhuǎn)pBTmCN植株表現(xiàn)出了良好的抗黃褐麗金龜幼蟲的特性。
銅綠麗金龜幼蟲對供試轉(zhuǎn)基因植物的危害程度、危害指數(shù)見附圖19、20。轉(zhuǎn)pBSmCN植株危害率為70％，危害指數(shù)為25.0；轉(zhuǎn)pBTmCN植株危害率為50％，危害指數(shù)為12.5，低于轉(zhuǎn)pBSmCN植株；轉(zhuǎn)pBI121植株危害率為100％，危害指數(shù)為62.8，與未轉(zhuǎn)化植株危害指數(shù)75.0相當(dāng)。轉(zhuǎn)pBTmCN植株和轉(zhuǎn)pBSmCN植株表現(xiàn)出了良好的抗銅綠麗金龜幼蟲的特性。附圖21直觀地顯示了轉(zhuǎn)pBTmCN植株和轉(zhuǎn)pBI121植株相比表現(xiàn)出的良好的抗銅綠麗金龜幼蟲特性。
附本發(fā)明所涉及的DNA序列和蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO 1(mcry8Ca基因的核苷酸序列)atgagcccaa acaatcaaaa cgagtacgaa attatcgacg ctctctcacc cacttccgtt60tccgataact ctattcgtta tcctctcgcc aatgaccaaa ccaacacact ccagaatatg120aactacaaag attatctgaa gatgaccgaa tcaacaaacg ctgagttgtc tcgcaacccc180gggacattta ttagtgctca ggacgctgtt ggaactggaa ttgatattgt tagcactatc240atcagtggtc tcggcattcc agtgcttggg gaagtcttct caattctggg ttcactcatt300ggcctcttgt ggccctcaaa taacgaaaac gtttggcaaa tctttatgaa ccgcgtggag360gagttgattg accaaaaaat cctcgattcc gtccgttcaa gggccattgc agacctcgct420aattctcgta tcgctgttga gtactaccag aacgcccttg aagactggag gaagaaccca480cacagcacac gcagcgcagc ccttgtgaag gaaagattcg gaaacgcaga ggccattctc540cgtactaata tgggttcatt ttctcaaacc aactatgaga ctccactcct ccccacatac600gcccaggccg cctccctgca tttgcttgtt atgagggatg ttcaaattta cggcaaggaa660tggggatatc ctcagaacga cattgacttg ttttacaaag aacaagtctc ttataccgct720agatactccg atcactgcgt ccaatggtac aacgctggtc tcaataagct cagaggaacc780ggtgctaagc agtgggtgga ctataaccgt ttccgccgtg agatgaacgt gatggttttg840gatttggttg cactcttccc aaactacgac gctcgtatct acccactgga aacaaatgcc900gaacttacaa gagagatttt cacagatcct gttggaagtt acgtgactgg acaatcgagc960acccttatct cttggtacga catgattcca gcagctcttc cttcattttc aaccctcgag1020aacttgcttc gtaaacctga tttctttact ttgctgcaag aaattaggat gtatacaagt1080ttcagacaga acggcaccat tgaatactat aactactggg gaggacaaag gctcaccctt1140tcctatatct acggttcctc attcaataag tatagcgggg ttcttgccgg tgctgaggac1200attattcctg tgggtcaaaa cgatatttac agggttgttt ggacttacat cggaaggtac1260accaacagtc tgttgggagt caacccagtt actttttact tcagcaataa cacacctaaa1320acttattcga agccaaagca attcgctggt ggaatcaaaa caattgactc cggcgaggaa1380ctcacttacg aaaactacca atcttatagt cacagggtta gctacattac atcttttgag1440atcaagagta ccggtggtac agtgctcgga gttgttccta tcttcggttg gacccatagc1500agtgccagcc gcaacaattt tatttacgca acaaaaatct cacagatccc aatcaacaag1560gccagtagaa ctagcggtgg agctgtttgg aacttccaag aaggtttgta caacggagga1620cctgtcatga aactctccgg ctctggttcc caagttatca atctcagggt cgcaacagat1680gccaagggag caagccagcg ttatcgtatt agaatcagat acgcctctga ccgtgctggt1740aagtttacca tctcctccag atctccagag aaccctgcaa cctattcagc ttccattgct1800tacacaaaca ctatgtccac aaacgcttct ttgacctata gtactttcgc ctacgcagaa1860tctggcccta tcaatctcgg gatttcggga agctcaagga cttttgatat ctccattaca1920aaaggtgccg gtgctgctaa cctttatatt gacagaattg aatttattcc agttaacacc1980ctcttcgaag cagaggaaga cttggatgtg gccaagaagg ctgtgaatgg cttgttcacc2040taa 2043SEQ IDNO 2(mcty8Ca基因的氨基酸序列)MSPNNQNEYE IIDALSPTSV SDNSIRYPLA NDQTNTLQNM NYKDYLKMTE STNAELSRNP60GTFISAQDAV GTGIDIVSTI ISGLGIPVLG EVFSILGSLI GLLWPSNNEN VWQIFMNRVE120
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權(quán)利要求
1.一種Bt基因cry8Ca的人工合成序列，其特征是該序列具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
2.一種對昆蟲具有活性的蛋白質(zhì)，其特征是該蛋白質(zhì)是由權(quán)利要求1的核苷酸序列所編碼，且具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種植物表達載體，其特征是該植物表達載體含有權(quán)利要求1的基因序列和一種可在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穿梭的雙元載體。
4.一種植物表達載體，其特征是該植物表達載體含有權(quán)利要求1的基因序列和一種可以在大腸桿菌中表達的載體。
5.一種轉(zhuǎn)化植物使之表現(xiàn)出對昆蟲毒性的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求3的植物表達載體。
6.一種轉(zhuǎn)化植物使之表現(xiàn)出對昆蟲毒性的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求4的植物表達載體。
全文摘要
本發(fā)明為“一種人工合成的對鞘翅目害蟲高毒力的Bt cry8基因序列”，屬生物防治技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及對鞘翅目地下害蟲高毒力的Bt cry8Ca基因的人工改造核苷酸序列、核苷酸突變序列和缺失片段，涉及可提高Bt cry8Ca基因抗蟲活性的氨基酸突變序列，涉及該氨基酸序列包含的編碼蛋白質(zhì)的活性區(qū)序列、表達盒；本發(fā)明進一步涉及利用人工改造的cry8Ca基因序列和基因片段構(gòu)建的表達載體，和使用該載體和人工改造的cry8Ca基因構(gòu)建工程菌和轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明可使轉(zhuǎn)基因植物對鞘翅目地下害蟲產(chǎn)生抗性，可用于植物地下蟲害的防治。
文檔編號C07K14/195GK1609220SQ20041000980
公開日2005年4月27日 申請日期2004年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者郎志宏, 宋福平, 馮書亮, 張 杰, 王容燕, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所