專利名稱：Rip5基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個能誘導(dǎo)細胞調(diào)亡的新基因RIP5、該基因編碼的蛋白序列及其在篩選治療或預(yù)防癌癥藥物的用途。
背景技術(shù)：
1972年Kerr等人首次發(fā)現(xiàn)存在著細胞凋亡這種有別于壞死的現(xiàn)象，其后三十多年的研究使人們認識到了細胞的這種“自殺”行為的廣泛的生理學(xué)意義。細胞是否在正確的時間和地點啟動清除自己的機制，這與機體各個系統(tǒng)的正常發(fā)育和各個器官生理功能的正確實行息息相關(guān)；一旦這種機制發(fā)生異常，就將引起包括癌癥、自身免疫疾病和神經(jīng)退行性疾病等等多種病癥。目前，研究能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生細胞凋亡或者能夠抑制腫瘤細胞內(nèi)拮抗細胞凋亡分子活性的新的藥物，已經(jīng)成為癌癥治療研究的一個新的熱點。
目前發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡類型包括以下幾種1.caspase依賴性的細胞凋亡caspase依賴性的細胞凋亡的信號途徑中有caspase蛋白酶的參與。
在哺乳動物中，caspase依賴性的細胞凋亡主要有兩條信號通路由TNF家族的死亡受體誘導(dǎo)起始的性細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和內(nèi)源性細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即線粒體接受到細胞內(nèi)部或者外部的信號后，線粒體的外膜上打開向細胞質(zhì)中釋放出一些凋亡相關(guān)因子，引起細胞發(fā)生凋亡。
2.caspase非依賴性的細胞凋亡Apoptosis inducing factor(AIF)是在1999年首先被克隆的第一個由線粒體釋放的能夠誘導(dǎo)caspase非依賴的細胞凋亡的因子。此外，屬于依賴于Mg2+的核酸酶家族的Endonuclease G在細胞凋亡中發(fā)揮著一定的作用，而且它可能與AIF共同作用來影響凋亡進程。
NF-κB(nuclear factor-κB)是一種在各種類型細胞中廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，負責(zé)調(diào)節(jié)大量與細胞應(yīng)急狀態(tài)相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB在機體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NF-κB活化的失調(diào)與許多人類病癥直接相關(guān)，同時NF-κB在某些造血細胞，上皮細胞和淋巴器官結(jié)構(gòu)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。近來的研究證明，NF-κB家族成員還參與了神經(jīng)突觸的形成和腫瘤的遷移(Karin and Ben-Neriah，2000)。
NF-κB通常與抑制因子IκBs(inhibit κB)相結(jié)合，以非活性形式存在于細胞質(zhì)中。NF-κB能被各種刺激因子激活。細胞在上游刺激因素的作用下，通過不同的胞內(nèi)信號傳遞途徑，導(dǎo)致IκBs的降解及NF-κB的活化。NF-κB活化途徑中的關(guān)鍵因子均可作為藥物設(shè)計篩選的靶標(biāo)，因此研究者們一直致力于克隆調(diào)節(jié)NF-κB活性的因子。它們不僅對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的基礎(chǔ)理論研究有重要意義，而且為免疫及炎癥的醫(yī)學(xué)干預(yù)提供了機遇。
RIP是一種已知的，在TNF-R1誘導(dǎo)的NF-κB活化過程中發(fā)揮重要作用的激酶。
RIP家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4個成員——RIP，RIP2，RIP3，RIP4。RIP2的C-端為Caspase招募結(jié)構(gòu)域。在細胞中過表達RIP2能激活NF-kB和JNK激酶；RIP3的C端沒有明結(jié)構(gòu)域，能與RIP結(jié)合并且磷酸活化RIP從而抑制RIP和TNF誘導(dǎo)的NF-kB的激活；RIP4的C端含有錨結(jié)構(gòu)域重復(fù)，能激活NF-kB和JNK。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找RIP家族的新基因成員，以便找到能誘導(dǎo)細胞調(diào)亡的新基因。
本發(fā)明利用序列同源性比對得到了具有SEQ ID NO1所示序列的DNA，命名為RIP5。實驗結(jié)果證明，RIP5基因及其編碼的蛋白(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，在篩選治療或預(yù)防癌癥等與細胞凋亡有關(guān)疾病的的藥物中，可用作分子靶標(biāo)或診斷標(biāo)記。
本發(fā)明以RIP的序列在NCBI序列庫中進行了blast搜索，找到了一個與RIP有同源性的RIP家族新基因RIP5。在哺乳動物細胞內(nèi)過表達RIP5能引起細胞死亡，并且能誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)DNA ladder，并且RIP5誘導(dǎo)的DNAladder能被crmA抑制，這個現(xiàn)象說明RIP5誘導(dǎo)的細胞死亡是調(diào)亡。但是在凋亡形態(tài)學(xué)研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)RIP5誘導(dǎo)的細胞死亡形態(tài)不能被crmA抑制，認為RIP5能引起Caspase依賴和非依賴兩條凋亡信號通路。以上結(jié)果表明，RIP5是一種能夠誘導(dǎo)細胞凋亡的RIP家族新基因。


圖1是人RIP5和RIP在激酶結(jié)構(gòu)域的序列比對，陰影代表相似氨基酸。
圖2表示細胞中過表達RIP5后存活細胞的數(shù)量變化。圖中，橫坐標(biāo)表示RIP5的DNA用量按0，0.5，1，2，4ug遞增，縱坐標(biāo)表示每孔存活細胞的相對數(shù)目。
圖3是經(jīng)β-Gal染色分析，200倍光鏡所示的轉(zhuǎn)染RIP5的細胞形態(tài)變化。圖中A為轉(zhuǎn)染空載體的形態(tài)，B為轉(zhuǎn)染RIP5表達載體的形態(tài)。
圖4表示RIP5誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)DNA ladder，進行DNA ladder分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，從左到右依次為
RIP+CrmA；RIP；RIP5+CrmA；RIP5；Marker；圖5表示RIP5基因在各種不同凋亡抑制劑存在下，轉(zhuǎn)染細胞后存活細胞的數(shù)量變化。圖中，橫坐標(biāo)表示轉(zhuǎn)染的內(nèi)容從左到右分別為空載體；RIP5；RIP5+VAD-fmk；RIP5+CrmA；RIP；RIP+VAD-fmk；RIP+CrmA，縱坐標(biāo)表示存活細胞的相對數(shù)量。
具體實施例方式以下是本發(fā)明實驗方法及結(jié)果詳述。
一、材料及方法材料人胚腎293細胞購自ATCC；細胞培養(yǎng)用DMEM，胎牛血清，0.05％胰酶溶液，丙酮酸鈉溶液，青、鏈酶素溶液購自GIBCO和Hyclone；哺乳動物細胞表達載體pRK-HA和PRK-flag由本實驗室構(gòu)建；CMV-β-gal報告質(zhì)粒由Dr.Gary Johnson(University of Colorado Health Science Center)惠贈；RIP5基因從人乳腺癌細胞系MCF-7中RT-PCR得到并聯(lián)入PRK-HA和PRK-flag載體；載體構(gòu)建所需限制性內(nèi)切酶購自Promega；DNA回收試劑盒Geneclean III Kit購自Q-BIO Gene；RT-PCR試劑盒購自PROMEGA公司；DNA序列測定由中國上海生工生物工程公司完成；PCR引物由中國上海生工生物工程公司合成；Western blot用硝酸纖維素膜Hybond ECL和HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG、羊抗鼠兔IgG購自Amersham pharmacia biotech.；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自PIERCE；HA單克隆抗體購自Sigma；兔抗人RIP5蛋白的多克隆抗體由中科院遺傳所免疫室制備；
CaCl2，PEG4000，LiAc，DMSO購自Sigma；CsCl購自Fisher Biotech.；β-gal購自Promega；其它化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑商店。
方法1.質(zhì)粒構(gòu)建及DNA純化以RIP序列在NCBI序列庫中進行blast搜索和EST(expression sequece tag)序列拼接得到RIP5分子的全長編碼序列，然后根據(jù)RIP5的全長編碼序列設(shè)計引物，從人乳腺癌細胞系MCF-7中RT-PCR得到RIP5基因并聯(lián)入PRK-HA的表達載體中。構(gòu)建的哺乳動物細胞表達質(zhì)粒均參照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等，1999)質(zhì)粒大量提取法，經(jīng)CsCl密度梯度超速離心純化。
2.細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
293細胞(1×105)接種于12孔板中，18小時后參照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等，1999)進行磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
3.β-Gal染色將CMV-β-Gal基因作為報告基因和RIP5表達載體共轉(zhuǎn)染293細胞，36小時以后用戊二醛固定細胞，并用β-Gal染色過夜。次日在顯微鏡下對形態(tài)正常的細胞進行計數(shù)。每個孔計3個視野，取平均值，作為存活細胞的數(shù)目。
4.DNA ladder分析以RIP5等表達載體傳染293細胞，36小時以后收集所有漂浮的和貼壁的細胞，用含有0.2mg/ml蛋白酶K和2％NP40的裂解液裂解，釋放出來的細胞DNA用無水乙醇沉淀，并用50ul水溶解，再加入2ulRNA處理，最后進行2％瓊脂糖凝膠電泳。
二、RIP5的克隆及功能鑒定1.RIP5基因的克隆為了尋找RIP家族的新基因，我們以RIP序列在NCBI序列庫中進行了BLAST搜索，找到了多個EST克隆，對這些基因進行的分析表明其中一些EST克隆編碼同一個尚未報道過的新基因。我們將其命名為RIP5。RIP5得C-末端含有一個激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與RIP得激酶結(jié)構(gòu)域有較大同源性。我們根據(jù)RIP5的5’和3’cDNA序列設(shè)計引物，從人乳腺癌細胞中RT-PCR得到了RIP5的全長cDNA并連入PRK-HA和PRK-flag表達載體。
2.RIP5基因誘導(dǎo)細胞凋亡的功能鑒定用RIP5的表達載體轉(zhuǎn)染293細胞，并隨著RIP5量的增加存活細胞的數(shù)量逐漸下降(見圖2)經(jīng)β-Gal染色分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染RIP5的細胞死亡形態(tài)的細胞明顯增多，并且與RIP5的表達量成正比(圖2，3)，說明在細胞中過表達RIP5能引起細胞死亡。在細胞中過表達RIP5能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生DNA ladder。并且這種RIP5誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA ladder能被crmA抑制。但是在apoptosis assay實驗中，RIP5誘導(dǎo)的細胞凋亡不能被crmA抑制，也不能被調(diào)亡抑制劑VAD-fmk抑制(圖5)。上述結(jié)果說明RIP5誘導(dǎo)的細胞調(diào)亡能同時通過Caspase依賴和Capase非依賴兩條途徑進行。
序列表<110>北京大學(xué)<120>RIP5基因及其用途<130>04-01<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2927<212>DNA<213>人(human)<400>1ccacgcgtcc ggccgcaaag acagagcggg cagaggcgat ggagggcgac ggggtgccat60ggggcagcga gcccgtctcg ggtcccggcc ccggcggcgg cggaatgatc cgcgagctgt120gccggggctt cggccgctac cgccgctacc tgggacggct gcgacagaac ctgcgcgaga180cccagaagtt cttccgcgac atcaagtgct cccacaacca cacttgtctc tcctccctca240cgggcggcgg cggggccgag cgcggccctg caggcgatgt cgccgaaacc gggctgcagg300cgggccaact gagctgcatt tccttcccac ctaaggaaga gaagtacctc cagcagattg360tggactgcct cccttgcata ctgatcctcg gccaggattg taacgtcaag tgccagctgt420tgaatctgct gttgggggtg caggtgcttc ccaccaccaa gctgggcagt gaggagagct480gtaagcttcg gcgcctccgc ttcacctatg ggactcagac tcgggtcagc ctggcgctcc540ctggacagta tgaactagtg cacacgctgg ttgctcatca gggcaactgg gagaccatcc600ctgaggagga tctggaggtc caagagaaca atgaggatgc tgctcatgtt ttagcggaac660tggaggtaac gatgcaccat gctctcttac aggaagtgga cgttgtggta gcaccatgcc720aaggcctccg gcccacagtg gatgttctgg gtgacttggt gaatgatttc ttgcctgtga780taacctatgc actccacaaa gatgaactct ctgagaggga tgagcaagag cttcaggaaa840tccgaaagta tttctccttt cctgtattct ttttcaaagt gccgaaactg ggctcggaga900taatagactc ctcaaccagg agaatggaga gcgaaagatc accgctttat cgccagctaa960ttgacctggg ctatctgagc agcagtcact ggaactgtgg ggctcctggc caggatacta1020aagctcagag catgttggtg gaacagagtg aaaagctgag acacttgagc acattttctc1080accaggtgtt acagactcgc ctggtggatg cagccaaggc cctgaacctg gtgcactgcc1140actgccttga catctttatt aaccaggcat ttgacatgca gcgggacctg cagatcactc1200
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權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO1所示序列的DNA。
2.權(quán)利要求1所述DNA誘導(dǎo)細胞凋亡的用途。
3.用權(quán)利要求1所述DNA在篩選治療或預(yù)防與細胞凋亡有關(guān)疾病的藥物的用途。
4.權(quán)利要求1所述DNA在篩選治療或預(yù)防癌癥藥物的用途。
5.具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
6. 權(quán)利要求5所述氨基酸序列誘導(dǎo)細胞凋亡的用途。
7.權(quán)利要求5所述氨基酸序列在篩選治療或預(yù)防與細胞凋亡有關(guān)疾病的藥物的用途。
8.權(quán)利要求5所述氨基酸序列在篩選治療或預(yù)防癌癥藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及RIP5基因及其用途。本發(fā)明利用序列同源性比對得到了一種新基因RIP5。實驗結(jié)果證明，該基因及其編碼的蛋白能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，在篩選治療或預(yù)防癌癥等與細胞凋亡有關(guān)疾病的的藥物中，可用作分子靶標(biāo)或診斷標(biāo)記。
文檔編號C07K14/435GK1600857SQ20041003413
公開日2005年3月30日 申請日期2004年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月26日
發(fā)明者查紀坤, 舒紅兵, 翟中和 申請人:北京大學(xué)