專利名稱：利用人Rhbdl5基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療禿發(fā)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的人禿發(fā)相關(guān)基因Rhbdl5及其編碼蛋白。本發(fā)明還涉及Rhbdl5多核苷酸和多肽的制備和應(yīng)用，尤其是在診斷和治療禿發(fā)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類的先天性禿發(fā)、稀發(fā)常見于男性女性患者較為少見，雖然不影響人的生存質(zhì)量，但是對于個(gè)人來講由其是女性這種先天性的遺傳疾病嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，遺憾的是迄今為止沒有可以從根本上治療的方法。此外，搜集人類的先天性禿發(fā)家系存在較大的困難。
然而，目前還沒有發(fā)現(xiàn)或分離出與禿發(fā)有關(guān)的人基因。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的與禿發(fā)有關(guān)的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人禿發(fā)相關(guān)蛋白-Rhbdl5蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的Rhbdl5多肽，它包含具有SEQID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(i)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(ii)具有SEQ ID NO2氨基酸序列且第259位為Met的多肽；(iii)具有SEQ ID NO2氨基酸序列且第546位為Ser的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述Rhbdl5多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列選自下組(c-1)具有SEQ ID NO1中第1-3118位的序列；(c-2)具有SEQ IDNO1中第71-2551位的序列；(c-3)具有SEQ ID NO1中第71-2551位且第846位為T的序列；(c-4)具有SEQ ID NO1中第71-2551位且第1706位為T的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備Rhbdl5蛋白的方法，該方法包含(a)在表達(dá)Rhbdl5蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出Rhbdl5蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的Rhbdl5多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的20-3118個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗Rhbdl5多肽活性的化合物，以及抑制Rhbdl5多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是Rhbdl5多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在Rhbdl5蛋白的方法，它包括將樣品與Rhbdl5蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Rhbdl5蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與Rhbdl5多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病(如禿發(fā))易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。較佳地，所述的突變是SEQ ID NO1中第846位C→T，第1706為C→T。此外，還提供了相應(yīng)的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增Rhbdl5基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。較佳地，所述試劑盒還含有與突變部位結(jié)合的探針。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)Rhbdl5多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制Rhbdl5多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的Rhbdl5蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的Rhbdl5多肽或其激動(dòng)劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療禿發(fā)等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了Rhbdl5的cDNA序列，其中開放閱讀框架(ORF)位于第71-2551位，編碼827個(gè)氨基酸rhbdl5蛋白。
圖2顯示了Rhbdl5蛋白的氨基酸序列，其中第205-827位是一個(gè)rhomboid蛋白家族高度保守區(qū)域(下劃線部分)。
圖3顯示了一禿發(fā)病人Rhbdl5基因的測序結(jié)果，在Rhbdl5基因的846位存在T/C雜合，該突變造成第259位氨基酸Thr→Met。
圖4顯示了一禿發(fā)病人Rhbdl5基因的測序結(jié)果，在Rhbdl5基因的1706位存在T/C雜合，該突變造成第546位氨基酸Pro→Ser。
圖5顯示了人Rhbdl5蛋白與小鼠Rhor蛋白的氨基酸序列比對圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，首次分離和證明了一種與禿發(fā)密切相關(guān)的人基因Rhbdl5，該基因編碼類似表皮生長因子受體的蛋白。Rhbdl5的突變或功能下降或缺失將導(dǎo)致禿發(fā)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Rhbdl5蛋白”、“Rhbdl5多肽”或“人禿發(fā)相關(guān)蛋白Rhbdl5”可互換使用，都指具有人禿發(fā)相關(guān)蛋白Rhbdl5氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的Rhbdl5蛋白。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的Rhbdl5蛋白或多肽”是指Rhbdl5多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化Rhbdl5蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本發(fā)明還包括Rhbdl5蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然Rhbdl5蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Rhbdl5多肽”指具有Rhbdl5蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與Rhbdl5蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括Rhbdl5蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與Rhbdl5 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗Rhbdl5多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含Rhbdl5多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了Rhbdl5多肽的可溶性片段。通常，該片段具有Rhbdl5多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供Rhbdl5蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然Rhbdl5多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“Rhbdl5蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID N02的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的Rhbdl5核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或Rhbdl5蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的Rhbdl5多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼Rhbdl5多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，Rhbdl5多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含Rhbdl5編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；入噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的Rhbdl5蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療Rhbdl5蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如無精子，或精子活力低下等疾病)，和用于篩選促進(jìn)或?qū)筊hbdl5蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組Rhbdl5蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激Rhbdl5蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對Rhbdl5 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于Rhbdl5基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與Rhbdl5基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制Rhbdl5蛋白的分子，也包括那些并不影響Rhbdl5蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的Rhbdl5基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的Rhbdl5基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)Rhbdl5蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷Rhbdl5蛋白功能的抗體以及不影響Rhbdl5蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用Rhbdl5基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與Rhbdl5基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗Rhbdl5蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的Rhbdl5蛋白。此外，與Rhbdl5蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用Rhbdl5蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Rhbdl5蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療和預(yù)防，尤其是防治禿發(fā)。在使用本發(fā)明Rhbdl5蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他用于同一病癥的治療劑。
本發(fā)明還提供了一種組合物(包括藥物組合物)，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％)的本發(fā)明Rhbdl5多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及(藥學(xué)上)可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的Rhbdl5蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約5毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的Rhbdl5蛋白或其激動(dòng)劑還可添加在洗發(fā)膏、洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素等頭發(fā)護(hù)理用品中，添加量通常為總重量的0.001-5％(較佳地0.01-1％)，從而在日常使用時(shí)就起到防治禿發(fā)/脫發(fā)的效果。
Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于Rhbdl5蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的Rhbdl5蛋白的表達(dá)所致的禿發(fā)。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將Rhbdl5基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。另外重組Rhbdl5基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與Rhbdl5蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時(shí)，必須對Rhbdl5蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測Rhbdl5蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗(yàn)中所檢測的Rhbdl5蛋白水平，可以用作解釋Rhbdl5蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷Rhbdl5蛋白起作用的疾病(如禿發(fā))。
一種檢測檢測樣品中是否存在Rhbdl5蛋白的方法是利用Rhbdl5蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與Rhbdl5蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Rhbdl5蛋白。
Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸可用于Rhbdl5蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸可用于檢測Rhbdl5蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下Rhbdl5蛋白的異常表達(dá)。如Rhbdl5 DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷Rhbdl5蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用Rhbdl5蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測Rhbdl5蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測Rhbdl5基因的突變也可用于診斷Rhbdl5蛋白相關(guān)的疾病。Rhbdl5蛋白突變的形式包括與正常野生型Rhbdl5 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。本發(fā)明的試驗(yàn)已表明，Rhbdl5的突變與禿發(fā)直接相關(guān)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，分離的Rhbdl5的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為3118個(gè)堿基，其開放讀框位于71-2551位，編碼全長為827個(gè)氨基酸的Rhbdl5蛋白(SEQ ID NO2)。研究表明，該基因的突變與人類的先天性禿發(fā)、稀發(fā)密切相關(guān)。Rhbdl5為治療禿發(fā)等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1Rhbdl5基因完整開放閱讀框架的獲得按照Qiagen公司的Total RNA純化試劑盒提供的方法抽提人皮膚細(xì)胞總RNA，1％瓊脂糖電泳鑒定純度后用Promega公司的Reverse Transcript System將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.后用以下引物forward 5’TGTACAGAGCAAGGAGAAGACA3’(SEQ ID NO3)reverse 5’CTTTCCCACAATGTCCCATC3’(SEQ ID NO4)使用ABI公司的TaqGold高溫聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR熱循環(huán)條件是95℃ 10分鐘，1個(gè)循環(huán)；熱循環(huán)95℃ 30秒，56℃ 45秒，72℃ 3分30秒，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 10分鐘，1個(gè)循環(huán)。
0.8％瓊脂糖電泳分離，獲得長度約3.2kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。割膠純化，因該產(chǎn)物較長，故使用PRIMER WALKING的方法進(jìn)行測序。依次使用以下8對測序引物Hs.rhbdl5 forward 5’-TGTACAGAGCAAGGAGAAGACA-3’(SEQ ID NO3)Hs.rhbdl5 reverse 5’-GGAGCTCCAGGTCACGCT-3’(SEQ ID NO5)
Hs.rhbdl5 l forward 5’-CCACAGACTGAGGCTTGACA-3’(SEQ ID NO6)Hs.rhbdl5 1 reverse 5’-GATGCTCTGGGACAGTGAGG-3’(SEQ ID NO7)Hs.rhbdl5 2 forward 5’-ACTTGAAGAGCGTCAGCCTC-3’(SEQ ID NO8)Hs.rhbdl5 2 reverse 5’-ATCGACCACATCCTCCTCC-3’(SEQ ID NO9)Hs.rhbdl5 3 forward 5’-AGTCCTGTCCCTCACCTCCT-3’(SEQ ID NO10)Hs.rhbdl5 3 reverse 5’-GGACGAAGGTCAGCCAGTAG-3’(SEQ ID NO11)Hs.rhbdl5 4 forward 5’-CGGCCCTACTTCACCTACTG-3’(SEQ ID NO12)Hs.rhbdl5 4 reverse 5’-TTGATCTCGCAGTCCATGTG-3’(SEQ ID NO13)Hs.rhbdl5 5 forward 5’-GGCCCGATGACATCACTAAG-3’(SEQ ID NO14)Hs.rhbdl5 5 reverse 5’-TGAACAGGAAGAGCACGATG-3’(SEQ ID NO15)Hs.rhbdl5 6 forward 5’-CAGTGCCATCTTTCTCCCAT-3’(SEQ ID NO16)Hs.rhbdl5 6 reverse 5’-CTGTCTTGGGTCTCTGGCTC-3’(SEQ ID NO17)Hs.rhbdl5 7 forward 5’-TGCGAGAAGTATGAGCTGGA-3’(SEQ ID NO18)Hs.rhbdl5 7 reverse 5’-CTTTCCCACAATGTCCCATC-3’(SEQ ID NO4)測序鑒定，得到Rhbdl5基因的全長序列，如SEQ ID NO1和圖1所示，其中，Rhbdl5基因的開放閱讀框架(ORF)位于71-2551位，編碼全長為827個(gè)氨基酸的Rhbdl5蛋白(SEQ ID NO2和圖2)。
通過結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Rhbdl5蛋白的第205-827位氨基酸是一個(gè)rhomboid蛋白家族高度保守區(qū)域(圖2的下劃線部分)，這表明，Rhbdl5蛋白屬于Rhomboid蛋白家族成員，該家族成員在細(xì)菌和真核生物中都有報(bào)道，大部分是完整的膜蛋白，它們預(yù)測跨膜區(qū)存在三個(gè)高度保守的組氨酸。
此外，采用常規(guī)的微衛(wèi)星標(biāo)記的方法對Rhbdl5進(jìn)行染色體定位。結(jié)果表明Rhbdl5基因定位在人類第十五號染色體上。
實(shí)施例2
Rhbdl5基因cDNA缺失的鑒定方法抽提200個(gè)正常人和2個(gè)禿發(fā)患者的頭皮細(xì)胞基因組DNA，作為模板。然后使用以下引物引物對1 Fwd 5-CGTTCAGCTTGCAGAATCTC-3(SEQ ID NO20)Rev 5-CCACATAGGACCATGCCACA-3(SEQ ID NO21)引物對2 Fwd 5-GACCCACCAGCCTTCTTCT-3(SEQ ID NO22)Rev 5-AAGCCTGTGTGGTTGCTCC-3(SEQ ID NO23)使用ABI公司的GoldTaq高溫聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件同實(shí)施例1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后，用Omega公司的Cycle-Pure Kit純化產(chǎn)物，用ABI公司的BigDye terminal仍用上述引物測序。
測序結(jié)果表明，200個(gè)正常人的Rhbdl5基因不存在引起氨基酸變化的核苷酸突變，而一禿發(fā)病人Rhbdl5基因的846位存在T/C雜合(C→T)，該突變造成第259位氨基酸Thr→Met(圖3)。另一禿發(fā)病人Rhbdl5基因的1706位存在T/C雜合(C→T)，該突變造成第546位氨基酸Pro→Ser(圖4)。這表明Rhbdl5基因與禿發(fā)密切相關(guān)。
圖5顯示了人Rhbdl5蛋白(SEQ ID NO2)與小鼠Rhor蛋白(SEQ ID NO19)的氨基酸序列比對圖。小鼠Rhor蛋白是本發(fā)明人以前研究發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致了小鼠的先天性無毛的基因(見中國專利申請02145253.9)。Rhbdl5蛋白與小鼠Rhor蛋白具有較高的同源性，這提示了它們具有相似的功能，而本實(shí)施例更證實(shí)了與禿發(fā)的相關(guān)性。
實(shí)施例3Rhbdl5在原核細(xì)胞中的表達(dá)合成以下引物正向引物5′ATAAAGCTTATGGCCTCAGCTGACAAGAATGGCAGCAACCTCCCA 3′(SEQ ID NO24)(引入HindIII切點(diǎn)GGATCC，第一個(gè)ATA為保護(hù)堿基)反向引物5′CCGCTCGAGGCTCGATCTGGTCCACGATGTGATT 3′(SEQID NO25)(引入XhoI切點(diǎn)CTCGAG，起始CCG為保護(hù)堿基)以人頭皮細(xì)胞的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增編碼Rhbdl5蛋白的DNA。
利用HindIII和Hind III位點(diǎn)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到相同酶切的質(zhì)粒pET32a(Novagen公司)中，然后轉(zhuǎn)化宿主E.ColiBL21(DE3)。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)。
表達(dá)產(chǎn)物在SDS-PA6E膠中分子量大約為90Kda，與預(yù)測值相符。
實(shí)施例4抗體的制備用實(shí)施例3中獲得蛋白用作抗原，在兔中制備多克隆抗體。具體程序如下第一次免疫純種新西蘭兔，蛋白用量為240ug/只，用弗氏完全佐劑。4周后，第二次免疫，蛋白用量為140ug/只，用不完全佐劑。之后2周，第三次免疫，蛋白用量為120ug/只，用不完全佐劑。
獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人Rhbdl5蛋白(實(shí)施例3)的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與Rhbdl5蛋白發(fā)生結(jié)合。
實(shí)施例5禿發(fā)易感性的檢測試劑盒如實(shí)施例1-3所述，SEQ ID NO1中846位C→T(該突變造成第259位氨基酸Thr→Met)和1706位C→T的突變，與禿發(fā)密切相關(guān)。因此，可基于這些突變設(shè)計(jì)引物在以病人的基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行檢測，例如SEQ ID NO20和21，SEQ ID NO22和23。

制備一檢測SEQ ID NO1中846位C→T的突變試劑盒(100人次)，它含有名稱 編號 數(shù)量正向引物 SEQ ID NO20 100pmol反向引物 SEQ ID NO21 100pmolPCR緩沖液 若干制備一檢測SEQ ID NO1中1706 C→T的突變試劑盒(100人次)，它含有名稱 編號數(shù)量正向引物 SEQ ID NO22 100pmol反向引物 SEQ ID NO23 100pmolPCR緩沖液 若干抽提取待檢測對象的皮膚細(xì)胞的mRNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA。將禿發(fā)易感性檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所制備的cDNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
檢測結(jié)果表明，具有846位C→T和1706位C→T的檢測對象(年齡)的禿發(fā)易感性明顯高于正常人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生物工程研究中心<120>利用人Rhbdl5基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療禿發(fā)的方法<130>040333<160>25<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3118<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(71)..(2551)<223>
<400>1gccctttcac agcaagaccc ggaagccgcg ggcaaactca gactcgaagc cctcccgcct 60cctgcccaca atg gcc tct gct gac aag aat ggc ggg agc gtg tcc tct109Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Gly Ser Val Ser Ser1 5 10gtg tcc agc agc cgc ctg cag agc cgg aag cca ccc aac ctc tcc atc 157Val Ser Ser Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile15 20 25acc atc ccg cca ccc gag aaa gag acc cag gcc cct ggc gag cag gac 205Thr Ile Pro Pro Pro Glu Lys Glu Thr Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp30 35 40 45agc atg ctg cct gag agg aag aac cca gcc tac ttg aag agc gtc agc 253Ser Met Leu Pro Glu Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser50 55 60ctc cag gag cca cgc agc cga tgg cag gag agt tca gag aag cgc cct 301Leu Gln Glu Pro Arg Ser Arg Trp Gln Glu Ser Ser Glu Lys Arg Pro65 70 75ggc ttc cgc cgc cag gcc tca ctg tcc cag agc atc cgc aag ggc gca 349Gly Phe Arg Arg Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Gly Ala80 85 90gcc cag tgg ttt gga gtc agc ggc gac tgg gag ggg cag cgg cag cag 397Ala Gln Trp Phe Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Gln Arg Gln Gln95 100 105tgg cag cgc cgc agc ctg cac cac tgc agc atg cgc tac ggc cgc ctg 445Trp Gln Arg Arg Ser Leu His His Cys Ser Met Arg Tyr Gly Arg Leu110 115 120 125aag gcc tcg tgc cag cgt gac ctg gag ctc ccc agc cag gag gca ccg 493Lys Ala Ser Cys Gln Arg Asp Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Ala Pro130 135 140tcc ttc cag ggc act gag tcc cca aag ccc tgc aag atg ccc aag att 541Ser Phe Gln Gly Thr Glu Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile145 150 155gtg gat ccg ctg gcc cgg ggc cgg gcc ttc cgc cac ccg gag gag atg 589
Val Asp Pro Leu Ala Arg G1y Arg Ala Phe Arg His Pro Glu Glu Met160 165 170gac agg ccc cac gcc ctg cac cca ccg ctg acc ccc gga gtc ctg tcc637Asp Arg Pro His Ala Leu His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser175 180 185ctc acc tcc ttc acc agt gtc cgt tct ggc tac tcc cac ctg cca cgc685Leu Thr Ser Phe Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg190 195 200 205cgc aag aga atg tct gtg gcc cac atg agc ttg caa gct gcc gct gcc733Arg Lys Arg Met Ser Val Ala His Met Ser Leu Gln Ala Ala Ala Ala210 215 220ctc ctc aag ggg cgc tcg gtg ctg gat gcc acc gga cag cgg tgc cgg781Leu Leu Lys Gly Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg225 230 235gtg gtc aag cgc agc ttt gcc ttc ccg agc ttc ctg gag gag gat gtg829Val Val Lys Arg Ser Phe Ala Phe Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Val240 245 250gtc gat ggg gca gac acg ttt gac tcc tcc ttt ttt agt aag gaa gaa877Val Asp Gly Ala Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu255 260 265atg agc tcc atg cct gat gat gtc ttt gag tcc ccc cca ctc tct gcc925Met Ser Ser Met Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala270 275 280 285agc tac ttc cga ggg atc cca cac tca gcc tcc cct gtc tcc ccc gat973Ser Tyr Phe Arg Gly Ile Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp290 295 300ggg gtg caa atc cct ctg aag gag tat ggc cga gcc cca gtc ccc ggg1021Gly Val Gln Ile Pro Leu Lys Glu Tyr Gly Arg Ala Pro Val Pro Gly305 310 315ccc cgg cgc ggc aag cgc atc gcc tcc aag gtg aag cac ttt gcc ttt1069Pro Arg Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe320 325 330gat cgg aag aag cgg cac tac ggc ctc ggc gtg gtg ggc aac tgg ctg1117Asp Arg Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu335 340 345aac cgc agc tac cgc cgc agc atc agc agc act gtg cag cgg cag ctg1165Asn Arg Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu350 355 360 365gag agc ttc gac agc cac cgg ccc tac ttc acc tac tgg ctg acc ttc1213Glu Ser Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe370 375 380gtc cat gtc atc atc acg ctg ctg gtg att tgc acg tat ggc atc gca1261Val His Val Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala385 390 395ccc gtg ggc ttt gcc cag cac gtc acc acc cag ctg gtg ctg cgg aac1309Pro Val Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Arg Asn400 405 410aaa ggt gtg tac gag agc gtg aag tac atc cag cag gag aac ttc tgg1357Lys Gly Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp415 420 425gtt ggc ccc agc tcg att gac ctg atc cac ctg ggg gcc aag ttc tca1405Val Gly Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser430 435 440 445ccc tgc atc cgg aag gac ggg cag atc gag cag ctg gtg ctg cgc gag1453Pro Cys Ile Arg Lys Asp Gly Gln Ile Glu Gln Leu Val Leu Arg Glu
450 455 460cga gac ctg gag cgg gac tca ggc tgc tgt gtc cag aat gac cac tcc1501Arg Asp Leu Glu Arg Asp Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp His Ser465 470 475gga tgc atc cag acc cag cgg aag gac tgc tcg gag act ttg gcc act1549Gly Cys Ile Gln Thr Gln Arg Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr480 485 490ttt gtc aag tgg cag gat gac act ggg ccc ccc atg gac aag tct gat1597Phe Val Lys Trp Gln Asp Asp Thr Gly Pro Pro Met Asp Lys Ser Asp495 500 505ctg ggc cag aag cgg act tcg ggg gct gtc tgc cac cag gac ccc agg1645Leu Gly Gln Lys Arg Thr Ser Gly Ala Val Cys His Gln Asp Pro Arg510 515 520 525acc tgc gag gag cca gcc tcc agc ggt gcc cac atc tgg ccc gat gac1693Thr Cys Glu Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp530 535 540atc act aag tgg ccg atc tgc aca gag cag gcc agg agc aac cac aca1741Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Arg Ser Asn His Thr545 550 555ggc ttc ctg cac atg gac tgc gag atc aag ggc cgc ccc tgc tgc atc1789Gly Phe Leu His Met Asp Cys Glu Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile560 565 570ggc acc aag ggc agc tgt gag atc acc acc cgg gaa tac tgt gag ttc1837Gly Thr Lys Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe575 580 585atg cac ggc tat ttc cat gag gaa gca aca ctc tgc tcc cag gtg cac1885Met His Gly Tyr Phe His Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His590 595 600 605tgc ttg gac aag gtg tgt ggg ctg ctg ccc ttc ctc aac cct gag gtc1933Cys Leu Asp Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val610 615 620cca gat cag ttc tac agg ctc tgg ctg tct ctc ttc cta cat gct ggc198lPro Asp Gln Phe Tyr Arg Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly625 630 635gtg gtg cac tgc ctc gtg tct gtg gtc ttt caa atg acc atc ctg agg2029Val Val His Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg640 645 650gac ctg gag aag ctg gcc ggc tgg cac cgt atc gcc atc atc ttc atc2077Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Phe Ile655 660 665ctc agt ggc atc aca ggc aac ctc gcc agt gcc atc ttt ctc cca tac2125Leu Ser Gly Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr670 675 680 685cgg gca gag gtg ggc ccg gcc ggc tca cag ttc ggc ctc ctc gcc tgc2173Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys690 695 700ctc ttc gtg gag ctc ttc cag agc tgg ccg ctg ctg gag agg ccc tgg2221Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln Ser Trp Pro Leu Leu Glu Arg Pro Trp705 710 715aag gcc ttc ctc aac ctc tcg gcc atc gtg ctc ttc ctg ttc atc tgt2269Lys Ala Phe Leu Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys720 725 730ggc ctc ctg ccc tgg atc gac aac atc gcc cac atc ttc ggc ttc ctc2317Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu735 740 745
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l80 185 190Phe Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg Arg Lys Arg195 200 205Met Ser Val Ala His Met Ser Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Lys210 215 220Gly Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg Val Val Lys225 230 235 240Arg Ser Phe Ala Phe Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Val Val Asp Gly245 250 255Ala Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu Met Ser Ser260 265 270Met Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Phe275 280 285Arg Gly Ile Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Val Gln290 295 300Ile Pro Leu Lys Glu Tyr Gly Arg Ala Pro Val Pro Gly Pro Arg Arg305 310 315 320Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe Asp Arg Lys325 330 335Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu Asn Arg Ser340 345 350Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu Glu Ser Phe355 360 365Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Val370 375 380Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly385 390 395 400Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Arg Asn Lys Gly Val405 410 415Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp Val Gly Pro420 425 430Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Ile435 440 445Arg Lys Asp Gly Gln Ile Glu Gln Leu Val Leu Arg Glu Arg Asp Leu450 455 460Glu Arg Asp Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp His Ser Gly Cys Ile465 470 475 480Gln Thr Gln Arg Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Val Lys485 490 495Trp Gln Asp Asp Thr Gly Pro Pro Met Asp Lys Ser Asp Leu Gly Gln500 505 510Lys Arg Thr Ser Gly Ala Val Cys His Gln Asp Pro Arg Thr Cys Glu515 520 525Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp Ile Thr Lys530 535 540Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Arg Ser Asn His Thr Gly Phe Leu545 550 555 560His Met Asp Cys Glu Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys565 570 575Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe Met His Gly580 585 590Tyr Phe His Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Leu Asp595 600 605Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln610 615 620
Phe Tyr Arg Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Val Val His625 630 635 640Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg Asp Leu Glu645 650 655Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Phe Ile Leu Ser Gly660 665 670Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu675 680 685Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys Leu Phe Val690 695 700Glu Leu Phe Gln Ser Trp Pro Leu Leu Glu Arg Pro Trp Lys Ala Phe705 710 715 720Leu Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys Gly Leu Leu725 730 735Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu Ser Gly Leu740 745 750Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly Thr Ser Asp755 760 765Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Ala Phe Ala770 775 780Gly Leu Phe Ala Ala Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr Pro Ile Asn785 790 795 800Trp Pro Trp Ile Glu His Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr Ser Arg Phe805 810 815Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His820 825<210>3<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3tgtacagagc aaggagaaga ca 22<210>4<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4ctttcccaca atgtcccatc 20<210>5<211>18<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5ggagctccag gtcacgct 18<210>6<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>6ccacagactg aggcttgaca 20<210>7<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7gatgctctgg gacagtgagg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>8acttgaagag cgtcagcctc 20<210>9<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9atcgaccaca tcctcctcc 19<210>10<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>10agtcctgtcc ctcacctcct 20<210>11<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11ggacgaaggt cagccagtag 20<210>12<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>12cggccctact tcacctactg 20<210>13<211>20<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)<400>13ttgatctcgc agtccatgtg 20<210>14<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>14ggcccgatga catcactaag 20<210>15<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15tgaacaggaa gagcacgatg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16cagtgccatc tttctcccat 20<210>17<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>17ctgtcttggg tctctggctc 20<210>18<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>18tgcgagaagt atgagctgga 20<210>19<211>827<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>19Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Ser Asn Leu Pro Ser Val Ser Gly1 5 10 15Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro20 25 30
Pro Pro Glu Ser Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu Pro Glu35 40 45Arg Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser Leu Gln Glu Pro50 55 60Arg Gly Arg Trp Gln Glu Gly Ala Glu Lys Arg Pro Gly Phe Arg Arg65 70 75 80Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Ser Thr Ala Gln Trp Phe85 90 95Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Lys Arg Gln Asn Trp His Arg Arg100 105 110Ser Leu His His Cys Ser Val His Tyr Gly Arg Leu Lys Ala Ser Cys115 120 125Gln Arg Glu Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Val Pro Ser Phe Gln Gly130 135 140Thr Glu Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile Val Asp Pro Leu145 150 155 160Ala Arg Gly Arg Ala Phe Arg His Pro Asp Glu Val Asp Arg Pro His165 170 175Ala Ala His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser Leu Thr Ser Phe180 185 190Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg Arg Lys Arg Ile195 200 205Ser Val Ala His Met Ser Phe Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gly2l0 215 220Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg His Val Lys Arg225 230 235 240Ser Phe Ala Tyr Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Ala Val Asp Gly Ala245 250 255Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu Met Ser Ser Met260 265 270Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Phe Arg275 280 285Gly Val Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Val His Ile290 295 300Pro Leu Lys Glu Tyr Ser Gly Gly Arg Ala Leu Gly Pro Gly Thr Gln305 310 315 320Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe Asp Arg325 330 335Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu Asn Arg340 345 350Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu Glu Ser355 360 365Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His370 375 380Ile Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala Pro Val385 390 395 400Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Lys Asn Arg Gly405 410 415Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly420 425 430Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys435 440 445Ile Arg Lys Asp Gln Gln Ile Glu Gln Leu Val Arg Arg Glu Arg Asp450 455 460Ile Glu Arg Thr Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp Arg Ser Gly Cys
465 470 475 480Ile Gln Thr Leu Lys Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Val485 490 495Lys Trp Gln Asn Asp Thr Gly Pro Ser Asp Lys Ser Asp Leu Ser Gln500 505 510Lys Gln Pro Ser Ala Val Val Cys His Gln Asp Pro Arg Thr Cys Glu515 520 525Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp Ile Thr Lys530 535 540Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Gln Ser Asn His Thr Gly Leu Leu545 550 555 560His Ile Asp Cys Lys Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys565 570 575Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe Met His Gly580 585 590Tyr Phe His Glu Asp Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Leu Asp595 600 605Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln610 615 620Phe Tyr Arg Ile Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Val His625 630 635 640Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg Asp Leu Glu645 650 655Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ser Ile Ile Phe Ile Leu Ser Gly660 665 670Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu675 680 685Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys Leu Phe Val690 695 700Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Leu Leu Glu Arg Pro Trp Lys Ala Phe705 710 715 720Phe Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys Gly Leu Leu725 730 735Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu Ser Gly Met740 745 750Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly Thr Ser Asp755 760 765Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Val Phe Ala770 775 780Gly Leu Phe Ala Ser Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr Pro Ile Asn785 790 795 800Trp Pro Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr Set Arg Phe805 810 815Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His820 825<210>20<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>20cgttcagctt gcagaatctc 20<210>21
<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>21ccacatagga ccatgccaca 20<210>22<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>22gacccaccag ccttcttct 19<210>23<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>23aagcctgtgt ggttgctcc 19<210>24<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>24ataaagctta tggcctcagc tgacaagaat ggcagcaacc tccca 45<210>25<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>25ccgctcgagg ctcgatctgg tccacgatgt gatt 3權(quán)利要求
1.一種分離的Rhbdl5多肽，其特征在于，該多肽選自下組具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、其保守性變異多肽、其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下組(i)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(ii)具有SEQ ID NO2氨基酸序列且第259位為Met的多肽；(iii)具有SEQ ID NO2氨基酸序列且第546位為Ser的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(c-1)具有SEQ ID NO1中第1-3118位的序列；(c-2)具有SEQ ID NO1中第71-2551位的序列；(c-3)具有SEQ ID NO1中第71-2551位且第846位為T的序列；(c-4)具有SEQ ID NO1中第71-2551位且第1706位為T的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種Rhbdl5蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在表達(dá)Rhbdl5蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出Rhbdl5蛋白。
9.一種檢測禿發(fā)易感性的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增Rhbdl5基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
10.一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人禿發(fā)相關(guān)蛋白－Rhbd15蛋白，編碼Rhbd15蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生Rhbd15蛋白的方法。本發(fā)明還公開了Rhbd15蛋白和多核苷酸的用途。
文檔編號C07K14/435GK1712414SQ20041002536
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日
發(fā)明者孔祥銀, 滕曉坤, 胡蘭靛 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院