專利名稱：對蝦的G蛋白pvGαq基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從對蝦中克隆的G蛋白pvGαq基因。
背景技術(shù)：
細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息和物質(zhì)之間的交流最主要的一種方式就是G蛋白信號(hào)途徑。該途徑普遍存在于各種生物體內(nèi)，各種胞外信號(hào)，包括化學(xué)藥物、蛋白激素等都通過細(xì)胞膜上具有七重跨膜片斷結(jié)構(gòu)特征的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)將信號(hào)傳給細(xì)胞內(nèi)的G蛋白(GTP-binding protein)，再由各種G蛋白亞基(α、β和γ亞基)通過不同的組合激活下游不同的分子途徑，使細(xì)胞以至機(jī)體發(fā)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。
G蛋白是α、β和γ 3個(gè)不同的亞基結(jié)合而成的異源三聚體，可將七次跨膜受體接受的胞外信號(hào)傳給胞內(nèi)的效應(yīng)生物功能蛋白。β和γ亞基總是緊密結(jié)合在一起作為一個(gè)功能單位，而α亞基可以與二磷酸鳥苷GDP或三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合。α亞基在結(jié)合GDP狀態(tài)下比結(jié)合GTP更易與β/γ亞基復(fù)合體親和。當(dāng)配體與膜受體結(jié)合后，可引起與α亞基結(jié)合的GDP被GTP取代，并導(dǎo)致GTP-α亞基與β/γ亞基復(fù)合體的分離，進(jìn)而各自調(diào)控相應(yīng)的效應(yīng)功能蛋白。α亞基具有內(nèi)在的GTP酶活性，可將GTP水解成GDP，使GDP-α亞基和功能蛋白分開，并再度與β/γ亞基復(fù)合體形成緊密結(jié)合，從而恢復(fù)到非激活狀態(tài)。G蛋白α亞基是最主要的G蛋白成員之一。在哺乳動(dòng)物中已被克隆的G蛋白α亞基有17個(gè)，根據(jù)它們的序列相似性，可分為四個(gè)家族，即Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。Gαq/11家族成員有Gαq、Gα11、Gα14、Gα15和Gα16。研究已發(fā)現(xiàn)，Gαq和Gα11與細(xì)胞產(chǎn)生百日咳毒素(PTX)的抗性有關(guān)。它們與磷脂酶PLC-形成偶聯(lián)，PLC-β被激活后，可促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生二酰甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白激酶C(PKC)的活化和胞內(nèi)Ca2+的釋放。Gαq/11還能夠激活ERK、p38和JNK/SAPK。目前，對G蛋白信號(hào)調(diào)控的研究多見于高等生物，對低等生物只限于酵母、真菌、線蟲等，在甲殼類無脊椎動(dòng)物中只有美國龍蝦(Homarus americanus)中克隆到Gαq，而且它在龍蝦的嗅覺受體神經(jīng)元中表達(dá)豐富。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用生物工程技術(shù)從對蝦的感覺器官中克隆與Gαq同源的新基因pvGαq，為對蝦生長與發(fā)育提供理論基礎(chǔ)，為對蝦養(yǎng)殖、防病害以及新型配合飼料的研制奠定理論基礎(chǔ)。
本發(fā)明所說的基因名稱pvGαq(Penaeus vannamei heterotrimeric Gq protein alphasubunit)。
Genbank序列號(hào)AY626792序列特征長度1424個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈幾何特征線性分子類型cDNA基因來源南美白對蝦Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白編碼序列210-1271表達(dá)產(chǎn)物pvGαq翻譯成蛋白的氨基酸序列353aaMACCLSEEAKEQKRINQEIERQLRKDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSDDDKRGFIKLVFQNIFMAMQSMIRAMDLLQISYGDSANSEHADLVRAVDYESVTTFEEPYVTAMKSLWADTGIQHCYDRRREYQLTDSAKYYLDDLERIISSDFLPTEQDILRARVPTTGIIEYPFDLDSIIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIIFLVALSEYDQILFESDNENRMEESKALFKTIITYPWFQHSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAIAAREFILRMFVELNPDPEKIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNLVcDNA序列描述1 gagacggccg gaccaaaccc caccccattt ggctttggga ttttgtgtgg aggaaataag cccaaaattg agaaaattcc81 ccgattaaac gccgcttccc cttcgtggcg aaaggcgggc tgaaagagga gaggaaggag gtgaaattag tcccgaagtt161 ggagtgaaag gaagtcaaaa ttggtaataa tattagttga tcagcaaaca tggcgtgctg tttaagcgaa gaagccaagg241 aacagaagag gataaaccaa gaaatagaac gacaattaag gaaagataag agagatgcca gaagagaact caaactactg321 ttattgggca caggagaatc tggcaaatct accttcatca agcagatgcg tattatccac ggtgcaggtt atagcgatga401 tgacaaacga gggttcatca agctggtctt ccagaacatc ttcatggcca tgcagtcaat gatcagggcc atggaccttc481 ttcaaatatc ttatggagac tctgcaaaca gtgaacacgc agatctggtg cgagcggtgg actatgagtc agtcacaacg561 tttgaggagc catatgtaac tgccatgaaa agcttatggg ctgacaccgg catccaacac tgctatgatc gtcgcagaga641 gtaccagctc acagattcag caaaatatta tcttgatgat ttggagcgta tcatatcatc ggacttctta ccgaccgagc721 aggatattct tagggctcga gtaccaacca ctggaatcat tgagtacccc tttgatctgg actcaatcat ctttagaatg801 gtagatgtcg gtggtcagcg atctgagcga cggaagtgga ttcattgctt cgagaatgtc acctctatca ttttcctggt
881 cgcactttct gagtatgatc agatcttgtt tgagtctgac aatgagaacc gaatggaaga atcaaaggcc ctgttcaaga961 ccattatcac atacccctgg ttccagcact cgtctgttat tctcttcctt aacaagaagg atctgttgga ggagaagatc1041 atgtactcac atctggtgga ctattttcca gaatatgatg gcccacagag ggatgccatt gcagcccggg agttcatcct1121 acgtatgttt gtagaattaa atcctgatcc tgagaagatt atatattcac atttcacatg cgcgacagac actgagaaca1201 taaggttcgt cttcgctgcc gtcaaagaca caatcctgca gctaaatcta aaggaataca atctggtgta acgtagagct1281 gtgcccaact ctggccgaaa gtgtacccaa ggtgaagtga cagcataccc ccctactctt gtgaggggct gtcggttgag1361 gcctcacttc atcaccctaa tatggacact aaactatgaa ggcagtaaaa aaaaaaaaa aaaa//pvGαq基因的提取過程如下1)從南美白對蝦(Penaeus vannamei)中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMReverse Transcriptase(Invitrogen)II反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
2)根據(jù)已知物種G蛋白α亞基的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，GαF5’-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’。進(jìn)行簡并PCR；3)簡并PCR得到500bp的片斷產(chǎn)物，將這些片段經(jīng)Klenow和T4 DNA聚合酶處理后克隆到pBluescript經(jīng)Sma I酶切，CIP去磷酸化后的載體上，測序分析發(fā)現(xiàn)，該片斷序列與其他物種Gαq具有非常高的保守性。
4)通過上述序列設(shè)計(jì)特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物為Q5’，5’-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGA T-3’，3’-RACE引物為Q3’，5’-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA 3’。5’-和3’-RACE的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆到pBluescript載體并測序，得到5’-和3’-兩端序列，從而得到全長序列。
5)利用Genedoc軟件對pvGαq與其它物種Gαq序列進(jìn)行alignment分析，比較pvGαq與其它物種Gαq的同源性。
6)利用DNAstar軟件對Gαq做進(jìn)化樹分析，確定對蝦在進(jìn)化中的地位。
對蝦是我國主要的海水養(yǎng)殖產(chǎn)品之一，對蝦的感覺系統(tǒng)發(fā)達(dá)，而且感覺系統(tǒng)在其簡單的生命活動(dòng)中起著非常關(guān)鍵的作用，我們發(fā)現(xiàn)pvGαq蛋白在對蝦的神經(jīng)系統(tǒng)(腦)、感覺器官(眼、觸角)、攝食和消化系統(tǒng)(小額、鰓和腸道)中的大量分布也證實(shí)了G蛋白在對蝦生命活動(dòng)中的重要性。而pvGαq蛋白的結(jié)構(gòu)和功能在進(jìn)化上有極強(qiáng)的保守性，為G蛋白功能分子在進(jìn)化上的同源性研究提供了分子與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。所以對對蝦Gαq蛋白的研究可能為對蝦的生命活動(dòng)規(guī)律、對蝦抗病害和養(yǎng)殖的研究打下理論基礎(chǔ)。


圖1為對蝦G蛋白pvGαq與其它物種Gαq的alignment分析。
圖2為對Gαq的進(jìn)化樹分析。
圖3為Western blot檢測對蝦各器官組織中pvGαq的表達(dá)。
圖4為免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)電泳圖。
圖5為細(xì)胞內(nèi)IP3濃度測定結(jié)果示意圖。
圖6為細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度測定結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1.基因pvGαq的克隆1.從市場買來新鮮對蝦，鑒定為從南美白對蝦(Penaeus vannamei)。從新鮮對蝦中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMReverse Transcriptase(Invitrogen)II反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
2.根據(jù)已知物種G蛋白α亞基的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，GαF5’-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’。進(jìn)行簡并PCR，PCR在25μl體系中進(jìn)行，其中單鏈cDNA 1.5μl，兩端引物各20pmol，dNTP 0.24mM，Taq聚合酶(Promega，USA)1.25 U和相應(yīng)緩沖液2.5μl。運(yùn)行程序如下94℃退火3分鐘，接著94℃，30秒，42℃ 60秒，72℃60秒40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3分鐘。
3.簡并PCR得到500bp的片斷產(chǎn)物，將這些片段經(jīng)Klenow和T4 DNA聚合酶處理后克隆到pBluescript經(jīng)Sma I酶切，CIP去磷酸化后的載體上，測序分析發(fā)現(xiàn)，該片斷序列與其他物種Gαq具有非常高的保守性。
4.通過這段序列設(shè)計(jì)特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物為Q5’，5’-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT-3’，3’-RACE引物為Q3’，5’-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA3’。5’-和3’-RACE的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆到pBluescript載體并測序，得到5’-和3’-兩端序列，從而得到全長序列。
5.利用Genedoc軟件對pvGαq與其它物種Gαq序列進(jìn)行alignment分析，比較pvGαq與其它物種Gαq的同源性(見圖1，圖中細(xì)線標(biāo)記為棕櫚酰化修飾后與膜錨定的位點(diǎn)、粗線標(biāo)記為GTP結(jié)合位點(diǎn)、圓點(diǎn)標(biāo)記R177為霍亂毒素作用位點(diǎn)。)及利用DNAstar軟件對Gαq做進(jìn)化樹分析，確定對蝦在進(jìn)化中的地位(見圖2)。發(fā)現(xiàn)該基因與其它物種(從無脊椎動(dòng)物線蟲、甲殼類龍蝦到脊椎動(dòng)物小鼠和人類)都具有很高的同源性，而且具有其他物種保守的功能位點(diǎn)。與龍蝦具有最近的親緣關(guān)系。確定了該基因就是Gαq，我們給它命名pvGαq。
實(shí)施例2pvGαq的功能鑒定1.按文獻(xiàn)Sternweis(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)公開的方法提取對蝦各器官中膜蛋白，取10μg膜蛋白進(jìn)行Western blot分析。發(fā)現(xiàn)pvGαq在對蝦的各組織中都有少量分布，尤其在腦、眼、小額、觸角、鰓和腸道上有豐富的表達(dá)(圖3)。
2.免疫共沉淀取適當(dāng)濃度的HEK 293T細(xì)胞鋪于60mm細(xì)胞培養(yǎng)板，在含10％小牛血清的DMEM(Gibco)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24小時(shí)后，用聚醚酰亞胺PEI(Polyethylenimine)將pCMV5-HA-pvGαq分別與pCMV5、pCMV5-Flag-pvGβ1和同樣載體的人類Gβ1各2ug，共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。36小時(shí)后收細(xì)胞，按照Sternweis等人(Sternweis，P.C.，Robishaw，J.D.，1984.J.Biol.Chem.295，13806-13813.)的方法提取細(xì)胞膜蛋白。將膜蛋白重懸于緩沖液(Hepes 30mM，MgCl2 1mM，EDTA 10mM，DTT 0.1mM，NaCl 150mM，GDP 0.1mM，Lubrol-PX 0.1％)中，取800μl濃度為4mg/ml的膜蛋白，冰上放置30分鐘，然后離心20分鐘后去掉不溶物，在上清溶液中加入抗HA的抗體(Santa Cruz)1μg，Protein-A/G beads 5μl，于4℃混和器上轉(zhuǎn)過夜，1000rpm 4℃離心收集沉淀產(chǎn)物，同上緩沖液洗三次，然后SDS-PAGE電泳，用抗Flag的一抗進(jìn)行western blot分析。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在GDP存在的情況下它能結(jié)合對蝦G蛋白pvGβ1，也能結(jié)合人Gβ1(圖4)。
3.細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的測定同上方法將pCMV5-HA-pvGαq2μg轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體做為對照。36小時(shí)后分散細(xì)胞，取6×104個(gè)細(xì)胞于Eppendorf管，500g離心3分鐘，用Hanks平衡鹽溶液HBSS洗細(xì)胞3次，于10μM的FLUO-3/AM(CalBiochem)中37℃孵育30分鐘，加HBSS(含1％FBS)400μl，繼續(xù)孵育30分鐘，再用HEPES緩沖液(HEPES 10mM，Na2HPO41mM，NaCl 137mM，KCl 5mM，CaCl21mM，MgCl20.5mM，glucose 5mM，BSA 0.1％，pH7.4)洗兩次，加180μl HEPES緩沖液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到黑色96孔板，加入10mM的LiCl 20μl，30uM AlCl3與10mM NaF的混合物30μl，分別孵育5min、10min、20min后加入高氯酸終止反應(yīng)。最后酶標(biāo)儀分析，485nm激發(fā)，526nm吸收波長檢測。結(jié)果顯示在哺乳類細(xì)胞HEK293中過量表達(dá)pvGαq，能使細(xì)胞內(nèi)Ca2+和IP3濃度上升(圖5)。右圖中灰色為AlF4-激活后檢測結(jié)果。
4.細(xì)胞內(nèi)三磷酸肌醇濃度的測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染、G蛋白激活過程同鈣離子濃度測定方法，測定IP3具體過程見Amersham公司產(chǎn)品號(hào)90-0037-01說明書。
權(quán)利要求
1.對蝦G蛋白pvGαq基因，其特征在于其基因名稱為pvGαq(Penaeus vannameiheterotrimeric Gq protein alpha subunit)，Genbank序列號(hào)AY626792序列特征長度1424個(gè)堿基類型核酸鏈型單鏈幾何特征線性分子類型cDNA基因來源南美白對蝦Penaeus vannamei(Litopenaeus vannamei)蛋白編碼序列210-1271表達(dá)產(chǎn)物pvGαq翻譯成蛋白的氨基酸序列353aaMACCLSEEAKEQKRINQEIERQLRKDKRDARRELKLLLLGTGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSDDDKRGFIKLVFQNIFMAMQSMIRAMDLLQISYGDSANSEHADLVRAVDYESVTTFEEPYVTAMKSLWADTGIQHCYDRRREYQLTDSAKYYLDDLERIISSDFLPTEQDILRARVPTTGIIEYPFDLDSIIFRMVDVGGQRSERRKWIHCFENVTSIIFLVALSEYDQILFESDNENRMEESKALFKTIITYPWFQHSSVILFLNKKDLLEEKIMYSHLVDYFPEYDGPQRDAIAAREFILRMFVELNPDPEKIIYSHFTCATDTENIRFVFAAVKDTILQLNLKEYNLVcDNA序列描述1 gagacggccg gaccaaaccc caccccattt ggctttggga ttttgtgtgg aggaaataag cccaaaattg agaaaattcc81 ccgattaaac gccgcttccc cttcgtggcg aaaggcgggc tgaaagagga gaggaaggag gtgaaattag tcccgaagtt161 ggagtgaaag gaagtcaaaa ttggtaataa tattagttga tcagcaaaca tggcgtgctg tttaagcgaa gaagccaagg241 aacagaagag gataaaccaa gaaatagaac gacaattaag gaaagataag agagatgcca gaagagaact caaactactg321 ttattgggca caggagaatc tggcaaatct accttcatca agcagatgcg tattatccac ggtgcaggtt atagcgatga401 tgacaaacga gggttcatca agctggtctt ccagaacatc ttcatggcca tgcagtcaat gatcagggcc atggaccttc481 ttcaaatatc ttatggagac tctgcaaaca gtgaacacgc agatctggtg cgagcggtgg actatgagtc agtcacaacg561 tttgaggagc catatgtaac tgccatgaaa agcttatggg ctgacaccgg catccaacac tgctatgatc gtcgcagaga641 gtaccagctc acagattcag caaaatatta tcttgatgat ttggagcgta tcatatcatc ggacttctta ccgaccgagc721 aggatattct tagggctcga gtaccaacca ctggaatcat tgagtacccc tttgatctgg actcaatcat ctttagaatg801 gtagatgtcg gtggtcagcg atctgagcga cggaagtgga ttcattgctt cgagaatgtc acctctatca ttttcctggt881 cgcactttct gagtatgatc agatcttgtt tgagtctgac aatgagaacc gaatggaaga atcaaaggcc ctgttcaaga961 ccattatcac atacccctgg ttccagcact cgtctgttat tctcttcctt aacaagaagg atctgttgga ggagaagatc1041 atgtactcac atctggtgga ctattttcca gaatatgatg gcccacagag ggatgccatt gcagcccggg agttcatcct1121 acgtatgttt gtagaattaa atcctgatcc tgagaagatt atatattcac atttcacatg cgcgacagac actgagaaca1201 taaggttcgt cttcgctgcc gtcaaagaca caatcctgca gctaaatcta aaggaataca atctggtgta acgtagagct1281 gtgcccaact ctggccgaaa gtgtacccaa ggtgaagtga cagcataccc ccctactctt gtgaggggct gtcggttgag1361 gcctcacttc atcaccctaa tatggacact aaactatgaa ggcagtaaaa aaaaaaaaaa aaaa//
2.對蝦的G蛋白pvGαq基因的提取方法，其特征在于其步驟為1)從南美白對蝦中取出腦、觸角和眼，用Trizol試劑(Invitrogen)分別提取其中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTM Reverse Transcriptase(Invitrogen)II反轉(zhuǎn)錄成cDNA；2)根據(jù)已知物種G蛋白α亞基的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，GαF5’-AGC AGI(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG-3’，GαR5’-TTGAA(AG)CA(AGCT)TG(AGT)ATCCA(CT)TT-3’，進(jìn)行簡并PCR；3)簡并PCR得到500bp的片斷產(chǎn)物，將這些片段經(jīng)Klenow和T4 DNA聚合酶處理后克隆到pBluescript經(jīng)Sma I酶切，CIP去磷酸化后的載體上；4)通過上述序列設(shè)計(jì)特異的引物，用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech，USA)做5’-和3’-RACE，5’-RACE引物為Q5’，5’-CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT-3’，3’-RACE引物為Q3’，5’-ATGATCAGGGCCATGGACCTTCTTCAA 3’，5’-和3’-RACE的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆到pBluescript載體并測序，得到5’-和3’-兩端序列，從而得到全長序列；5)利用Genedoc軟件對pvGαq與其它物種Gαq序列進(jìn)行alignment分析，比較pvGαq與其它物種Gαq的同源性；6)利用DNAstar軟件對Gαq做進(jìn)化樹分析，確定對蝦在進(jìn)化中的地位。
全文摘要
對蝦的G蛋白pvGα
文檔編號(hào)C07K14/435GK1769450SQ20041009029
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者金利華, 林圣彩 申請人:廈門大學(xué)