專利名稱：從紅豆杉枝葉中初分離10－去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅豆杉植物成分的提取方法，特別是一種從紅豆杉枝葉中用大孔吸附樹(shù)脂初分離10-去乙酰基巴卡亭III的方法。
背景技術(shù)：
10-去乙酰基巴卡亭III(10-DABIII)是抗癌藥紫杉醇(Taxol)的同系物，也是植物體內(nèi)合成紫杉醇的前體成分。現(xiàn)已作為人工半合成紫杉醇或多烯紫杉醇的前體原料。紫杉醇或多烯紫杉醇在臨床上已應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等治療，其療效好，毒副作用小，是當(dāng)今抗癌藥的新秀。我國(guó)和世界上多個(gè)國(guó)家都已批準(zhǔn)生產(chǎn)和臨床使用，需求量日增。以往紫杉醇的主要來(lái)源于天然紅豆杉的樹(shù)皮，而紅豆杉植物是屬國(guó)家珍稀保護(hù)植物，天然紅豆杉資源極為有限，國(guó)家嚴(yán)禁把它用作制取紫杉醇的原料，因此，紫杉醇的生產(chǎn)和供應(yīng)由于原料缺乏遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床治療的需要。目前，利用大規(guī)模人工栽培紅豆杉，剪取其枝葉作為原料，是解決藥源緊缺的途徑之一。紫杉醇和10-DABIII共存于紅豆杉植物中，早期研究認(rèn)為歐洲短葉紅豆杉枝葉中10-DABIII含量較高，是紫杉醇含量的4倍，達(dá)到0.08％左右。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)我國(guó)栽培的某些紅豆杉的枝葉含有豐富的10-DABIII，因此把10-DABIII分離出來(lái)，作為半合成紫杉醇或多烯紫杉醇的原料具有重要的意義。
目前，國(guó)外文獻(xiàn)及專利報(bào)道的從紅豆杉枝葉中提取10-DABIII的方法，大多是先利用乙醇或甲醇進(jìn)行提取，再用其他有機(jī)溶劑萃取，萃取液濃縮后，進(jìn)行多次硅膠柱層析并重結(jié)晶。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2136678公開(kāi)了從乙醇提取過(guò)紫杉醇的紅豆杉枝葉殘?jiān)刑崛?0-DABIII的方法，先用乙醇提取紅豆杉枝葉中的紫杉醇，其殘?jiān)谐M乙醇，再用水提取殘?jiān)械?0-DABIII，水提取液濃縮、噴霧干燥，高壓正相制備色譜分離，得到純品10-DABIII。此外，中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)CN1473821A公開(kāi)了一種提取10-DABIII的方法，紅豆杉枝葉超細(xì)粉φ≤10μm用乙醇提取，濃縮后，浸膏用有機(jī)溶劑萃取，兩次硅膠柱層析，水解轉(zhuǎn)化，進(jìn)行硅膠柱層析，重結(jié)晶等得到10-DABIII。前者雖然省去了有機(jī)溶劑萃取，但是對(duì)大量水提取液使用噴霧干燥方法進(jìn)行濃縮干燥，能耗大，成本高；后者在初分離中都要用大量有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，成本高，安全性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種利用可再生大孔吸附樹(shù)脂，吸附分離紅豆杉枝葉的含水乙醇提取液的濃縮液中的10-去乙?；涂ㄍII，從而實(shí)現(xiàn)初分離10-去乙?；涂ㄍII的方法。
本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)將大孔吸附樹(shù)脂放入含10-去乙?；涂ㄍII的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液中，搖動(dòng)吸附3～5小時(shí)，或?qū)⒋罂孜綐?shù)脂裝填于層析柱中，讓含10-去乙?；涂ㄍII的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液流經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂，進(jìn)行吸附，濾液PH值5～6，吸附后，用無(wú)水乙醇洗脫被大孔吸附樹(shù)脂吸附的10-去乙酰基巴卡亭III，乙醇洗脫液濃縮后，得到含10-去乙?；涂ㄍII的流浸膏。大孔吸附樹(shù)脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520。紅豆杉枝葉是南方紅豆杉、云南紅豆杉、中國(guó)紅豆杉、東北紅豆杉、西藏紅豆杉或曼地亞紅豆杉的枝葉。
本發(fā)明充分利用了紅豆杉枝葉資源，既提取紫杉醇，又提取10-DABIII，提高了資源利用率，省去了液-液萃取步驟，減少了有機(jī)溶劑的使用量，降低了成本，安全性高，10-DABIII的回收率高。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
試驗(yàn)用材料南方紅豆杉、云南紅豆杉、中國(guó)紅豆杉、東北紅豆杉、西藏紅豆杉或曼地亞紅豆杉的枝葉風(fēng)干后，粉碎成40～200目的粉末。
試驗(yàn)用試劑95％食用級(jí)乙醇，由廣東豐順光明化工廠生產(chǎn)，分析純無(wú)水乙醇，由廣州化學(xué)試劑二廠生產(chǎn)，色譜純?cè)噭┘状肌⒁译嬗蛇M(jìn)口分裝。
試驗(yàn)用儀器900瓦超聲提取器由深圳超晉超聲工程有限公司生產(chǎn)，HPLC檢測(cè)使用Waters高壓液相色譜儀，色譜儀由美國(guó)Waters公司生產(chǎn)，高壓液相色譜條件Nova-PAK C18反相柱，3.9mm×150mm粒度4μm，流動(dòng)相為甲醇∶水＝43∶57，流速1ml/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)227nm。大孔吸附樹(shù)脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520，由南開(kāi)大學(xué)化工廠生產(chǎn)。
大孔吸附樹(shù)脂用下述試劑依次處理1)蒸餾水浸泡洗滌24小時(shí)，去雜至水洗液透明；2)1mol的NaoH浸泡24小時(shí)去雜；3)蒸餾水洗至中性；4)1mol的HCL浸泡24小時(shí)去雜；5)蒸餾水洗至中性；6)無(wú)水乙醇洗到洗脫液加水不產(chǎn)生白色混濁為止；7)蒸餾水洗至無(wú)乙醇味為止。
試驗(yàn)用紅豆杉枝葉提取液的制備采集紅豆杉枝葉風(fēng)干后，粉碎成40～200目的干粉，稱取42g，放入500ml標(biāo)準(zhǔn)磨口玻璃三角瓶中，加入200ml的70％乙醇，裝上球形冷凝管，通入冷卻水，將三角瓶裝置放在900瓦的超聲提取器中，在28.5℃下，超聲提取30分鐘，過(guò)濾，濾渣再重復(fù)提取3次，合并4次的乙醇提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，55℃水浴，-0.08Mpa的真空下，減壓回收乙醇至濃縮液無(wú)醇味，水性濃縮液靜置過(guò)夜，有沉淀析出，用布氏漏斗抽濾，沉淀物作為分離紫杉醇、三尖杉寧等之用。含10-DABIII的濾液計(jì)215ml供大孔吸附樹(shù)脂富集分離10-DABIII之用。用HPLC檢測(cè)上述濾液中的10-DABIII，其含量為0.313mg/ml，總含量為67.37mg，占紅豆杉枝葉干粉重的0.16％。
實(shí)施例一在四個(gè)250ml玻璃三角瓶中，分別加入13.13ml紅豆杉枝葉的70％乙醇提取液的濃縮液的濾液，濾液中含4.11mg10-DABIII，分別用蒸餾水16.87ml稀釋為30ml，PH值5；再分別加入已處理好的濕基大孔吸附樹(shù)脂S-8、D4020、X-5、D3520各5g，干重分別為1.25g、1.1g、1.35g、1.1g。
將上述四個(gè)試驗(yàn)樣品瓶在20℃下放在搖床上搖動(dòng)吸附4小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為103轉(zhuǎn)/分，用普通定性濾紙?jiān)诓Ａ┒分羞^(guò)濾，得到已吸附了10-DABIII的大孔吸附樹(shù)脂和濾液。用HPLC測(cè)定濾液中殘留的10-DABIII的含量，計(jì)算出每種大孔吸附樹(shù)脂的吸附量；吸附了10-DABIII的大孔吸附樹(shù)脂分別裝入三角瓶中，再各加入60ml無(wú)水乙醇，在室溫下置于搖床上搖動(dòng)洗脫1小時(shí)，用普通定性濾紙?jiān)诓Ａ┒分羞^(guò)濾，重復(fù)洗脫4次，合并4次洗脫液，定容為250ml，用HPLC檢測(cè)其中10-DABIII的含量，計(jì)算10-DABIII的洗脫量、洗脫率和回收率，見(jiàn)表一。含10-DABIII的乙醇洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，于55℃水浴，-0.08Mpa的真空減壓濃縮成流浸膏，待進(jìn)一步純化之用。
吸附量＝試液中原含量-試液中殘留量洗脫率＝洗脫量/吸附量×100％回收率＝洗脫量/試液中原含量×100％表一


從表一數(shù)據(jù)看出，以上4種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)紅豆杉枝葉含水乙醇提取液的濃縮液的過(guò)濾液中的10-DABIII均有良好的吸附和解吸附性能。1g干樹(shù)脂吸附量除X-5為2.76mg外，其余3種均在3mg以上。洗脫率均在90～97.7％之間。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，用大孔吸附樹(shù)脂吸附法初分離紅豆杉枝葉中的10-DABIII是可行的。
實(shí)施例二取二份各6.1ml的制備好的紅豆杉枝葉80％乙醇提取液的濃縮液的濾液，濾液中含10-DABIII 1.91mg，分別加入50ml玻璃三角瓶中，加蒸餾水8.9ml稀釋為15ml，測(cè)PH值為5.2。分別稱取已處理好的濕基大孔樹(shù)脂AB-8、NKA-9各5g，干重分別為1.38g、1.58g；分別裝入2根35cm×0.7cm的玻璃層析柱中，用蒸餾水平衡后，把已備好的二份含10-DABIII的濾液分別倒入二根層析柱中，開(kāi)啟柱下部活塞，使濾液緩慢流過(guò)柱中的大孔吸附樹(shù)脂，重復(fù)3次，使濾液中的10-DABIII被完全吸附。用HPLC檢測(cè)層析柱流出液不含10-DABIII后，流出液棄去。用無(wú)水乙醇洗脫被大孔吸附樹(shù)脂吸附的10-DABIII，共接受洗脫液6份計(jì)240ml，用HPLC檢測(cè)最后1份中10-DABIII，結(jié)果顯示不含10-DABIII。合并乙醇洗脫液，定容至250ml，取樣，進(jìn)行HPLC分析。由分析結(jié)果計(jì)算大孔吸附樹(shù)脂對(duì)10-DABIII的吸附量、洗脫量、洗脫率、回收率。計(jì)算方法與實(shí)施例一相同，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表二。含10-DABIII乙醇洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，于55℃水浴，-0.08Mpa的真空減壓濃縮成流浸膏。
表二

表二顯示，大孔吸附樹(shù)脂AB-8、NKA-9在層析柱中對(duì)紅豆杉枝葉的80％乙醇提取液的濃縮液的濾液中10-DABIII的吸附和洗脫結(jié)果都比較理想。在樹(shù)脂用量稍稍過(guò)量時(shí)，能夠?qū)⒃囈褐械?0-DABIII完全吸附。洗脫率、回收率都在98％以上上以上兩種大孔吸附樹(shù)脂用于紅豆杉枝葉的80％乙醇提取液的濃縮液的過(guò)濾液10-DABIII的初分離是可行的。上述試驗(yàn)結(jié)果也表明，搖動(dòng)吸附與在層析柱中吸附二種吸附方式均能達(dá)到較好效果。
權(quán)利要求
1.一種從紅豆杉枝葉中初分離10-去乙?；涂ㄍII的方法，其特征在于將大孔吸附樹(shù)脂放入含10-去乙酰基巴卡亭III的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液中，吸附3～5小時(shí)，或?qū)⒋罂孜綐?shù)脂裝填于層析柱中，讓含10-去乙?；涂ㄍII的紅豆杉枝葉的70～80％乙醇提取液的濃縮液的濾液流經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂，進(jìn)行吸附，濾液PH值5～6，吸附后，用無(wú)水乙醇洗脫被大孔吸附樹(shù)脂吸附的10-去乙?；涂ㄍII，乙醇洗脫液濃縮后，得到含10-去乙酰基巴卡亭III的流浸膏。
2.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于大孔吸附樹(shù)脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520。
3.依權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于紅豆杉枝葉是南方紅豆杉、云南紅豆杉、中國(guó)紅豆杉、東北紅豆杉、西藏紅豆杉或曼地亞紅豆杉的枝葉。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從紅豆杉枝葉初分離10－去乙酰基巴卡亭III的方法，用70～80％乙醇提取紅豆杉枝葉，得到水溶性濃縮液，靜置后，不溶于水的紫杉醇及低極性雜質(zhì)沉淀析出，10－去乙?；涂ㄍII等較大極性的紫杉醇同系物留在水溶液中，過(guò)濾，得到固形物和水性濾液，濾液pH值5～6，用大孔吸附樹(shù)脂吸附濾液中的10－去乙?；涂ㄍII，吸附后，用無(wú)水乙醇洗脫被大孔吸附樹(shù)脂吸附的10－去乙?；涂ㄍII，乙醇洗脫液濃縮后，得到富集10－去乙?；涂ㄍII的產(chǎn)物。本發(fā)明充分利用了紅豆杉枝葉資源，既提取了紫杉醇，又提取了10－DABIII，提高了資源利用率，省去了液－液萃取步驟，減少了有機(jī)溶劑使用量，降低了成本，安全性高。
文檔編號(hào)C07D305/14GK1660827SQ20041007755
公開(kāi)日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者王國(guó)亮, 張依健, 駱雪蘭, 黃巧明, 謝維權(quán), 夏惠青, 王彬力, 曾秋玲, 葉瑞英, 侯嵩生, 李志良 申請(qǐng)人:梅縣梅雁生物工程研究所