專利名稱：一種微藻藻紅蛋白分離純化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用蒸餾水浸提、硫酸銨分級沉淀和離子交換柱層析分離純化微藻藻紅蛋白的技術(shù)。
藻膽蛋白是一種水溶性色素蛋白，存在于紅藻、藍(lán)藻、隱藻和某些甲藻體內(nèi)，是這些藻類特有的光合系統(tǒng)捕光色素，在光合作用中起捕集光能和傳遞能量的作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和光譜特性，藻膽蛋白分為藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)和別構(gòu)藻藍(lán)蛋白(A-PC)。藻紅蛋白將捕獲的光能傳遞給藻藍(lán)蛋白，再傳遞給別藻藍(lán)蛋白，最后傳遞給中心色素，實現(xiàn)光合作用。因而藻紅蛋白在光合作用的原初理論方面具有重要的研究價值。另一方面，藻紅蛋白用途廣泛，既可以作為天然色素廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、染料等工業(yè)，又可制成熒光試劑，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷、免疫化學(xué)及生物工程等領(lǐng)域，作為光敏劑用于光動力治療腫瘤。
紫球藻細(xì)胞內(nèi)有一個大而呈星形的色素體，內(nèi)含豐富的藻紅蛋白及藻藍(lán)蛋白，藻紅蛋白占藻膽蛋白84％，其中以B-藻紅蛋白含量最多。Kost-Reyes(EurJBiochem.1979，102(1)83-91)利用無載體電泳從過柱的蛋白中分離出B-藻紅蛋白、b-藻紅蛋白和R藻藍(lán)蛋白，最后獲得的B-藻紅蛋白OD545/OD280比率≥5。Stadnichuk(J Photochemistry Photobiology B.1997，3919-23)通過ToypearlDEAE-650M離子交換、羥基磷灰石和Sephadex G-200凝膠分離得到紫球藻B-藻紅蛋白，最終得到的B-藻紅蛋白OD542/OD500＝2.00，OD542/OD280＞6.0。Bermejo(JChromatogr A.2001，917(1-2)135-145，J Botech.2002，9373-85；JChromatogr B.2003，709317-325)等利用兩步層析的方法分離純化紫球藻B-藻紅蛋白，采用反向高性能液體色譜梯度半制備方法，用C4大孔徑柱和含有0.05％三氟乙酸(TFA)的水溶液和0.05％TFA的乙氰溶液分離藻紅蛋白的α、β和γ亞基，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳產(chǎn)生三條接近的條帶，這三條帶和它的三個亞基相對應(yīng)。他們還制備自然態(tài)的B-藻紅蛋白和R-藻藍(lán)蛋白。建立一種新的且可放大的分離純化紫球藻B-藻紅蛋白的方法，該實驗結(jié)合膨化床和DEAE-纖維素填充床兩種層析方法。Ma(Plant Sci.2003，164253-257)等利用SephadexG-200凝膠層析分離紫球藻B-藻紅蛋白和R-藻藍(lán)蛋白，并利用這兩種蛋白氨基基團(tuán)之間的相互反應(yīng)形成人工B-藻紅蛋白-R-藻藍(lán)蛋白共價聯(lián)合體，實驗結(jié)果表明這種人工共價聯(lián)合體的穩(wěn)定性高于B-藻紅蛋白，有望用于藻膽蛋白探針的制備。溫少紅(海洋通報.2000，19(3)90-93；中國海洋藥物.2001，333-35)等將紫球藻的水溶性粗提物經(jīng)過硫酸銨沉淀和羥基磷灰石柱層析，分離純化得到B-藻紅蛋白(B-PE)，B-PE在545nm和563nm各有一個吸收峰，在498nm有一吸收肩峰。他們還將藻膽蛋白粗提物經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、羥基磷灰石和SephadexG-100柱層析，分離純化得到B-藻紅蛋白，純度(OD545/OD280)分別為4.92和3.78，聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳得到一條帶。
本發(fā)明的目的就是提供一種將藻粉反復(fù)浸提，硫酸銨分部沉淀得到粗藻膽蛋白，經(jīng)離子交換柱層析純化得到高純度的藻紅蛋白的技術(shù)。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的而采用的技術(shù)方案是首先將微藻藻粉按1∶10～15加蒸餾水于冰箱中過夜浸提，浸提后高速冷凍離心機(jī)4℃、6000r/min離心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶8.0～12.5加蒸餾水于冰箱中繼續(xù)2次過夜浸提，于4℃、6000r/min離心20min，各取上清液，合并3次浸提所得上清液(即為藻紅蛋白粗提液)，分組，分別加入固體硫酸銨20、40、60、80％飽和度，混勻后靜置過夜，4℃、6000r/min離心20min，取沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水裝入透析袋中，4℃蒸餾水透析24h，再用pH7.0的0.01mol/L磷酸鈉緩沖液平衡透析24h。將透析后的樣品于4℃、6000r/min離心20min，取上清液，即為上樣樣品。將裝好的DEAE-Sepharose FF柱用0.01mol/L磷酸鈉緩沖液平衡，直至流出液pH值為7.0。將樣品上樣于平衡好的柱頂，用0.01～0.02mol/L磷酸鈉緩沖液洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，然后用0.5～1.0mol/LNaCl作梯度洗脫，流速1.5mL/min。將收集到的各管測其280nm和545nm處的光吸收值，并作出280nm層析曲線。根據(jù)吸收峰和OD545/OD280比值，收集樣品，透析、濃縮、離心、凍干得樣品。本發(fā)明具體的技術(shù)方案包括以下具體的步驟1、藻紅蛋白的提取稱取一定量凍干藻粉，如Rhodella reticulate、紫球藻(Porphydidium cruentum)按1∶10～15加蒸餾水于冰箱中過夜浸提，浸提后于高速冷凍離心機(jī)4℃、6000r/min離心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶8.0～12.5加蒸餾水繼續(xù)2次過夜浸提，于高速冷凍離心機(jī)4℃、6000r/min離心20min，取上清液。合并上述3次浸提所得上清液即為藻紅蛋白粗提液。
2、硫酸銨分級沉淀粗提液分組，分別加入固體硫酸銨，飽和度為20％、40％、60％和80％，進(jìn)行雜蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)的分級沉淀，靜置過夜后，高速冷凍離心機(jī)，4℃、6000r/min離心20min，取沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水裝入透析袋中，4℃蒸餾水透析15～24h，然后用pH7.0緩沖液平衡透析15～24h。將透析后的樣品于高速冷凍離心機(jī)，4℃6000r/min離心20min，取上清液，即為上樣樣品。分別測定經(jīng)硫酸銨分級沉淀的藻紅蛋白樣品純度，以確定硫酸銨分級沉淀所采用的飽和度。
3、DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析將裝好的DEAE-Sepharose FF柱，用pH7.0緩沖液平衡，直至流出液為pH7.0。將樣品上樣于平衡好的柱頂，用上樣緩沖液洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，然后用0.5～1.0mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，將收集到的各管測其280nm和545nm處的光吸收值，并作出280nm層析曲線。根據(jù)吸收峰和OD545/OD280比值，收集較純的樣品，透析、濃縮、離心、凍干得藻紅蛋白樣品。
本發(fā)明具有的優(yōu)點在于藻紅蛋白經(jīng)過DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析一步純化，純度達(dá)到OD545/OD280＝4.85，所得樣品在聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示一條帶，說明已達(dá)到電泳純，總收率52％。采用DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析具有純化效果好、上樣量大、樣品得率較高且可用于放大生產(chǎn)等特點。與已報道的藻紅蛋白分離純化方法相比，采用DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析優(yōu)于采用羥基磷灰石柱層析、Sephadex G-100凝膠柱層析。
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
實施例11、藻紅蛋白的提取稱取5g紫球藻凍干粉按1∶10的比例加50mL蒸餾水于冰箱中過夜浸提，充分浸提后于高速冷凍離心機(jī)4℃6000r/min離心20min，取上清液。沉淀的藻泥加50mL蒸餾水繼續(xù)過夜浸提2次。合并3次浸提所得上清液即為藻紅蛋白粗提液。
2、硫酸銨分級沉淀粗提液分組，分別加入固體硫酸銨，飽和度為20％、40％、60％和80％，混勻后進(jìn)行雜蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)的分級沉淀，靜置過夜，高速冷凍離心機(jī)，4℃、6000r/min離心20min，取沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水裝入透析袋中，4℃蒸餾水透析24h，然后用0.01mol/L磷酸鈉緩沖液(PBS)pH7.0緩沖液平衡透析24h。將透析后的樣品于高速冷凍離心機(jī)，4℃6000r/min離心20min，取上清液，即為上樣樣品。分別測定經(jīng)硫酸銨分級沉淀的藻紅蛋白樣品純度，以確定硫酸銨分級沉淀所采用的飽和度。
3、藻紅蛋白DEAE-Sepharose FF柱層析純化將裝好的DEAE-SepharoseFF柱，用0.01mol/L磷酸鈉緩沖液平衡，直至流出液為pH7.0。將樣品上樣于平衡好的柱頂，用上樣緩沖液洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，然后用0.5mol/L NaCl作梯度洗脫，洗脫液總體積為300mL，流速1.5mL/min，每管收集約5mL。將收集到的各管測其280nm和545nm處的光吸收值，并作出280nm層析曲線。根據(jù)吸收峰和OD545/OD280比值，收集較純的樣品，透析、濃縮、凍干得紫球藻藻紅蛋白樣品。
實施例21、藻紅蛋白的提取稱取5gRhodella reticulate凍干粉按1∶15的比例加75mL蒸餾水于冰箱中過夜浸提，充分浸提后于高速冷凍離心機(jī)4℃6000r/min離心20min，取上清液。沉淀的藻泥按1∶12.5加60mL蒸餾水繼續(xù)2次過夜浸提。合并3次浸提所得上清液即為藻紅蛋白粗提液。
2、硫酸銨分級沉淀，粗提液分組，分別加入固體硫酸銨，飽和度為20％、40％、60％和80％，混勻后進(jìn)行雜蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)的分級沉淀，靜置過夜，高速冷凍離心機(jī)，4℃、6000r/min離心20min，取沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水裝入透析袋中，4℃蒸餾水透析24h，然后用0.02mol/L磷酸鈉緩沖液(PBS)pH7.0緩沖液平衡透析24h。將透析后的樣品于高速冷凍離心機(jī)，4℃6000r/min離心20min，取上清液，即為上樣樣品。分別測定經(jīng)硫酸銨分級沉淀的藻紅蛋白樣品純度，以確定硫酸銨分級沉淀所采用的飽和度。
3、藻紅蛋白DEAE-Sepharose FF柱層析純化，將裝好的DEAE-SepharoseFF柱，用0.02mol/L磷酸鈉(pH7.0)緩沖液平衡，直至流出液pH7.0。將樣品上樣于平衡好的柱頂，用上樣緩沖液洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，然后用1.0mol/L NaCl作梯度洗脫，洗脫液總體積為500mL，流速2.0mL/min，每管收集約5mL。將收集到的各管測其280nm和545nm處的光吸收值，并作出280nm層析曲線。根據(jù)吸收峰和OD545/OD280比值，收集較純的樣品，透析、濃縮、凍干得薔薇藻藻紅蛋白。
權(quán)利要求
1.一種采用硫酸銨分級沉淀和離子交換柱層析微藻藻紅蛋白的分離純化技術(shù)，其特征是I、藻粉加蒸餾水于冰箱中過夜浸提，離心分離上清液，沉淀的藻泥加蒸餾水于冰箱中2次過夜浸提，合并所得上清液即為藻紅蛋白粗提液；II、藻紅蛋白粗提液加入固體硫酸銨，過夜、離心，取沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中蒸餾水透析，磷酸鈉緩沖液平衡透析，將透析后的樣品離心，取上清液即為上樣樣品；III、將樣品上樣于平衡好的DEAE-Sepharose FF離子交換柱柱頂，用緩沖液洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，用0.5～1.0mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化技術(shù)，其特征是藻粉和藻泥分別按1∶10～15和1∶8.0～12.5加蒸餾水浸提后，于高速冷凍離心機(jī)4℃、6000r/min離心20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化技術(shù)，其特征是藻紅蛋白粗提液分組后加入固體硫酸銨，飽和度分別為20％、40％、60％和80％進(jìn)行分級沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化技術(shù)，其特征是經(jīng)固體硫酸銨分級沉淀后的沉淀溶于少量蒸餾水裝入透析袋中，4℃蒸餾水透析24h，再用pH為7.0的0.01mol/L磷酸鈉緩沖液平衡透析24h，于4℃、6000r/min離心20min，取上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化技術(shù)，其特征是將樣品上樣于平衡好的DEAE-Sepharose FF離子交換柱柱頂，用0.01～0.02mol/L磷酸鈉上樣緩沖液洗柱直至280nm處吸收峰回到基線，然后用0.5～1.0mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，流速1.5mL/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用蒸餾水浸提、硫酸銨分級沉淀和離子交換柱層析分離純化微藻藻紅蛋白的技術(shù)。凍干藻粉及藻泥加蒸餾水于4℃過夜浸提、高速冷凍離心，加入固體硫酸銨至一定的飽和度時進(jìn)行分級沉淀，磷酸鈉緩沖液平衡透析，離心20min后，采用離子交換柱層析將上清液一步純化，得到藻紅蛋白。本發(fā)明通過硫酸銨分級沉淀、DEAE－Sepharose FF離子交換柱層析一步純化得到藻紅蛋白，具有純化效果好、上樣量大、樣品得率較高且可用于放大生產(chǎn)等特點，所分離得藻紅蛋白純度達(dá)到4.85，總收率52％，聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示一條帶。
文檔編號C07K14/405GK1587275SQ20041006307
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月13日
發(fā)明者陳必鏈, 王娟, 黃鍵, 王明茲 申請人:福建師范大學(xué)