專利名稱：融合型幽門螺桿菌粘附素基因工程疫苗的構(gòu)建及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及融合型幽門螺桿菌粘附素基因工程疫苗的構(gòu)建及其制備方法背景技術(shù)幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是定植于人胃粘膜的革蘭氏陰性螺桿菌，是導(dǎo)致慢性感染最常見的病原微生物之一，全世界約有50％以上的人感染過Hp。大多數(shù)的感染者平時無任何癥狀，但約有30％的感染者發(fā)展為慢性胃炎，10-20％的人發(fā)展為消化性潰瘍(胃潰瘍和十二指腸潰瘍)，還有部分感染者可以在慢性活動性胃炎的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)胃粘膜萎縮和腸上皮化生，其中有少數(shù)人還可以發(fā)展為胃癌。對于Hp的抗感染治療尚存在較大問題，單劑藥物治療根除率低，而使用多聯(lián)藥物費用昂貴，治愈率不高且不能有效阻止Hp再感染和復(fù)發(fā)，此外，耐藥菌株的增加也使抗Hp治療面臨越來越復(fù)雜的難題。
由于抗生素治療的局限性，人們開始探索用免疫手段防治Hp感染的可能性。隨著該菌功能蛋白的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)基因的克隆及動物模型的不斷完善，Hp疫苗研制的可行性大大提高，其中基因工程尿素酶亞單位疫苗已進入II期臨床試驗階段。目前采用的基因重組抗原有尿素酶、VacA、CagA、熱休克蛋白等，它們基本上著眼于阻斷Hp的毒力因素。由于粘附素與Hp定植密切相關(guān)，在Hp致病過程中的重要作用也使其越來越受到重視。
Hp的粘附素是位于菌體表面、能與胃上皮細胞發(fā)生特異性粘附引起病理損害一組蛋白分子。Evans等首先證明N-乙酰神經(jīng)氨酰乳糖結(jié)合原纖維血凝素(N-acetylneuraminyl-lactose-binding haemagglutinin，NLBH)是Hp的主要粘附素之一，可與胃粘膜上皮細胞上的特異性受體結(jié)合，使Hp緊密粘附于胃上皮細胞，發(fā)揮對胃粘膜的損傷作用。Evans等在研究粘附因子時獲得了約1.4Kbp的基因片段，通過序列分析發(fā)現(xiàn)，該片段含有ORF1、ORF2、ORF3三個開放閱讀框(ORF1360bp；ORF2549bp；ORF3177bp)。其中ORF2、ORF3之間有一天然的閱讀框內(nèi)連接，因此ORF2+ORF3構(gòu)成783bpHpaA基因，可編碼260aa組成的HpaA蛋白，其分子量約29,000Da?？贵w檢測和Western印跡證實該蛋白具有與NLBH亞單位相同的抗原特性以及植物血凝素結(jié)合的特點，認為該蛋白是NLBH的亞單位HpaA。
HpaA屬于外膜蛋白家族，具有十分保守的含KRTIQK6個氨基酸的涎酸乳糖結(jié)合域。我們通過基因分析12株Hp菌株710bp的HpaA基因進行分析，結(jié)果顯示HpaA核苷酸同源性致性＞94.4％，由核苷酸序列推定的氨基酸同源性＞96.8％，提示HpaA蛋白具有相對的保守性。Evans等用包含RTIQK的十二肽免疫動物所得抗血清能夠阻斷Hp與人紅細胞的凝集，表明該區(qū)域具有較理想的免疫原性。同時HpaA在所有的Hp菌株中表達，機體所產(chǎn)生抗HpaA抗體不與人體內(nèi)的正常菌群和粘膜組織發(fā)生交叉反應(yīng)，因此HpaA蛋白可作為Hp疫苗侯選亞單位組分之一。
大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)和霍亂毒素(CT)是現(xiàn)在研究較多的粘膜免疫佐劑。LT和CT分子結(jié)構(gòu)相似，由一個A亞單位和形成油煎餅狀的B亞單位五聚體組成，腸毒素活性主要與A亞單位相關(guān)，B亞單位第33位的甘氨酸殘基可以與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂末端的半乳糖結(jié)合，是LTB的活性結(jié)合位點，這一特征賦予LTB具有與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的能力，能與廣泛分布于哺乳動物細胞表面的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，通過介導(dǎo)受體之間的相互作用，使具有毒性的A亞單位內(nèi)在化和吸收。實驗證明LT和CT在動物實驗中具有粘膜免疫佐劑活性，能夠刺激產(chǎn)生針對共服抗原的分泌型IgA，并對同型病原微生物的再次感染具有保護作用。George等認為單獨的B亞單位也具有佐劑活性，是LT/CT具有免疫原性和佐劑活性的關(guān)鍵，因而LTB和CTB的佐劑活性越來越受到高度重視。將LTB或CTB與抗原結(jié)合在一起免疫動物或人體，可以發(fā)揮LTB及CTB的橋梁及錨定作用，有利于激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供工藝簡捷、免疫效果好、成本低、對人無害的融合型幽門螺桿菌粘附素基因工程疫苗的構(gòu)建及制備方法。
本發(fā)明采用了以下的技術(shù)路線和步驟一、原核表達載體的構(gòu)建1.引物設(shè)計合成如下(下劃線示酶切位點)根據(jù)GenBank公布的Hp HpaA、E.coli LT以及霍亂弧菌基因核苷酸序列設(shè)計引物，引入酶切位點。將linker序列設(shè)計在上游基因的3’端，同時在需融合的下游基因5’端引入BamHI位點。
LTB P15’-ccatggctccccagtctattacag-3’(NcoI)P25’-ggatcctgcggcgcgtagttttccatactgattgccg-3’(BamHI)CTB P35’-cccatgggatgattaaattaaaatttg-3’(NcoI)P45’-cgggatctgcggcgcgtaaacggtatgattaacgc-3’(BamHI)HpaAP55’-ggatcctacgaatgaagtcgctttgaaat-3’(BamHI)P65’-ctcgagtcggtttcttttgcc-3’(XhoI)
分別以大腸桿菌、霍亂弧菌及幽門螺桿菌基因組DNA為模板，用P1和P2擴增LTB基因，用P3和P4擴增CTB基因，用P5和P6擴增HpaA基因。
2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建將表達載體與LTB或CTB片段分別進行NcoI和BamHI雙酶切回收后，用連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒酶切鑒定，用NcoI和BamHI酶切，2.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
將含LTB或CTB的重組質(zhì)粒與HpaA進行BamHI和XhoI雙酶切回收后，按前述方法連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，分別采用NcoI+BamHI、BamHI+XhoI、NcoI+XhoI酶切組合進行鑒定。
3.高效表達融合蛋白工程菌的構(gòu)建及篩選將重組工程菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并鑒定后，接種于3mL含Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的工程菌按1％的比例轉(zhuǎn)種于20mL含Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)，以IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達形式和表達量，篩選高效表達菌株。
二、發(fā)酵及純化制備工藝(1)發(fā)酵發(fā)酵過程中種子菌10％接種，保持70％溶氧、溫度37℃、pH 7.0，在A600未達到2時補加補料，之后每3h流加補料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的終濃度分別為0.5％、0.2％和0.2％。在第3次補料后加入IPTG 500μmol/L誘導(dǎo)4h收菌。
(2)包涵體提取將高效表達的菌體200-500g以TE緩沖液1∶10(W/V)比例混懸浮，4℃預(yù)冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻。采用高壓均質(zhì)機在壓力為40～70Mpa的條件下破菌(共破菌4～6次)，破菌完畢后，取少量菌液涂片染色，顯微鏡觀察細胞的完整性，確保細胞破碎完全，隨后以500g離心25min，棄沉淀，再以15,000g離心40min，棄上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分別用洗滌液A和B各洗滌2次。洗滌條件為4℃攪拌20min，15,000g離心40min，收集包涵體沉淀；最后將包涵體用包涵體溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃攪拌3h，15,000g離心45min，取上清作為下一步純化的原料。
(3)包涵體復(fù)性用8mol/L尿素調(diào)整蛋白濃度為10-15mg/ml溶液在80-180分鐘內(nèi)緩慢加入復(fù)性緩沖液，4℃平衡48小時，然后用陰離子柱層析緩沖液A透析或經(jīng)超濾平衡去除復(fù)性緩沖液，得到重組蛋白。
(4)陰離子柱純化選擇陰離子柱進行初級純化，使用50mmol/L Tris在pH7.0～9.0條件下對目標(biāo)蛋白進行純化，采用NaCl梯度洗脫。
(5)凝膠過濾層析純化步驟(4)所獲目標(biāo)蛋白經(jīng)葡聚糖PEG透析袋內(nèi)濃縮或超濾濃縮后用凝膠過濾柱純化，用凝膠過濾平衡緩沖液平衡，收集目標(biāo)峰。
(6)將純化所獲LTB-HpaA或CTB-HpaA分別制備成液體劑型、冷凍干燥劑型及膠囊劑，供口服、注射或滴(噴)鼻使用。
步驟(1)所述的發(fā)酵過程在級聯(lián)溶氧控制的分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，流加補料。
步驟(1)所述的發(fā)酵過程使用培養(yǎng)基為改良M9-CAA培養(yǎng)基，在M9-CAA的基礎(chǔ)上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl 2·4H2O、2mg/L CoCl 2·4H2O、4mg/LFeSO4·16H2O、5mg/L H3BO3、1.6mg/L MnCl2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。
步驟(2)所述采用生產(chǎn)或中試純化中使用的高壓破菌技術(shù)，破菌至細菌破解率大于98％，差速離心獲得包涵體沉淀物。
步驟(2)所述包涵體溶解液使用6～8mol/L尿素或6～7mol/L鹽酸胍。
步驟(4)所述陰離子純化填料為Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL之一。
步驟(5)所述所用凝膠過濾層析柱為Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR10/30之一。
步驟(5)所述將離子交換層析的重組蛋白加入凝膠過濾平衡緩沖液中上柱并洗脫，至紫外吸收峰為零時停止。
步驟(6)中所述液體劑型、冷凍干燥劑型及膠囊劑型的制備方法為①將純化所獲LTB-HpaA或CTB-HpaA加上5％～20％的蛋白穩(wěn)定劑甘露醇或果糖或山梨醇，經(jīng)低溫冷凍干燥，或分裝入腸溶膠囊口服使用或經(jīng)純化水稀釋后直接口服；②將純化所獲LTB-HpaA或CTB-HpaA直接無菌過濾分裝或加入適當(dāng)比例(0.1％～0.5％)穩(wěn)定劑甘露醇混勻，無菌過濾分裝，冷凍干燥后待注射使用；③將純化所獲LTB-HpaA或CTB-HpaA加入穩(wěn)定劑制備為液體滴鼻劑或冷凍干燥后制備為噴鼻劑。
發(fā)明效果通過上述工藝處理不同批次的融合型幽門螺桿菌LTB-HpaA及CTB-HpaA融合蛋白，作12％SDS-PAGE，均呈現(xiàn)單一條帶，分子質(zhì)量分別約為39 KD和41 KD。HPLCC4柱分析均呈現(xiàn)單一的峰，純度在95％以上，N端15個氨基酸序列與預(yù)期一致。不同批次融合蛋白圖譜各峰峰數(shù)均保持一致，各峰的保留時間均在±10s內(nèi)波動，肽圖譜重視性好。動物試驗證明LTB-HpaA和CTB-HpaA以不同途徑和劑型免疫小鼠和沙鼠可有效刺激機體產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答和免疫預(yù)防保護作用。
圖1 rLTB-HpaA純度分析和UVP掃描曲線圖2 rLTB-HpaA純化標(biāo)本HPLC純度檢測結(jié)果圖3 rHpaA-LTB UVP測定相對分子量報告圖4 連續(xù)三批rLTB-HpaA純化樣品肽圖分析結(jié)果具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細描述實施例一、LTB/HpaA基因工程疫苗的構(gòu)建及制備方法一、基因工程菌的構(gòu)建1、引物設(shè)計與合成分別以野生型產(chǎn)毒大腸桿菌H44815(購自中國藥品生物制品檢定所，本室保存)、幽門螺桿菌SS1(Hp悉尼株，澳大利亞Lee A等命名，本室保存)基因組DNA為模板，用P1和P2、P5和P6擴增LTB、HpaA基因，細菌基因組抽提按常規(guī)方法(顏子穎，王海林譯.精編分子生物學(xué)實驗指南.科學(xué)出版社，1998，P39)進行。PCR擴增體系為10×不含鎂離子擴增緩沖液10μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTPs(2.5mmol/L each)8μL，上下游引物(P1和P2或P5和P6)各2μL，上述LTB基因組2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(3單位/μL)1μL，加滅菌水至100μL。
PCR擴增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s，35個循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建將載體pET28a(購自美國Novagen公司，本室保存)與LTB片段分別進行NcoI和BamHI雙酶切回收后，LTB純化回收產(chǎn)物2μL，載體片段1μL，酶連接緩沖液5μL，加滅菌水至10μL，16℃連接16小時。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒酶切鑒定，用NcoI和BamHI酶切，2.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定的結(jié)果可見，除5kb左右的載體條帶，還可看見約320bp的LTB條帶，說明LTB已插入了載體(pET28a-LTB)。
將含LTB的重組質(zhì)粒與HpaA進行BamHI和XhoI雙酶切回收后，按前述方法連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，分別采用NcoI+BamHI、BamHI+XhoI、NcoI+XhoI酶切組合進行鑒定，酶切條帶依次為320bp、690bp、1010bp，與實驗設(shè)計的酶切片段大小相符。核苷酸序列測定證明重組融合質(zhì)粒構(gòu)建成功(pET28a-LTB/HpaA)，核苷酸序列測定采用DNA自動測序儀，在專業(yè)DNA測序公司完成。
3.融合蛋白的表達及鑒定將重組工程菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并鑒定后，接種于3mL Kan+LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1％的比例轉(zhuǎn)種于20mL Kan+LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)(200r/min)待OD600≈0.8時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L開始誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達。
超聲破菌和包涵體洗滌證實融合蛋白LTB-HpaA以包涵體形式表達，表達量約占全菌的25.6％，western blotting顯示融合蛋白具有與兔抗Hp、LTB血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的能力。
二、發(fā)酵與純化根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的融合型幽門螺桿菌粘附素工程菌，通過高密度發(fā)酵，目標(biāo)蛋白表達率為23％，離心收集菌體，將其懸浮于10倍體積的TE緩沖液中，經(jīng)高壓均質(zhì)破菌后，差速離心收集包涵體，包涵體洗滌后溶解于包涵體溶解液中(1mmol/L EDTA、20mmol/LTris、10mmmol/LDTT、8mol/L尿素pH7.0～9.0)。復(fù)性后的樣品選擇陰離子柱Q SepharoseFF進行初級純化，使用50mmol/L Tris在pH 7.0～9.0條件下對目標(biāo)蛋白進行純化，采用NaCl梯度洗脫，收集目標(biāo)峰樣品經(jīng)超濾濃縮后用凝膠過濾柱Superdex 75純化，平衡緩沖液使用50mmol PB，50mmol NaCl和1mmol EDTA pH7.0～9.0收集目標(biāo)峰。12％SDS-PAGE，目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)單一條帶，分子質(zhì)量約為39KD。HPLC C4柱分析呈現(xiàn)單一的峰，純度為95.3％。
三、劑型制備上述方法獲得的重蛋白分別被制備成液體劑型、冷凍干燥劑型或膠囊劑。其中液體劑型供口服、滴鼻或注射使用；冷凍干燥劑型加純化水或注射用水溶解后供口服、滴鼻或注射使用；膠囊劑型供口服使用。液體劑型制備方法為向純化所獲得的LTB-HpaA中加入適當(dāng)比例(0.1％～0.5％)的穩(wěn)定劑甘露醇，混勻，除菌過濾后分裝，其中用于滴鼻的液體劑型中還加入1％的卡泊波(carbopol)；冷凍干燥劑型制備方法為向純化所獲得的LTB-HpaA中加入適當(dāng)比例(5％～20％)的穩(wěn)定劑甘露醇(果糖或山梨醇)，混勻，除菌過濾分裝后冷凍干燥；膠囊劑型制備方法為首先向純化所獲得的LTB-HpaA中加入適當(dāng)比例(5％～20％)的穩(wěn)定劑甘露醇，混勻，除菌過濾分裝后冷凍干燥，再裝填入腸溶膠囊。
四、動物試驗將不同劑型LTB-HpaA直接口服、滴鼻或注射免疫BALB/c小鼠，能刺激小鼠產(chǎn)生特異性sIgA分泌，蒙古沙鼠攻毒保護試驗證實不同劑型LTB-HpaA能有效誘導(dǎo)沙鼠預(yù)防Hp感染，保護率為80％以上。
實施例二、CTB/HpaA基因工程疫苗的構(gòu)建及制備方法一、基因工程菌的構(gòu)建1、引物設(shè)計與合成分別以大腸桿菌0139(來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC31165)、幽門螺桿菌SS1基因組DNA為模板，用P3和P4、P5和P6擴增CTB、HpaA基因，基因組抽提方法同實施例一。PCR擴增體系為10×不含Mg+離子擴增緩沖液10μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTPs(2.5mmol/L each)8μL，上下游引物(P1和P2)各2μL，上述CTB基因組2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(3單位/μL)1μL，加滅菌水至100μL。
PCR擴增反應(yīng)94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s，35個循環(huán)，72℃完全延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建將載體pET28a與CTB片段分別進行NcoI和BamHI雙酶切回收后，LTB純化回收產(chǎn)物2μL，載體片段1μL，酶連接緩沖液5μL，加滅菌水至10μL，16℃連接16小時。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒酶切鑒定，用NcoI和BamHI酶切，2.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定的結(jié)果可見，除5kb左右的載體條帶，還可看見約370bp的LTB條帶，說明CTB已插入了載體(pET28a-CTB)。
將含CTB的重組質(zhì)粒與HpaA進行BamHI和XhoI雙酶切回收后，按前述方法連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，分別采用NcoI+BamHI、BamHI+XhoI、NcoI+XhoI酶切組合進行鑒定，酶切條帶依次為370bp、690bp、1060bp，與實驗設(shè)計的酶切片段大小相符。核苷酸序列測定證明重組融合質(zhì)粒構(gòu)建成功(pET28a-CTB/HpaA)。
3.融合蛋白的表達及鑒定將重組工程菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并鑒定后，接種于3mL Kan+LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1％的比例轉(zhuǎn)種于20mL Kan+LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)(200r/min)待OD600≈0.8時，加入IPTG至終濃度為1mmol/L開始誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達。
超聲破菌和包涵體洗滌證實融合蛋白CTB-HpaA以包涵體形式表達，表達量約占全菌的20％，western blotting顯示融合蛋白具有與兔抗Hp、CTB血清發(fā)生反應(yīng)的能力。
二、發(fā)酵與純化根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的融合型幽門螺桿菌粘附素工程菌，通過高密度發(fā)酵，目標(biāo)蛋白表達率為20％，離心收集菌體，將其懸浮于10倍體積的TE緩沖液中，經(jīng)高壓均質(zhì)破菌后，離心收集包涵體，包涵體洗滌后溶解于包涵體溶解液中(1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、10mmmol/L DTT、8mol/L 尿素，pH7.0～9.0)。復(fù)性后的樣品選擇陰離子柱Q SepharoseHP進行初級純化，使用50mmol/L Tris在pH 7.0～9.0條件下對目標(biāo)蛋白進行純化，采用NaCl梯度洗脫，收集目標(biāo)峰樣品經(jīng)超濾濃縮后用凝膠過濾柱Superdex 200純化，平衡緩沖液使用50mmol PB，50mmol NaCl和1mmol EDTA pH 8.0～9.0收集目標(biāo)峰。12％SDS-PAGE，目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)單一條帶，分子質(zhì)量約為41KD。HPLC C4柱分析呈現(xiàn)單一的峰，純度為97.8％。
三、劑型制備劑型種類及制備方法同實施例一。
四、動物實驗將不同劑型CTB-HpaA直接口服、滴鼻或注射免疫BALB/c小鼠，能刺激小鼠產(chǎn)生特異性sIgA分泌，蒙古沙鼠攻毒保護試驗證實不同劑型CTB-HpaA能有效誘導(dǎo)沙鼠預(yù)防Hp感染，保護率為80％以上。
以下是工藝所涉及的溶液配方以及發(fā)明效果的檢測(一)工藝所涉及的溶液配方1.TE緩沖液50mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 7.5-9.0。
2.包涵體洗滌液A5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.53.包涵體洗滌液B20mmol/L Tris、2mol/L Urea，pH 8.54.包涵體溶解液1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、10mmmol/L DTT、8mol/LUrea(pH 8.5)或6～7mol/L鹽酸胍。
5.復(fù)性緩沖液2mol/L Urea，Tris-HCl，50mmol/L NaCl pH8.56.陰離子柱層析緩沖液A50mmol/L Tris，pH 7.0～9.07.陰離子柱層析緩沖液B50mmol/L Tris，pH 7.0～9.08.凝膠過濾平衡緩沖液50mmol NaH2PO4，50mmol NaCl和1mmol EDTA pH7.0～9.0(二)發(fā)明效果的檢測1.層析樣品的純度分析①SDS-PAGE分析參見附圖1，采用12％SDS-PAGE分析，電泳后進行CBB染色。以UVP凝膠掃描分析儀分析目標(biāo)蛋白的純度。按常規(guī)方法制備12％SDS-PAGE膠(分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度5％)，樣品處理及電泳方法也按常規(guī)操作進行，電泳時加蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。以UVP凝膠成像系統(tǒng)進行掃描分析，rHpaA-LTB蛋白純度為96.8％。
②HPLC純度分析純化后的目標(biāo)蛋白經(jīng)SephadexG-25凝膠柱脫鹽復(fù)性處理，樣品置透析袋內(nèi)，HPLC流動相buffer(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)透析置換緩沖液，Lowry法測定蛋白質(zhì)含量后調(diào)整蛋白濃度為1mg/ml進行HPLC蛋白純度分析，分析條件如下(1)色譜柱OHpak SB-805HQ凝膠過濾柱，8.0mm I.D.×300mm；(2)流動相20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；(3)柱溫25℃；
(4)流速0.3ml/min；(5)洗脫時間40min；(6)檢測波長280nm；(7)上樣量10μl；結(jié)果HPLC C4柱分析呈現(xiàn)單一的峰，純化后目標(biāo)蛋白rLTB-HpaA純度為96.3％，參見附圖2。
2.相對分子量測定蛋白樣品處理同前所述，目標(biāo)蛋白上樣量控制在2～5ug，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)LMW作為參比，15％SDS-PAGE分析，電泳后進行CBB染色。UVP凝膠掃描分析儀分析其相對分子量，測得rLTB-HpaA相對分子量為38.531KD，參見附圖3。
3.HPLC肽圖分析連續(xù)三批次純化樣品，分別經(jīng)胰蛋白酶酶解后進行HPLC肽圖分析比較。
①色譜條件A.色譜柱Zorbax 300SB-C18，5μm，4.6mm I.D.×150mmB.保護柱Zorbax 300SB-C18，5μm，4.6mm I.D.×12.5mmC.流動相A相 1000ml超純水(含1％三氟乙酸)B相 1000ml乙腈(含0.9％1三氟乙酸)D.柱溫30℃E.檢測波長210nmF.流速1.0ml/minG.洗脫梯度B相0-65％(40min)H.進樣量100μl②酶解條件處理過(除去尿素、EDTA)的樣品1ml加入20μl胰蛋白酶溶液，37℃保溫10h，加入10μl三氟乙酸終止反應(yīng)，經(jīng)0.45μm孔徑濾膜過濾待用，同時做空白對照。
結(jié)果，在確定的酶解條件和色譜條件下，不同批次的rLTB-HpaA(批號為20021107、20021126、20021208)得到的肽圖譜各峰峰數(shù)均保持一致。不同批次融合蛋白圖譜各峰峰數(shù)均保持一致，各峰的保留時間均在±10s內(nèi)波動，肽圖譜重視性好，參見附圖4。
4.動物實驗①BALB/c小鼠免疫后特異性免疫應(yīng)答小鼠經(jīng)不同劑型rLTB-HpaA、rCTB-HpaA免疫后30天處死采取血液、胃沖洗液和腸沖洗液。用ELISA方法檢測針對粘附素rHpaA的特異性抗體。不同劑型的融合蛋白rLTB-HpaA組、rCTB-HpaA組及將CT和LTB作為外粘膜佐劑的CT+HpaA組和LTB+HpaA組中血清標(biāo)本、胃沖洗液和腸沖洗液中IgA和IgG含量明顯高于單獨HpaA組和緩沖液對照組，差異非常顯著(P＜0.01)。
②蒙古沙鼠口服免疫攻毒保護實驗將不同劑型rLTB-HpaA、rCTB-HpaA免疫(第1、2、4周各免疫1次)沙鼠，末次免疫后9天，以幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1株攻毒，攻毒后2周剖殺動物，進行細菌培養(yǎng)和病理切片檢查。結(jié)果對照組感染率為100％，各組接種保護率80％以上。
權(quán)利要求
1.一種融合型幽門螺桿菌粘附素基因工程疫苗的構(gòu)建及其制備方法，其特征在于首先，克隆LTB或CTB、HpaA基因，構(gòu)建融合LTB-HpaA或CTB-HpaA表達載體和高效表達菌株；然后，用發(fā)酵方式高密度表達融合蛋白；最后，采用包涵體提取，復(fù)性，離子交換層析、凝膠過濾層析純化技術(shù)的顆序組合，大量獲得LTB-HpaA或CTB-HpaA，并將該疫苗分別制備成口服劑、注射劑及滴/噴鼻劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是克隆LTB、CTB、HpaA基因的步驟在于設(shè)計合成以下引物L(fēng)TBP1 5’-ccatggctccccagtctattacag-3’(NcoI)P2 5’-ggatcctgcggcgcgtagttttccatactgattgccg-3’(BamHI)CTBP3 5’-cccatgggatgattaaattaaaatttg-3’(NcoI)P4 5’-cgggatctgcggcgcgtaaacggtatgattaacgc-3’(BamHI)HpaA P5 5’-ggatcctacgaatgaagtcgctttgaaat-3’(BamHI)P6 5’-ctcgagtcggtttcttttgcc-3’(XhoI)下劃線部分為酶切位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是構(gòu)建融合LTB-HpaA或CTB-HpaA表達載體和高效表達菌株的步驟是先將LTB或CTB與表達質(zhì)粒連接后，再與HpaA基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)酶切、測序分析得到含有LTB-HpaA和CTB-HpaA的重組表達質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是其發(fā)酵、純化包括下述順序的步驟(1)發(fā)酵發(fā)酵過程中種子菌10％接種，保持70％溶氧、溫度37℃、pH7.0，在A600未達到2時不加補料，之后每3h流加補料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的終濃度分別為0.5％、0.2％和0.2％，在第3次補料后加入IPTG 500μmol/L誘導(dǎo)4h收菌；(2)包涵體提取將高效表達的菌體200-500g以TE緩沖液按1∶10(W/V)比例混懸浮，4℃預(yù)冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻。采用高壓均質(zhì)機破菌4～6次，差速離心獲得包涵體沉淀。包涵體沉淀用包涵體洗滌液A、B各洗滌2次后溶解于包涵體溶解液中；(3)包涵體復(fù)性將8mol/L尿素液調(diào)整蛋白濃度為10-15mg/ml溶液在80-180分鐘內(nèi)緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4℃攪拌48小時，然后用陰離子柱層析緩沖液A透析或經(jīng)超濾平衡去除復(fù)性緩沖液，得到重組蛋白；(4)陰離子柱純化選擇陰離子柱進行初級純化，使用50mmol/L Tris在pH7.0～9.0條件下對目標(biāo)蛋白進行純化，采用NaCl梯度洗脫；(5)Superdex凝膠過濾層析純化步驟(4)所獲目標(biāo)蛋白經(jīng)葡聚糖PEG透析袋內(nèi)濃縮或超濾濃縮后用凝膠過濾柱Superdex純化，用凝膠過濾平衡緩沖液平衡。
5.如權(quán)利要求4中所述制備方法，其特征在于步驟(1)所述的發(fā)酵過程在級聯(lián)溶氧控制的分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，流加補料；發(fā)酵過程使用培養(yǎng)基為改良M9-CAA培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求4中所述制備方法，其特征在于步驟(2)所述采用生產(chǎn)或中試純化中使用的高壓破菌技術(shù)，破菌至細菌破解率大于98％，差速離心獲得包涵體沉淀物；包涵體溶解液使用6～8mol/L尿素或6～7mol/L鹽酸胍。
7.如權(quán)利要求4中所述制備方法，其特征在于步驟(4)所述陰離子純化填料為QSepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL之一；步驟(5)所述所用凝膠過濾層析柱為Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30之一，將離子交換層析的重組蛋白加入凝膠過濾平衡緩沖液中上柱并洗脫，至紫外吸收值為零時停止。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是將純化所獲LTB-HpaA或CTB-HpaA加上蛋白穩(wěn)定劑，經(jīng)低溫冷凍干燥，或分裝入腸溶膠囊口服使用或經(jīng)純化水稀釋后直接口服。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是將純化所獲LTB-HpaA或CTB-HpaA直接無菌過濾分裝或加入適當(dāng)比例穩(wěn)定劑混勻，無菌過濾分裝，冷凍干燥后待注射使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是將純化所獲LTB-HpaA或CTB-HpaA加入穩(wěn)定劑制為液體滴鼻劑或冷凍干燥后制備為噴鼻劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了融合型幽門螺桿菌粘附素基因工程菌疫苗的構(gòu)建及其制備方法，其特征在于用粘附素HpaA通過基因重組方法構(gòu)建幽門螺桿菌粘附素與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位或霍亂毒素B亞單位分子內(nèi)佐劑融合工程菌，經(jīng)過高密度發(fā)酵、包涵體提取、復(fù)性及純化大量獲得所需疫苗蛋白，該疫苗可以分別被制備成口服劑、注射劑及滴/噴鼻劑。該基因工程疫苗構(gòu)建方法獨特，制備工藝簡捷、容易放大、重復(fù)性好，所獲疫苗蛋白純度高，動物試驗證明可有效刺激機體產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答和免疫保護作用。
文檔編號C07K1/14GK1563388SQ20041002218
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者鄒全明, 劉正祥, 洪愉, 朱永紅, 童文德, 解慶華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)