專利名稱：大腸桿菌表達(dá)的人乳頭瘤病毒16型l1e7重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
1.醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域 2.免疫預(yù)防和治療背景技術(shù)據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，在全球婦女癌癥死因中，宮頸癌排在第二位，而在發(fā)展中國家，由于衛(wèi)生狀況差同時(shí)經(jīng)濟(jì)條件的限制使得宮頸脫落細(xì)胞篩查難以普及，宮頸癌在婦女癌癥死因中升居第一位。全世界每年約有二十萬婦女死于宮頸癌，其中80％在發(fā)展中國家。我國是世界上宮頸癌高發(fā)國之一，每年死于宮頸癌的患者約5萬人。大量研究資料證明，生殖道的高危HPV感染與宮頸癌有十分密切的關(guān)系。90％的宮頸癌患者可查到HPV DNA的存在，其中HPV16型占50％，是引起宮頸癌的主要致病因子。目前盡管早期宮頸癌患者放療及手術(shù)治療效果較好，但中晚期患者必須在手術(shù)治療的基礎(chǔ)上給予放療和一定的化療。由于放療的巨大副作用及宮頸癌對化療的不敏感性，仍有35％的患者出現(xiàn)目前尚無法治療的嚴(yán)重合并癥，費(fèi)用大且復(fù)發(fā)率高。這一切表明有必要發(fā)展更有效的預(yù)防和治療性疫苗來防治HPV的感染和子宮頸癌以及相關(guān)腫瘤。
HPV16主要衣殼蛋白L1在多種表達(dá)體系統(tǒng)中表達(dá)并自組裝成病毒樣顆粒(VLP)?？梢哉T發(fā)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，是較理想的預(yù)防性疫苗，它所引起的細(xì)胞免疫較弱，不能達(dá)到有效的治療作用。早期蛋白E6、E7在宮頸癌細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，是腫瘤治療性疫苗的理想靶抗原。近年來國外有人將E7早期基因插入L1的C末端，在昆蟲細(xì)胞中研制出L1 E7重組蛋白，電鏡結(jié)構(gòu)為病毒樣顆粒(cVLP)，其不但產(chǎn)生高滴度的中和抗體，而且還產(chǎn)生針對E7的CTL反應(yīng)，具備預(yù)防和治療雙重作用，是較有發(fā)展前景的疫苗。然而由于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的cVLP產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差，因而成本高，很難做到廣泛應(yīng)用，尤其在發(fā)展中國家。因此探索是否能夠用原核表達(dá)系統(tǒng)研制出簡單、經(jīng)濟(jì)的并具有免疫活性的L1E7重組蛋白成為本發(fā)明的主要目的。
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發(fā)明內(nèi)容
下面結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，用PCR及基因克隆的方法將HPV16主要?dú)さ鞍譒1活性位點(diǎn)與E7早期基因的主要抗原活性位點(diǎn)融合，再將構(gòu)建的融合基因插到表達(dá)載體pQE30a中，借助原核系統(tǒng)高效表達(dá)L1E7重組蛋白，采用層析方法分離蛋白，并電鏡觀察其為五鄰體結(jié)構(gòu)。用免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)L1E7重組蛋白的免疫活性。


圖1顯示其中插入了HPV16L1E7融合基因的克隆質(zhì)粒“pMD18TL1E7”結(jié)構(gòu)簡2顯示其中插入了HPV16L1E7融合基因的表達(dá)質(zhì)?！皃QE30a L1E7”結(jié)構(gòu)簡3顯示HPV16L1E7融合基因在大腸桿菌系統(tǒng)中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的L1E7重組蛋白產(chǎn)物，圖4(A)顯示HPV16L1E7融合基因表達(dá)產(chǎn)物用L1抗體進(jìn)行檢測的結(jié)果(B)顯示HPV16L1E7融合基因表達(dá)產(chǎn)物用E7抗體進(jìn)行檢測的結(jié)果圖5顯示L1E7重組蛋白樣品加在銅網(wǎng)上用2％磷鎢酸負(fù)染，在philips EM410透識(shí)電子顯微鏡下觀察到的五鄰體樣結(jié)構(gòu)圖6顯示L1E7重組蛋白免疫小鼠后，檢測小鼠血清中L1抗體和E7抗體滴度的結(jié)果圖7顯示L1E7重組蛋白免疫小鼠后，抗腫瘤移植實(shí)驗(yàn)的結(jié)果具體實(shí)施方式
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的例1、L1E7融合基因克隆的構(gòu)建利用PCR技術(shù)將L1編碼區(qū)基因3’末端缺失，然后與去除轉(zhuǎn)化活性的5’端E7編碼區(qū)基因融合，再將其插入pMD18T克隆載體獲得融合基因克隆質(zhì)粒pMD18TL1E7(見圖1)。
例2、原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30a L1E7的構(gòu)建pMD18TL1E7質(zhì)粒酶切消化后獲得L1E7融合基因片斷，將其插入原核表達(dá)載體pQE30a，獲得表達(dá)質(zhì)粒pQE30a L1E7(見圖2)例3、L1E7重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pQE30a L1E7轉(zhuǎn)化JM109鈣化菌，經(jīng)涂皿，挑斑誘導(dǎo)表達(dá)篩選出高表達(dá)克隆菌株03B，SDS-PAGE蛋白電泳膠分析在61KD處有一新增蛋白帶，結(jié)果見圖3例3、L1E7重組蛋白的Western-Blot鑒定高表達(dá)克隆菌株03B誘導(dǎo)表達(dá)后，走SDS-PAGE蛋白電泳膠，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，分別用L1抗體和E7抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖4例4、L1E7重組蛋白的純化(1)菌的制備將菌種接種于300ML培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)5小時(shí)，加入IPTG至終濃度0.84mM/升，37℃誘導(dǎo)表達(dá)7小時(shí)，收集菌體沉淀，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> (2)蛋白的純化①樣品的處理a.取-20℃凍存的菌體，溶解在裂解緩沖液里，加入溶菌酶，于室溫放置45分鐘后，在冰浴中超聲(400瓦12次)12秒，間隔60秒。離心(12000rmp 20分鐘，4℃)取沉淀。
b.將沉淀重懸于緩沖液A里，于冰浴中超聲(200瓦10次)12秒，間隔30秒。離心(12000rmp 20分鐘，4℃)取沉淀。并將步驟b再重復(fù)一次。
c.沉淀重懸于緩沖液B中，并于室溫中振蕩溶解一小時(shí)。然后將懸液離心(12000rmp 20分鐘，20℃)取上清備用。
②離子交換層析將上清加入已用緩沖液C平衡的離子交換柱上，用加了100mM氯化鈉緩沖液A以1毫升每分鐘的速度洗脫。
③親和層析將從離子交換得到的樣品調(diào)PH至8.0，然后加入用緩沖液B平衡過的Ni-NTA親和層析柱，用含咪唑的緩沖液B以1毫升每分鐘的流速洗脫，收集目的蛋白。
(3)蛋白的透析復(fù)性及濃縮①蛋白的透析將最后洗脫的蛋白置于處理好的透析袋中密封，放入100倍體積的含有尿素的透析液D中，每6小時(shí)更換透析液，經(jīng)4、2、1、0M的尿素梯度進(jìn)行透析，最后再透析到磷酸緩沖鹽溶液中。
②蛋白的濃縮
將透析好的蛋白取出離心(12000rmp 20分鐘，4℃)取上清重新用透析袋封閉好，埋于聚乙二醇(PEG 8000)顆粒中，待其濃縮至初體積的1/3時(shí)取出，將蛋白離心(12000rmp 20分鐘，4℃)取上清，分裝儲(chǔ)存。
例5、重組蛋白結(jié)構(gòu)電鏡分析將L1E7重組蛋白樣品加在銅網(wǎng)上，用2％磷鎢酸負(fù)染，在philipsEM410透識(shí)電子顯微鏡下觀察到五鄰體結(jié)構(gòu)(見圖5)。
例6、L1E7重組蛋白動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)①L1E7重組蛋白免疫小鼠血清抗體檢測L1E7重組蛋白免疫小鼠，二周后加強(qiáng)一針，再過兩周取血清用酶聯(lián)免疫法分別檢測L1抗體和E7抗體水平結(jié)果見圖6。從圖中可看出L1E7重蛋白能誘發(fā)產(chǎn)生滴度為1∶450的L1抗體和1∶200的E7抗體。
②L1E7重組蛋白抗腫瘤移植實(shí)驗(yàn)用L1E7重組蛋白免疫C57小鼠，加強(qiáng)免疫后10天，用1×104TC-1腫瘤細(xì)胞注射小鼠腹股溝處，觀察腫瘤生長情況三個(gè)月，結(jié)果見圖7。從圖中可看出L1E7重蛋白具有免疫保護(hù)作用，不僅能將成瘤時(shí)間推遲，而且保護(hù)50％小鼠抵抗TC-1腫瘤細(xì)胞攻擊，經(jīng)三個(gè)月的觀察，證明這種保護(hù)是長期的。
權(quán)利要求
1.大腸桿菌中表達(dá)的人乳頭瘤病毒16型病毒的重組蛋白HPV16PL1E7，其特征為重組蛋白HPV16PL1E7系利用基因工程技術(shù)將人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白基因L1的免疫活性部分和早期基因E7的免疫活性部分融合構(gòu)建為融合基因L1E7，并將L1E7融合基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)得到的產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，HPV16PL1E7重組蛋白的電子顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)為五鄰體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，HPV16L1E7重組蛋白可與藥學(xué)上可接受的藥物制成藥物組合物，用于預(yù)防人乳頭瘤病毒16型的感染和治療與此感染相關(guān)的疾病，也可用于研制預(yù)防或治療人乳頭瘤病毒16型感染的疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV16PL1E7重組蛋白和權(quán)利要求2、3描述的HPV16P L1E7重組蛋白的特征產(chǎn)生的藥物、藥物組合物和疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在大腸桿菌中高效表達(dá)的人乳頭瘤病毒16型L1E7重組蛋白，它是利用基因工程技術(shù)，將HPV16型早期基因E7與HPV16主要?dú)さ鞍谆騆1融合，然后在大腸桿菌中高效表達(dá)。經(jīng)層析純化后的L1E7重組蛋白電鏡分析結(jié)構(gòu)為五鄰體(pentamer)，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有強(qiáng)的免疫學(xué)特性。該重組蛋白可應(yīng)用于臨床預(yù)防和治療HPV16感染以及與其相關(guān)的腫瘤免疫治療。
文檔編號(hào)C07K14/005GK1696152SQ200410091189
公開日2005年11月16日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者田厚文, 陸振華, 邊濤, 任皎, 趙莉, 葉振梅, 阮力 申請人:中國疾病預(yù)防控治中心病毒病預(yù)防控制所