專利名稱：冠狀病毒主蛋白酶的小分子抑制劑、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了基于SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)所設(shè)計(jì)的一系列小分子抑制劑、制備方法及其在制備用于治療或者預(yù)防各種冠狀病毒感染的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
一種新型的冠狀病毒目前已經(jīng)被確認(rèn)是嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(Severe Acute Respiratory Sydrome，簡(jiǎn)稱為SARS)的元兇，并被命名為SARS冠狀病毒(簡(jiǎn)稱為SARS-CoV)。SARS冠狀病毒在種屬分類上屬于“Nidovirales”目、“Coronaviridae”科、“Coronavirus”屬。它是冠狀病毒家族中新出現(xiàn)的一個(gè)變種，全長(zhǎng)29,736bp(Urbani Strain)。SARS是一種對(duì)人類具有巨大威脅的烈性傳染病，目前尚無(wú)特效藥及疫苗上市。
根據(jù)血清學(xué)分類，冠狀病毒家族(冠狀病毒屬)共包括四種類型(Group)。I型包括豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissiblegastroenteritis virus，簡(jiǎn)稱為TGEV)、人冠狀病毒(human coronavirus，簡(jiǎn)稱為HCoV)毒株229E、貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectiousperitonitis virus，簡(jiǎn)稱為FIPV)等；II型包括牛冠狀病毒(Bovinecoronavirus，簡(jiǎn)稱為BCoV)、鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus，簡(jiǎn)稱為MHV)等；III型目前只包括三種病毒，其中一種被稱為禽傳染性支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，簡(jiǎn)稱為AIBV)；SARS-CoV則屬于IV型。各類冠狀病毒對(duì)人、畜的生命健康有巨大威脅。
SARS冠狀病毒的基因組編碼了兩個(gè)大的復(fù)制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla(486kDa)和pplab(790kDa)，這兩個(gè)蛋白是由占冠狀病毒2/3到3/4的基因組編碼的。這兩個(gè)蛋白被水解后產(chǎn)生病毒復(fù)制復(fù)合體的很多功能亞基。在這一水解過(guò)程中，SARS冠狀病毒的主要蛋白水解酶(main protease，簡(jiǎn)稱為主蛋白酶，縮寫為Mpro，分子量33.8kDa，有時(shí)也稱為3C-Like Protein)起到了非常關(guān)鍵的作用。主蛋白酶也是ppla和pplab中的一段，它的釋放是通過(guò)自催化水解完成的，自催化水解發(fā)生在該蛋白酶旁側(cè)的Gln(Ser，Ala)位點(diǎn)，通過(guò)反式剪接(雙分子反應(yīng))完成。在主蛋白酶的作用下，復(fù)制酶多蛋白ppla和pplab被水解成十多個(gè)功能肽段，從而進(jìn)一步發(fā)揮作用。如果能夠抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的水解作用，那么將會(huì)有效地抵御SARS冠狀病毒對(duì)人體的侵染。因此，SARS冠狀病毒主蛋白酶是抗SARS藥物設(shè)計(jì)的理想靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能夠有效抑制冠狀病毒主蛋白酶活性的小分子抑制劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述小分子抑制劑的制備方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供所述小分子抑制劑在制備用于治療或者預(yù)防冠狀病毒感染的藥物中的用途。
因此，本發(fā)明提供了下述通式(I)化合物 其中，U為 或 ，其中的X為NH或CH2；R1選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、芐氧羰基、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、 R2選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、氟代芐基；R3選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、對(duì)甲基苯基、氟代芐基；R4選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、對(duì)甲基苯基、氟代芐基；R5選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、對(duì)甲基苯基、氟代芐基、氟代苯基。
本發(fā)明還提供了通式(I)化合物的制備方法，包括如下步驟將式(II)化合物中氨基的保護(hù)基R6脫除，其中的R6選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組叔丁氧羰基、三氟乙?；?、芐氧羰基；在縮合試劑的存在下，將上一步的產(chǎn)物與式(III)化合物進(jìn)行縮合，得到式(I)化合物，
其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R4、U的定義與式(I)中的相同。
本發(fā)明還提供了通式(I)化合物在制備用于治療或者預(yù)防冠狀病毒感染的藥物中的用途。
試驗(yàn)證明，本發(fā)明化合物能夠顯著抑制TGEV、HcoV、FIPV、AIBV、SARS-CoV等冠狀病毒主蛋白酶的活性，在制備用于治療或者預(yù)防冠狀病毒感染的藥物方面具有良好的應(yīng)用前景。


附圖不一定是成比例的，其目的僅僅在于更好地解釋本發(fā)明，以便于讀者理解。將附圖與具體實(shí)施方式
結(jié)合在一起考慮，可以更好地理解本發(fā)明。
圖1是小分子N1與SARS-CoV Mpro單體A結(jié)合的表面圖；圖2是N1與單體A的活性口袋結(jié)合的電子密度圖；圖3示出了小分子N1、N2、N3和N4對(duì)SARS-CoV Mpro的抑制活性曲線，其中，SARS_3CL代表SARS冠狀病毒主蛋白酶，即SARS-CoVMpro；圖4示出了小分子N1對(duì)Transmissible Gastroenteritis Viruses(TGEV)主蛋白酶(圖中簡(jiǎn)稱為TGEV_3CL)的抑制活性曲線；圖5示出了小分子N1對(duì)Human Coronavirus 229E(HCoV)主蛋白酶(圖中簡(jiǎn)稱為HCoV_3CL)的抑制活性曲線；圖6示出了小分子N1對(duì)Feline Infectious Peritonitis Virus(FIPV)主蛋白酶(圖中簡(jiǎn)稱為FIPV_3CL)的抑制活性曲線；圖7示出了小分子N1對(duì)Avian Infectious Bronchitis Virus(AIBV)主蛋白酶(圖中簡(jiǎn)稱為AIBV_3CL)的抑制活性曲線。
具體實(shí)施例方式
術(shù)語(yǔ)定義為了敘述上的方便，本文中使用了一些特定的術(shù)語(yǔ)，下面逐一對(duì)其進(jìn)行解釋。
“N1”、“N2”、“N3”和“N4”是本發(fā)明特別優(yōu)選的小分子抑制劑，其結(jié)構(gòu)式分別為 N1的結(jié)構(gòu)式 N2的結(jié)構(gòu)式 N3的結(jié)構(gòu)式
N4的結(jié)構(gòu)式本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“SARS冠狀病毒的主要蛋白水解酶”、“SARS-CoV Mpro”、“SARS-CoV 3CLpro”、“SARS冠狀病毒主蛋白酶”等，都是指SARS冠狀病毒的主要蛋白水解酶。
“C3～C6的烷基”是指碳原子數(shù)在3到6之間的直鏈或帶支鏈的烷基，包括但不限于正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。
“C1～C4的烷基”是指碳原子數(shù)在1到4之間的直鏈或帶支鏈的烷基，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等。
“氟代芐基”包括對(duì)氟芐基、間氟芐基、鄰氟芐基等。
“氟代苯基”包括對(duì)氟苯基、間氟苯基、鄰氟苯基等。
在部分結(jié)構(gòu)式中，iPr代表異丙基，Et代表乙基，“Bn”代表芐基，“Boc”代表叔丁氧羰基。
“TFA”代表三氟乙酸，“THF”代表四氫呋喃，“DMF”代表N，N-二甲基甲酰胺，“DMSO”代表二甲亞砜，“PhH”代表苯，“iPr2NEt”代表二異丙基乙基胺，“NEt3”代表三乙胺。
“DCC”代表二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide)；“DIEA”代表二異丙基乙胺(diisopropylethylamine)；“DMAP”代表4-N，N-dimethylaminopyridine；“EDCI”代表1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride；“HATU”代表N-[(dimethylamino)(3H-1，2，3-triazolo(4，5-b)pyridine-3-yloxy)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate；
“HBTU”代表O-(benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate；“HOBt”代表1-hydroxybenzotriazole。
本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)如前所述，本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)如通式(I)所示。
本發(fā)明的某些優(yōu)選化合物符合下述通式， 本發(fā)明的另一些優(yōu)選化合物符合下述通式， 本發(fā)明的另一些優(yōu)選化合物符合下述通式， 下面列出了本發(fā)明的一些特別優(yōu)選的具體化合物，
本發(fā)明化合物的制備方法本發(fā)明所提供的式(I)化合物的制備方法包括如下步驟將式(II)化合物中氨基的保護(hù)基R6脫除，其中的R6選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組叔丁氧羰基、三氟乙?；?、芐氧羰基；
在縮合試劑的存在下，將上一步的產(chǎn)物與式(III)化合物進(jìn)行縮合，得到式(I)化合物， 其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R4、U的定義與式(I)中的相同。
式(II)化合物的合成可參考文獻(xiàn)Qingping Tian，Naresh K.Nayyar，Srinivasan Babu，Lijian Chen，Junhua Tao，Steven Lee，Anthony Tibbetts，Terence Moran，Jason Liou，Ming Guo and Timothy P.Kennedy TetrahedronLett.2001，42，6808-6809。式(III)化合物的合成可參考文獻(xiàn)Dawei Ma，Weiqing Xie，Bin Zou，Qiong Lei and Duanqing Pei Tetrahedron Lett.2004，45，8103-8105。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例中，將式(II)化合物在有機(jī)溶劑中與酸(例如二氯甲烷與三氟乙酸體積比為1～4∶1混合液)室溫反應(yīng)1～4小時(shí)；抽去溶劑，與式(III)化合物溶于非質(zhì)子性溶劑中(如CH2Cl2，THF，CHCl3)，加入縮合試劑如HATU，HBTU，EDCI，然后加入有機(jī)堿如iPr2NEt，NEt3，在室溫下反應(yīng)8～24小時(shí)得到式(I)化合物。
還可以通過(guò)衍生化，將式(I)化合物中的R1基團(tuán)更換為預(yù)期的基團(tuán)R1’，從而得到式(I)化合物的一系列衍生物，其中，R1’選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、芐氧羰基、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、 所述的衍生化包括如下步驟將得到的式(I)化合物中的R1脫除；在縮合試劑的存在下，將上一步的產(chǎn)物與羧酸R1’-OH進(jìn)行縮合，得到衍生化了的式(I)化合物，其中的R1基團(tuán)被更換為R1’基團(tuán)；其中R1’選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、芐氧羰基、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、 在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例中，將待衍生化的式(I)化合物在有機(jī)溶劑中與酸(例如二氯甲烷與三氟乙酸體積比為1～4∶1混合液)室溫反應(yīng)1～4小時(shí)；抽去溶劑，與羧酸R1’-OH溶于非質(zhì)子性溶劑中(如CH2Cl2，THF，CHCl3)，加入縮合試劑如HATU，HBTU，EDCI，然后加入有機(jī)堿如iPr2NEt，NEt3，在室溫下反應(yīng)8～24小時(shí)得到式(I)化合物的一系列衍生物。
其中，上面所述的酸優(yōu)選為三氟乙酸或鹽酸；優(yōu)選的有機(jī)溶劑選自由如下成員構(gòu)成的組CH2Cl2、四氫呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六環(huán)；優(yōu)選的非質(zhì)子性溶劑選自由如下成員構(gòu)成的組CH2Cl2、四氫呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、苯；優(yōu)選的縮合試劑選自由如下成員構(gòu)成的組HATU、HBTU、EDCI；優(yōu)選的有機(jī)堿選自由如下成員構(gòu)成的組二異丙基乙基胺、三乙胺。
為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給出本發(fā)明的具體實(shí)施例。在對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行描述時(shí)，沒(méi)有對(duì)公知的實(shí)驗(yàn)方法、儀器、試劑和材料等進(jìn)行詳細(xì)的描述，以避免喧賓奪主、淡化了本發(fā)明的主要內(nèi)容。
實(shí)施例1將42mg的 溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，抽干溶劑。得到的脫Boc的底物溶解在2ml的CH2Cl2中，加入40mg的 再加入71μl的iPr2NEt，然后加63mg的HATU。在室溫下反應(yīng)12小時(shí)，依次用1M HCl、飽和NaHCO3水溶液、飽和食鹽水洗，Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸去溶劑，快速柱層析，得到52mg的產(chǎn)物 產(chǎn)率80％。
譜圖數(shù)據(jù)如下H NMRδ(500MHz，CDCl3)0.76(d，3H，J＝6.9Hz)，0.98(d，3H，J＝5.7Hz)，1.30(t，3H，J＝7.3Hz)，1.42(s，9H)，1.74-1.94(m，4H)，2.10-2.40(m，2H)，2.49-2.52(m，1H)，2.67-2.71(m，1H)，2.85-3.00(m，1H)，3.05-3.17(m，1H)，3.23-3.39(m，3H)，4.18(q，2H，J＝7.1Hz)，4.41-4.51(m，1H)，4.58-4.65(m，1H)，5.03-5.10(m，1H)，5.49(t，1H，J＝14.7Hz)，5.98(dd，1H，J＝15.8Hz，4.4Hz)，6.70-7.00(m，3H)，7.12-7.16(m，3H)；
ESI-MS[M+H+]590.2，HRMS found m/z 612.3062，C31H44N3O7FNarequires 612.3065；[α]D24.0(c 0.69，CHCl3)。
實(shí)施例2將45mg 溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，抽干溶劑。得到的脫Boc的底物溶解在2ml的CH2Cl2中，加入12mg的 再加入48μl的iPr2NEt，然后加44mg的HATU。在室溫下反應(yīng)12小時(shí)，依次用1M HCl、飽和NaHCO3水溶液、飽和食鹽水洗，Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸去溶劑，快速柱層析，得到34mg的產(chǎn)物 產(chǎn)率73％。
譜圖數(shù)據(jù)如下H NMRδ(300MHz，CDCl3)0.85(d，3H，J＝6.6Hz)，1.03(d，3H，J＝6.9Hz)，1.30(t，3H，J＝7.2Hz)，1.52-1.61(m，1H)，1.71-1.90(m，2H)，2.26-2.42(m，2H)，2.48(s，3H)，2.53-2.73(m，3H)，2.84-2.98(m，2H)，3.13-3.23(m，1H)，3.30-3.42(m，2H)，4.18(q，2H，J＝7.2Hz)，4.41-4.56(m，1H)，4.66-4.76(m，1H)，5.50(d，1H，J＝15.6Hz)，5.91(s，1H)，6.39(s，1H)，6.63(dd，1H，J＝15.3Hz，4.8Hz)，6.94-7.03(m，2H)，7.11-7.35(m，4H)；ESI-MS[M+H+]599.3，[M+Na+]621.3，HRMS found m/z 621.2717，C31H44N3O7FNa requires 621.2695；[α]D32.8(c 0.51，CHCl3)。
實(shí)施例1和實(shí)施例2可以用下面的反應(yīng)式簡(jiǎn)要概括 實(shí)施例3在對(duì)本實(shí)施例進(jìn)行描述時(shí)，參考了如下的反應(yīng)式(其中某些化合物下方的一位或二位阿拉伯?dāng)?shù)字為其編號(hào))
化合物9的制備將321mg(1mmol)化合物8溶解在2ml的二氯甲烷中，再加入1ml的三氟乙酸，室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶劑減壓蒸去，油泵抽干。將所得到的產(chǎn)物溶解在4ml的二氯甲烷中，依次加入260mg的化合物 0.4ml的二異丙基乙基胺，162mg的HOBt，最后加入247mg的DCC，在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)體系過(guò)濾加入10ml的二氯甲烷，依次用1M的HCl、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸去溶劑，快速柱層析得到387mg的化合物9，產(chǎn)率92％。
譜圖數(shù)據(jù)如下H NMRδ(300MHz，CDCl3)0.90-0.95(m，12H)，1.44(s，9H)，1.45-1.68(m，3H)，2.03-2.15(m，1H)，3.88(dd，1H，J＝6.6Hz，9.3Hz)，4.64-4.72(m，1H)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz)，5.16(d，2H，J＝3.3Hz)，6.24(d，1H，J＝10.5Hz)，7.29-7.30(m，5H)。
化合物10的制備將331mg化合物9溶解在4ml的二氯甲烷中，再加入1ml的三氟乙酸，室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶劑減壓蒸去，油泵抽干。將所得到的產(chǎn)物溶解在4ml的二氯甲烷中，依次加入19mg的化合物 0.3ml的二異丙基乙基胺，128mg的HOBt，最后加入195mg的DCC，在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)體系過(guò)濾，加入10ml的二氯甲烷，依次用1M的HCl、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸去溶劑，快速柱層析得到357mg化合物10，產(chǎn)率92％。
譜圖數(shù)據(jù)如下H NMRδ(300MHz，CDCl3)0.89-0.94(m，12H)，1.35(d，3H，J＝7.2Hz)，1.44(s，9H)，1.56-1.69(m，3H)，2.13-2.24(m，1H)，4.09-4.19(m，1H)，4.24(dd，1H，J＝6.6Hz，8.7Hz)，4.92-5.03(m，1H)，4.95(d，2H，J＝5.4Hz)，6.35-6.44(m，1H)，6.69-6.78(m，2H)，7.31-7.42(m，5H)。
化合物11的制備將310mg的化合物10溶解在5ml的甲醇中，加入62mg的20％的鈀碳，常壓氫化3小時(shí)，過(guò)濾掉鈀碳，將溶劑蒸去，快速柱層析，得到258mg的化合物11，產(chǎn)率100％。
譜圖數(shù)據(jù)如下H NMRδ(300MHz，CDCl3)0.91-0.96(m，12H)，1.34(d，3H，J＝6.9Hz)，1.44(s，9H)，1.60-1.75(m，3H)，2.08-2.20(m，1H)，4.18-4.28(m，1H)，4.33(t，1H，J＝9.0Hz)，4.51-4.61(m，1H)，5.27-5.35(m，1H)，7.08-7.17(m，1H)，7.27-7.33(m，1H)。
化合物N2的制備將50mg的 溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，抽干溶劑。得到的脫Boc的底物溶解在2ml的CH2Cl2中，加入62mg的化合物11，再加入97μl的iPr2NEt，然后加75mg的HATU。在室溫下反應(yīng)12小時(shí)，依次用1M HCl、飽和NaHCO3水溶液、飽和食鹽水洗，Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸去溶劑，快速柱層析得到76mg的產(chǎn)物N2，產(chǎn)率81％。
譜圖數(shù)據(jù)如下ESI-MS[M+H+]610.4。
化合物N1的制備將41mg的化合物N2溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，抽干溶劑。得到的脫Boc的底物溶解在2ml的THF中，加入10mg的 再加入42μl的iPr2NEt，然后加33mg的HATU。在室溫下反應(yīng)12小時(shí)，依次用1M HCl、飽和NaHCO3水溶液、飽和食鹽水洗，Na2SO4干燥。過(guò)濾，減壓蒸去溶劑，快速柱層析得到34mg的產(chǎn)物N1，產(chǎn)率82％。
譜圖數(shù)據(jù)如下H NMRδ(300MHz，CDCl3)0.89(s，12H)，1.25-1.29(m，3H)，1.44(d，3H，J＝7.4Hz)，1.50-1.92(m，5H)，2.04-2.17(m，2H)，2.20-2.41(m，3H)，2.47(s，3H)，3.20-3.41(m，2H)，4.18(q，2H，J＝7.2Hz)，4.32-4.43(m，1H)，4.57-4.79(m，2H)，4.85-4.97(m，1H)，5.93-6.00(m，1H)，6.46(s，1H)，6.82-6.92(m，1H)，7.47-7.93(m，3H)；ESI-MS[M+H+]619.3。
實(shí)施例4 SARS-CoV Mpro與小分子抑制劑的復(fù)合物的晶體制備、數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析一、材料與方法1.SARS-CoV Mpro與小分子化合物N1的復(fù)合物的晶體制備將SARS-CoV Mpro在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達(dá)后進(jìn)行進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶(參見(jiàn)Yang H et al.2003.The Crystal Structures of SARSVirus Main Protease Mpro and Its Complex with an Inhibitor.PNAS，100(23)13190-13195)。將N1用7.5％PEG6000、6％ DMSO、0.1M MES(pH6.0)的池液制備成10mM的溶液后，等體積加入晶體生長(zhǎng)的懸滴中，291K靜置2天。
2.SARS-CoV Mpro與小分子化合物N1的復(fù)合物的數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析(1)數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)處理用Rigaku CuKα旋轉(zhuǎn)靶X光衍射儀完成，數(shù)據(jù)收集時(shí)的系統(tǒng)參數(shù)為電壓40KV，電流20mA，波長(zhǎng)1.5418，溫度100K。晶體在30％PEG400、0.1M MES(pH6.0)的防凍液中浸泡后，用液氮流迅速冷卻至100K。晶體的衍射分辨率為1.88。所有的最終衍射數(shù)據(jù)用HKL2000處理到2.0。
(2)結(jié)構(gòu)解析復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析是通過(guò)用SARS-CoV Mpro的母體結(jié)構(gòu)(PDBcode1UJ1)為起始搜索模型，用分子置換法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的。用CNS程序做旋轉(zhuǎn)函數(shù)和平移函數(shù)搜索，可獲得一個(gè)對(duì)稱二體的清晰解。然后在程序O中利用2Fo-Fc和Fo-Fc的差值圖進(jìn)行小分子模型的搭建。經(jīng)過(guò)修正后，Rwork20.0，Rfree23.8。
SARS-CoV Mpro與N2、N3及N4的復(fù)合物的晶體制備、數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析所采用的方法與N1基本相同，此處不再贅述。
二、結(jié)構(gòu)分析1、SARS-CoV Mpro與小分子化合物N1的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析SARS-CoV Mpro是一個(gè)同源二體結(jié)構(gòu)，在一個(gè)不對(duì)稱單位中含有兩個(gè)單體A和B，由于小分子化合物N1與A、B兩個(gè)單體的結(jié)合基本類似，現(xiàn)在僅分析N1和A的結(jié)合模式。
在單體A的2Fo-Fc差值圖(countered at 1σ)中，可以清楚地觀察到N1結(jié)合到了酶的底物結(jié)合口袋中。其中N1中的Cβ與A145-Cys的Sγ形成了一根鍵長(zhǎng)為1.8的共價(jià)鍵。N1酯基中的羰基氧與A145-Cys主碳鏈上的氨基形成3.1的氫鍵；酯中的乙基與A27-Leu，His-A41和Thr-A25的側(cè)鏈形成疏水相互作用。在P1位點(diǎn)，內(nèi)酰胺五元環(huán)中的氧與His-163的NE2形成2.6氫鍵。在內(nèi)酰胺環(huán)附近的一個(gè)水分子能與N1的內(nèi)酰胺環(huán)上的N，His-172的NE2以及140-Phe和Ser-B1的羰基氧分別形成2.6，3.2，2.6和2.7的氫鍵，使得內(nèi)酰胺環(huán)牢固的結(jié)合在了S1口袋中。由于整個(gè)冠狀病毒家族的主蛋白酶的P1位點(diǎn)非常保守，并總是以Q的形式出現(xiàn)，因此，占據(jù)相應(yīng)的底物結(jié)合口袋S1是抑制蛋白酶活性的一個(gè)關(guān)鍵。對(duì)于N1的P2位點(diǎn)而言，小分子的Leu側(cè)鏈很容易地插入His-41，Met-49和Phe-181側(cè)鏈，以及Gln-189和Asp-187的側(cè)鏈的烷基部分組成的疏水口袋中。His-164中的羰基氧與N1中的靠近酯基一側(cè)的肽鍵中的N形成2.9的氫鍵，N1中的Val的羰基氧與Glu-A166中的N形成2.9氫鍵，Val肽鍵中的N與Glu-A166羰基氧形成3.0的氫鍵，N1中Ala肽鍵中的N與Thr-190的羰基氧形成3.2的氫鍵。Ala的側(cè)鏈插入Phe-185，Glu-192，Leu-167，Met-165側(cè)鏈組成的疏水口袋中。N1中末端的雜環(huán)與Pro-168的五元環(huán)之間有疏水作用。所有這些共價(jià)鍵，氫鍵和疏水相互作用使得抑制劑化合物N1牢固的結(jié)合在酶的底物活性口袋，從而造成了酶的失活。
2、N2和N3的結(jié)合和N1基本類似，這里不再贅述。
實(shí)施例5小分子化合物N1、N2、N3和N4對(duì)來(lái)源于各種不同冠狀病毒的主蛋白酶的抑制活性一、材料與方法(1)N1、N2、N3和N4對(duì)SARS-CoV Mpro的抑制活性的測(cè)定在緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入1μM(終濃度)的SARS-CoV Mpro，100μM(終濃度)的化合物N1，298K放置10分鐘后，迅速加入5μM的熒光標(biāo)記底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2)。激發(fā)波波長(zhǎng)和發(fā)射波波長(zhǎng)分別為330nm和395nm，溫度保持298K，每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)。
N2、N3和N4的抑制活性的測(cè)定方法與N1基本相同。
對(duì)照不加入抑制劑，其余條件相同。結(jié)果示于圖3中。
(2)N1對(duì)傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Viruses，TGEV)主蛋白酶的抑制活性的測(cè)定。
在緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入1μM的所述蛋白酶，100μM的化合物N1，298K放置10分鐘后，迅速加入5μM的熒光標(biāo)記底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2)。激發(fā)波波長(zhǎng)和發(fā)射波波長(zhǎng)分別為330nm和395nm，溫度保持298K，每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)。然后改變抑制劑濃度，分別在10nM，1μM下測(cè)定抑制活性。對(duì)照不加入抑制劑，其余條件相同。結(jié)果示于圖4中。
(3)N1對(duì)人冠狀病毒(Human Coronavirus，HCoV)229E主蛋白酶的抑制活性的測(cè)定在緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入0.1μM的所述蛋白酶，100μM的化合物N1，298K放置10分鐘后，迅速加入5μM的熒光標(biāo)記底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2)。激發(fā)波波長(zhǎng)和發(fā)射波波長(zhǎng)分別為330nm和395nm，溫度保持298K，每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)。對(duì)照不加入抑制劑，其余條件相同。結(jié)果示于圖5中。
(4)N1對(duì)貓傳染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus，F(xiàn)IPV)的主蛋白酶的抑制活性的測(cè)定方法同(3)，結(jié)果示于圖6中。
(5)N1對(duì)禽傳染性支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，AIBV)的主蛋白酶的抑制活性的測(cè)定在緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入0.1μM的所述蛋白酶，100μM的化合物N1，298K放置10分鐘后，迅速加入5μM的熒光標(biāo)記底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2)。激發(fā)波波長(zhǎng)和發(fā)射波波長(zhǎng)分別為330nm和395nm，溫度保持298K，每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)。對(duì)照不加入抑制劑，其余條件相同。結(jié)果示于圖7中。
FIPV、HCoV、TGEV的表達(dá)純化參考文獻(xiàn)Conservation of substratespecificities among coronavirus main proteases.J Gen Virol.2002；83(Pt 3)595-9.
二、結(jié)果與分析1、N1、N2、N3和N4對(duì)SARS-CoV Mpro的抑制活性由圖3中可以看出，N1、N2、N3和N4對(duì)SARS-CoV Mpro都有抑制活性，而且N1的抑制活性最強(qiáng)。
2、N1對(duì)其他冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性從N1對(duì)其他冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性測(cè)定(即圖4-圖7)中可知，N1對(duì)TGEV、HcoV、FIPV和AIBV的主蛋白酶都有抑制活性，其中對(duì)TGEV的主蛋白酶的抑制活性最強(qiáng)，在10nM的條件下，N1對(duì)TGEV主蛋白酶仍然有抑制活性。
由于TGEV、HcoV、FIPV屬于冠狀病毒科的I型(血清型)，AIBV屬于III型，SARS-CoV屬于IV型，因此，可以推斷N1對(duì)整個(gè)冠狀病毒家族的主蛋白酶都有抑制活性。
本文中所涉及的參考文獻(xiàn)，包括專利文件、學(xué)術(shù)論文、出版物等，均以引用的方式將其全部?jī)?nèi)容包括在本文中。
應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，如果在文中沒(méi)有特別說(shuō)明，則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說(shuō)明書、手冊(cè)等加以實(shí)施。
本文中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)用品(包括但不限于化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等)之中，對(duì)于那些特殊的或不易獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法；未經(jīng)特別說(shuō)明的，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，在本發(fā)明申請(qǐng)日之前，可以通過(guò)各種方式(例如購(gòu)買、自行制備等)很方便地獲得。
應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種改變和改進(jìn)，而這些均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.下述通式(I)化合物 其中，U為 或 其中的X為NH或CH2；R1選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、芐氧羰基、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、 R2選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、氟代芐基；R3選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、對(duì)甲基苯基、氟代芐基；R4選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、對(duì)甲基苯基、氟代芐基；R5選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C1～C4的烷基、苯基、芐基、對(duì)甲基苯基、氟代芐基、氟代苯基。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組叔丁氧羰基、異噁唑基羰基、三氟甲基羰基、 R2為甲基或異丙基；R3為甲基或異丙基；R4為乙基或芐基；R5選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組異丁基、對(duì)氟芐基、苯基、氟代苯基。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述化合物選自由如下成員構(gòu)成的組 其中，Boc為叔丁氧羰基，Ph為苯基，Et為乙基，Bn為芐基。
4.權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述化合物的結(jié)構(gòu)式為
5.權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物的結(jié)構(gòu)式符合如下通式
6.權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物的結(jié)構(gòu)式符合如下通式
7.權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物的結(jié)構(gòu)式符合如下通式
8.權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，包括如下步驟將式(II)化合物中氨基的保護(hù)基R6脫除，其中的R6選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組叔丁氧羰基、三氟乙酰基、芐氧羰基；在縮合試劑的存在下，將上一步的產(chǎn)物與式(III)化合物進(jìn)行縮合，得到式(I)化合物， 其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R4、U的定義與式(I)中的相同。
9.權(quán)利要求8所述的方法，包括如下步驟在有機(jī)溶劑中，使式(II)化合物與酸在室溫下反應(yīng)1～4小時(shí)，脫去氨基的保護(hù)基R6，抽去溶劑；將產(chǎn)物與式(III)化合物溶于非質(zhì)子性溶劑中，加入縮合試劑和有機(jī)堿，在室溫下反應(yīng)8～24小時(shí)，得到式(I)化合物。
10.權(quán)利要求8所述的方法，還包括對(duì)得到的式(I)化合物進(jìn)行進(jìn)一步的衍生化，以將其中的R1基團(tuán)更換為預(yù)期的基團(tuán)R1’，其中R1’選自由如下基團(tuán)構(gòu)成的組C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、芐氧羰基、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、 所述的衍生化包括如下步驟將權(quán)利要求8的方法中得到的式(I)化合物中的R1脫除；在縮合試劑的存在下，將上一步的產(chǎn)物與羧酸R1’-OH進(jìn)行縮合，得到衍生化了的式(I)化合物，其中的R1基團(tuán)被更換為R1’基團(tuán)。
11.權(quán)利要求8-10之一所述的方法，其中，所述的酸為三氟乙酸或鹽酸；所述的有機(jī)溶劑選自由如下成員構(gòu)成的組CH2Cl2、四氫呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六環(huán)；所述的非質(zhì)子性溶劑選自由如下成員構(gòu)成的組CH2Cl2、四氫呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、苯；所述的縮合試劑選自由如下成員構(gòu)成的組HATU、HBTU、EDCI；所述的有機(jī)堿選自由如下成員構(gòu)成的組二異丙基乙基胺、三乙胺。
12.權(quán)利要求1-7的化合物在制備用于治療或者預(yù)防冠狀病毒感染的藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述冠狀病毒為SARS冠狀病毒、豬的傳染性胃腸炎病毒、人冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了基于SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)所設(shè)計(jì)的一系列小分子抑制劑，其結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示。本發(fā)明還提供了所述小分子抑制劑的制備方法，及其在制備用于治療或者預(yù)防各種冠狀病毒感染的藥物中的用途。
文檔編號(hào)C07D413/12GK1763002SQ20041008772
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者饒子和, 楊海濤, 薛曉宇, 楊楷林, 馬克·巴特拉姆, 馬大為, 謝衛(wèi)青 申請(qǐng)人:清華大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所