專利名稱：胞苷－5′－一磷酸的制備方法
涉及領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種核苷酸的制備，尤其涉及“胞苷-5’-一磷酸”的制備方法，特別涉及以胞苷為原料采用化學(xué)合成的方法制備“胞苷-5’-一磷酸”。
背景技術(shù)：
核糖核酸(RNA)是一種生物高分子化合物，是構(gòu)成生物細(xì)胞的主要成份。從結(jié)構(gòu)上看，RNA由許多重復(fù)單元構(gòu)成，這些重復(fù)單元便是核苷酸。因此，核苷酸及其衍生物具有多種生物活性物質(zhì)，可以直接或間接地作為藥物使用，其系列化合物主要用于醫(yī)藥領(lǐng)域，用途十分廣泛，新產(chǎn)品層出不窮，應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大，對(duì)治療多種疾病起到了極其重要的作用。
本發(fā)明所涉及的“胞苷-5’-一磷酸”是構(gòu)成RNA的一種基本核苷酸，又稱為“5’-胞苷酸”、“5’-單磷酸胞苷”或“5’-CMP”，其分子式為C9H14N3O8P，結(jié)構(gòu)如式I所示。
(式I) (式II)5’-CMP不僅可以與其它核苷酸搭配使用而生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)食品添加劑或化妝品，更重要的是，它可以作為中間體用來制備胞二磷膽堿、胞苷三磷酸、阿糖胞苷、聚肌胞等生化藥物，其中胞二磷膽堿能夠增加腦血流量，促進(jìn)腦損傷和中風(fēng)的恢復(fù)，在治療帕金森氏癥、老年癡呆癥、抑郁癥及心腦血管疾病等方面有很好療效；胞苷三磷酸是一種抗病毒藥物，其作用類似于鹽酸環(huán)胞苷、ATP(三磷酸腺苷)；阿糖胞苷也有抗病毒作用，是治療急性白血病的常用藥；聚肌胞是人工合成的雙鏈核糖核酸，可誘生低水平干擾素，具有抗病毒作用，能調(diào)節(jié)肌體免疫功能，促使人體非特異性免疫功能和某些特異性免疫功能的增強(qiáng)，起到抗細(xì)胞壞死和抗腫瘤作用，常用于治療慢性病毒性肝類疾病、單純皰疹及扁平疣等。這些生化藥物臨床上需求量比較大，目前國(guó)內(nèi)有幾十家藥廠生產(chǎn)，但由于其起始生產(chǎn)原料——5’-CMP比較缺乏，使得每年需要從國(guó)外大批量高價(jià)進(jìn)口。
現(xiàn)有技術(shù)中，制備5’-CMP的方法主要有核酸降解法、酶合成法和化學(xué)合成法三大類。
核酸降解法是利用核酸酶P1的核心核酸降解水酵母RNA，得到5’-腺苷酸、5’-鳥苷酸、5’-尿苷酸和5’-CMP等核苷酸，然后用離子交換色譜柱分離，再經(jīng)過精制而制得5’-CMP。這是我國(guó)目前生產(chǎn)5’-CMP的主要方法，但這種方法生產(chǎn)周期長(zhǎng)，分離與精制工序復(fù)雜，產(chǎn)量小，加工成本高。
酶合成法是采用微生物酶為基礎(chǔ)的生產(chǎn)技術(shù)，以聚核苷酸磷酸化酶和核苷磷酸化酶為酶源，經(jīng)過多次發(fā)酵加工，最終轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)品。該方法的缺點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，易染菌，轉(zhuǎn)化率較低。
化學(xué)合成法的路線是，先由胞嘧啶與四乙酰核糖(α、β-混合四乙酰-D-核糖)在四氯化錫等縮合劑的作用下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制得胞苷(分子式為C9H13N3O5，其結(jié)構(gòu)式見式II)。然后將胞苷與保護(hù)試劑2’、3’-O-異丙叉胞苷反應(yīng)，使胞苷分子內(nèi)2’、3’位置上的羥基先保護(hù)起來，再與磷酸化劑進(jìn)行酸化反應(yīng)，最后脫除保護(hù)劑便可制得5’-CMP。
很明顯，化學(xué)合成比其它兩種方法更具有優(yōu)點(diǎn)，其開發(fā)前景也最為看好。一方面，胞嘧啶是生產(chǎn)核苷酸產(chǎn)品當(dāng)中最為廉價(jià)的原料，另一方面，胞苷的合成工藝日趨成熟，因此，人們逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到以胞苷為原料合成5’-CMP上來，研究探索更好的工藝路線和條件，以便克服現(xiàn)有技術(shù)那種先保護(hù)、再酸化、最后脫保護(hù)的缺陷，從而簡(jiǎn)化工藝過程，使得制備高純度的胞苷-5’-一磷酸的工藝過程更為經(jīng)濟(jì)、高效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以胞苷為原料制備胞苷-5’-一磷酸的方法，該方法工藝過程短、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品純度高、能夠大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)解決方案來實(shí)現(xiàn)一種制備胞苷-5’-一磷酸的方法，以胞苷為起始原料，依次包括以下操作步驟①將胞苷溶于有機(jī)溶劑，加入磷酸化劑，在-15℃至-5℃、常規(guī)大氣壓力下進(jìn)行酸化反應(yīng)，磷酸化劑與胞苷的摩爾用量之比為1/1～1/1.5；②當(dāng)胞苷的酸化轉(zhuǎn)化率≥85％時(shí)，加入冰水終止反應(yīng)，并在-5℃～5℃溫度下水解1～3小時(shí)；③加入萃取劑進(jìn)行萃取，靜置分層，分離后分別得到有機(jī)相和水相；④用稀堿溶液中和水相，直至PH值為3～4，然后在10℃～0℃下冷凍結(jié)晶，固液分離得胞苷-5’-一磷酸粗品；⑤精制所得粗品，干燥，即得胞苷-5’-一磷酸成品。
本發(fā)明的目的還可通過以下技術(shù)解決措施來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)前述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步驟⑤精制過程的工序是，將粗品加入純水中，加熱溶解，加入活性炭脫色，過濾，冷卻后向?yàn)V液中加入乙醇，析出白色晶體，離心分離，真空干燥后得到胞苷-5’-一磷酸成品；或者是，用乙醇洗滌粗品，然后加入純水，用稀堿溶液調(diào)節(jié)PH值為5～6，加熱溶解后加入活性炭脫色，過濾，冷卻后再用稀酸溶液調(diào)節(jié)PH值為3～4，在10℃～0℃下冷凍結(jié)晶，固液分離即得胞苷-5’-一磷酸成品。
前述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步驟①中所述磷酸化劑是氧氯化磷，所述有機(jī)溶劑是鹵代烷烴、有機(jī)腈、二甲基甲酰胺或磷酸酯。
前述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步驟①酸化反應(yīng)過程中溫度優(yōu)選-10℃至-5℃，參加酸化反應(yīng)所有物料原料當(dāng)中的含水量均應(yīng)不超過0.1Wt％。
前述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其中步驟③所用萃取劑為鹵代烷，更優(yōu)選氯代烷。
前述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其中可以將步驟③萃取分離之后得到的有機(jī)相進(jìn)行蒸餾，回收其中所含有的萃取劑和酸化反應(yīng)有機(jī)溶劑，并重復(fù)使用。
本發(fā)明的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步體現(xiàn)在以下幾方面首先，胞嘧啶是生產(chǎn)核苷酸產(chǎn)品的最為廉價(jià)的原料，國(guó)內(nèi)每年現(xiàn)有上百噸的產(chǎn)量，原料來源廣、價(jià)格低，制得的胞苷價(jià)格也較為便宜。與核酸降解法、酶合成法相比，本發(fā)明優(yōu)勢(shì)十分明顯，不僅原料來源豐富、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品收率高、加工成本低，而且生產(chǎn)過程不會(huì)染菌，產(chǎn)品質(zhì)量可靠。
其次，與現(xiàn)有技術(shù)所采用的化學(xué)合成方法相比，本發(fā)明通過對(duì)酸化反應(yīng)溶劑的選擇、反應(yīng)條件的優(yōu)化、反應(yīng)終點(diǎn)的控制，使胞苷與磷酸化劑反應(yīng)生成5’-CMP的過程一次性完成，簡(jiǎn)化了制備工藝，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。
第三，本發(fā)明給出了胞苷在完成酸化反應(yīng)之后中和過量酸及脫除溶劑的最佳工藝條件，對(duì)于粗品的精制，本發(fā)明給出了兩種技術(shù)方案，能夠很好地去除反應(yīng)生成的大量鹽、副產(chǎn)物以及未反應(yīng)的胞苷，制得的產(chǎn)品用高效液相色譜分析含量在98％左右，純度很高。
此外，本發(fā)明可以有效防止和克服現(xiàn)有技術(shù)常發(fā)生的物料糖漿化現(xiàn)象，研究結(jié)果表明本發(fā)明所采用的技術(shù)方案工藝過程穩(wěn)定，各工序均能有效控制，可靠性強(qiáng)。
總之，本發(fā)明提供了一種更為經(jīng)濟(jì)、高效的制備5’-CMP的方法，該方法對(duì)于開發(fā)5’-CMP成套生產(chǎn)技術(shù)、實(shí)行從胞嘧啶→胞苷→胞苷酸→生化藥品等系列化加工與銜接都具有非常重要的積極意義。這種方法可以大幅度降低生產(chǎn)成本，為大規(guī)模生產(chǎn)胞苷酸產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的、優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)，將通過下面優(yōu)先實(shí)施例的非限制性說明進(jìn)行圖示和解釋，這些實(shí)施例是參照附圖僅作為例子給出的。


圖1為本發(fā)明工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
如圖1所示，本發(fā)明以胞苷為起始原料，在有機(jī)溶劑中、-15℃至-5℃溫度下，與氧氯化磷等磷酸化劑按照1/1～1/1.5摩爾用量的比例進(jìn)行反應(yīng)，制得胞苷-5’-一磷酸。反應(yīng)方程式可簡(jiǎn)化為 當(dāng)胞苷的酸化轉(zhuǎn)化率≥85％時(shí)，加入冰水終止反應(yīng)，并在0℃～5℃溫度下水解1～3小時(shí)；然后加入鹵代烷等萃取劑進(jìn)行萃取，靜置分層，分離后分別得到有機(jī)相和水相；有機(jī)相經(jīng)蒸餾回收，得到萃取劑和酸化反應(yīng)有機(jī)溶劑，可以重復(fù)使用；水相用NaOH等稀堿溶液中和，至PH值為3～4時(shí)冷凍結(jié)晶，固液分離得到5’-CMP粗品；粗品經(jīng)過精制和干燥處理，即得5’-CMP成品。
上述精制及干燥工序可以采用以下兩種方法之一其一，將粗品加入純水中，加熱溶解，加入活性炭脫色，過濾，冷卻后向?yàn)V液中加入乙醇，析出白色晶體，離心分離后真空干燥；其二，用乙醇洗滌粗品，然后加入純水，用稀堿溶液調(diào)節(jié)PH值為5～6，加熱溶解后加入活性炭脫色，過濾，冷卻后再用稀酸溶液調(diào)節(jié)PH值為3～4，冷凍結(jié)晶后離心分離，真空干燥。
長(zhǎng)對(duì)產(chǎn)品收率有影響，當(dāng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到85％以后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)液中5’-CMP的含量反而呈下降趨勢(shì)。其原因可能是由于在強(qiáng)酸環(huán)境下，5’-CMP分子中的苷鍵發(fā)生斷裂。因此在酸化反應(yīng)過程中，可以每隔半小時(shí)取一次樣品，用上述“電泳法”進(jìn)行分析，當(dāng)確定胞苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到85％以后，即可加入冰水終止反應(yīng)。
為防止苷鍵斷裂影響產(chǎn)品收率，酸化反應(yīng)應(yīng)當(dāng)在較低溫度下進(jìn)行。通過研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度在-15℃至-5℃之間，收率比較穩(wěn)定；溫度大于-5℃時(shí)，收率開始下降。一般地，以-10℃至-5℃之間比較適宜。
酸化反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)水解、萃取、中和、結(jié)晶，5’-CMP與大量的鹽和副反應(yīng)產(chǎn)物一起同時(shí)析出，其中5’-CMP的重量比例只占40～50％左右，因此，接下來的精制過程非常重要。前面已給出了精制的兩種方法，精制后的5’-CMP成品純度很高，高效液相色譜(HPLC)分析結(jié)果在98％左右，紫外光譜(UV)分析結(jié)果在96％左右，說明兩種精制方法的效果都很好。
精制過程中加入活性炭的目的在于脫色，使制得的產(chǎn)品更白。
實(shí)施例1在干燥、潔凈的合成反應(yīng)瓶中加入140ml磷酸三乙酯，投入20克胞苷，攪拌，降溫到-5～-10℃。緩慢滴加12ml氧氯化磷，維持反應(yīng)溫度在-5～-10℃之間，加畢，在.此溫度下保溫反應(yīng)。兩小時(shí)后每隔半小時(shí)取樣，進(jìn)行電泳分析。當(dāng)胞苷轉(zhuǎn)化率達(dá)85％以上，向反應(yīng)體系中加入80ml冰水終止反應(yīng)，保持溫度在0～5℃之間，水解1小時(shí)，然后用二氯乙烷萃取，靜置分層。有機(jī)層經(jīng)蒸餾回收，得到二氯乙烷和磷酸三乙酯，可重復(fù)使用；水層用30％重量濃度的NaOH中和，直到PH值為3～4，然后降溫至10℃～0℃進(jìn)行冷凍結(jié)晶，離心分離后得到粗產(chǎn)品。
向粗產(chǎn)品中加入3～10倍量純水，加熱溶解，用活性炭脫色，過濾，冷卻后向?yàn)V液中加入95％乙醇，析出晶體，離心分離后母液套用，晶體經(jīng)真空干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。產(chǎn)品外觀白色結(jié)晶或粉末；純度HPLC分析結(jié)果為97.8％，UV分析結(jié)果為95.7％；總收率81.75％，其中酸化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率85％，精制收率96.17％。
實(shí)施例2在干燥、潔凈的合成反應(yīng)瓶中加入30ml磷酸三丁酯，投入40克胞苷，攪拌，降溫到-5～-10℃。緩慢滴加30ml氧氯化磷，，維持反應(yīng)溫度在-5～-10℃之間，加畢，在此溫度下保溫反應(yīng)。兩小時(shí)后每隔半小時(shí)取樣，進(jìn)行電泳分析。當(dāng)胞苷轉(zhuǎn)化率達(dá)85％以上，向反應(yīng)體系中加入200ml冰水終止反應(yīng)，保持溫度在0～5℃之間，水解1小時(shí)，然后用三氯甲烷萃取，靜置分層。有機(jī)層經(jīng)蒸餾回收，得到三氯甲烷和磷酸三丁酯，可重復(fù)使用；水層用30％重量濃度的NaOH中和，直到PH值為3～4，然后降溫至10℃～0℃進(jìn)行冷凍結(jié)晶，離心分離后得到粗產(chǎn)品。
用80％乙醇按3倍用量洗滌粗產(chǎn)品兩次，然后再加熱溶解于3倍用量的純水當(dāng)中，用活性炭脫色，過濾，冷卻后向?yàn)V液中加入95％乙醇，析出晶體，離心分離后母液套用，晶體經(jīng)真空干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。產(chǎn)品外觀白色結(jié)晶或粉末；純度HPLC分析結(jié)果為98.2％，UV分析結(jié)果為96.1％；總收率80％，其中酸化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率86％，精制收率93％。
實(shí)施例3在干燥、潔凈的合成反應(yīng)釜中加入560克磷酸三乙酯，投入80克胞苷，攪拌，降溫到-5～-10℃。緩慢滴加48L氧氯化磷，維持反應(yīng)溫度在-5～-10℃之間，加畢，在此溫度下保溫反應(yīng)。兩小時(shí)后每隔半小時(shí)取樣，進(jìn)行電泳分析。當(dāng)胞苷轉(zhuǎn)化率達(dá)85％以上，向反應(yīng)體系中加入80L冰水終止反應(yīng)，保持溫度在0～5℃之間，水解1小時(shí)，然后用二氯乙烷萃取，靜置分層。有機(jī)層經(jīng)蒸餾回收，得到二氯乙烷和磷酸三乙酯，可重復(fù)使用；水層用30％重量濃度的NaOH中和，直到PH值為3～4，然后降溫至10℃～0℃進(jìn)行冷凍結(jié)晶，離心分離后得到粗產(chǎn)品。
用80％乙醇按3倍用量洗滌粗產(chǎn)品兩次，然后將醇洗后的粗產(chǎn)品溶于純水，用10％NaOH調(diào)節(jié)PH值為5～6，加熱溶解，加活性炭脫色，過濾，冷卻后再用稀濃度HCL調(diào)節(jié)PH為3～3.5，冷凍后析出結(jié)晶，離心分離，母液套用，晶體經(jīng)真空干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。產(chǎn)品外觀白色結(jié)晶或粉末；純度HPLC分析結(jié)果為98.5％，UV分析結(jié)果為96.3％；總收率82.5％，其中酸化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率86％，精制收率96％。
除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其它具體實(shí)施方式
。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備胞苷-5’-一磷酸的方法，以胞苷為起始原料，依次包括以下操作步驟①將胞苷溶于有機(jī)溶劑，加入磷酸化劑，在-15℃至-5℃、常規(guī)大氣壓力下進(jìn)行酸化反應(yīng)，磷酸化劑與胞苷的摩爾用量之比為1/1～1/1.5；②當(dāng)胞苷的酸化轉(zhuǎn)化率≥85％時(shí)，加入冰水終止反應(yīng)，并在-5℃～5℃溫度下水解1～3小時(shí)；③加入萃取劑進(jìn)行萃取，靜置分層，分離后分別得到有機(jī)相和水相；④用稀堿溶液中和水相，直至PH值為3～4，然后在10℃～0℃下冷凍結(jié)晶，固液分離得胞苷-5’-一磷酸粗品；⑤精制所得粗品，干燥，得胞苷-5’-一磷酸成品。
2.按權(quán)利要求1所述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于所述步驟⑤精制工序是，將粗品加入純水中，加熱溶解，加入活性炭脫色，過濾，冷卻后向?yàn)V液中加入乙醇，析出白色晶體，離心分離，真空干燥后即得胞苷-5’-一磷酸成品。
3.按權(quán)利要求1所述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于所述步驟⑤精制工序是，用乙醇洗滌粗品，然后加入純水，用稀堿溶液調(diào)節(jié)PH值為5～6，加熱溶解后加入活性炭脫色，過濾，冷卻后再用稀酸溶液調(diào)節(jié)PH值為3～4，在10℃～0℃下冷凍結(jié)晶，固液分離即得胞苷-5’-一磷酸成品。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于步驟①中所述磷酸化劑是氧氯化磷，所述有機(jī)溶劑是鹵代烷烴、有機(jī)腈、二甲基甲酰胺或磷酸酯。
5.按權(quán)利要求4所述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于步驟①酸化反應(yīng)過程中溫度為-10℃至-5℃，參加酸化反應(yīng)所有物料原料當(dāng)中的含水量不超過0.1Wt％。
6.按權(quán)利要求1或2或3所述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于步驟③所用萃取劑為鹵代烷。
7.按權(quán)利要求6所述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于所述鹵代烷為氯代烷。
8.按權(quán)利要求1所述的制備胞苷-5’-一磷酸的方法，其特征在于將步驟③萃取分離以后得到的有機(jī)相進(jìn)行蒸餾，回收其中所含有的萃取劑和酸化反應(yīng)有機(jī)溶劑，重復(fù)使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及化學(xué)合成法制備“胞苷－5’－一磷酸”。以胞苷為原料，在－15～－5℃、常壓條件下，與氧氯化磷等磷酸化劑反應(yīng)，當(dāng)酸化轉(zhuǎn)化率≥85％時(shí)，加入冰水終止反應(yīng)，然后在0～5℃下水解，再加入鹵代烷進(jìn)行萃取，靜置分層，分離后得到有機(jī)相和水相。有機(jī)相經(jīng)蒸餾得到萃取劑和酸化反應(yīng)有機(jī)溶劑，可以回收使用；水相經(jīng)中和至pH為3～4時(shí)冷凍結(jié)晶，得到5’－CMP粗品。粗品再經(jīng)過進(jìn)一步的精制和干燥處理，即得5’－CMP成品。該技術(shù)方案原料來源豐富，胞苷與磷酸化劑反應(yīng)生成5’－CMP的過程一次性完成，簡(jiǎn)化了工藝過程，生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品收率高、加工成本低，并且生產(chǎn)過程不會(huì)染菌，產(chǎn)品純度經(jīng)HPLC分析達(dá)到98％。
文檔編號(hào)C07H19/00GK1616475SQ20041006471
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2004年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月21日
發(fā)明者周景康 申請(qǐng)人:蘇州工業(yè)園區(qū)賽康德萬馬化工有限公司