專利名稱：一種重組人干擾素α1b的純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人干擾素的純化工藝。
背景技術(shù)：
干擾素作為一種廣譜的抗病毒藥物越來越廣泛的應(yīng)用于臨床上，具有很大的市場價(jià)值。自從人α1b干擾素通過基因工程的辦法獲得高效表達(dá)成功以后，為了保證高純度，該蛋白的純化工藝一直都采用以單抗親和層析柱為主結(jié)合其他層析柱的方法進(jìn)行分離純化，(專利申請(qǐng)?zhí)?3114639.9)，這類方法具有高選擇性的特點(diǎn)，通過一個(gè)柱子即可達(dá)到較高的純度。但是該工藝存在層析介質(zhì)價(jià)格昂貴、單抗容易脫落造成蛋白藥物污染、介質(zhì)使用壽命短等這些單抗親和層析自身不可回避的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于在純化工藝中避開單抗親和層析柱，并使操作環(huán)節(jié)的銜接更為簡便，同時(shí)保證相應(yīng)的高純度和收率。本工藝包括細(xì)菌裂解，包涵體變性和復(fù)性等過程，其特征在于還包括以下步驟(1)疏水柱層析；(2)陽離子柱層析；(3)體積排阻層析。
上述3種柱層析使用的層析介質(zhì)可從多家公司購買，每一種介質(zhì)都有多種選擇。僅以Amersham Biosciences公司為例，其出售的疏水介質(zhì)有PhenylSepharose FF、Butyl Sepharose FF、Qctyl Sepharose FF等；陽離子介質(zhì)有CMSepharose FF、SP Sepharose FF、S Sepharose FF等；體積排阻層析介質(zhì)有Sepharose、Sephacryl、Sephadex、Superdex等。本發(fā)明的主要內(nèi)容在于將上述不同種類的柱層析相互組合，從而達(dá)到純化人干擾素α1b的目的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員很容易做到將同一種類的介質(zhì)互相替換，以達(dá)到相同的純化效果，所以這種同一類型純化介質(zhì)之間的簡單替換，仍然包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
上述純化工藝中，疏水柱層析使用Phenyl Sepharose FF，其中洗脫液使用10-40％(v/v)的乙二醇溶液，優(yōu)選20％的乙二醇溶液；陽離子柱層析使用CMSepharose FF，其中平衡液使用pH4.4-5.0的醋酸緩沖液；體積排阻柱層析使用Sephacryl S-100。
本發(fā)明應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中能產(chǎn)生以下的積極意義本發(fā)明涉及的工藝沒有采用單抗親和層析柱，而采用了疏水柱層析和陽離子交換層析為主的分離方法，節(jié)約了生產(chǎn)成本并避免了單抗脫落帶來的污染問題。
本發(fā)明采用疏水柱層析作為柱層析的第一步，無需將蛋白液進(jìn)行大體積的透析，簡便了操作過程，節(jié)約了時(shí)間。同時(shí)疏水柱具有高結(jié)合量、能承受較高流速的優(yōu)點(diǎn)，作為第一步柱層析能起到很有效的濃縮效果。此外，更重要的是，經(jīng)過這一步就能使目的蛋白純度達(dá)到90％以上。
CM柱層析能使目的蛋白純度達(dá)到95％以上，同時(shí)進(jìn)一步濃縮了目的蛋白。
采用本工藝，重組人干擾素α1b的收率、純度和比活性不低于單抗親和層析的方法，相應(yīng)于10％目的蛋白表達(dá)量的菌種，每1克菌最終可收獲1mg干擾素純品。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1(1)超聲波裂解取40g工程菌菌體，按菌體的質(zhì)量每克用20-40ml的TE溶液(pH8.0)懸浮菌體，超聲波的輸出功率設(shè)置為600W以上、破碎時(shí)間為10分鐘以上。12,000rpm，4℃離心20分鐘收集包涵體沉淀，用TE溶液或Tris-HCl溶液(pH8.0)洗滌一次，12,000rpm，4℃離心20分鐘收集沉淀。
(2)包涵體的變性按照包涵體的質(zhì)量，每克包涵體加入10ml的6N鹽酸胍充分溶解，室溫下變性2小時(shí)以上。
(3)包涵體的復(fù)性4,000rpm離心收集上清，蛋白的變性液用0.15M硼酸溶液(pH9.0)稀釋100倍，4℃過夜復(fù)性。
(4)Phenyl Sepharose疏水柱層析將復(fù)性后的蛋白液對(duì)0.44μm的膜抽濾以去除不溶性雜質(zhì)顆粒，向抽濾液中加入適量體積的濃(NH4)2SO4溶液使蛋白液中最終的(NH4)2SO4濃度至1.5mol/L。用1.5M濃度的(NH4)2SO4溶液平衡好層析柱，上樣后用3-5個(gè)柱體積的平衡液沖洗，用10％(v/v)的乙二醇溶液洗脫，收集洗脫峰組分。
(5)CM Sepharose FF陽離子交換柱層析將上一步收集的洗脫組分對(duì)5mM醋酸緩沖液(pH4.4)透析后上樣到用80mM醋酸緩沖液(pH4.4)平衡好的CM層析柱上，用50mM NaCl/80mM醋酸緩沖液(pH4.4)洗脫，收集洗脫峰組分。
(6)Sephacryl S-100柱層析用0.1N NaOH將上一步洗脫組分的pH值調(diào)至7.0，上樣到用PBS(pH7.0)平衡好的層析柱上，用PBS(pH7.0)洗脫，收集洗脫峰組分即為重組人α1b干擾素純品。
40g菌體經(jīng)上述處理，共得到39mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為98％，經(jīng)常規(guī)WISH-VSV系統(tǒng)測定，比活性為1.3×107IU/mg。整個(gè)工藝過程共用28個(gè)小時(shí)。
實(shí)施例2將Phenyl Sepharose疏水柱層析中10％的乙二醇溶液換成20％的乙二醇溶液，將CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱層析各緩沖液的pH值調(diào)成4.6，其余步驟同實(shí)施例1。
40g菌體經(jīng)上述處理，共得到45mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為98％，經(jīng)常規(guī)WISH-VSV系統(tǒng)測定，比活性為1.2×107IU/mg。整個(gè)工藝過程共用28個(gè)小時(shí)。
實(shí)施例3將Phenyl Sepharose疏水柱層析中10％的乙二醇溶液換成40％的乙二醇溶液，將CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱層析各緩沖液的pH值調(diào)成5.0，其余步驟同實(shí)施例1。
40g菌體經(jīng)上述處理，共得到48mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為96％，經(jīng)常規(guī)WISH-VSV系統(tǒng)測定，比活性為1.1×107IU/mg。整個(gè)工藝過程共用28個(gè)小時(shí)。
對(duì)照實(shí)施例超聲波裂解、包涵體變性和復(fù)性同實(shí)施例1，然后按以下步驟處理(1)DEAE Sepharose FF陽離子交換柱層析復(fù)性液用25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)透析，用Tris-HCl溶液(pH7.5)平衡好層析柱，上樣后用3-5個(gè)柱體積的平衡液沖洗，用0.2M NaCl/25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)洗脫，收集洗脫峰組分。
(2)單克隆抗體親和層析將上一步收集的洗脫組分對(duì)25mM pH7.0PB緩沖液透析后上樣到用25mM pH7.0PB緩沖液平衡好的親和層析柱上，用PBSpH7.0緩沖液沖洗，用50mM pH2.5的甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，收集洗脫峰，立即調(diào)pH至7.0。
(3)Sephacryl S-100柱層析將上一步洗脫組分上樣到用PBS(pH7.0)平衡好的層析柱上，用PBS(pH7.0)洗脫，收集洗脫峰組分即為重組人α1b干擾素純品。
40g菌體經(jīng)上述處理，共得到42mg干擾素α1b純品，SDS-PAGE電泳檢測，純度為98％，經(jīng)常規(guī)WISH-VSV系統(tǒng)測定，比活性為1.2×107IU/mg。整個(gè)工藝過程共用38個(gè)小時(shí)。
以上結(jié)果表明，使用本發(fā)明純化工藝的實(shí)施例1、2、3與對(duì)照實(shí)施例相比，沒有使用傳統(tǒng)的單克隆抗體親和層析，獲得的干擾素α1b純品的質(zhì)量相當(dāng)，而工藝過程明顯縮短。
權(quán)利要求
1.一種重組人干擾素α1b的純化工藝，包括以下步驟(1)疏水柱層析；(2)陽離子柱層析；(3)體積排阻柱層析。
2.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中疏水柱層析為Phenyl Sepharose FF。
3.如權(quán)利要求2所述的工藝，其中疏水柱層析的洗脫液是10％-40％的乙二醇溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中陽離子柱層析是CM Sepharose FF。
5.如權(quán)利要求4所述的工藝，其中陽離子柱層析的平衡液是pH 4.4-5.0的醋酸緩沖液。
6.如權(quán)利要求1所述的工藝，其中體積排阻柱層析是Sephacryl S-100。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人干擾素α1b的純化工藝，包括疏水柱層析、陽離子柱層析、體積排阻柱層析。該工藝無需采用單抗親和層析柱，避免了單抗脫落造成的污染，產(chǎn)品純度、收率及活性與傳統(tǒng)親和層析方法相當(dāng)，同時(shí)各純化步驟之間的銜接更為合理，縮短了工藝過程。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1724568SQ20041006939
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者楊大軍, 梁天鳳, 劉金毅, 劉永全, 孫儉波, 程永慶 申請(qǐng)人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發(fā)展有限公司