專利名稱：苊并雜環(huán)類化合物及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗腫瘤的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的氨基或鹵素取代衍生物及其在體內(nèi)、體外的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和作為抗癌化合物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
隨著對(duì)細(xì)胞死亡過(guò)程和機(jī)理不斷深入的研究，細(xì)胞凋亡成為抗腫瘤藥物研究的新的靶點(diǎn)。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的特性是通過(guò)逃避有機(jī)體信號(hào)調(diào)控來(lái)抵制凋亡，達(dá)到“永生”。所以，有效的凋亡誘導(dǎo)劑將從根本上抑制腫瘤細(xì)胞的生存，和癌前病變的繼續(xù)異型化。不論作為腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究的工具還是臨床治療腫瘤的藥物，凋亡誘導(dǎo)劑都具有極大的價(jià)值。目前，包括Calbiochem(German)，Merck(German)，Promage(USA)等多家生物公司都開(kāi)發(fā)了并且繼續(xù)開(kāi)發(fā)凋亡誘導(dǎo)產(chǎn)品。有一些凋亡誘導(dǎo)劑已經(jīng)成為臨床用化療藥物，例如喜樹(shù)堿(Y Pommier.Diversity ofDNA topoisomerases I and inhibitors.Biochimie，1998，80；255-270.)。這些產(chǎn)品全部屬于維生素A，非甾體類抗炎藥、多酚、香草素、和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，可見(jiàn)他們?nèi)匀灰蕴烊凰幬锘蚱漕愃莆锏幕瘜W(xué)合成產(chǎn)物為主，都存在著來(lái)源不足、價(jià)格昂貴、選擇性低、副反應(yīng)大、效果不理想等問(wèn)題。為了發(fā)現(xiàn)新的化療藥物，The National Cancer Institute已經(jīng)隨機(jī)篩選了300000個(gè)不同種類化合物的抗腫瘤活性(John N.Weinstein，Timothy GMyers，Patrick M.O’Connor，et al.Aninformation-intensive approach to the molecular pharmacology of cancer.Science，1997，275；3430-349.)。近年來(lái)，錢旭紅等也合成、檢測(cè)、報(bào)道了多種抗癌化合物。這一研究領(lǐng)域的目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)、更低的半數(shù)致死濃度、以誘導(dǎo)凋亡為作用途經(jīng)、體內(nèi)體外均具有抗腫瘤活性的化合物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在已經(jīng)成功制備新的熒光發(fā)色團(tuán)8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈及其衍生物(ZL021484007，錢旭紅，肖義)的基礎(chǔ)上，在母體8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈上引入新的活性基團(tuán)，創(chuàng)制了本發(fā)明所涉及的新型細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和抗腫瘤化合物。
本發(fā)明是在8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的3或6位引入各種伯胺和仲胺以及鹵素，生成3，6-二取代，3-取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，這是一類具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和抗腫瘤活性的化合物，其分子結(jié)構(gòu)通式
(1)R1＝NHR4，R2＝H，a、R4＝X SR5，X＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，R5＝CH3，C2H5；b、R4＝Y(jié)COO(CH2)mCH3，Y＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，m＝0-3；c、R4＝(CH2)nAr，n＝1-3，Ar＝2’-CF3Ph-，3’-CF3Ph-，4’-CF3Ph-，2’-FPh-， 3’--FPh-，4’-FPh-；d、R4＝(CH2)xCF3，x＝2，3；e、R4＝X S(O)R6，X＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，R6＝CH3，C2H5；f、R4＝X S(O2)R6，X＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，65＝CH3，C2H5 (2)R2＝吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，N’-甲基哌嗪基，嗎啉基，硫嗎啉基； (3)R1＝F，Cl，Br，R2＝H； (4)R1＝H，R2＝F，Cl，Br； (5)R1＝R2＝F，Cl，Br。
本發(fā)明是以具有很好的剛性共平面性并且強(qiáng)缺電子的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(ZL021484007)為原料，與親核試劑伯胺或伸胺發(fā)生芳香氫親核取代反應(yīng)，得到3，6-二取代，3-取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(分子結(jié)構(gòu)通式A)
8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈在溶劑(四氫呋喃，乙腈，吡啶，二甲基甲酰胺或二甲基亞砜)中，與等摩爾量的伯胺，仲胺類親核試劑反應(yīng)，溫度為20-100℃，反應(yīng)時(shí)間0.5～24小時(shí)。冷卻后減壓蒸除部分溶劑后，過(guò)濾或直接柱層析即可制得產(chǎn)品3或6-單取代氨基-8-氧代-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈。
而3，6-雙取代氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的合成方法則為8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈在溶劑(四氫呋喃，乙腈，吡啶，二甲基甲酰胺或二甲基亞砜)中與過(guò)量的(4～5倍摩爾量)的仲胺長(zhǎng)時(shí)間經(jīng)6～48小時(shí)反應(yīng)，溫度為20-100℃，同上述同樣處理后得到二取代產(chǎn)品。
3或6-鹵素取代的8-氧-8氫-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(分子通式A中的5，6，7)的合成方法為堿催化環(huán)合反應(yīng)原料2-(2-氧代-2氫-鹵代苊)-丙二腈，在溶劑(四氫呋喃，丙酮，吡啶，二甲基甲酰胺，乙腈，乙醇，甲醇或二甲基亞砜)中，堿性催化劑(碳酸鉀，三乙胺或吡啶)存在下，溫度為40-120℃，攪拌10-100分鐘。冷卻后減壓蒸除部分溶劑后，過(guò)濾即可制得產(chǎn)品。

A系列化合物，和專利ZL021484007中已經(jīng)作為熒光發(fā)色團(tuán)公開(kāi)結(jié)構(gòu)的B系列化合物
(1)R1＝硫嗎啉基，吡咯烷基，R2＝H； (2)R1＝NHR4，R2＝H，R4＝C1-C12支鏈烷基； (3)R1＝R2＝吡咯烷基，硫嗎啉基； (4)R1＝NH(CH2)yNR5，y＝2，3，R5＝CH3，C2H5，R2＝H； (5)B1(當(dāng)R1＝硫嗎啉基，R2＝H時(shí)) 作為體內(nèi)、體外細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和抗腫瘤化合物的應(yīng)用。方法是首先通過(guò)MTT法測(cè)定IC50。選擇HELA細(xì)胞為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度約為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl腫瘤細(xì)胞懸液。分別加入化合物A、B的100％DMSO溶液，終濃度100，50，10，5，0.5，0.1，0.05，0.01μM，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和陽(yáng)性藥物環(huán)磷酰胺對(duì)照組。CO2溫箱中孵育24hrs后每孔加入MTT溶液20μl，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm下光密度(OD)值，根據(jù)光密度值，計(jì)算各孔腫瘤細(xì)胞的存活率。
結(jié)果表明細(xì)胞毒性最強(qiáng)的化合物B1的IC50＝0.17μM(0.56μg)。其它化合物IC50值在0.4-6.8μM之間。
體內(nèi)抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)方法是首先培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系H22，按200μl/只接種于小鼠右腋皮下，制備成腫瘤動(dòng)物模型。于接種后5天，瘤塊形成。開(kāi)始按照濃度梯度每日一次靜脈或局部注射化合物A、B的30％DMSO溶液。實(shí)驗(yàn)期間每周兩次測(cè)定腫瘤長(zhǎng)徑(a)及與之相垂直的短徑(b)，按公式1/2ab2計(jì)算瘤塊體積。觀察動(dòng)物存活時(shí)間。結(jié)果表明A系列化合物和B系列化合物均有不同程度抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)腫瘤模型動(dòng)物生存時(shí)間的作用。
本發(fā)明還通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了A、B系列化合物在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用。方法是體外試驗(yàn)中，選擇HeLa細(xì)胞為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度約為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl腫瘤細(xì)胞懸液。按濃度梯度分別加入化合物A、B，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和陽(yáng)性藥物環(huán)磷酰胺對(duì)照組。CO2溫箱中孵育24小時(shí)后，70％冷乙醇固定；體內(nèi)試驗(yàn)中，取經(jīng)過(guò)化合物處理的腫瘤模型動(dòng)物的腫瘤組織，制備單細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)定未經(jīng)處理的腫瘤模型動(dòng)物組為對(duì)照。70％冷乙醇固定。上機(jī)檢測(cè)前洗去固定液，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)算機(jī)自動(dòng)對(duì)各峰的位置、峰高度、細(xì)胞周期各時(shí)相百分比進(jìn)行分析。結(jié)果表明，效果最佳的化合物B1在0.01-10μM之間以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率在9％-31％。細(xì)胞周期阻滯在S期。其它化合物均以劑量依賴方式誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞凋亡。
A、B系列化合物均作為抗腫瘤化合物或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式在體內(nèi)、體外抑制腫瘤的生長(zhǎng)。



圖1流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。橫坐標(biāo)為DNA濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)。化合物B1與培養(yǎng)細(xì)胞共孵育，終濃度0.01μM。24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，電腦分析DNA濃度和細(xì)胞周期。圖示可見(jiàn)凋亡峰，凋亡比例9.4％，細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示S期細(xì)胞占6.7％。
圖2流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。化合物B1與培養(yǎng)細(xì)胞共孵育，終濃度0.1μM。24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果可見(jiàn)凋亡峰，凋亡比例15.6％，細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示S期細(xì)胞占26.5％。
圖3流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果?；衔顱1與培養(yǎng)細(xì)胞共孵育，終濃度10μM。24小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果可見(jiàn)凋亡峰，凋亡比例31.3％，細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示S期細(xì)胞占32.4％。
圖4a流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。皮下荷瘤小鼠，經(jīng)過(guò)化合物B1處理后，取瘤塊制備細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果可見(jiàn)凋亡峰，凋亡比例13.1％。
圖4b流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。對(duì)照組皮下荷瘤小鼠(未經(jīng)過(guò)化合物處理)，取瘤塊制備細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果沒(méi)有凋亡峰。

具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.46克3-巰甲基-丙胺，常溫?cái)嚢?小時(shí)，蒸發(fā)部分溶劑，析出產(chǎn)品3-(3′-巰甲基-丙基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A1，收率60％。M.p.266-268℃；1H NMR(400M，DMSO)δ9.604(br s，-NH-，1H)，8.5-8.54(d，J＝7.6Hz，1H)，8.2-8.21(d，J＝7.2Hz，1H)，7.75-79(d，J＝8.8Hz，1H)，7.57-7.6(t，J＝7.8Hz，1H)，6.9-6.92(d，J＝9.2Hz，1H)，3.24(br s，-NHCH2CH2-，2H)，2.82-2.84(m，-NHCH2CH2CH2-，2H)，2.42(br s，-SCH3-，3H)，1.89-1.91(m，-NHCH2CH2CH2-，2H)；ESI-MS[M+H]-(334m/z). 實(shí)施例2
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.54克4-氨基丁酸乙酯，常溫?cái)嚢?0分鐘，蒸發(fā)部分溶劑，析出產(chǎn)品3-(3′-羧酸乙酯丙基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A2，收率65％。M.p.＞300℃；1H NMR(400M，DMSO)δ9.20(br s，-NH-，1H)，8.84-8.86(d，J＝7.6Hz，1H)，8.64-8.66(d，J＝7.2Hz，1H)，7.95＝7.97(d，J＝8.8Hz，1H)，7.74-7.78(t，J＝7.8Hz，1H)，6.80-6.82(d，J＝9.2Hz，1H)，4.14-4.19(q，-COOCH2CH3，2H)，3.62-3.67(m，-NHCH2CH2CH2-，2H)，2.52-2.55(m，-NHCH2CH2CH2COO-，2H)，2.10-2.13(m，-NHCH2CH2CH2COO-，2H)，1.35-1.38(t，-COOCH2CH3，3H)；ESI-MS[M+H]-(360m/z). 實(shí)施例3
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.45克硫嗎啉，常溫?cái)嚢?小時(shí)，柱層析分離出產(chǎn)品3-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈和6-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A3，收率分別為40％和30％。A3M.p.225℃分解；1H NMR(400M，DMSO)8.69-8.71(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42-8.45(d，J＝8.2Hz，1H)，7.98-7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.88-7.92(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04-7.02(d，J＝8.2Hz，1H)，3.68(br s，-N(CH2CH2)2S，4H)，3.05(br s，-N(CH2CH2)2S，4H)；ESI-MS[M-H]-(330m/z). 實(shí)施例4
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.43克N-甲基哌嗪，常溫?cái)嚢?小時(shí)，柱層析分離出產(chǎn)品6-(N’-甲基哌嗪基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A4，收率30％。A4M.p.240℃分解；1H NMR(400M，DMSO)8.69-8.71(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42-8.45(d，J＝8.2Hz，1H)，7.98-7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.88-7.92(t，J＝8.0Hz，1H)，7.04-7.02(d，J＝8.2Hz，1H)，3.45(br s，-N(CH2CH2)2NCH3，4H)，2.95(br s，-N(CH2CH2)2NCH3，4H)，2.43((br s，-N(CH2CH2)2NCH3，3H)；ESI-MS[M+H]-(329m/z). 實(shí)施例5
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的50毫升乙腈中加入0.82克2-(4′-三氟甲基苯基)乙胺，常溫?cái)嚢?0分鐘，蒸發(fā)部分溶劑，析出產(chǎn)品3-2-(4′-三氟甲基苯基)乙氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A5，收率55％。A5M.p.254-256℃；1H NMR(400M，DMSO)δ9.13-9.11(d，J＝7.6Hz，-NH-，1H)，9.03-9.01(d，J＝7.6Hz，1H)，8.54-8.52(d，J＝7.2Hz，1H)，7.90-7.87(d，J＝9.2Hz，1H)，7.87-7.83(d，J＝8.0Hz，2H)，7.27-7.25(d，J＝8.0Hz，2H)，7.22-7.20(t，J＝8.0Hz，1H)，7.09-7.07(d，J＝9.2Hz，1H)，3.60-3.59(br s，-NHCH2CH2-，2H)，2.80-2.78(d，-NHCH2CH2，2H)；ESI-MS[M+H]-(418m/z). 實(shí)施例6
1克8-氧-8H苊并[1，2-b]吡咯9-腈的50毫升乙腈中加入0.50克2-三氟甲基乙胺，常溫?cái)嚢?0分鐘，蒸發(fā)部分溶劑，析出產(chǎn)品3-(2′-三氟甲基乙基)氨基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A6，收率55％。M.p.266-268℃；1H NMR(400M，DMSO)δ9.450(br s，-NH-，1H)，8.6-8.62(d，J＝7.6Hz，1H)，8.42-8.45(d，J＝7.2Hz，1H)，7.80-7.82(d，J＝8.8Hz，1H)，7.57-7.6(t，J＝7.8Hz，1H)，7.12-7.14(d，J＝9.2Hz，1H)，3.16(br s，-NHCH2CH2-，2H)，2.32-2.34(m，-NHCH2CH2CF3-，2H)；ESI-MS[M+H]-(342m/z).實(shí)施例7
1克2-(2-氧代-2氫-苊)-丙二腈，0.2克碳酸鉀，10毫升二甲基亞砜，加熱到100℃，攪拌15分鐘，冷卻析出晶體。過(guò)濾，水洗干燥，得產(chǎn)品黃棕色晶體8-氧代-8氫-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈A7，收率，80％。1H NMR(400M，DMSO)δ8.71-8.69(d，J＝8.0Hz，1H)，8.67-8.65(d，J＝7.6Hz，1H)，8.64-8.62(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42-8.40(d，J＝7.6Hz，1H)，7.99-7.95(t，J＝7.8Hz，1H)；13C NMR(100M，DMSO)δ177.48，138.26，137.73，134.40，132.72，131.82，131.37，128.91，127.94，127.37，126.13，122.22，119.72，113.82，113.38；IR(KBr)cm-12231，1643，1577；ESI-MSM+Na+(331，m/z). 實(shí)施例8 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。采用細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)A、B系列化合物進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。首先通過(guò)MTT法測(cè)定IC50。選擇HeLa細(xì)胞為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度約為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl腫瘤細(xì)胞懸液。分別加入A、B系列化合物的100％DMSO溶液，終濃度100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.05，0.01μM，同時(shí)設(shè)立培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞對(duì)照組和抗癌藥物環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組。CO2溫箱中孵育24hrs后每孔加入MTT溶液20μl，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm下光密度(OD)值，根據(jù)光密度值，計(jì)算各孔腫瘤細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。根據(jù)公式logIC50＝Xm-I[P-1/4(3-Pm-Pn)]計(jì)算IC50。
其中，Xmlog最大濃度，Ilog(最大濃度/相對(duì)濃度)，P陽(yáng)性率之和，Pm最大陽(yáng)性率，Pn最小陽(yáng)性率。結(jié)果表明細(xì)胞毒性最強(qiáng)的化合物B1的IC50＝0.17μM(0.56μg)。(表1)。其它化合物IC50值在0.4-6.8μM之間。
再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡比例和細(xì)胞周期阻滯。選擇HELA細(xì)胞為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度約為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl腫瘤細(xì)胞懸液。分別加入化合物，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和陽(yáng)性藥物環(huán)磷酰胺對(duì)照組。CO2溫箱中孵育24小時(shí)后，冷乙醇固定。上機(jī)前洗去固定液，取單細(xì)胞懸液，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)算機(jī)自動(dòng)對(duì)各峰的位置、峰高度、細(xì)胞周期各時(shí)相百分比進(jìn)行分析。結(jié)果表明，效果最佳的化合物B1在0.01-10μM之間以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率在9％-31％。細(xì)胞周期阻滯在S期(附圖1-3)。
其它化合物均以劑量依賴方式誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞凋亡，凋亡比例在15％左右。實(shí)施例9 體內(nèi)抗腫瘤活性檢測(cè)。選擇飼養(yǎng)的中國(guó)昆明小鼠，隨機(jī)分組，每組10只。培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞H22，按200μl/只接種于小鼠右腋皮下。于荷瘤5天后，皮下瘤塊形成。開(kāi)始靜脈或局部注射化合物A、B的30％DMSO溶液。以化合物B1為例，分為0.03mg/kg體重組，和0.3mg/kg體重組。實(shí)驗(yàn)期間每周兩次測(cè)定腫瘤長(zhǎng)徑(a)及與之相垂直的短徑(b)，按公式1/2ab2計(jì)算腫瘤體積.觀察動(dòng)物存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)第14天，按腫瘤體積計(jì)算抑瘤率。0.03mg/kg體重組抑瘤率50％，0.3mg/kg體重組抑瘤率70％。其它化合物均有不同程度抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，抑制率在20-50％左右。
對(duì)照組動(dòng)物平均生存時(shí)間為18天，化合物組的平均壽命26天。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示P＜0.05，認(rèn)為這些化合物具有延長(zhǎng)腫瘤動(dòng)物生存時(shí)間的作用。
試驗(yàn)7天后，剝?nèi)⌒∈笃は履[瘤，按1∶3體積用生理鹽水將組織勻漿制備細(xì)胞懸液，同上方法用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率。結(jié)果表明這些化合物都具有誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞凋亡的作用(附圖4a，4b)。凋亡比例在10％-50％之間。 表1化合物B1對(duì)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞的抑制濃度(μM)0.01 0.05 0.1 0.2 0.4 0.5 1 2抑制率(％)(3次)2 6.7 31.5 53.5 68 78 83.8 89.81.2 6 31 52.2 67.5 76.6 83.4 87.81.4 7.1 31.4 51.2 67.6 76.4 83.6 88.2平均抑制率(％)1.53 6.6 31.3 52.3 67.7 77.0 83.6 88.權(quán)利要求
1、一類8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的氨基或鹵素取代衍生物，其特征在于該衍生物是3，6-二取代，3-取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，分子結(jié)構(gòu)通式A
通式A中，(1)R1＝NHR4，R2＝H，
a、R4＝XSR5，X＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，R5＝CH3，C2H5；
b、R4＝Y(jié)COO(CH2)nCH3，Y＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，n＝0-3；
c、R4＝(CH2)xAr，x＝1-3，Ar＝2’-CF3Ph-，3’-CF3Ph-，4’-CF3Ph-，2’-FPh-，
3’--FPh-，4’-FPh-；
d、R4＝(CH2)yCF3，y＝2，3；
e、R4＝XS(O)R6，X＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，R6＝CH3，C2H5；
f、R4＝XS(O2)R6，X＝C2-C6直鏈或支鏈烷基，R6＝CH3，C2H5；
(2)R2＝吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，N’-甲基哌嗪基，嗎啉基，硫嗎啉基，R1＝H；
(3)R1＝F，Cl，Br，R2＝H；
(4)R1＝H，R2＝F，Cl，Br；
(5)R1＝R2＝F，Cl，Br。
2、按照權(quán)利要求1所述的化合物A和化合物B作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的應(yīng)用，其特征在于A、B兩類化合物的100％DMSO溶液，與培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞共孵育24小時(shí)，濃度梯度為0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的條件下，經(jīng)過(guò)70％乙醇固定，碘化丙啶染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果證明它們能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，凋亡比例在9％-31％之間，并且能夠阻斷細(xì)胞周期于S期。
3、按照權(quán)利要求1所述的化合物A和化合物B作為抗癌化合物的應(yīng)用，其特征在于A、B兩類化合物的30％DMSO溶液，局部注射或靜脈注射于腫瘤模型動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)30天左右的觀察期，證明他們能夠延長(zhǎng)腫瘤模型動(dòng)物的生存期(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組的平均壽命在26天，30％DMSO對(duì)照組的平均壽命在18天，觀察過(guò)程中每周兩次測(cè)定腫瘤長(zhǎng)徑(a)及與之相垂直的短徑(b)，按公式1/2ab2計(jì)算腫瘤體積，結(jié)果證明他們能夠抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)(P＜0.01)；觀察結(jié)束后處死動(dòng)物，剝?nèi)∧[瘤組織，勻漿后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證明他們能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡比例在10％-50％之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類8－氧－8H－苊并[1，2－b]吡咯－9－腈的氨基或鹵素取代衍生物及其生物學(xué)用途，主要包括在體內(nèi)、體外的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和作為抗癌化合物的應(yīng)用。該類化合物是3，6－二取代，3－取代或6－取代的8－氧－8H－苊并[1，2－b]吡咯－9－腈的衍生物。他們能夠在低至0.01μm直到10μm的寬濃度范圍內(nèi)以劑量依賴的方式誘導(dǎo)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并阻滯細(xì)胞周期?；钚宰罡叩幕衔顱1的IC50=0.17μm(0.56μg)。應(yīng)用于腫瘤模型動(dòng)物體內(nèi)能夠通過(guò)誘導(dǎo)凋亡的方式明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。是一類活性很高的凋亡誘導(dǎo)劑和抗腫瘤化合物。
文檔編號(hào)C07D209/56GK1616428SQ200410050449
公開(kāi)日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者錢旭紅, 張志超, 肖義, 劉鳳玉, 呂哲 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)