專利名稱：一種多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，特別涉及一種β分泌酶的底物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
切割β淀粉狀前體蛋白(APP)產(chǎn)生β淀粉狀蛋白多肽(Aβ)必需兩個酶，其中之一為β分泌酶(Vassar，R，et.al，Science，286(5440)533-537，1999；Sukanto S，et.al，Nature，402537-540，1999)，Aβ產(chǎn)生后聚集成為Aβ纖維絲最后形成淀粉狀沉淀。抑制Aβ的產(chǎn)生以及抑制Aβ纖維絲的形成是治療Alzheimer疾病的兩種途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種硫氧還蛋白和Aβ融合形成的多肽。
本發(fā)明的另一目的旨在提供這種多肽的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的多肽命名為TrxAβ，序列如SEQ ID No.1所示。
本發(fā)明所述的多肽應(yīng)用于篩選β分泌酶抑制物。
本發(fā)明所述的多肽應(yīng)用于篩選Aβ纖維絲形成抑制物。
本發(fā)明所述的多肽TrxAβ由改構(gòu)的硫氧還蛋白(HP thioredoxin)和APPSW(651-713)以及一段連接肽組成，如圖1所示。HP thioredoxin是invitrogen公司的商業(yè)化產(chǎn)品，主要用作重組可溶性表達(dá)分子伴侶，可用金屬螯和親和層析純化。連接肽是在構(gòu)建TrxAβ的過程中引入的。
當(dāng)TrxAβ與β分泌酶組成反應(yīng)體系，在適當(dāng)條件下經(jīng)一段時間，TrxAβ被β分泌酶在SW位點(diǎn)切割開，分成兩部分一部分由HP thioredoxin和連接肽及APP(651-671)組成，另一部分為Aβ(1-42)，反應(yīng)液與金屬螯和酶標(biāo)板孵育，含HP thioredoxin的肽段與酶標(biāo)板結(jié)合，然后用抗Aβ抗體作ELISA檢測，可反應(yīng)β分泌酶活性的高低，從而可用于篩選β分泌酶抑制物。
Aβ單體在一定條件下聚集形成Aβ纖維絲，可用剛果紅和Thioflavin-T染色顯示，還可用其它方法顯示Aβ纖維絲的形成(Stephen J.W.，et.al，J.Bio.Chem.271(8)4086-4092，1996；Hilal A.L.，J.Bio.Chem.277(45)42881-42890，2002)。Aβ一般從老年癡呆病人尸體提取得到。本發(fā)明的TrxAβ在體外會發(fā)生聚集，形成聚集后不能與金屬螯和板結(jié)合，用ELISA法可檢測到與金屬螯和板結(jié)合的TrxAβ的量(如用抗Aβ抗體)。因此本發(fā)明的TrxAβ可用于篩選Aβ纖維絲抑制物。


圖1為TrxAβ蛋白組成示意圖。
圖2表達(dá)質(zhì)粒pThioAβ示意圖。
圖3β分泌酶酶切反應(yīng)時間圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1TrxAβ用于篩選Aβ纖維絲形成抑制物TrxAβ的制備人工合成如SEQ ID No.2的DNA序列，在其5’端加入含KpnI酶切位點(diǎn)的序列(5’GGTACCC)，在其3’端加入SalI酶切位點(diǎn)(5’GTCGAC)，克隆入表達(dá)載體pThioHisA(invitrogen公司)的KpnI/SalI酶切位點(diǎn)間，使其與編碼HPthioredoxin蛋白的序列融合，篩選得到重組表達(dá)質(zhì)粒pThioAβ并測序證實(shí)，表達(dá)質(zhì)粒pThioAβ示意圖如圖2所示。
將表達(dá)質(zhì)粒pThioAβ轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，用LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)至OD660大約為0.6，加入終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，四小時后離心收菌。菌體懸浮于0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，超聲破碎離心去上清，沉淀用1M Urea/0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5洗一次，溶于4M Urea/0.02MTris/1mM EDTA/pH7.5中，過QAE-spherose層析純化，線性梯度洗脫，合并含目的蛋白的各收集管，稀釋于4倍體積的0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，加入終濃度為1mM的GSH，調(diào)pH值為8.0，4℃放置7天后即可使用。
Aβ纖維絲形成抑制物篩選將上述的復(fù)性液對0.1M NaAc/pH4.0透析，離心去除沉淀，取37.5ul，加入待篩選樣品2.5ul，37℃放置24小時后，加入一定量的0.75M Tris/pH8.8調(diào)pH值為7.5-8.0，包被在金屬螯和酶標(biāo)板上(pierce公司，catalog15146)，室溫振搖1小時后，然后用專用封閉液(pierce公司，catalog37547)封閉30 minutes，再用封閉液(1％BSA/PBS)封閉30 minutes，加入一抗(生物素標(biāo)記的抗β-amyloid單抗，pierce公司，catalogMN1150B)室溫孵育1小時，用洗液(0.1％BSA/0.05％Tween 20/PBS)洗三次，加入HRP-ABC液孵育30 minutes，洗液洗三次，加入DAB顯色劑顯色，測OD450-OD630值。
用Aβ纖維絲形成抑制物去甲腎上腺素、多巴胺、MTMA(myristyltrimethylammonim)作陽性對照，結(jié)果(表1)表明此方法是有效的。
表1Aβ纖維絲形成抑制物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例2TrxAβ用于篩選β分泌酶抑制物重組β分泌酶的制備以下方法提供了一種β分泌酶的重組融合表達(dá)形式(與HP-thiredoxin融合，TrxBACE)。
用QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA Micro Kit提取胎胰腺組織mRNA，用大連寶生物公司的BcaBestTMRNA Kit Ver1.1，以oligodT作引物擴(kuò)增第一鏈，以引物(BACE_F5’GGTACCCACCCAGCACGGCATCCGGC，BACE_R5’GTCGACTTAGGGTTGACTCATCTGTCTGT)擴(kuò)增得BACE cDNA，克隆入寶生物公司的pMT18載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5alpha，用藍(lán)白斑篩選結(jié)合PCR法篩選得陽性克隆，提取質(zhì)粒并測序證實(shí)，測序結(jié)果表明克隆得到的序列有一無意突變，編碼Tyr129的TAT→TAG。設(shè)計(jì)引物組1(TrxF5’TTCCTCGACGCTAACCTG和MutantR5’GGTGTAGGGCACGTACACACCCTTCCG)和引物組2(TrxR5’TGTAAAACGACGGCCAGTGC和MutantR5’CGTGCCCTACACCCAGG)，再用TrxF和TrxR作引物，突變得到編碼序列正確的BACE cDNA，其5’端加有含KpnI酶切位點(diǎn)的序列(5’GGTACCC)，3’端加有SalI酶切位點(diǎn)(5’GTCGAC)，克隆入表達(dá)載體pThioHisA(invitrogen公司)的KpnI/SalI酶切位點(diǎn)間，篩選得到重組表達(dá)質(zhì)粒pThioBACE。
將表達(dá)質(zhì)粒pThioBACE轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，用LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)至OD660大約為0.6，加入終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，四時間后離心收菌。菌體懸浮于0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，超聲破碎離心去上清，沉淀用1M Urea/0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5洗一次，溶于4M Urea/0.02MTris/1mM EDTA/pH7.5中，稀釋于4倍體積的0.02M Tris/1mM EDTA/pH7.5中，加入終濃度為1mM的GSH，調(diào)pH值為8.0，4℃放置7天后即可使用。
β分泌酶抑制物篩選將TrxAβ和TrxBACE復(fù)性液對0.1M NaAc/pH4.0透析，離心去除沉淀。取TrxAβ75ul和TrxBACE 100ul及篩選樣品5ul，20ul乙醇組成酶反應(yīng)體系，37℃保溫18至24小時后，調(diào)pH至7.5-8.0，與金屬螯和酶標(biāo)板結(jié)合，其它ELISA步驟同實(shí)施例1。用βsecretase inbitor II(calbiochem，catalog565749)，測得的IC50與報(bào)道的近似，說明本方法的有效性。
本酶切反應(yīng)耐受20％含量以下的甲醇和乙醇，耐受10％含量以下的DMSO。在反應(yīng)中加入多巴胺或去甲腎上腺素等Aβ纖維絲形成抑制物，可使檢測信噪比增高。另外，酶切反應(yīng)結(jié)果還可用SDS-PAGE顯示。將酶切液跑SDS-PAGE電泳，隨酶切時間的延長，可見一酶切條帶增強(qiáng)，而底物條帶逐漸減弱(圖3)。
表2 β分泌酶抑制物篩選實(shí)驗(yàn)

SEQ ID No.1序列特征1.長度184氨基酸2.類型蛋白質(zhì)序列1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA HWCGPCKMIA PILDEIADEY51 QGKLTVAKLN IDHNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL101 KEFLDANLAG SGSGDDDDKV PTTRPGSGLT NIKTEEISEV NLDAEFRHDS151 GYEVHHQKLV FFAEDVGSNK GAIIGLMVGG VVIASEQ ID No.2序列特征1.長度192堿基對2.類型核酸3.鏈型雙鏈4.拓?fù)鋵W(xué)線性序列1 ACC ACC CGT CCG GGT TCC GGT CTG ACC AAC ATC AAA ACC GAA GAATGG TGG GCA GGC CCA AGG CCA GAC TGG TTG TAG TTT TGG CTT CTT46 ATC TCC GAA GTT AAC CTG GAC GCT GAA TTC CGT CAC GAC TCC GGTTAG AGG CTT CAA TTG GAC CTG CGA CTT AAG GCA GTG CTG AGG CCA91 TAC GAA GTT CAC CAC CAG AAA CTG GTT TTC TTC GCT GAA GAC GTTATG CTT CAA GTG GTG GTC TTT GAC CAA AAG AAG CGA CTT CTG CAA136 GGT TCC AAC AAA GGT GCT ATC ATC GGT CTG ATG GTT GGT GGT GTTCCA AGG TTG TTT CCA CGA TAG TAG CCA GAC TAC CAA CCA CCA CAA181 GTT ATC GCT TAACAA TAG CGA ATT
權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于命名為TrxAβ，序列如下所示1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA HWCGPCKMIA PILDEIADEY51 QGKLTVAKLN IDHNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL101 KEFLDANLAG SGSGDDDDKV PTTRPGSGLT NIKTEEISEV NLDAEFRHDS151 GYEVHHQKLV FFAEDVGSNK GAIIGLMVGG VVIA
2.權(quán)利要求1的多肽用于篩選β分泌酶抑制物。
3.權(quán)利要求1的多肽用于篩選Aβ纖維絲形成抑制物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物制劑，特別涉及一種β分泌酶的底物及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的多肽命名為TrxA β，序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明所述的多肽TrxAβ由改構(gòu)的硫氧還蛋白(HP thioredoxin)和APP
文檔編號C07K14/00GK1583786SQ20041002264
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月26日
發(fā)明者趙彬, 楊宏軍, 趙晶, 徐林 申請人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院