專利名稱：維生素d衍生物結(jié)晶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的維生素D衍生物結(jié)晶，更具體地講，本發(fā)明涉及通過反相色譜法純化維生素D衍生物，然后將純化的衍生物于有機(jī)溶劑中結(jié)晶獲得的新的維生素D衍生物結(jié)晶。本發(fā)明還涉及維生素D衍生物的純化方法，該方法包括結(jié)晶步驟。
背景技術(shù)：
已知各種維生素D衍生物具有生理活性。例如JP 6-23185B/1994公開了可用作鈣代謝障礙引起的疾病的治療劑或者用作抗腫瘤劑的下列通式表示的1α-羥基維生素D3衍生物 其中R1表示氨基或式OR’，其中R’表示未被取代或被羥基、鹵原子、氰基或酰氨基取代的具有1-7個(gè)碳原子的低級烷基，而R2表示氫原子或羥基。
作為包括在上述通式中的一種化合物，1α，25-二羥基-2β-(3-羥基丙氧基)維生素D3(也稱作ED-71)是具有骨形成作用并因此可用作骨質(zhì)疏松癥治療劑的維生素D衍生物的一種活性形式。
一旦此類維生素D衍生物成為治療劑，就應(yīng)當(dāng)是高純度的并且能夠以批量并穩(wěn)定地提供。因此，就需要建立一種維生素D衍生物的生產(chǎn)方法。
特別是，現(xiàn)在僅能以非晶形形式獲得ED-71并且還沒有以結(jié)晶形式分離ED-71的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)目的是建立一種制備高純度維生素D衍生物，特別是ED-71的方法，該方法使得以批量并穩(wěn)定地提供所述產(chǎn)物成為可能。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種維生素D衍生物結(jié)晶，其可以通過純化維生素D衍生物粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物獲得。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括結(jié)晶步驟。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種純化ED-71前體化合物的方法，該方法包括結(jié)晶步驟，并且本發(fā)明還提供了由所述方法獲得的純的前體化合物。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供在維生素D衍生物合成和純化過程中二次生成的新化合物。
我們已對由前維生素D衍生物(前體)合成和純化ED-71過程中出現(xiàn)的下列問題進(jìn)行了深入研究(1)前體中的雜質(zhì)對HPLC制備純化ED-71的影響；(2)ED-71及其前維生素D衍生物(前體)對熱、光和氧的穩(wěn)定性；(3)對即使在十分小的劑量下仍具有較高生理活性的ED-71的處理；以及(4)通過結(jié)晶純化ED-71的可能性。研究結(jié)果表明，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過下述方法可以以克水平獲得ED-71結(jié)晶，即將所述前體于甲醇中重結(jié)晶，于低溫下將重結(jié)晶的前體進(jìn)行光反應(yīng)，然后進(jìn)行熱異構(gòu)化反應(yīng)，經(jīng)反相HPLC純化所述異構(gòu)化產(chǎn)物，濃縮洗脫液，然后殘余物于乙酸乙酯中析晶并完成本發(fā)明。另外，我們已經(jīng)測定了所述前體中原來含有的或者在所述光反應(yīng)中形成的副產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)并且發(fā)現(xiàn)它們中的某些化合物是新的。
本發(fā)明一方面提供了下列式(I)所示化合物的結(jié)晶
本發(fā)明另一方面提供了經(jīng)反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物，然后將純化的衍生物于有機(jī)溶劑中析晶獲得的維生素D衍生物結(jié)晶。
本發(fā)明另一方面提供了一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括將所述維生素D衍生物進(jìn)行反相色譜純化。
本發(fā)明另一方面提供了一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括將所述維生素D衍生物于有機(jī)溶劑中析晶。
本發(fā)明另一方面提供了一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括經(jīng)反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物，然后將純化的衍生物于有機(jī)溶劑中析晶。
本發(fā)明另一方面提供了一種下列式(II)所示化合物的純化方法 該方法包括將式(II)所示化合物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物于醇中重結(jié)晶。
本發(fā)明另一方面提供了下列式(II)所示化合物的純化產(chǎn)物
該產(chǎn)物通過將式(II)所示化合物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物于醇中重結(jié)晶獲得。
本發(fā)明另一方面提供了一種下列式(I)所示維生素D衍生物的純化產(chǎn)物的制備方法 該方法包括將下列式(II)所示化合物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物于醇中重結(jié)晶， 將重結(jié)晶的式(II)化合物進(jìn)行紫外光照射，然后進(jìn)行熱異構(gòu)化反應(yīng)，得到式(I)所示維生素D衍生物，經(jīng)反相色譜法純化式(I)維生素D衍生物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物，并將所述式(I)維生素D衍生物于有機(jī)溶劑中析晶。
本發(fā)明另一方面提供了下列式(III)所示化合物 和下列式(IV)所示化合物 這些化合物包含在紫外光照射以及隨后進(jìn)行的所述ED-71前體熱異構(gòu)化反應(yīng)獲得的反應(yīng)混合物中。
附圖簡要說明
圖1是說明ED-71結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)投影圖。
圖2是說明ED-71結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)立體圖形。
圖3是說明其中關(guān)注氫鍵的ED-71結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)投影圖(1)。
圖4是說明其中關(guān)注氫鍵的ED-71結(jié)晶結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)投影圖(2)。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案本文所用術(shù)語“維生素D衍生物”是指具有下列式(V)部分結(jié)構(gòu)的化合物
所述維生素D衍生物優(yōu)選地是下列式(VIA)、(VIB)和(VIC)所示化合物 其中R1表示(1)氨基；(2)-OR5，其中R5是低級烷基、低級鏈烯基或低級鏈炔基，其中每一個(gè)基團(tuán)可以被羥基、鹵原子、氰基、氨基、酰氨基或低級烷氧基取代；或者(3)低級烷基、低級鏈烯基或低級鏈炔基，其中每一個(gè)基團(tuán)可以被羥基、鹵原子、氰基、氨基、酰氨基或低級烷氧基取代；R2、R3和R4分別表示具有1-10個(gè)碳原子的烷基、具有2-10個(gè)碳原子的鏈烯基或者具有2-10個(gè)碳原子的鏈炔基，其中每一個(gè)基團(tuán)可以被一個(gè)或多個(gè)羥基取代；和A表示硫或氧原子。
在上述取代基定義中，術(shù)語“低級”是指所述術(shù)語限定的所述基團(tuán)的碳原子數(shù)，例如1-7個(gè)碳原子的烷基，分別為2-7個(gè)碳原子的鏈烯基和鏈炔基，以及1-7個(gè)碳原子的烷氧基。
所述維生素D衍生物更優(yōu)選地是1α-羥基維生素D3、1α，25-二羥基維生素D3、24，25-二羥基維生素D3或者下列式(VIIA)或(VIIB)所示化合物
其中n表示1-7的整數(shù)，或者下列式(VIIIA)或(VIIIB)所示化合物 其中A表示硫或氧原子。
特別優(yōu)選的維生素D衍生物是下列式(VIIA)所示化合物 其中n表示1-7的整數(shù)。
所述最優(yōu)選的維生素D衍生物是下列式(IX)所示化合物
其也被稱作ED-71。
本文所用術(shù)語“結(jié)晶”以其最寬含義使用，因此不僅限于結(jié)晶體形式、晶系等。
如上所述，作為本發(fā)明最優(yōu)選維生素D衍生物的ED-71結(jié)晶并不受任何物理特性的限制。但它們特別優(yōu)選地是具有下列特性(1)表觀目測或熒光顯微鏡檢測為白色結(jié)晶粉末；(2)溶解度在1mg/ml濃度下乙醇中完全溶解；(3)鑒定方法IR或NMR法；(4)熔點(diǎn)用DSC測定，熔點(diǎn)為130℃或者更高；(5)吸收系數(shù)在40μg/ml乙醇濃度下在265nm下測定，ε＝16000或者更高；(6)HPLC純度以在下列條件下記錄的相對于HPLC總峰面積的ED-71峰面積為基準(zhǔn)，純度為97％或者會更高，所述條件為DIACHROMA ODS N-20 5μm 4.6×250mm，45％乙腈-水，流速為1ml/min，220nm，1mg/ml 10μl，4-90分鐘。
本發(fā)明另一方面提供了可經(jīng)反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物，然后將純化的衍生物于有機(jī)溶劑中析晶獲得的維生素D衍生物結(jié)晶，以及一種維生素D衍生物的純化方法，該方法包括將維生素D衍生物進(jìn)行反相色譜純化和/或?qū)⒓兓木S生素D衍生物于有機(jī)溶劑中析晶。
本文所用術(shù)語“粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物”是指由維生素D衍生物合成反應(yīng)獲得的、在合成反應(yīng)后未經(jīng)純化或者立即經(jīng)常規(guī)方法純化并且通常為非晶形的維生素D衍生物產(chǎn)物。
本文所用術(shù)語“反相色譜法”是指其中固定相極性低于流動相的色譜體系。作為所述反相色譜法，優(yōu)選的是高效液相色譜法(HPLC)。
為了有效地分離所述物質(zhì)，有必要對洗脫劑、柱填充物和柱填充量進(jìn)行適當(dāng)選擇。
所述洗脫劑的實(shí)例包括，但不僅限于，乙腈/水和乙腈/甲醇/水。用作上述洗脫劑的所述溶劑的混合比可根據(jù)下列因素而改變，例如所純化的物質(zhì)以及所用柱填充物，因此，對于具體應(yīng)用中所述溶劑的最佳比可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。乙腈/甲醇/水的比通常在20-60/0-40/0-80(重量份)范圍內(nèi)。
考慮到所述柱填充物與所純化的物質(zhì)以及所用柱子的相容性，可對柱填充物的粒徑和孔徑大小作出選擇。
所述柱的填充量也可根據(jù)柱子的內(nèi)徑等而改變。但是例如，當(dāng)于內(nèi)徑為50mm時(shí)，填充量可以是約25μg-10g，優(yōu)選約25μg-3g。
對進(jìn)行如上所述色譜純化所得的流份應(yīng)當(dāng)進(jìn)行處理，分離出所述流份中含有的溶解物，然后結(jié)晶。所述分離方法包括蒸發(fā)法、冷凍干燥法、萃取法和過濾法。根據(jù)所述物質(zhì)的特性，技術(shù)人員可以由所述的這些分離方法中選擇出一種或多種與所純化的物質(zhì)相適宜的方法。例如，由于蒸發(fā)法具有重現(xiàn)性并且ED-71不分解，因此蒸發(fā)法對于ED-71的純化在操作上是有利的。
可用于維生素D衍生物析晶的有機(jī)溶劑優(yōu)選是非質(zhì)子傳遞有機(jī)溶劑。所述非質(zhì)子傳遞有機(jī)溶劑的實(shí)例包括酯例如乙酸乙酯、酮例如丙酮、醚例如乙醚和二異丙基醚、乙腈以及它們的混合物，優(yōu)選乙酸乙酯、丙酮、乙腈及其混合物。
結(jié)晶條件可以根據(jù)下列因素而改變，例如所純化的物質(zhì)以及所用溶劑，因此，對于某一具體應(yīng)用的適宜條件可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。但通常，所述結(jié)晶可以在不高于30℃并且優(yōu)選不高于-10℃溫度下，用比粗維生素D衍生物多1-100倍并且優(yōu)選5-10倍的溶劑進(jìn)行。
本發(fā)明另一方面提供了一種下列式(II)所示化合物的純化方法 該方法包括將所述化合物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物于醇中重結(jié)晶，以及用所述方法純化式(II)化合物。
用于此重結(jié)晶中的所述醇為甲醇。
對于如上所述于醇中重結(jié)晶純化的式(II)所示化合物的物理特性并沒有任何意義的限定。但是，其特別優(yōu)選地是具有下列特性(1)表觀目測或熒光顯微鏡檢測為白色至黃色結(jié)晶粉末；(2)溶解度在2mg/ml濃度下乙醇中完全溶解(水溶液-白色至黃色)；(3)鑒定方法IR和NMR法；(4)水含量用100mg樣品經(jīng)費(fèi)歇爾法測定，水含量為3.0％或者更低；(5)吸收系數(shù)在100μg/ml乙醇濃度下于282nm下測定，ε＝10000或者更高；(6)HPLC純度以在下列條件下相對于記錄的HPLC總峰面積以及HPLC中前體和unP4峰之間沒有可觀測到的峰時(shí)的式(II)所示化合物峰面積為基準(zhǔn)，純度為85％或者更高，所述條件為DIACHROMAODS N-20 5μm 4.6×250mm，55％乙腈-水，流速為1ml/min，220nm，1mg/ml 10μl，4-70分鐘；和(7)含量在下列條件下用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行HPLC，含量為85％或者更高，所述條件為YMC填充物ODS A-303 5μm 4.6×250mm，55％乙腈-水，流速為1ml/min，220nm。
下列實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但對本發(fā)明保護(hù)范圍不起限定作用。
實(shí)施例實(shí)施例12β-(3’-羥基丙氧基)-5，7-二烯膽甾-1α，3β-三醇(前體型)的合成和純化 環(huán)氧化物(1)前體型(2)將環(huán)氧化物(1)(1.00g，2.41mmol)、叔丁醇鉀(0.75g，6.68mmol)和1，3-丙二醇(20ml)的混合物于室溫下攪拌10分鐘，然后，將反應(yīng)混合物加熱至內(nèi)溫95℃并于此溫度下攪拌5小時(shí)。攪拌下，將反應(yīng)混合物傾入到飽和氨水溶液(40ml)中。于室溫(25-35℃)下攪拌10分鐘后，在過濾器上收集形成的結(jié)晶并用蒸餾水(20ml)洗滌三次。將含水粗結(jié)晶產(chǎn)物(6.3g)在室溫(27-22℃)下于乙腈(20ml)中攪拌1小時(shí)。在過濾器上收集結(jié)晶并用乙腈(5ml)洗滌兩次，然后干燥，得到所述前體化合物(2)(0.96g，產(chǎn)率為81％)。
在通入氬氣進(jìn)行預(yù)處理之前，將如此獲得的前體化合物(2)(29.0g)加熱溶于甲醇(290ml)，然后將所得溶液趁熱經(jīng)Kiriyama濾紙(4號)過濾。冷卻至室溫后，向溶液中加入晶種以誘導(dǎo)結(jié)晶。進(jìn)一步冷卻至低于-10℃后，于過濾器上收集所生成的結(jié)晶并用29ml冷甲醇洗滌兩次，然后，將所述結(jié)晶于室溫真空下干燥，得到22.9g純化的前體(回收率為79.1％，凈回收率為92.1％)。所述純化的前體的物理數(shù)據(jù)如下所示NMR(CD3OD)和IR(KBr)表明是所述標(biāo)題化合物；TLC(CH2Cl2∶EtOH＝9∶1)展開僅呈一個(gè)點(diǎn)(Rf0.5)；HPLC純度(220nm)98.7％；含量97.1％(內(nèi)標(biāo)法)；和DSC出峰時(shí)間(min)95.6℃和163.2℃，峰最大值120.2℃。
實(shí)施例2(1R，2R)-1，25-二羥基-2-(3’-羥基丙氧基)-膽鈣化甾醇；2β-(3’-羥基丙氧基)-(1α，3β，5Z，7E)-9.10-開環(huán)膽甾-5，7，10(19)-三烯-1，3，25-三醇(ED-71)的合成和純化 前體(2)前體 ED-71在1L容器中，將實(shí)施例1所得純化的前體(2)(6.02g)溶于THF(1L)并將溶液于氬氣流中冷卻條件(內(nèi)溫低于-13℃)下，經(jīng)Vycor過濾器用具有高壓汞蒸汽的400W燈UV光照射150分鐘。令其升至室溫后，將反應(yīng)溶液由所述容器傾入2L茄形燒瓶中，所述容器用新制的THF(100ml)洗滌，將合并的溶液回流下加熱180分鐘。將反應(yīng)混合物濃縮后，所得殘余物溶于甲醇(80ml)，以形成供分離的樣品。將經(jīng)過計(jì)算并表示為所述前體的含有1.5g溶解物的20ml樣品用泵加入到制備色譜柱上，所述色譜柱內(nèi)徑為50mm，長300mm并用由MitsubishiKakouki Co.市售獲得的粒徑為5μm的DIACHROMA ODS N-20裝填。45％乙腈水溶液以60ml/min的流速通過所述色譜柱，洗脫液在220和305nm下用UV-光檢測。開始進(jìn)行色譜分離后約130-170分鐘內(nèi)，收集到約2.4L含ED-71的流份。此連續(xù)過程再重復(fù)三次，總共得到合并的ED-71流份約9L。然后，將合并的流份用10L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將殘余物溶于乙醇，將溶液再次蒸發(fā)至干。所得殘余物再用乙酸乙酯(20ml)處理，溶液于室溫下進(jìn)行攪拌以沉淀出結(jié)晶，將懸浮液進(jìn)一步冷卻至低于-10℃并在此溫度下攪拌15分鐘。濾出結(jié)晶產(chǎn)物，用冷乙酸乙酯(6ml)洗滌三次并于室溫真空下干燥過夜，得到ED-71(2.17g，產(chǎn)率為36.1％)。
HPLC純度99.8％(220nm)，99.9％(265nm)UV(EtOH)λmax265.4nm(ε17100)DSC135.3℃(出峰(min))，122mJ/mg殘余溶劑(GC 方法)1.24％(EtOAc)，0.24％(EtOH)IR(cm-1)3533，3417，3336，2943，2918，2862，1649，1470，1444，1416，1381，1377，1342，1232，1113，1078，1072，1045，999，974，957，955，924，910，895，868，833，796，764，663，634，594，472實(shí)施例3相關(guān)化合物的物理數(shù)據(jù)分離在所述光和熱異構(gòu)化反應(yīng)中形成的某些類似物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，然后進(jìn)行表征鑒定。并且對實(shí)施例1和2所得ED-71及其前體進(jìn)行更具體的表征鑒定。應(yīng)注意的是，下列物理數(shù)據(jù)是經(jīng)重結(jié)晶和類似方法進(jìn)一步純化所得樣品的數(shù)據(jù)。
熔點(diǎn)未校正。IR譜用溴化鉀壓片法用JEOL JIR-6000測定。1H-NMR和13C-NMR譜用JEOL JNM-270EX測定。TMS用作1H-NMR內(nèi)標(biāo)，而CHCl3峰用作13C-NMR的標(biāo)準(zhǔn)峰。UV在室溫下于乙醇中用HITACHI U-3210測定。
實(shí)施例1所得ED-71前體的物理數(shù)據(jù)1H-NMR(ppm)0.63(3H，s)，0.96(3H，d，J20-21＝6.3Hz)，1.07(3H，s)，1.22(6H，s)，3.6-4.0(7H，m)，5.36-5.40(1H，m)，5.70-5.73(1H，m)13C-NMR(ppm)141.1，136.6，120.8，115.1，82.2，71.0，70.9，68.3，66.7，59.8，55.7，54.4，44.1，
42.9，41.3，39.0，38.3，36.3，36.0，34.6，32.0，28.8，28.7，27.9，22.9，20.7，20.5，18.6，15.8，11.7UV；λmax(ε)294.2nm(6550)，282.2nm(11300)，271.9nm(10500)，204.7nm(2420)IR(cm-1)3385，2941，2872，1471，1468，1381，1379，1327，1138，1082，1080，1053ED-71的物理數(shù)據(jù)1H-NMR(ppm)6.37(1H，d；11.4Hz)，6.05(1H，d；11.4Hz)，5.50(1H，t；2.1Hz)，5.08(1H，t；2.1Hz)，4.32(1H，d；8.9Hz)，4.26(1H，m)，3.88-3.96(1H，m)，3.85(2H，t；5.7Hz)，3.69-3.77(1H，m)，3.27(1H，dd；9.0Hz，2.8Hz)，2.78-2.83(1H，m)，2.55(1H，dd；10.6Hz，4.0Hz)，2.42(1H，bd；13.6Hz)，1.8-2.1(5H，m)，1.22(6H，s)，1.2-1.7(11H，m)，0.94(3H，d；6.3Hz)，0.9-1.1(1H，m)，0.55(3H，s)13C-NMR(ppm)144.2，143.0，132.2，124.9，117.2，111.8，85.4，71.6，71.1，68.3，66.6，61.1，56.6，56.4，45.9，44.4，40.5，36.4，36.1，31.9，29.3，29.2，29.1，27.7，23.7，22.4，20.8，18.8，11.9UV；λmax265.4nm(ε17900)m.p.134.8-135.8℃(1℃/min)，DSC137℃(出峰(min)，115mJ/mg)，TG/DTA138℃(出峰(min)，熔融干重?fù)p失約1％，試驗(yàn)樣品1.96mg)，IR(cm-1)3533，3417，3336，2943，2918，2862，1649，1470，1444，1416，1381，1377，1342，1232，1113，1078，1072，1045，999，974，957，955，
924，910，895，868，833，796，764，663，634，594，472下式所示ED-71的照射形成體 HPLC純度97.5％(220nm)1H-NMR(ppm)5.75(1H，d，J＝5.3Hz)，5.42-5.44(1H，m)，4.19(1H，q，J＝2.9Hz)，3.8-4.0(4H，m)，3.6-3.7(1H，m)，3.25(1H，dd，J＝2.6Hz，9.6Hz)，1.21(6H，s)，0.90(3H，d，J＝5.6Hz)，0.82(3H，s)，0.58(3H，s)C-NMR(ppm)141.9，136.2，123.3，115.5，82.8，77.9，71.1，67.4，64.9，61.1，57.2，49.5，46.7，44.4，43.8，41.4，37.5，36.2，35.9，32.0，29.4，29.2，28.8，22.6，21.4，20.9，18.5，18.3，8.5UV；λmax273.5nm(ε9010)IR(cm-1)3437，3383，3309，3041，2960，2935，2872，2787，1657，1641，1470，1441，1375，1257，1205，1203，1167，1128，1097，1074，1039，1011，980，935，908，885，820，781，779，723，671，613下式所示ED-71的快速形成體
HPLC純度97.6％(220nm)1H-NMR(ppm)6.65(1H，d，J-16.1Hz)，6.10(1H，d，J＝16.1Hz)，5.73(1H，d，J＝2.8Hz)，4.21-4.25(2H，m)，3.70-3.90(4H，m)，3.45(1H，dd，J＝2.4Hz，6.0Hz)，1.91(3H，s)，1.22(6H，s)，0.98(3H，d，J＝6.5Hz)，0.69(3H，s)13C-NMR(ppm)138.1，130.9，129.5，127.8，126.0，124.5，83.1，72.4，71.1，68.5，65.3，61.1，54.0，50.0，44.4，42.8，36.4，36.0，35.9，31.9，31.4，29.4，29.2，28.7，25.1，24.3，20.8，18.7，15.1，11.2UV；λmax281.4nm(ε26100)IR(cm-1)3375，2945，2875，1664，1632，1612，1468，1429，1377，1215，1157，1095，1068，957，908，879，764，710，646下式所示ED-71的前體
HPLC純度97.2％(220nm)1H-NMR(ppm)5.91，5.78(1H×2，d，J＝12Hz)，5.52(1H，d，J＝3.3Hz)，4.0-4.2(2H，m)，3.7-4.0(4H，m)，3.43(1H，dd)，1.76(3H，s)，1.22(6H，s)，0.96(3H，d，J＝6.6Hz)，0.70(3H，s)UV；λmax206nm(ε10300)IR(cm-1)3377，2949，2947，2872，1643，1470，1435，1406，1379，1377，1263，1215，1140，1119，1088，1063，1047，1032，1030，962，937，935，756，735，542實(shí)施例4ED-71的X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析用選自所述樣品粉末的結(jié)晶粉末進(jìn)行ED-71 X-射線衍射試驗(yàn)，部分樣品粉末也可用于實(shí)施例3中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所述結(jié)晶是正交晶系并含有P212121空間群，晶格常數(shù)為a＝10.352(2)，b＝34.058(2)和c＝8.231(1)，并且Z＝4。由此試驗(yàn)，得到2520反射數(shù)據(jù)。
結(jié)構(gòu)分析如下所述進(jìn)行。測定相中使用SHELXS86直接法，然后通過付里葉映象(Fourier mapping)測定每個(gè)非氫原子的位置。對于與碳鍵合的氫原子，它們中每個(gè)的位置可用所述碳原子的位置通過計(jì)算測定。對于與氧鍵合的氫原子，它們中每個(gè)的位置可以在測定了其他每個(gè)原子的位置后通過D映象測定。
在改進(jìn)了所述非氫原子和與氧鍵合的氫原子位置的精確度以及最小二乘法對所述非氫原子各向異性溫度因子以后，所述分析結(jié)果的可靠性因子共計(jì)3.9％。然而，由所述結(jié)果不能直接測定所述結(jié)晶的絕對結(jié)構(gòu)，但通過進(jìn)一步計(jì)算，ED-71的13、14、17和20位構(gòu)象結(jié)果與膽甾醇的相應(yīng)構(gòu)象相同。
圖1-4分別表明了在所述分析結(jié)果的基礎(chǔ)上測定的ED-71的結(jié)構(gòu)及其中的氫鍵。
參考實(shí)施例1ED-71結(jié)晶化合物的穩(wěn)定性在10℃、25℃和40℃下，對非晶形和結(jié)晶ED-71化合物的穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)。用HPLC定量試驗(yàn)以及吸收度和純度測定，以對所述穩(wěn)定性作出評價(jià)。所述純度以HPLC中峰面積百分比表示(％P.A.R.)。所述試驗(yàn)用下述方法進(jìn)行(1)穩(wěn)定性試驗(yàn)在帶有螺絲帽的透明的10ml試管中分別精確稱取所述非晶形和結(jié)晶樣品約2mg.
所述試管用真空干燥器和手套箱用氬氣清洗。此清洗過程不適用于下表中記作“1M(空氣)”的試管。
將所述多組試管固定于恒溫浴器中并于黑暗中靜置，所述恒溫浴器分別控制在上述溫度下。1周(1W)或兩周(2W)和1個(gè)月(1M)后，由所述恒溫浴器中取出試管并進(jìn)行下列試驗(yàn)和測定(2)HPLC定量試驗(yàn)將5ml無水乙醇精確地加入到所述試管中，以形成樣品溶液。將1ml所述樣品溶液和1ml內(nèi)標(biāo)溶液精確地加入到另一試管中并將所得混合物用二氯甲烷稀釋，至總體積為20ml。此稀釋溶液記作溶液1。通過將2-氨基嘧啶溶于甲醇達(dá)到濃度為0.6mg/ml，制得所述內(nèi)標(biāo)溶液。
下一步，將1ml另一種用于定量試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)液(通過將ED-71結(jié)晶溶于無水乙醇達(dá)到濃度為0.4mg/ml制得)和1ml所述內(nèi)標(biāo)溶液精確地加入到另一試管中并將所得混合物用二氯甲烷稀釋，至總體積為20ml。此稀釋溶液記作溶液2.
分別用20μl溶液1和2進(jìn)行HPLC。對于每種溶液，由所述HPLC數(shù)據(jù)測定ED-71峰與內(nèi)標(biāo)物峰的面積比。由溶液1面積比與溶液2面積比的比值測得所述樣品中ED-71的含量。
將所述ED-71含量被上述處理之前相同樣品中的ED-71含量除，測得耐受性(survivability)(％)。
所用HPLC的條件為色譜柱；YMC A-004SIL(4.6×300mm)流動相；二氯甲烷/甲醇混合物(95/5)
流速；1ml/min檢測；UV 265nm。
(3)吸收度測定將上述“HPLC定量試驗(yàn)”中制備的1ml樣品溶液用無水乙醇稀釋，達(dá)到總體積為10ml，然后將此稀釋溶液在265nm下用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行吸收度檢測。將所述吸收度轉(zhuǎn)換成E1％值，其由朗伯比爾(Lambert-Beer)定律得到并可按下列等式轉(zhuǎn)換E1％＝A/cb其中A是吸收度，c是濃度(g/100ml)，而b是經(jīng)過試驗(yàn)溶液的光路長度(cm)，通常為1。
(4)純度測定(4-1)正相HPLC將上述“HPLC定量試驗(yàn)”中制備的1ml樣品溶液進(jìn)行真空干燥，以除去所述溶劑(無水乙醇)。將殘余物溶于1ml二氯甲烷，用25μl此溶液進(jìn)行HPLC試驗(yàn)。
所用HPLC的條件為色譜柱；YMC A-004SIL(4.6×300mm)流動相；二氯甲烷/甲醇混合物(96/4)流速；1.8ml/min檢測；UV 265nm。
(4-2)反相HPLC用上述“HPLC定量試驗(yàn)”中制備的25μl樣品溶液進(jìn)行HPLC。
所用HPLC的條件為色譜柱；Inertsil ODS-2(5×250mm)流動相；乙腈/水混合物(55/45)流速；1ml/min檢測；UV 265nm和220nm。
所述HPLC定量試驗(yàn)和純度測定的數(shù)值是兩輪的平均值。所得結(jié)果如下列表1-5所示。
表1HPLC定量試驗(yàn)結(jié)果(耐受性％)
注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表2E1％
注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表3用正相HPCL測定純度(265nm下P.A.R.％)
注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表4用反相HPLC測定純度(265nm下P.A.R.％)
注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
表5220nm(％)
注除1M(空氣清洗)以外，所有樣品用氬氣清洗。
由上表可以看出，在25℃和40℃下，所述結(jié)晶體比非晶體的穩(wěn)定性至多高至2星期。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明所述維生素D衍生物結(jié)晶是具有改善的純度和穩(wěn)定性以及穩(wěn)定的產(chǎn)量的所述維生素D衍生物，并因此可用于制備含有所述維生素D衍生物的藥物。而且，本發(fā)明所述維生素D衍生物的純化方法使得以批量(克水平)并且穩(wěn)定地提供高純度維生素D衍生物成為可能。另外，分別作為ED-71和ED-71前體的快速形成體和照射形成體是新的化合物并可用于維生素D衍生物合成中所進(jìn)行的試驗(yàn)或分析中。
權(quán)利要求
1.一種下列式(II)所示化合物的純化方法 該方法包括將式(II)所示化合物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物于醇中重結(jié)晶。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中所述醇是甲醇。
3.下列式(II)所示化合物的純化產(chǎn)物 該產(chǎn)物通過將式(II)所示化合物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物于醇中重結(jié)晶獲得。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中所述醇是甲醇。
5.下列式(III)所示化合物
6.下列式(IV)所示化合物
7.下列式所示化合物前體
8.下列式所示化合物的純化產(chǎn)物前體
全文摘要
本發(fā)明提供了下列式(I)所示化合物的結(jié)晶；經(jīng)反相色譜法純化維生素D衍生物的粗產(chǎn)物或初步純化的產(chǎn)物，然后將純化的衍生物于有機(jī)溶劑中析晶獲得的維生素D衍生物結(jié)晶；維生素D衍生物合成過程中形成的作為副產(chǎn)物的新的化合物；以及維生素D衍生物或其前體的純化方法。本發(fā)明所述方法使得以批量并且穩(wěn)定地提供高純度維生素D衍生物，特別是ED－71成為可能。
文檔編號C07J71/00GK1637017SQ20041009261
公開日2005年7月13日 申請日期1997年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月1日
發(fā)明者山內(nèi)剛 申請人:中外制藥株式會社