專利名稱：重組幽門螺桿菌熱休克蛋白a基因工程疫苗制備中的純化工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥領域，具體涉及幽門螺桿菌熱休克蛋白A基因工程疫苗制備中的純化工藝。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種定植于胃內(nèi)的革蘭氏染色陰性、螺桿狀、微需氧菌，在全世界人群中感染率超過50％，是上消化道疾病如慢性胃炎、消化性潰瘍及非潰瘍性消化不良的主要致病因素，并且與胃部惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。
已知的Hp菌株都能產(chǎn)生兩種熱休克蛋白，即HspA和HspB。HspA由118個氨基酸組成，N端91個氨基酸與大腸桿菌GroES同源性很高，可以作為分子伴侶，在Hp蛋白合成、組裝中起重要作用；C端27個氨基酸區(qū)域為Hp所特有，富含組氨酸和半胱氨酸，是個鎳離子結合區(qū)域并與尿素酶活性相關。將hspA與尿素酶基因在大腸桿菌中共表達，尿素酶分解尿素的能力增強4倍以上?？傊?，HspA參與尿素酶的組裝和尿素酶活性的發(fā)揮，是Hp重要的致病因子之一。HspA是能夠激發(fā)機體產(chǎn)生保護性免疫應答最有效的抗原之一，是Hp亞單位疫苗的重要侯選成分。
幽門螺桿菌HspA是HSP家族成員GroES(Hsp 10)的同源蛋白，與其它細菌相比，Hp的HspA具有獨特性，在HspA的C末端(即HspA的b區(qū)域)包含有一個金屬離子結合位點。研究發(fā)現(xiàn)HspA與鎳離子結合的能力遠遠大于與鈷、鐵、鋅、銅離子的結合力(Kansau I，Guillain F，et al.Nickel binding andimmunological properties of the c-terminal domain of the Helicobacterpylori GroES homologue(HspA).Mol Microbiol，1996，22(5)1013-1023)。本申請人已構建了高效表達重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A的大腸桿菌工程菌(冉向陽，鄒全明等.重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的高效表達及其初步純化.細胞與分子免疫學雜志[J].2002，18(6)539-542)。
申請人在對rHspA的初純化樣品進行進一步純化的摸索中，發(fā)現(xiàn)在非變性條件下，離子交換層析柱、疏水層析柱和凝膠過濾層析柱，均不能將30KD大小的雜蛋白去除，而此蛋白為親和層析純化后rHspA樣品中主要的雜蛋白。所使用的Superdex 75凝膠過濾層析柱在蛋白分子為3～70KD范圍內(nèi)的分辨率最好(Amersham Pharmacia Biotech AB，Gel Filtration Principles and Methods，code No.18-1022-18)，理論上應能將30KD與16KD的蛋白分離，然而Superdex75凝膠過濾層析中rHspA的親和樣品上樣后洗脫只形成了單一峰(見附圖1)，SDS-PAGE結果顯示峰前、峰尖、峰尾30KD的雜蛋白始終與rHspA相伴隨，分析此雜蛋白可能與rHspA形成了聚合體。
打開蛋白聚合體的常用方法是使用變性劑如SDS、尿素、鹽酸胍等以及加入還原劑如β-巰基乙醇、DTT(凌明圣，許祥裕，丁樹標.以包涵體存在的重組蛋白的純化和體外折疊.中國生化藥物雜志，1995，16(3)135-139)，嘗試了將rHspA的初純化樣品濃縮后用鹽酸胍裂解，復性，再純化，觀察能否將30KD雜蛋白與rHspA分離。結果表明，仍未將兩者分離開。分析可能是變性條件下30KD雜蛋白與rHspA分離開了，但在復性過程中，兩者又形成了聚合體。
由此可見采用常規(guī)的純化工藝不能獲得高純度的rHspA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在針對現(xiàn)有純化工藝不能直接適用于本發(fā)明人所構建的重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A基因工程疫苗蛋白，而提供一種工藝簡捷、所獲得蛋白純度高回收率較好的重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A基因工程疫苗制備的純化工藝。
本發(fā)明采用了以下步驟(1)壓破菌將高效表達的可溶性表達重組熱休克蛋白A(rHspA)的大腸桿菌工程菌菌體200-500g以鎳離子親和層析平衡緩沖液懸浮1∶10(W/V)比例混懸浮，4℃預冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻，用高壓均質機破菌4～6次，高速離心，收集上清；(2)過濾將上述上清液通過微孔濾膜過濾直接使用鎳離子親和層析柱進行初級純化。
(3)鎳離子親和層析柱純化選擇鎳離子親和層析柱進行初步純化，使用20mmol/L Tris在pH 7.0～9.0條件下對目標蛋白進行純化，收集目的蛋白峰。
(4)濃縮、裂解將步驟(3)將初純化樣品濃縮后加鹽酸胍和DTT變性裂解；(5)Superdex凝膠過濾層析純化將步驟(4)所獲得的變性蛋白樣本，用凝膠過濾柱Superdex純化，用凝膠過濾平衡緩沖液平衡；(6)復性將步驟(5)純化樣品采用稀釋等容透析法或層析柱復性法復性，復性后的樣品，采用Superdex凝膠過濾層析分離單體和聚體。
步驟(1)所述采用生產(chǎn)或中試純化中使用的高壓破菌技術，破菌至細菌破解率大于98％，差速離心獲得包涵體沉淀物。
步驟(2)所述離心上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后直接上層析柱純化。
步驟(3)所述鎳離子純化填料為Chelating Sepharose HP、ChelatingSepharose FF之一。
步驟(4)的初純化樣品超濾濃縮至蛋白濃度為20～30g/L，變性裂解是加入鹽酸胍至6～7mol/L、加入DTT至50mmol/L，4℃，攪拌30分鐘以上；步驟(5)使用的凝膠過濾層析柱為Superdex 75、Superdex 200、SuperdexHR 10/30之一。
步驟(6)所用的層析柱復性法，可采用Sephadex G-25脫鹽除尿素復性和鎳離子親和層析柱上重折疊復，鎳離子親和層析柱填料為Chelating SepharoseHP、Chelating Sepharose FF之一。
發(fā)明效果本發(fā)明人所構建的rHspA，在使用鎳離子親和層析后天然條件下直接樣品進行純化效果不理想的情況下，在變性條件下，直接對rHspA的親和層析純化樣品進行進一步純化，采用鎳離子親和層析柱，從表達HspA的大腸工程菌破菌液中提取rHspA，獲得了理想的純化效果，對最終純化獲得的變性rHspA，采用稀釋復性或層析柱上復性，從而可以獲得純度大于98％的rHspA。(初步純化得的rHspA純度＞75％，經(jīng)鑒定本發(fā)明人構建獲得的rHspA分子量約為15KD)。
參見圖2，通過SDS-PAGE顯示，在8mol/L尿素條件下，使用Superdex 75凝膠過濾層析柱發(fā)現(xiàn)，與非變性條件相比，層析圖譜中在130ml～170ml處出現(xiàn)了雙峰，SDS-PAGE表明已經(jīng)將30KD雜蛋白與目的蛋白rHspA分離，并且純化后的rHspA純度＞98％，目的蛋白得率在67％左右，參見圖3，圖中1為低分子蛋白標準；2為未純化前的蛋白樣品；3為鎳離子親和層析純化后的樣品；4為變性條件下Superdex 75二次純化時的雜蛋白峰樣品，以30KD雜蛋白為主；5~10為變性條件下Superdex 75二次純化時的收集的目的蛋白峰樣品。
通過上述工藝處理不同批次的rHspA作15％SDS-PAGE，呈現(xiàn)單一條帶，分子質量約為15KD。HPLC C4柱分析呈現(xiàn)單一的峰，純度在98％以上。等電點在pH6.2左右。不同rHspA圖譜各峰峰數(shù)均保持一致，各峰的保留時間均在±10s內(nèi)波動，肽圖譜重視性好。純化后的rHspA與粘膜免疫佐劑CT(霍亂毒素)或LTB(大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位)共口服免疫BalB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)rHspA加粘膜免疫佐劑組血清、胃腸液中的IgA和IgG水平顯著高于對照組(PBS組)(P＜0.01)，證明HspA可有效刺激機體產(chǎn)生較高的免疫應答；rHspA與粘膜免疫佐劑CT(霍亂毒素)或LTB(大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位)共口服免疫蒙古沙鼠后，采用Hp SS1株(澳大利亞Lee A.教授惠贈)感染，發(fā)現(xiàn)rHspA加粘膜佐劑組蒙古沙鼠感染率為21％，對照組(PBS組)感染率為87％，計算得出rHspA抗Hp感染的保護率為70％。


圖1是非變性條件下rHspA親和純化樣品的Superdex 75 26/60凝膠過濾層析圖譜；圖2是變性條件下rHspA親和純化樣品Superdex 75 26/60凝膠過濾層析純化圖譜；圖3是變性條件下Superdex 75 26/60層析柱純化rHspA親和純化樣品結果。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作詳細描述實施例一將本申請人構建的重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A工程菌，通過高密度發(fā)酵，目標蛋白表達率為23％，離心收集菌體，按以下步驟進行純化(1)高壓破菌將高效表達的菌體500g以TE鎳離子親和層析緩沖液懸浮1∶10(W/V)比例混懸浮，4℃預冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻。采用高壓均質機在壓力為75Mpa的條件下進行破菌(共破菌5次，至細菌破解率大于98％)，破菌完畢后，取少量菌液涂片染色，顯微鏡觀察細胞的完整性，確保細胞破碎完全，以15,000g離心40min，收集上清棄沉淀。
(2)過濾將上述上清液通過0.45μm微孔濾膜過濾直接使用鎳離子親和層析柱進行初級純化。
(3)鎳離子親和層析柱純化選擇鎳離子親和層析柱Chelating SepharoseHP進行初步純化，使用20mmol/L Tris在pH 8.5條件下對目標蛋白進行純化，鎳離子親和層析平衡緩沖液10mmol/L咪唑，20mmol/L Tir，0.5mol/L NaCl)，采用咪唑(0.5mol/L咪唑，20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCl)梯度洗脫，收集目的蛋白峰。
(4)濃縮、裂解步驟(3)初純化樣品經(jīng)超濾(膜包孔徑小于5KD)濃縮至蛋白濃度為30g/L后，加入鹽酸胍至6mol/L、加入DTT至50mmol/L，4℃，攪拌30分鐘以上。
(5)Superdex凝膠過濾層析純化在變性條件下，對步驟(4)所獲得的變性蛋白樣本，采用凝膠過濾柱Superdex 75純化(平衡緩沖液8mol/L尿素，0.15mol/L NaCl，20mmol Tris，pH8.5)，收集目標峰，至紫外吸收峰為零時停止。
(6)復性將變性條件下純化的HspA使用鎳離子親和層析柱ChelatingSepharose FF進行柱上復性法復性，方法為層析柱經(jīng)平衡液(8mol/L尿素，20mmolTris，pH 8.5)平衡后，上樣變性目的蛋白樣品，使用復性液(20mmol/L PBS，2mmolGSH，0.2mmol/L GSSG，0.15mol/L NaCl)緩慢梯度洗脫柱至尿素完全去除，使用咪唑緩沖液(20mmol/LPBS，0.5mol/L咪唑，pH8.5)洗脫目的蛋白，收集蛋白峰。
實施實例二樣品處理同實例一，使用鎳離子親和純化柱Chelating Sepharose FF初步純化，純化條件同實例一；采用8mol/L尿素和50mmol/L DTT變性裂解蛋白；變性條件下，采用凝膠過濾柱Superdex 75純化(平衡緩沖液6mol/L鹽酸胍，20mmolTris，pH8.5)，收集目標蛋白峰。變性蛋白采用凝膠過濾柱G-25進行柱脫鹽除變性劑復性，蛋白上樣后使用復性液(20mmol NaHCO3/Na2CO3，20mmol EDTA，pH10)，收集目的蛋白峰。
實施實例三樣品處理、純化條件同實例一；變性裂解蛋白采用8mol/L尿素和50mmol/LDTT；變性條件下，采用凝膠過濾柱Superdex 200純化(平衡緩沖液6mol/L鹽酸胍，20mmol Tris，pH8.5)，收集目標蛋白峰；HspA變性蛋白，使用鎳離子親和層析柱Chelating Sepharose HP進行柱上復性，方法為層析柱經(jīng)平衡液(8mol/L尿素，20mmol Tris，pH 8.5)平衡后，上樣變性目的蛋白樣品，使用復性液(20mmol/L PBS，2mmol GSH，0.2mmol/L GSSG，0.15mol/L NaCl)緩慢梯度洗脫柱至尿素完全去除，使用咪唑緩沖液(20mmol/L PBS，0.5mol/L咪唑，pH8.5)洗脫目的蛋白，收集蛋白峰。
實施實例四樣品處理同實例一，使用鎳離子親和純化柱Chelating Sepharose FF初步純化，純化條件同實例一；變性裂解蛋白采用6mol/L鹽酸胍和50mmol/L DTT；變性條件下，采用凝膠過濾柱Superdex HR 10/30純化(平衡緩沖液6mol/L鹽酸胍，20mmol Tris，pH8.5)，收集目標蛋白峰。變性蛋白采用凝膠過濾柱G-25進行柱脫鹽除變性劑復性，蛋白上樣后使用復性液(20mmol NaHCO3/Na2CO3，20mmolEDTA，pH10)，收集目的蛋白峰。
結果15％SDS-PAGE，目標蛋白呈現(xiàn)單一條帶，分質量約為15KD。HPLC C4柱分析呈現(xiàn)單一的峰，純度為98.2％。等電點在pH6.2左右?？诜庖連ALB/c小鼠，能刺激小鼠產(chǎn)生特異性sIgA分泌，蒙古沙鼠攻毒保護試驗證實其能有效誘導沙鼠預防和清除Hp感染，保護率為70％。
權利要求
1.一種重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A基因工程疫苗制備中的純化工藝，其特征在于用發(fā)酵方式高密度表達rHspA后，采用高壓破菌、過濾，鎳離子親和層析、凝膠過濾層析等純化技術的順序組合，大量獲得高純度rHspA。
2.根據(jù)權利要求1所述的純化工藝，其特征在于純化按以下順序進行(1)高壓破菌將高效表達的可溶性重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A的大腸桿菌工程菌菌體以鎳離子親和層析平衡緩沖液混懸浮，預冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻，用高壓均質機破菌，高速離心，收集上清(2)過濾將上述上清液通過微孔濾膜過濾待用；(3)鎳離子親和層析柱純化選擇鎳離子親和層析柱進行初步純化，使用Tris在pH7.0～9.0條件下對目標蛋白進行純化，采用咪唑梯度洗脫；(4)濃縮、裂解將步驟(3)初純化樣品濃縮后加鹽酸胍和DTT變性裂解；(5)Superdex凝膠過濾層析純化將步驟(4)所獲得的變性蛋白樣本，用凝膠過濾柱Superdex純化，用凝膠過濾平衡緩沖液平衡；(6)復性將步驟(5)純化樣品采用稀釋等容透析法或層析柱復性法復性，復性后的樣品，采用Superdex凝膠過濾層析分離單體和聚體。
3.如權利要求2中所述制備方法，其特征在于步驟(1)所述采用生產(chǎn)或中試純化中使用的60～80Mpa高壓破菌技術，破菌至細菌破解率大于98％，差速離心獲得包涵體沉淀物。
4.如權利要求2中所述的純化工藝，其特征在于步驟(2)所述離心上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后直接上層析柱純化。
5.如權利要求2中所述制備方法，其特征在于步驟(3)所述鎳離子純化填料為Chelating Sepharose HP、Chelating Sepharose FF之一。
6.如權利要求2中所述制備方法，其特征在于步驟(4)的初純化樣品超濾濃縮至蛋白濃度為20～30g/L，變性裂解是加入鹽酸胍至6～7mol/L(或尿素6～8mol/L)、加入DTT(或β-巰基乙醇)至10～50mmol/L，4℃，攪拌30分鐘以上。
7.如權利要求2中所述制備方法，其特征在于步驟(5)使用的凝膠過濾層析柱為Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30之一。
8.如權利要求2中所述制備方法，其特征在于步驟(6)所用的層析柱復性法，可采用Sephadex G-25脫鹽除尿素復性和鎳離子親和層析柱上重折疊復，鎳離子親和層析柱填料為Chelating Sepharose HP、Chelating Sepharose FF之一。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A基因工程菌疫苗制備中的純化工藝。采用對基因工程菌進行高壓破菌、過濾，鎳離子親和層析純化、濃縮裂解、凝膠過濾層析及復性等技術，獲得高純度的重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A。該發(fā)明純化工藝簡捷、容易放大、重復性好，所獲目標蛋白純度高，動物試驗證明本發(fā)明純化獲得的重組幽門螺桿菌熱休克蛋白A具有較好的免疫活性和免疫保護性。
文檔編號C07K14/195GK1563406SQ200410022360
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月20日 優(yōu)先權日2004年4月20日
發(fā)明者鄒全明, 郭鷹, 冉向陽, 朱永紅, 吳超, 張衛(wèi)軍, 童文德 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學