專利名稱：2－取代酰氨基二羧酸類化合物、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)和藥物治療學(xué)領(lǐng)域，具體涉及2-取代酰氨基二羧酸類化合物、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
過多的從飲食中攝入脂肪會很大的影響人體健康。許多證據(jù)表明，現(xiàn)代社會中許多疾病與攝取高脂肪含量飲食有關(guān)，比如糖尿病，肥胖和心血管疾病等，這些疾病還會引起許多并發(fā)癥，嚴(yán)重危害了身體健康并可能導(dǎo)致死亡。實(shí)驗(yàn)表明對嚙齒類和靈長類動物供給低脂肪的食物可以延長其壽命和降低代謝和心血管紊亂的作用。然而隨著社會發(fā)展和我們飲食結(jié)構(gòu)的變化，高熱量和高脂肪含量的食物比重越來越大，尋找治療上述疾病和控制人體脂肪攝入的藥物也成為了當(dāng)務(wù)之急。與人體代謝疾病相關(guān)流行病學(xué)和動物飼養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，熱量的攝取對調(diào)控脂質(zhì)代謝，胰島素敏感性，葡萄糖代謝平衡以及動脈粥樣硬化等有非常重要的作用。由此可以推測，動物必定有一套激素系統(tǒng)用于調(diào)控飲食中脂肪酸的吸收。Issemann于1990年首先發(fā)現(xiàn)的，PPAR對于調(diào)節(jié)飲食中脂肪在體內(nèi)的代謝與沉積具有重要作用，由于它們能被一類脂肪酸樣化合物(過氧化物酶體增殖劑PP(Peroxisome Proliferator))所激活而得名。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PPAR與糖尿病、肥胖癥、壞脂血癥、炎癥、高血壓和癌癥等疾病都有關(guān)系。除此之外，PPAR的發(fā)現(xiàn)也使人們對脂肪酸作為一種激素的重要性有了更進(jìn)一步的了解。因此，它引起了人們的極大關(guān)注。
PPAR共有三種亞型，即PPARα(NR1C1)，PPARγ(NR1C3)，PPARδ(NR1C2)。PPARδ在以前也有人稱之為PPARβ，現(xiàn)已經(jīng)統(tǒng)一稱作PPARδ。hPPAR主要分為DBD(DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和LBD(配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)兩大部分。LBD位于基因的C端，它與DBD之間為一段Hinge區(qū)連接。PPAR三種亞型之間的DBD和LBD的序列具有非常高的保守性，分別為85％和70％左右。同時PPAR作為核受體基因家族的成員與其他成員在結(jié)構(gòu)域上也具有非常高的相似性。然而，PPAR三個成員之間的LBD口袋區(qū)域的氨基酸殘基卻有明顯的序列差異性，這種差異性導(dǎo)致它們在藥理學(xué)上呈現(xiàn)出一定的差異。三個成員除了LBD口袋區(qū)域有差異外，它們的N末端區(qū)域表現(xiàn)出非常低的同源性。近來的研究發(fā)現(xiàn)，N末端區(qū)域與各自的生物功能的差異性有關(guān)，并且有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)催化磷酸化PPAR的N末端區(qū)域會影響到受體轉(zhuǎn)錄活性和配體結(jié)合活性。
三種亞型中以PPARγ作用最顯著，對其的研究也最多。PPARγ又可細(xì)分為三種成員，分別為PPARγ1，PPARγ2和PPARγ3。PPARγ1和PPARγ3編碼同一種蛋白，而PPARγ2比PPARγ1在N末端多編碼28個氨基酸。人源PPARγ基因有9個外顯子分布在人染色體3p25區(qū)，其長度達(dá)100kb。PPARγ主要在脂肪細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它是調(diào)節(jié)脂肪分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。近年來的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定PPARγ是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物(Thiazolidinediones，TZDs)作用的靶分子。這類藥物與PPARγ結(jié)合以后可以激活該受體。從而調(diào)控一系列重要的生理過程。一方面激活的PPARγ可以促進(jìn)脂肪組織中某些與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用相關(guān)基因的表達(dá)，如胰島素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4等；另一方面可以抑制體內(nèi)腫瘤壞死因子和肥胖蛋白的分泌，減輕這兩種蛋白產(chǎn)生的胰島素抵抗，從而起到降低血糖的效果?？梢奝PARγ的活性與葡萄糖的吸收和利用之間有著非常密切的聯(lián)系，因此，PPARγ配體將有希望成為一類全新的二型糖尿病治療藥物。合適的PPARγ配體可以提高胰島素對其靶組織的敏感性，從而有效降低血糖，達(dá)到治療效果。另外，PPARγ在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期和單核/巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能方面也起著重要作用，這提示了一個令人鼓舞的前景，即最初用于治療糖尿病的藥物有可能用于治療其它疾病如腫瘤等。現(xiàn)在我們已經(jīng)知道PPAR組成一個核受體家族，在脂生成和癌發(fā)生過程中具有廣泛的生物作用，目前已知，PPARγ核受體是調(diào)節(jié)很多與癌癥發(fā)生有關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是發(fā)展治療和預(yù)防癌癥的重要靶點(diǎn)，PPARγ的表達(dá)異常是癌發(fā)生的危險因素。這就需要篩選更多的配體，包括它的激動劑和拮抗劑來探索PPAR類，尤其是研究PPARγ的各種功能。
由于PPAR發(fā)現(xiàn)之初并沒有發(fā)現(xiàn)與其相互作用的配體因子，所以它們被稱為核受體基因家族中的孤兒受體。進(jìn)一步的研究中，與之相互作用的配體已經(jīng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多，這些配體被分為三大類激動劑，半激動劑(半拮抗劑)和拮抗劑。
由于篩選方法都很多且較成熟，PPAR的激動劑已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多，它們大部分為TZD和不飽和脂肪酸衍生物。其中三個PPARγ的TZD類激動劑羅格列酮rosiglitazone(Rezulin)，皮格列酮piogitazone(ACTOS)，和曲格列酮Troglitazone(Avandia)已被FDA認(rèn)證通過，作為治療2型糖尿病的藥物已經(jīng)在市場上銷售。這些藥物不論是作為單一的治療用藥還是與現(xiàn)存的治療方式相結(jié)合，在治療2型糖尿病上都前進(jìn)了一步。但是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)曲格列酮在能夠激活PPARγ的劑量下也能激活另一核受體PXR(Pregnane X Receptor，孕烷X受體)表現(xiàn)出肝毒性，因此它已經(jīng)在美國停止作為藥物銷售。雖然PPARγ的激動劑在治療心血管疾病上有很大作用，不過在很多方面也表現(xiàn)出很多副作用，其中主要的就是導(dǎo)致服用者體重的增加。而PPAR拮抗劑在糖尿病的治療中表現(xiàn)出更小的副作用，因此PPAR的拮抗劑具有更好的成藥價值。
近年來，“計算機(jī)輔助藥物設(shè)計”(Computer-Aided Drug Design，CADD)已成為現(xiàn)代藥物研究與開發(fā)的一個重要方法和工具，將計算機(jī)輔助藥物設(shè)計特別是計算機(jī)輔助組合化學(xué)庫設(shè)計加入新藥研究的循環(huán)，能縮短新藥研究的周期，節(jié)省研究與開發(fā)費(fèi)用，提高新藥篩選的命中率。計算機(jī)輔助藥物設(shè)計與其他現(xiàn)代藥物研究方法結(jié)合，將推動藥學(xué)和生命科學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展。CADD方法已廣泛地應(yīng)用于先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化，國際上一些大的制藥公司充分重視這一技術(shù)在新藥研究中的應(yīng)用。經(jīng)過多年努力，已有相當(dāng)數(shù)量的通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計的藥物陸續(xù)上市，如Merck Sharp & Dohme(Harlow，UK)公司的碳酸酐酶抑制劑Dorzolamid，Roche(Welwyn，UK)公司的HIV蛋白酶抑制劑Saquinavir，Biota(Melbourne，Australia)公司的神經(jīng)氨酸酐酶抑制劑Relenza和Roche(Basel，Switzerland)公司的凝血酶抑制劑Ro466240等；Searle公司開發(fā)的高選擇性的COX-2抑制劑Celecoxib也是根據(jù)三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)研究結(jié)果設(shè)計的。“組合化學(xué)”(Combinatorial Chemistry)是近年來藥物化學(xué)和合成化學(xué)中出現(xiàn)的一項(xiàng)新技術(shù)，能夠迅速產(chǎn)生大量分子結(jié)構(gòu)以進(jìn)行高通量篩選(HighThroughput Screening)。組合化學(xué)方法一經(jīng)出現(xiàn)，就引起了人們的廣泛關(guān)注。先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化一直是藥物化學(xué)研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。特別是近一、二十年來生物學(xué)和其他相關(guān)高新技術(shù)取得了長足進(jìn)步，產(chǎn)生了基于細(xì)胞和分子水平的高通量篩選技術(shù)，更使得合成大量新結(jié)構(gòu)類型的化合物成了藥物研究的瓶頸。組合化學(xué)的出現(xiàn)對于解決這一問題提供了巨大的可能性。因此，“組合化學(xué)和高通量篩選”已成為繼CADD又一藥物研究的核心技術(shù)?！敖Y(jié)構(gòu)生物學(xué)”也從原來的基礎(chǔ)研究進(jìn)入應(yīng)用研究階段，其中的一個主要應(yīng)用領(lǐng)域是在分子和原子結(jié)構(gòu)水平上研究藥物與靶蛋白的相互作用，測定藥物—蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，為新化合物的設(shè)計和先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造提供有益的結(jié)構(gòu)信息。近年來，這方面的研究進(jìn)展非常迅速，結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)和方法在抗艾滋病藥物、抗感冒病毒藥物和抗癌藥物等研究中均得到了成功的應(yīng)用。目前人類基因組測序已經(jīng)完成，與生物信息學(xué)相結(jié)合，結(jié)構(gòu)生物學(xué)將會在藥物作用新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)中起重要作用。
本發(fā)明者根據(jù)PPAR的晶體結(jié)構(gòu)，綜合運(yùn)用計算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計、組合化學(xué)、分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法，尋找具有PPAR抑制劑作用的先導(dǎo)化合物，并針對其生物學(xué)活性進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了具有全新結(jié)構(gòu)的2-取代酰氨基二羧酸類化合物與PPAR蛋白配體結(jié)構(gòu)域具有很高結(jié)合活性(KD＝0.20μM)，能夠降低PPAR和RXR的相互作用，并且在酵母雙雜交系統(tǒng)中能夠有效的抑制羅格列酮的活性(IC50＝8.67μM)，而在哺乳動物細(xì)胞水平對羅格列酮的抑制活性IC50＝31.9μM。從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一類2-取代酰氨基二羧酸類化合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供以3-取代吲哚烷基氨基酸為原料合成2-取代酰氨基二羧酸類化合物的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供含2-取代酰氨基二羧酸類化合物的醫(yī)學(xué)用途。
本發(fā)明的又一個目的是提供運(yùn)用生物傳感器，利用表面離子共振原理，簡單、快捷、低耗地篩選出分子水平上對PPAR有結(jié)合活性和抑制活性的化合物；接著用酵母雙雜交系統(tǒng)，通過檢測分泌型的產(chǎn)物α-半乳糖苷酶的活性來檢測化合物的酵母細(xì)胞水平活性；用哺乳動物反式激活試驗(yàn)，通過檢測熒光素酶活性來測定化合物的哺乳動物細(xì)胞水平活性。
本發(fā)明通過如下步驟實(shí)施本發(fā)明提供具有如下通式(I)結(jié)構(gòu)的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中X，Y各自獨(dú)立地選自O(shè)，S，NHR1選自氫，芐基，乙?；宥⊙貂；划?dāng)X＝O時，R2＝R3，可選自氫，C1-C3直鏈或支鏈烴基，芐基，環(huán)己基，芳香基Ar，5-7元芳香雜環(huán)(含有1-3個選自氧、硫、氮的雜原子)。
當(dāng)X＝NH時，R3＝H，R2可選自氫，C1-C3直鏈或支鏈烴基，芐基，環(huán)己基，芳香基Ar，5-7元芳香雜環(huán)(含有1-3個選自氧、硫、氮的雜原子)。
當(dāng)X，Y為O時，Ar為 R4，R5各自獨(dú)立選自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4酰基；m是0-3的整數(shù)，n是0-3的整數(shù)當(dāng)X為NH，Y為O時Ar為
R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；?；m是0-3的整數(shù)，n是0-3的整數(shù)2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型各自獨(dú)立的選R型或S型。
本說明書中所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”具體地可列舉與丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、等有機(jī)酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再與無機(jī)堿形成的鹽，如鈉、鉀、鈣、鋁鹽和銨鹽，或與有機(jī)堿形成的鹽，如甲胺鹽、乙胺鹽、乙醇胺鹽等，或與賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸等堿性氨基酸形成酯后的鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機(jī)酸的鹽，或與甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有機(jī)酸的鹽。
本發(fā)明式(I)化合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中，X，Y是OR1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致；2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為R型Ar選自以下基團(tuán) R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；?；本發(fā)明式(I)化合物的另一個優(yōu)選實(shí)施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中，X是NH；Y是O；R1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致；2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為R型；Ar選自以下基團(tuán)
R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；?；本發(fā)明式(I)化合物的又一個優(yōu)選實(shí)施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中，X，Y是O；R1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致；2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為R型；Ar選自以下基團(tuán) R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4酰基；本發(fā)明式(I)化合物的又一個優(yōu)選實(shí)施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中，X是NH，Y是O；R1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致；2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為R型；Ar選自以下基團(tuán) R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4酰基；本發(fā)明式(I)化合物的又一個優(yōu)選實(shí)施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中，X，Y是OR1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為S型；Ar選自以下基團(tuán)
R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；?；本發(fā)明式(I)化合物的又一個優(yōu)選實(shí)施方案是如下2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中，X是NH；Y是OR1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為S型；Ar選自以下基團(tuán) R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；槐景l(fā)明提供式化合物I包含的(IA)、(IB)和(IC)類化合物的制備方法。其中R2，R3，R4，R5，m，n的定義如上所述，2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型各自獨(dú)立的選R型或S型。

IA類化合物的合成是以3-取代吲哚烷基氨基酸為原料，分別經(jīng)叔丁氧?；?BOC)保護(hù)，酯活化，酯化，N-?；?，脫保護(hù)制得。合成方法具體見Scheme 1中。
Scheme 1a a(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H2O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，無機(jī)堿(如NaHCO3)，0-20℃(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸異丁酯，EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜0℃，CF3COOHIB類化合物的合成是以取代苯烷基氨基酸為原料，分別經(jīng)叔丁氧?；?BOC)保護(hù)，酯活化，酯化，N-?；?，脫保護(hù)制得。合成方法具體見Schem 2中。
Scheme 2a
a(a)(i)BO℃酸酐，dioxane/H2O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，無機(jī)堿(如NaHCO3)，0-20℃(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸異丁酯，EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜0℃，CF3COOHIC類化合物的合成是以2-取代萘烷基氨基酸為原料，分別經(jīng)叔丁氧?；?BOC)保護(hù)，酯活化，酯化，N-酰化，皂化，脫保護(hù)制得。合成方法具體見Scheme 3中。
Scheme 3a a(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H2O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，無機(jī)堿(如NaHCO3)，0-20℃(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸異丁酯，EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(e)(i)MeOH(或THF，或兩者混合液)，無機(jī)堿(如LiOH)(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(f)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜0℃，CF3COOH本發(fā)明利用的生物傳感技術(shù)和酵母雙雜交系統(tǒng)以及哺乳動物反式激活試驗(yàn)來驗(yàn)證PPAR拮抗劑活性的方法由下列步驟組成1、用生物傳感器測定2-取代酰氨基二羧酸類化合物與PPARγLBD的結(jié)合活性(1)、6His標(biāo)記PPARγLBD融合蛋白克隆本步驟是借助基因工程上游方法，選用pET15b載體構(gòu)建PPARγLBD融合蛋白的質(zhì)粒(pET15b-PPARγLBD)。
a.用PCR技術(shù)從pcDNA3.1-PPARγ中獲得PPARγLBD(206-475aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)NM_138712(GENEBANK))。
引物FW5’AAC ATATGT CCG CTG ACC TCC GGG CCC T3’RV5’AAG GAT CCC TAG TAC AAG TCC TTG TAG ATC3’95℃變性5min，開始循環(huán)95℃1min，58℃1min，72℃1min30s，重復(fù)29循環(huán)，72℃10min。采用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
b.將PPARγLBD的PCR產(chǎn)物克隆到pET15b載體上PPARγLBD的PCR產(chǎn)物和pET15b分別用Nde I和BamH I酶切；用試劑盒回收酶切產(chǎn)物，其中PPARγLBD回收的PCR酶切產(chǎn)物近800bp，pET15b酶切產(chǎn)物近5.7kb。用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；通過酶切鑒定和測序得到正確的克隆。
(2)、PPARγLBD表達(dá)純化本步驟運(yùn)用了基因工程下游技術(shù)。
a.將構(gòu)建好的pET15b-PPARγLBD轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中。挑取鑒定正確的克隆37攝氏度過夜培養(yǎng)于50ml LB培養(yǎng)基中(酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L)，并加入安芐青霉素至終濃度100mg/L。1∶1000轉(zhuǎn)接到新鮮1升LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體長到OD600為0.6左右時，加入IPTG至終濃度0.2mM并將溫度降至25攝氏度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)5小時。5000g/分離心5分鐘收集菌體，并分裝到兩個50ml離心管中放置于零下80攝氏度冰箱過夜。
b.超聲破碎細(xì)菌，然后用NTA-Ni2+樹脂純化蛋白。
(3)、2-取代酰氨基二羧酸類化合物與PPARγLBD結(jié)合活性檢測本步驟運(yùn)用了生物傳感器Biacore3000及其相關(guān)技術(shù)。
a.將純化后PPARγLBD蛋白透析到20mM磷酸緩沖液中(PH7.4)。然后將蛋白偶連到Biacore3000專用CM5芯片上。
b.將各個濃度的化合物2-取代酰氨基二羧酸類化合物配置到含0.1％DMSO的10mM HEPES-EP緩沖液中(HEPES 2.38g/L、NaCl 8.77g/L、0.5M EDTA 6ml和P200.5ml)。然后將各濃度梯度的2-取代酰氨基二羧酸類化合物流過芯片。通過Biacore3000自帶軟件擬合出2-取代酰氨基二羧酸類化合物與PPARγLBD的解離常數(shù)KD。
2、用生物傳感器測定2-取代酰氨基二羧酸類化合物抑制羅格列酮誘導(dǎo)增加的RXRαLBD與PPARγLBD結(jié)合活性(1)構(gòu)建6His標(biāo)記的RXRαLBD融合蛋白本步驟是借助基因工程上游方法，選用pET22b載體構(gòu)建RXRαLBD融合蛋白的質(zhì)粒(pET22b-RXRαLBD)。
a.用PCR技術(shù)從pcDNA3.1-RXRα中獲得RXRαLBD(223-462aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)NM_002957(GENEBANK))。
引物FW5’AAT CAT ATG ACC AGC AGC GCC AAC3’RV5’TAA CTC GAG CTA AGT CAT TTG GTG CGG3’95℃變性5min，開始循環(huán)95℃1min，55℃1min，72℃1min30s，重復(fù)30循環(huán)，72℃10min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
b.將RXRαLBD的PCR產(chǎn)物克隆到pET22b載體上RXRαLBD的PCR產(chǎn)物和pET22b分別用NdeI和XhoI酶切；用試劑盒回收酶切產(chǎn)物，其中RXRα回收的PCR酶切產(chǎn)物近750bp，pET22b酶切產(chǎn)物近5.5kb。用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；通過酶切和測序得到正確的克隆。
(2)RXRαLBD表達(dá)純化本步驟運(yùn)用了基因工程下游技術(shù)。
a.將構(gòu)建好的pET22b-RXRαLBD轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中。挑取鑒定正確的克隆37攝氏度過夜培養(yǎng)于50ml LB培養(yǎng)基中并加入安芐青霉素至終濃度100mg/L。1∶1000轉(zhuǎn)接到新鮮1升LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體長到OD600為0.6左右時，加入IPTG至終濃度0.5mM并將溫度降至25攝氏度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)5小時。5000g/分離心5分鐘收集菌體，并分裝到兩個50ml離心管中放置于零下80攝氏度冰箱過夜。
b.超聲破碎細(xì)菌，然后用NTA-Ni2+樹脂純化蛋白。
(3)2-取代酰氨基二羧酸類化合物抑制RXRαLBD與PPARγLBD結(jié)合活性檢測本步驟運(yùn)用了生物傳感器Biacore3000及其相關(guān)技術(shù)a.將純化后RXRαLBD蛋白透析到10mM HEPES-EP中。然后將蛋白偶連到Biacore3000專用CM5芯片上。
b.將PPARγLBD蛋白中加入10μM羅格列酮和各濃度梯度的2-取代酰氨基二羧酸類化合物。再將樣品流經(jīng)偶連有RXRαLBD芯片來檢測2-取代酰氨基二羧酸類化合物對PPAR和RXR結(jié)合活性的影響。
3、酵母雙雜交測定2-取代酰氨基二羧酸類化合物酵母細(xì)胞水平活性(1)、CBP和酵母GAL4AD融合蛋白(pGADT7-CBP)的質(zhì)粒構(gòu)建；本步驟是借助基因工程方法，選用pGADT7載體構(gòu)建CBP和酵母GAL4AD融合蛋白的質(zhì)粒(pGADT7-CBP)。
a.用PCR技術(shù)從CMV-mCBP中獲得CBP(1-464aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)S66385(GENEBANK))引物FW5’AACATATGATGGCCGAGAACTTGCTGGACG 3’RV5’AAGGATCCCTGTTGCCCTGCACCAACAG 3’95℃變性8min，開始循環(huán)95℃1min，65℃1min，72℃2min30s，重復(fù)30循環(huán)，72℃10min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
b.將CBP(1-464aa)的PCR產(chǎn)物克隆到pGADT7載體上CBP(1-464aa)的PCR產(chǎn)物和pGADT7分別用Nde I和BamH I酶切；用試劑盒回收酶切產(chǎn)物，其中回收CBP(1-464aa)的PCR酶切產(chǎn)物近1400bp，pGADT7酶切產(chǎn)物近8.0kb。用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；通過酶切鑒定挑選正確的克隆。
(2)、PPARγLBD和酵母GAL4LBD融合蛋白(pGBKT7-PPARγLBD)的質(zhì)粒構(gòu)建；本步驟是借助基因工程方法，選用pGBKT7載體構(gòu)建PPARγLBD和酵母GAL4DNA-BD融合蛋白的質(zhì)粒(pGBKT7-PPARγLBD)。
a.利用PCR技術(shù)從pcDNA3.1-PPARγ中獲得PPARγLBD(193aa-475aa)的DNA片段引物FW5’AACATATGGCGGAGATCTCCAGT 3’
RV5’AAGTCGACCTAGTACAAGTCCTT3’95℃變性8min，開始循環(huán)95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重復(fù)30循環(huán)，72℃10min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
b.將PPARγLBD的PCR產(chǎn)物克隆到pGBKT7載體上PPARγLBD的PCR產(chǎn)物和pGBKT7分別用Nde I和Sal I酶切；用試劑盒回收酶切產(chǎn)物，其中回收PPARγLBD的PCR酶切產(chǎn)物近850bp，pGBKT7酶切產(chǎn)物近7.3kb；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；通過酶切鑒定挑選正確的克隆。
(3)、將pGADT7-CBP與pGBKT7-PPARγLBD共轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞AH109中采用LiAc轉(zhuǎn)化法。先將pGBKT7-PPARγLBD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞AH109中，用色氨酸缺陷(T-)的培養(yǎng)基篩選陽性克隆，然后將pGADT7-CBP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有pGBKT7-PPARγLBD質(zhì)粒的酵母中，用色氨酸，亮氨酸雙缺陷(T-L-)的培養(yǎng)基篩選陽性克隆，得到同時含有pGADT7-CBP質(zhì)粒和pGBKT7-PPARγLBD質(zhì)粒的酵母細(xì)胞。
(4)、通過測定α-半乳糖苷酶的活性檢測化合物活性在得到的穩(wěn)定表達(dá)pGADT7-CBP和pGBKT7-PPARγLBD的陽性酵母細(xì)胞中加入羅格列酮(陽性激動劑)、GW9662(陽性拮抗劑)及化合物2-取代酰氨基二羧酸類化合物，當(dāng)酵母細(xì)胞生長至OD600到0.8至1.0時，通過測定410nm光吸收來檢測α-半乳糖苷酶的活性，并計算其抑制率。抑制率的計算公式為抑制率＝[(2-取代酰氨基二羧酸類化合物+羅格列酮)的酶活力-羅格列酮酶活力]/(DMSO酶活力-羅格列酮酶活力)×100％有益效果本發(fā)現(xiàn)找到了一種高活性的PPAR拮抗劑2-取代酰氨基二羧酸類化合物。
4、哺乳動物反式激活試驗(yàn)測定2-取代酰氨基二羧酸類化合物細(xì)胞水平活性(1)、RXRα哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RXRα的構(gòu)建；本步驟是借助基因工程方法，將全長RXRα接入pcDNA3.1載體多克隆位點(diǎn)構(gòu)建RXRα哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RXRα。
a.用PCR技術(shù)從pMT-RXRα中獲得RXRα的DNA片段(基因序列依據(jù)NM_002957(GENEBANK)引物FW5’ATAAGCTTATGGACACCAAACATTTCCTGC 3’RV5’ATGAATTCCTAAGTCATTTGGTGCGGCGC 3’95℃變性5min，開始循環(huán)95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重復(fù)30循環(huán)，72℃10min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
b.將RXRα的PCR產(chǎn)物克隆到pcDNA3.1載體上RXRα的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1分別用HindIII和EcoRI酶切；用試劑盒回收酶切產(chǎn)物，其中回收RXRα的PCR酶切產(chǎn)物近1.5kb，pcDNA3.1酶切產(chǎn)物近5.5kb。用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；通過酶切鑒定挑選正確的克隆。
(2)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染；用含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基37攝氏度5％二氧化碳孵箱中培養(yǎng)COS-7細(xì)胞。細(xì)胞在25平方厘米培養(yǎng)瓶中調(diào)養(yǎng)，每24小時更換培養(yǎng)基，并用PBS清洗細(xì)胞碎片一次。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)90％左右時，將細(xì)胞接種到24孔板中。孵育過夜后，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70％左右。用脂質(zhì)體PPAR、RXR和報告基因以及內(nèi)參質(zhì)粒pSV-beta-gal共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
(3)待測化合物加入和活性檢測；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24小時，加入加入羅格列酮(陽性激動劑)、GW9662(陽性拮抗劑)及化合物2-取代酰氨基二羧酸類化合物，測定OD410nM時β半乳糖苷酶活性和螢火蟲熒光素酶底物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。當(dāng)各孔OD410在同一水平時(說明轉(zhuǎn)染效率相同)，抑制率的計算公式為抑制率＝[(2-取代酰氨基二羧酸類化合物+羅格列酮)的酶活力-羅格列酮酶活力]/(DMSO酶活力-羅格列酮酶活力)×100％有益效果本發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞水平證實(shí)了一種高活性的PPAR拮抗劑2-取代酰氨基二羧酸類化合物的活性。
該類拮抗劑可用于與PPAR相關(guān)疾病研究和治療，包括II型糖尿病、肥胖癥、動脈粥樣硬化、壞脂血、以及血糖、血脂異常等代謝類疾病。
本發(fā)明的2-取代酰氨基二羧酸類化合物的制備方法具有反應(yīng)條件溫和、原料豐富易得、操作及后處理簡單等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的2-取代酰氨基二羧酸類化合物在計算機(jī)虛擬篩選以及PPAR蛋白配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，具有很高結(jié)合活性(KD＝0.20μM)，能夠降低PPAR和RXR的相互作用，在酵母雙雜交系統(tǒng)中能夠有效的抑制羅格列酮的活性(IC50＝8.67μM)并且在哺乳動物反式激活試驗(yàn)中同樣有效的抑制了羅格列酮的活性(IC50＝31.9μM)從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的化合物毒性很低。


圖1是SDS-PAGE電泳考馬氏亮藍(lán)染色檢測純化后PPARγLBD蛋白。左起第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；后三泳道為純化過程中收集的不同洗脫體積的樣品。如圖所示，蛋白純度大于95％。
圖2是不同濃度的2-取代酰氨基二羧酸類化合物與PPARγLBD蛋白結(jié)合的Biacore3000檢測圖，通過Biacore自帶軟件分析得到其KD＝0.20μM。
圖3是SDS-PAGE電泳考馬氏亮藍(lán)染色檢測純化后RXRαLBD蛋白。左起第一泳道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；后兩泳道為純化過程中收集的不同洗脫體積的樣品。如圖所示，蛋白純度大于95％。
圖4是羅格列酮和GW9662對RXRαLBD與PPARγLBD結(jié)合活性影響的Biacore檢測圖，由圖所示羅格列酮以濃度依賴方式促進(jìn)RXRαLBD與PPARγLBD的結(jié)合，而GW9662可以有效地抑制羅格列酮的作用。
圖5是2-取代酰氨基二羧酸類化合物對RXRαLBD與PPARγLBD結(jié)合活性影響的Biacore檢測圖，由圖所示2-取代酰氨基二羧酸類化合物可以有效地抑制羅格列酮地作用。
圖6是酵母雙雜交檢測不同濃度2-取代酰氨基二羧酸類化合物對20μM羅格列酮活性地抑制作用，IC50＝8.67μM。
圖7是哺乳動物反式激活試驗(yàn)檢測不同濃度2-取代酰氨基二羧酸類化合物對0.1μM羅格列酮活性地抑制作用，IC50＝31.9μM。
具體實(shí)施例方式
下面進(jìn)一步用實(shí)施例說明式(I)化合物的制備，但這些實(shí)施例絕不是對本發(fā)明的任何限制。
核磁共振譜在Bruker AM-400上測定，質(zhì)譜在MAT-95型質(zhì)譜儀上進(jìn)行。元素分析由中科院上海藥物研究所分析室完成。熔點(diǎn)在電熱熔點(diǎn)管或b型熔點(diǎn)管上測定，溫度計未經(jīng)校正；簿層層析(TLC)采用硅膠GF254(青島海洋化工廠生產(chǎn))與濃度為0.8％的羧甲基纖維素鈉蒸餾水溶液充分?jǐn)噭蚝箐伆?，晾干，?jīng)100～110℃活化1～2小時后于干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?，紫外?λ254nm)顯色；柱層析采用100目～200目柱層析硅膠(青島海洋化工廠生產(chǎn))。
實(shí)施例1N-叔丁氧羰基-L-色氨酸(II-1)L-色氨酸(2.04g，10mmol)，BOC酸酐(6.54g，30mmol)，加入二氧六環(huán)、水、DMF的混合溶劑45ml中(4∶4∶1，v/v/v)，室溫攪拌下，分批加入NaHCO3(6.54g，30mmol)，繼續(xù)室溫攪拌10小時，減壓蒸除溶劑，所得固體溶于適量水中，6N HCl調(diào)PH＝6-7，析出大量固體，抽濾水洗，干燥，所得固體用無水甲醇重結(jié)晶得產(chǎn)物。
實(shí)施例2L-谷氨酸二甲酯鹽酸鹽(III-1)L-谷氨酸(0.75g，5mmol)加入到甲醇10ml中，冰浴冷卻攪拌下，滴加SOCl2(1.1ml，15mmol)，完畢后轉(zhuǎn)為室溫攪拌24小時，減壓蒸除溶劑得產(chǎn)品。
實(shí)施例3N-(N-叔丁氧羰基-L-色氨?；?-L-谷氨酸二甲酯(IV-1)II-1(0.45g，1.5mmol)加入到乙酸乙酯20ml中，冰鹽浴冷至-12℃，加入NMM(0.36ml，3.2mmol)，攪拌下滴加氯甲酸異丁酯(0.22g，1.6mmol)溶于乙酸乙酯(5ml)的溶液，加畢，在此溫度下繼續(xù)攪拌20分鐘，分批加入III-1(0.32g，1.5mmol)，然后自然升至室溫攪拌10小時，加入30ml水，分出有機(jī)層，依次用飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、水洗，干燥，減壓蒸除溶劑，所得殘余物硅膠柱層析分離的產(chǎn)品。
實(shí)施例4N-L-色氨?；?L-谷氨酸二甲酯(IA-1)IV-1(0.46g，1mmol)加入到10mlDCM中，冰浴冷卻下，滴加三氟乙酸(5ml)，然后自然升至室溫攪拌10小時，減壓蒸除溶劑，加適量的水，凍干得產(chǎn)品。
實(shí)施例5N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(V-1)L-苯丙氨酸(1.65g，10mmol)，BOC酸酐(6.54g，30mmol)，加入二氧六環(huán)、水、DMF的混合溶劑45ml中(4∶4∶1，v/v/v)，室溫攪拌下，分批加入NaHCO3(6.54g，30mmol)，繼續(xù)室溫攪拌10小時，減壓蒸除溶劑，所得固體溶于適量水中，6N HCl調(diào)PH＝6-7，析出大量固體，抽濾水洗，干燥，所得固體用無水甲醇重結(jié)晶得產(chǎn)物實(shí)施例6L-谷氨酰胺甲酯鹽酸鹽(VI-1)L-谷氨酰胺(0.73g，5mmol)加入到甲醇30ml中，冰浴冷卻攪拌下，滴加SOCl2(0.55ml，7.5mmol)，完畢后轉(zhuǎn)為室溫攪拌24小時，減壓蒸除溶劑得產(chǎn)品。
實(shí)施例7N-(N-叔丁氧羰基-L-苯丙酰基)-L-谷氨酰胺甲酯(VII-1)V-1(0.25g，1.5mmol)加入到乙酸乙酯20ml中，冰鹽浴冷至-12℃，加入NMM(0.36ml，3.2mmol)，攪拌下滴加氯甲酸異丁酯(0.22g，1.6mmol)溶于乙酸乙酯(5ml)的溶液，加畢，在此溫度下繼續(xù)攪拌20分鐘，分批加入VI-1(0.24g，1.5mmol)，然后自然升至室溫攪拌10小時，加入30ml水，分出有機(jī)層，依次用飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、水洗，干燥，減壓蒸除溶劑，所得殘余物硅膠柱層析分離的產(chǎn)品。
實(shí)施例8N-L-苯丙?；?L-谷氨酰胺甲酯(IB-1)VII-1(0.41g，1mmol)加入到10mlDCM中，冰浴冷卻下，滴加三氟乙酸(5ml)，然后自然升至室溫攪拌10小時，減壓蒸除溶劑，加適量的水，凍干得產(chǎn)品。
實(shí)施例9N-叔丁氧羰基-L-3-(2-萘基)丙氨酸(VIII-1)L-3-(2-萘基)丙氨酸(2.15g，10mmol)，BOC酸酐(6.54g，30mmol)，加入二氧六環(huán)、水、DMF的混合溶劑45ml中(4∶4∶1，v/v/v)，室溫攪拌下，分批加入NaHCO3(6.54g，30mmol)，繼續(xù)室溫攪拌10小時，減壓蒸除溶劑，所得固體溶于適量水中，6N HCl調(diào)PH＝6-7，析出大量固體，抽濾水洗，干燥，所得固體用無水甲醇重結(jié)晶得產(chǎn)物實(shí)施例10N-(N-叔丁氧羰基-L-3-(2-萘基)丙氨?；?-L-谷氨酸二甲酯(IX-1)VIII-1(0.47g，1.5mmol)加入到乙酸乙酯20ml中，冰鹽浴冷至-12℃，加入NMM(0.36ml，3.2mmol)，攪拌下滴加氯甲酸異丁酯(0.22g，1.6mmol)溶于乙酸乙酯(5ml)的溶液，加畢，在此溫度下繼續(xù)攪拌20分鐘，分批加入III-1(0.32g，1.5mmol)，然后自然升至室溫攪拌10小時，加入30ml水，分出有機(jī)層，依次用飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液、水洗，干燥，減壓蒸除溶劑，所得殘余物硅膠柱層析分離的產(chǎn)品。
實(shí)施例11N-(N-叔丁氧羰基-L-3-(2-萘基)丙氨酰基)-L-谷氨酸(X-1)IV-1(0.47g，1mmol)加入到甲醇20ml中，冰浴冷卻下加入LiOH.H2O(0.13g，3mmol)，然后自然升至室溫攪拌24小時，加入50ml水，1N HCl調(diào)PH＝2-3，乙酸乙酯提取，干燥，減壓蒸除溶劑得產(chǎn)品。
實(shí)施例12N-L-3-(2-萘基)丙氨酰基-L-谷氨酸(IC-1)X-1(0.45g，1mmol)加入到10mlDCM中，冰浴冷卻下，滴加三氟乙酸(5ml)，然后自然升至室溫攪拌10小時，減壓蒸除溶劑，加適量的水，凍干得產(chǎn)品。
實(shí)施例13N-L-色氨酰基-L-天冬氨酸二甲酯(IA-2)將L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替換成L-天冬氨酸(0.66g，5mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例1-4制得目標(biāo)物。
實(shí)施例142-L-色氨酰氨基-L-己二酸二甲酯(IA-3)
將L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替換成2-氨基-L-己二酸(0.81g，5mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例1-4制得目標(biāo)物。
實(shí)施例15N-L-苯丙?；?L-天冬酰胺甲酯(IB-2)將L-谷氨酰胺(0.73g，5mmol)替換成L-天冬酰胺(0.66g，5mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例5-8制得目標(biāo)物。
實(shí)施例16N-(4-甲氧基-L-苯丙酰基)-L-谷氨酰胺甲酯(IB-3)將L-苯丙氨酸(1.65g，10mmol)替換成4-甲氧基-L-苯丙氨酸(1.95g，10mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例5-8制得目標(biāo)物。
實(shí)施例17N-(4-氟-L-苯丙?；?-L-谷氨酰胺甲酯(IB-4)將L-苯丙氨酸(1.65g，10mmol)替換成4-氟-L-苯丙氨酸(1.83g，10mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例5-8制得目標(biāo)物。
實(shí)施例18N-L-3-(2-萘基)丙氨?；?L-天冬氨酸(IC-2)將L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替換成L-天冬氨酸(0.66g，5mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例2，9-12制得目標(biāo)物。
實(shí)施例19N-L-3-(2-萘基)丙氨酰基-D-天冬氨酸(IC-3)將L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替換成D-天冬氨酸(0.66g，5mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例2，9-12制得目標(biāo)物。
實(shí)施例202-L-3-(2-萘基)丙氨酰氨基-L-己二酸(IC-4)將L-谷氨酸(0.75g，5mmol)替換成2-氨基-L-己二酸(0.81g，5mmol)，其余所需原料、試劑及制備方法同實(shí)施例2，9-12制得目標(biāo)物。
下面再結(jié)合具體篩選實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源包括
NTA-Ni2+樹脂購自Novagen公司；Biacore3000專用CM5芯片購自安瑪西亞公司；酵母菌株AH109(基因型為MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4，gal80LYS2GAL 1UAS-GAL 1TATA-HIS3，MEL1UAS-MEL1TATA-MEL1，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ)、酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7和pGADT7為中科院上海生命科學(xué)學(xué)院龔毅教授惠贈；COS-7細(xì)胞由上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所提供；模板CMV-mCBP由M.G.Rosenfeld提供；模板pcDNA3.1-PPARγ由成都地奧公司提供；模板pMT-RXRα由美國鹽湖城研究所的Mangerdorf提供；報告基因PPRE3-TK-luc由美國鹽湖城研究所Evan提供；限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶、dNTP等均購自TaKaRa公司；10×buffer隨pyrobetTMDNA聚合酶一起購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自華舜公司；氨芐青霉素、卡那霉素、Ni2SO4、咪唑、Tris、NaCl、HEPES、DMSO、LiAc、PEG 3500、PNP-α-Gal、各培養(yǎng)基的配制原料均購自sigma公司；DMEM購自美國Gibco/BRL公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；脂質(zhì)體Transfectamine2000購自Invitrogen公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒和螢火蟲熒光素酶報告基因測活試劑盒Steady-Glo LuciferaseAssay購自美國Promega公司。
SS-carrier DNA購自Strategene；DNAmarker購自鼎國生物公司；引物合成與DNA測序由上海博亞公司完成；96孔板、24孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶均購自丹麥Nunc公司。
96孔白色平底冷光檢測板購自美國Corning公司；下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作參照有關(guān)文獻(xiàn)，其中限制性酶切方法參照分子克隆第二版P259-P262；用T4DNA連接酶連接方法參照分子克隆第二版P282-P283；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α方法參照分子克隆第二版P55-P56；用酶切鑒定方法參照分子克隆第二版P259-P262；此外瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物方法參照分子克隆第二版P680-P682；膠回收按照華舜公司的試劑盒說明書；蛋白純化方法參照His-Bind Kit(Novagen)；蛋白偶連到CM5芯片方法按照Biacore3000自帶軟件進(jìn)行；質(zhì)粒提取方法參照C.Hoffman and F.Winston，Gene 57267；1987；LB培養(yǎng)基的配制方法參照分子克隆第二版P908；酵母各培養(yǎng)基的配制方法參照Yeast Protocol Handbook(CLONTECH)。
實(shí)施例1 PPARγLBD和pET15b融合蛋白(pET15b-PPARγLBD)的質(zhì)粒構(gòu)建(一)試驗(yàn)方法1)以pcDNA3.1-PPARγ為模板，用PCR技術(shù)復(fù)制擴(kuò)增獲得PPARγLBD(206-475aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)NM_138712(GENEBANK))引物設(shè)計FW5’AAC ATA TGT CCG CTG ACC TCC GGG CCC T3’RV5’AAG GAT CCC TAG TAC AAG TCC TTG TAG ATC3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(體系100μl)pcDNA3.1-PPARγ模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；pyrobestTMDNA聚合酶1μl；水71μl。
反應(yīng)條件為95℃變性5min，開始循環(huán)95℃1min，58℃1min，72℃1min30s，重復(fù)29循環(huán)，72℃10min。
采用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
2)將PPARγLBD(206-475aa)的PCR產(chǎn)物克隆到pET15b載體上PPARγLBD(206-475aa)的PCR產(chǎn)物和pET15b分別用Nde I和BamH I酶切；用試劑盒方法回收酶切產(chǎn)物，其中回收PPARγLBD(206-475aa)的PCR酶切產(chǎn)物近800bp；pET15b酶切產(chǎn)物近5.7kb；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鑒定挑選正確的克隆，并送往測序。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1)采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。酶切鑒定結(jié)果在載體上187bp，1666bp處有兩個EcoRV的酶切位點(diǎn)，319bp-331bp間為多克隆位點(diǎn)，PPARγLBD(206-475aa)就克隆在這個區(qū)域內(nèi)，因而正確的克隆應(yīng)切出約2300bp和4200bp左右的兩片段。
2)DNA測序報告也顯示pET15b-PPARγLBD中PPARγLBD的序列與NM_138712(GENEBANK)中序列完全一致。
實(shí)施例2 6His標(biāo)記PPARγLBD融合蛋白(pET15b-PPARγLBD)的表達(dá)純化(一)試驗(yàn)方法1、將pET15b-PPARγLBD轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，酶切鑒定得到正確的克隆。挑取單克隆到50ml含100mg/L安芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37攝氏度搖床中250rpm培養(yǎng)過夜。然后按1∶1000轉(zhuǎn)接到1升含100mg/L安芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時，將溫度降到25攝氏度，并加入0.2mM的IPTG誘導(dǎo)5小時。5000rpm收集細(xì)菌到兩個50ml離心管中。零下80度冰箱放置過夜。取出收集的菌體，重懸于20ml Binding buffer中(10mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)，超聲破碎。15000rpm離心20分鐘，取上清穿過NTA-Ni柱。先用5倍體積的Binding buffer洗去雜蛋白，進(jìn)一步用Washing buffer洗去雜蛋白(60mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。最后用Elute buffer將PPARγLBD洗下(120mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。
(二)試驗(yàn)結(jié)果10％SDS-PAGE電泳并用考馬氏亮藍(lán)染色檢測蛋白，如圖1PPARγLBD蛋白全長270個氨基酸殘基，再加上6個組胺酸，整個蛋白約為30KD。染色后的電泳膠上可以清楚的看到單一的一條30KD的條帶，如圖一所示，最左邊道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，后三道純化時收集的不同洗脫體積的PPARγLBD蛋白。
實(shí)施例3 生物傳感器檢測2-取代酰氨基二羧酸類化合物與蛋白PPARγLBD結(jié)合活性(一)試驗(yàn)方法將PPARγLBD蛋白透析到20mM磷酸緩沖液(PH7.4)。Biacore3000系統(tǒng)運(yùn)行環(huán)境為10mMHEPES-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和500μl P20)緩沖液。按照BIAcore手冊所述方法將蛋白偶連到Biacore3000專用CM5芯片上。HEPES-EP配置不同濃度的2-取代酰氨基二羧酸類化合物，DMSO的終濃度都為0.1％。將不同濃度2-取代酰氨基二羧酸類化合物流經(jīng)PPARγLBD芯片，然后利用系統(tǒng)自帶分析軟件得到該化合物與PPARγLBD的KD。
(二)試驗(yàn)結(jié)果2-取代酰氨基二羧酸類化合物表現(xiàn)出跟PPARγLBD很高的結(jié)合活性KD＝0.20μM。如圖2所示，從結(jié)合曲線可以看出化合物跟芯片上的蛋白可以很快結(jié)合達(dá)到平臺，然后又很容易脫離解離開，說明該化合物可以很輕易進(jìn)出PPARγLBD的結(jié)合口袋。
實(shí)施例4 RXRαLBD和pET22b融合蛋白(pET22b-PPARγLBD)的質(zhì)粒構(gòu)建(一)試驗(yàn)方法1)以pcDNA3.1-RXRα為模板，用PCR技術(shù)復(fù)制擴(kuò)增獲得RXRαLBD(223-462aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)NM_002957(GENEBANK))引物設(shè)計FW5’AAT CATATGACC AGC AGC GCC AAC3’RV5’TAA CTC GAG CTAAGT CAT TTG GTG CGG3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(體系100μl)pcDNA3.1-RXRα模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；pyrobestTMDNA聚合酶1μl；水71μl。
反應(yīng)條件為95℃變性5min，開始循環(huán)95℃1min，55℃1min，72℃1min30s，重復(fù)29循環(huán)，72℃10min。
采用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
2)將RXRαLBD(223-462aa)的PCR產(chǎn)物克隆到pET22b載體上RXRαLBD(223-462aa)的PCR產(chǎn)物和pET22b分別用Nde I和Xho I酶切；用試劑盒方法回收酶切產(chǎn)物，其中回收RXRαLBD(223-462aa)的PCR酶切產(chǎn)物近750bp；pET22b酶切產(chǎn)物近5.5kb；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鑒定挑選正確的克隆，并送往測序。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1)采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。酶切鑒定結(jié)果在載體上217bp，1564bp處有兩個EcoRV的酶切位點(diǎn)，158bp-326bp間為多克隆位點(diǎn)，RXRαLBD(223-462aa)就克隆在這個區(qū)域內(nèi)，因而正確的克隆應(yīng)切出約2100bp和4200bp左右的兩片段。
2)DNA測序報告pET22b-RXRαLBD表達(dá)載體測序報告顯示，pET22b-RXRαLBD測序結(jié)果和RXRαLBD(223-462aa)原DNA序列比較，完全正確。
實(shí)施例5 6His標(biāo)記RXRαLBD融合蛋白(pET22b-RXRαLBD)的表達(dá)純化(一)試驗(yàn)方法將pET22b-RXRαLBD轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，酶切鑒定得到正確的克隆。挑取單克隆到50ml含100mg/L安芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37攝氏度搖床中250rpm培養(yǎng)過夜。然后按1∶1000轉(zhuǎn)接到1升含100mg/L安芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時，將溫度降到25攝氏度，并加入0.5mM的IPTG誘導(dǎo)5小時。5000rpm收集細(xì)菌到兩個50ml離心管中。零下80度冰箱放置過夜。取出收集的菌體，重懸于20ml Binding buffer中(10mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)，超聲破碎。15000rpm離心20分鐘，取上清穿過NTA-Ni柱。先用5倍體積的Binding buffer洗雜蛋白，進(jìn)一步用Washing buffer洗去雜蛋白(60mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。最后用Elute buffer將PPARγLBD洗下(150mM咪唑、500mM NaCl和20mM Tris，PH8.0)。
(二)試驗(yàn)結(jié)果10％SDS-PAGE電泳并用考馬氏亮藍(lán)染色檢測蛋白，RXRαLBD蛋白全長240個氨基酸殘基，再加上6個組胺酸，整個蛋白約為28KD。染色后的電泳膠上可以清楚的看到單一的一條28KD的條帶。如圖3，最左邊道為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，后二道純化時收集的不同洗脫體積的RXRαLBD蛋白。
實(shí)施例6 生物傳感器檢測2-取代酰氨基二羧酸類化合物對蛋白PPARγLBD和RXRαLBD結(jié)合活性的抑制作用(一)試驗(yàn)方法將RXRalphaLBD蛋白透析到20mM磷酸緩沖液(PH7.4)。Biacore3000系統(tǒng)運(yùn)行環(huán)境為10mMHEPES-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和500μl P20)緩沖液。利用系統(tǒng)所帶的程序?qū)⒌鞍着歼B到Biacore3000專用CM5芯片上。將0.2mM的PPARγLBD蛋白分別加入DMSO、羅格列酮、(羅格列酮+GW9662)和(羅格列酮+2-取代酰氨基二羧酸類化合物)一起孵育30分鐘。再將樣品流經(jīng)RXRαLBD芯片，檢測PPARγLBD與RXRαLBD的結(jié)合強(qiáng)度。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1)0.2mM PPARγLBD與RXRαLBD的結(jié)合加入10mM的羅格列酮比沒有加的Ru值明顯增加，并且隨羅格列酮濃度的增加結(jié)合加強(qiáng)。而GW9662的加入則會降低羅格列酮的增強(qiáng)作用。如圖4所示，由上而下第一條為0.2mMPPARγLBD蛋白中加入100μM的羅格列酮(DMSO終濃度為1％)、第二條為0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM的羅格列酮(DMSO終濃度為1％)、第三條0.2mMPPARγLBD蛋白中加入1％DMSO、第四條為0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM的羅格列酮和10μM的GW9662(DMSO終濃度為1％)。如圖可見羅格列酮對RXRαLBD與PPARγLBD的結(jié)合的促進(jìn)作用具有濃度依賴性，而GW9662可以有效地抑制羅格列酮的作用。該試驗(yàn)充分說明用此方法檢測拮抗劑活性是可行的。
2)與上面步驟相同加入10μM的2-取代酰氨基二羧酸類化合物，該化合物能夠有效的降低羅格列酮對PPARγ與RXRα的結(jié)合的增強(qiáng)作用。如圖5所示，由上而下分別為第一條0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM羅格列酮、第二條0.2mMPPARγLBD蛋白中加入10μM羅格列酮和10μM 2-取代酰氨基二羧酸類化合物、第三條0.2mMPPARγLBD蛋白中加入1％DMSO。所有樣品DMSO終濃度都為1％。
實(shí)施例7 CBP和酵母GAL4AD融合蛋白(pGADT7-CBP)的質(zhì)粒構(gòu)建(一)試驗(yàn)方法1)以CMV-mCBP為模板，用PCR技術(shù)復(fù)制擴(kuò)增獲得CBP(1-464aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)S66385(GENEBANK))引物設(shè)計FW5’AACATATGATGGCCGAGAACTTGCTGGACG 3’RV5’AAGGATCCCTGTTGCCCTGCACCAACAG 3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)CMV-mCBP模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；pyrobestTMDNA聚合酶1μl；水71μl。
反應(yīng)條件為95℃變性8min，開始循環(huán)95℃1min，65℃1min，72℃2min30s，重復(fù)30循環(huán)，72℃10min。
采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
2)將CBP(1-464aa)的PCR產(chǎn)物克隆到pGADT7載體上CBP(1-464aa)的PCR產(chǎn)物和pGADT7分別用Nde I和BamH I酶切；用試劑盒方法回收酶切產(chǎn)物，其中回收CBP(1-464aa)的PCR酶切產(chǎn)物近1400bp；pGADT7酶切產(chǎn)物近8.0kb；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鑒定挑選正確的克隆。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1、采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。酶切鑒定結(jié)果在載體上1480bp，2280bp處有兩個Hind III的酶切位點(diǎn)，1480bp-2280bp間存在著多克隆位點(diǎn)，CBP就克隆在這個區(qū)域內(nèi)，因而正確的克隆應(yīng)切出約2200bp和7.2kb左右的片段。
2、DNA測序結(jié)果與S66385(GENEBANK)上序列完全一致。
實(shí)施例8 PPARγLBD和酵母GAL4BD融合蛋白(pGBKT7-PPARγLBD)的構(gòu)建(一)試驗(yàn)方法以pcDNA3.1-PPARγ為模板，用PCR技術(shù)復(fù)制擴(kuò)增獲得PPARγLBD(193aa-475aa)的DNA片段(基因序列依據(jù)NM_138712(GENEBANK))引物設(shè)計FW5’AACATATGGCGGAGATCTCCAGT 3’RV5’AAGTCGACCTAGTACAAGTCCTT 3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)pcDNA3.1-PPARγ模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV；4μl；pyrobest聚合酶1μl；水71μl。
反應(yīng)條件為95℃變性8min，開始循環(huán)95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重復(fù)30循環(huán)，72℃10min。
采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
2)將PPARγLBD的PCR產(chǎn)物克隆到pGBKT7載體上PPARγLBD的PCR產(chǎn)物和pGBKT7分別用Nde I和Sal I酶切；用試劑盒方法回收酶切產(chǎn)物(回收PPARγLBD的PCR酶切產(chǎn)物近850bp；pGBKT7酶切產(chǎn)物近7.3kb)；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；涂布在含卡那霉素(50mg/l)的平板上用酶切鑒定，挑選正確的克隆。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1、采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。酶切鑒定結(jié)果在載體上6313bp處有一個EcoRV的酶切位點(diǎn)，PPARγLBD基因內(nèi)部16bp處也有一個EcoRV的酶切位點(diǎn)，因而正確的克隆應(yīng)切出約2200bp和6kb左右的片段。如圖7所示，經(jīng)進(jìn)一步酶切鑒定結(jié)果顯示確實(shí)有正確的克隆。
2、DNA測序顯示PPARγLBD DNA測序結(jié)果和NM 138712(GENEBANK)完全一致。
實(shí)施例9 將pGADT7-CBP與pGBKT7-PPARγLBD分步轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AH109中(一)試驗(yàn)方法1)按LiAC法將質(zhì)粒pGBKT7-PPARγLBD轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AH109接種酵母菌株AH109于約3ml YPDA中，30℃、250rpm培養(yǎng)16-18h(OD600約為1.4)；菌液按1∶5轉(zhuǎn)接于新鮮的YPDA中，30℃、200rpm培養(yǎng)5-7h(OD600至0.8～1.2)；取10ml菌液，4000rpm離心5min收集酵母細(xì)胞；棄上清，1ml無菌水重懸，轉(zhuǎn)移入另一離心管中，再加入約10ml無菌水，混勻；再次4000rpm離心5min收集酵母細(xì)胞；棄上清，1ml無菌水重懸，轉(zhuǎn)移入1.5ml eppendorf管中；4000rpm離心5min收集酵母細(xì)胞，小心吸去上清；依次加入240ul PEG 3500(50％W/V)、36ul 1.0M LiAc(pH7.5)、5ul煮沸的SS-carrier DNA(10mg/ml)、60ul無菌水和10ul待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。劇烈振蕩1min；30℃靜置30min；42℃水浴靜置30min，每隔5min顛倒混勻一次；4000rpm離心5min收集轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞；吸去上清，1ml無菌水重懸，取200ul涂于涂布于色氨酸缺陷(以下簡稱為T-)的選擇平板上，30℃培養(yǎng)3-4天。
2)鑒定攜帶pGBKT7-PPARγLBD質(zhì)粒的陽性克隆以上T-選擇平板上長出的克隆中，挑取克隆至T-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)16-18h；收集酵母，提取質(zhì)粒，PCR鑒定所提質(zhì)粒引物序列FW5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’RV5’TCCGAGTCACTTTAAAATTTGTAT 3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(20μl)模板(所提質(zhì)粒)14μl；10×buffer2μl；dNTP(2.5mM)2μl；FW1μl；RV1μl；taq DNApolymerase0.5μl。
反應(yīng)條件為95℃變性5min，開始循環(huán)95℃45s；50℃45s；72℃1min，重復(fù)35循環(huán)，72℃變性10min。
3)PCR鑒定得到擁有pGBKT7-PPARγLBD質(zhì)粒的陽性克隆。
4)將質(zhì)粒pGADT7-CBP轉(zhuǎn)入到上述陽性克隆中接種克隆于約3ml T-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm培養(yǎng)16-18h(OD600約為1.4)；菌液按1∶5轉(zhuǎn)接于新鮮的T-液體培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)5-7h(OD600至0.8～1.2)；按以上所述步驟轉(zhuǎn)化pGBKT7-PPARγLBD，最終涂布于色氨酸、亮氨酸雙缺陷(以下簡稱為T-L-)平板，30℃培養(yǎng)3-4天；5)PCR鑒定質(zhì)粒pGADT7-CBP是否轉(zhuǎn)入挑取T-L-平板上的克隆至T-L-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm，培養(yǎng)16-18h后提質(zhì)粒(方法同前)，PCR鑒定引物序列FW5’GTAATACGACTCACTATAGGGCGA 3’RV5’AGATGGTGCACGATGCACAGTT 3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(20μl)模板(所提質(zhì)粒)14μl；10×buffer2μl；dNTP(2.5mM)2μl；FW1μl；RV1μl；taq DNA聚合酶0.5μl。
反應(yīng)條件95℃變性5min，開始循環(huán)95℃45s；50℃45s；72℃1min，重復(fù)35循環(huán)；72℃變性10min6)鑒定得到擁有pGBKT7-PPARγLBD&pGADT7-CBP兩個質(zhì)粒的陽性克隆。
實(shí)施例10 酵母水平2-取代酰氨基二羧酸類化合物拮抗活性檢測1、羅格列酮(陽性化合物)對CBP與PPARγ相互作用影響的鑒定(一)試驗(yàn)步驟
1)將擁有雙質(zhì)粒pGBKT7-PPARγLBD和pGADT7-CBP的克隆劃線于T-L-平板上，30℃培養(yǎng)3-4d后，挑取單克隆接種于2ml T-L-液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm，過夜培養(yǎng)16-18h；2)轉(zhuǎn)接到新鮮T-L-液體培養(yǎng)基中，使OD600約0.1左右。繼續(xù)30℃、250rpm培養(yǎng)至OD600到0.8至1.0，然后再用新鮮T-L-液體培養(yǎng)基稀釋至OD600約0.05，并取出989ul加入11ulDMSO(DMSO終濃度為1.1％)作為空白對照，接著將其剩下的稀釋好的菌液按1∶1000加入20mM的羅格列酮(DMSO終濃度為0.1％)，并分裝成990ul每小份到eppendorf管中，再按1∶100加入0.01mM化合物GW9662和各濃度的2-取代酰氨基二羧酸類化合物(DMSO終濃度為1.1％(化合物GW9662為陽性拮抗劑)。各個樣品都做3份完全一樣的作為平行對照。30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8至1.0后，測定α-半乳糖苷酶活性(按照Yeast ProtocolHandbook(CLONTECH)進(jìn)行)96孔板中每孔加入198ulT-L-培養(yǎng)基和2ul DMSO、GW9662或不同濃度2-取代酰氨基二羧酸類化合物。然后混勻酵母培養(yǎng)液，取200ul加入到96孔板中，測定OD 600(BIO-RAD酶標(biāo)儀MODEL 550)；將平板3000rpm離心30分鐘，取16ul上清于96孔板中，每孔加入48ul分析緩沖液(100mM PNP-α-Gal水溶液與0.5M醋酸鈉，pH4.5按體積比1∶2混合)；30℃避光孵育60分鐘；加入136ul 10X終止緩沖液(1M Na2CO3)，終止反應(yīng)；測定410nm處的OD值(BIO-RAD酶標(biāo)儀MODEL 550)。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1、所用公式1)α-半乳糖苷酶活性的計算公式為α-半乳糖苷酶活性[mIU/(ml×cell)]＝(菌OD410-相應(yīng)化合物OD410)×Vf×1,000/[(ε×b)×t×Vi×(菌OD600-相應(yīng)化合物OD600)]其中，t＝反應(yīng)時間(分)Vf＝測值時的終體積(200ul)Vi＝加入酵母培養(yǎng)液上清的體積(16ul)OD600＝酵母培養(yǎng)液中酵母在600nm處的吸光度ε×b＝對-硝基苯酚在410nm處的摩爾吸光度×檢測液光程(cm)2)α-半乳糖苷酶相當(dāng)活性的計算公式為Tn＝A0/Ax；A0＝(菌DMSOOD410-DMSOOD510)/(菌DMSOOD600-DMSOOD600)；Ax＝(菌OD410-相應(yīng)化合物OD410)/(菌OD600-相應(yīng)化合物OD600)；其中
An為各樣品α-半乳糖苷酶相當(dāng)活性。
A0為只加入DMSO樣品的OD410與OD600的比值；Ax為加入各化合物樣品的OD410與OD600的比值；菌DMSOOD410為只加入1.1％DMSO的菌樣在410nm的吸光度；DMSOOD410為1.1％DMSO在410nm的吸光度；菌DMSOOD600為只加入1.1％DMSO的菌樣在600nm的吸光度；DMSOOD600為1.1％DMSO在600nm的吸光度；菌OD410為加入各化合物的菌樣在410nm的吸光度；相應(yīng)化合物OD410為加入的各化合物在410nm的吸光度；菌OD600為加入各化合物的菌樣在600nm的吸光度；相應(yīng)化合物OD600為加入的各化合物在600nm的吸光度；3)化合物抑制率計算公式為Ix＝(Ax-AR)/(A0-AR)×100％其中AR為羅格列酮終濃度為20μM、DMSO終濃度為1.1％的樣品的OD410與OD600的比值；2、試驗(yàn)結(jié)果2-取代酰氨基二羧酸類化合物能夠在酵母細(xì)胞水平很好地抑制PPARγ激動劑羅格列酮(20μM)的激活活性；如圖六所示，用Origin軟件作圖得到2-取代酰氨基二羧酸類化合物的IC50為8.67μM。
實(shí)施例11 哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1-RXRα質(zhì)粒的構(gòu)建(一)試驗(yàn)方法1)以pMT-RXRα為模板，用PCR技術(shù)復(fù)制擴(kuò)增獲得RXRα的DNA片段(基因序列依據(jù)NM_002957(GENEBANK)引物FW5’ATAAGCTTATGGACACCAAACATTTCCTGC 3’RV5’ATGAATTCCTAAGTCATTTGGTGCGGCGC 3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)pMT-RXRα模板2μl；10×buffer10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；pyrobestTMDNA聚合酶1μl；水71μl。
反應(yīng)條件為95℃變性5min，開始循環(huán)95℃1min，65℃1min，72℃1min30s，重復(fù)30循環(huán)，72℃10min。
采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，回收DNA。
2)將RXRα的PCR產(chǎn)物克隆到pcDNA3.1載體上RXRα的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1分別用HindIII和EcoRI酶切；用試劑盒方法回收酶切產(chǎn)物，其中回收RXRα的PCR酶切產(chǎn)物近1.5kb；pcDNA3.1酶切產(chǎn)物近5.5kb；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α；涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的平板上；用酶切鑒定挑選正確的克隆。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1、采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。酶切鑒定結(jié)果在載體上910bp，950bp處有分別有Hind III和EcoRI的酶切位點(diǎn)，RXRα就克隆在這個區(qū)域內(nèi)，因而用HindIII和EcoRI雙酶切，正確的克隆應(yīng)切出約1.5kb和5.5kb左右的片段。
2、DNA測序結(jié)果與NM_002957(GENEBANK)上序列完全一致。
實(shí)施例12 哺乳動物反式激活試驗(yàn)(一)試驗(yàn)方法1)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的純化，本步驟采用Invitrogen公司的質(zhì)粒純化試劑盒，得到無內(nèi)毒素的PPAR、RXR和報告基因質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒pSV-β-gal(表達(dá)β-半乳糖苷酶)，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法定量質(zhì)粒濃度。
2)細(xì)胞培養(yǎng)COS-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)基中并補(bǔ)加青霉素和鏈霉素，于37度5％二氧化碳孵箱中靜止培養(yǎng)。細(xì)胞在25平方厘米培養(yǎng)瓶中調(diào)養(yǎng)，每24小時更換培養(yǎng)基，并用PBS清洗細(xì)胞碎片一次。細(xì)胞覆蓋率達(dá)90％左右時，用胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)好時，以2×105個細(xì)胞每孔將細(xì)胞接種24孔板中。
3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和加藥接種于24孔板的細(xì)胞孵育過夜后，細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70％左右。將細(xì)胞用PBS和無血清無抗生素的DMEM各洗兩次，每孔加入500μl DMEM。將pcDNA3.1-PPAR(0.3μg/孔)、pcDNA3.1-RXR(0.3μg/孔)和報告基因(0.3μg/孔)加入DMEM(50μl/孔)中，脂質(zhì)體(2μl/孔)加入DMEM(50μl/孔)中，然后將二者混在一起室溫孵育15分鐘后，加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。孵箱中孵育6小時后，換成DMEM完全培養(yǎng)基孵育過夜。轉(zhuǎn)染后24小時后，加入羅格列酮(0.1μM/孔)和各濃度梯度的化合物GW9662和2-取代酰氨基二羧酸類化合物(DMSO終濃度為0.11％，化合物GW9662為陽性拮抗劑)。
4)β-半乳糖苷酶活性測定加藥后24小時，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基。加入Promega的細(xì)胞裂解緩沖液(200μl/孔)室溫30分鐘裂解細(xì)胞。取細(xì)胞裂解液(50μl/孔)于96孔板中，加入2×測活緩沖液，混勻，37攝氏度放置30分鐘。加入1M乙酸鈉(150μl/孔)終止反應(yīng)，混勻。讀取410nM波長的光吸收值。測得的β-半乳糖苷酶活性作為內(nèi)參。
5)報告基因熒光素酶活性的測定將Steady-Glu Luciferase Assay緩沖液和底物混勻加入96孔白色平底冷光檢測板中(100μl/孔)，然后加入細(xì)胞裂解液(100μl/孔)室溫反應(yīng)5分鐘。用全自動完全酶標(biāo)儀Teacon讀取熒光素酶催化底物的熒光強(qiáng)度。
(二)試驗(yàn)結(jié)果1.所用公式抑制率＝[(化合物+羅格列酮)報告基因活性-羅格列酮報告基因活性]/(DMSO報告基因活性-羅格列酮報告基因活性)×100％2.試驗(yàn)結(jié)果β-半乳糖苷酶活性為轉(zhuǎn)染效率評價的內(nèi)參。當(dāng)各孔的β-半乳糖苷酶活性在同一水平時，說明各孔質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率相近。這時可以忽略各孔轉(zhuǎn)染效率不同的影響，而各孔報告基因的活性就真實(shí)的反應(yīng)了該孔化合物的活性。試驗(yàn)結(jié)果表明2-取代酰氨基二羧酸類化合物能夠在哺乳動物細(xì)胞水平很好地抑制PPARγ激動劑羅格列酮(0.1μM)的激活活性；如圖七所示，用Origin軟件作圖得到2-取代酰氨基二羧酸類化合物的IC50為31.9μM。
權(quán)利要求
1.如下通式(I)結(jié)構(gòu)的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽 其中X，Y各自獨(dú)立地選自O(shè)，S，NHR1選自氫，芐基，乙?；?，叔丁氧酰基；當(dāng)X＝O時，R2＝R3，可選自氫，C1-C3直鏈或支鏈烴基，芐基，環(huán)己基，芳香基Ar，5-7元芳香雜環(huán)(含有1-3個選自氧、硫、氮的雜原子)；當(dāng)X＝NH時，R3＝H，R2可選自氫，C1-C3直鏈或支鏈烴基，芐基，環(huán)己基，芳香基Ar，5-7元芳香雜環(huán)(含有1-3個選自氧、硫、氮的雜原子)；當(dāng)X，Y為O時，Ar為 R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；?；m是0-3的整數(shù)，n是0-3的整數(shù)當(dāng)X為NH，Y為O時Ar為 R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4酰基；m是0-3的整數(shù)，n是0-3的整數(shù)2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型各自獨(dú)立的選R型或S型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于其中X，Y為O時，R1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為R型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于其中X是NH，Y是O時，R1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為R型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于其中X，Y為O時，R1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為S型。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于其中X是NH，Y是O時，R1，R2，R3，m和n的定義同前所述1一致，2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型均為S型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于當(dāng)式(IA)所示2-取代酰氨基二羧酸類化合物時， 其中，R2＝R3，可選自氫，C1-C3直鏈或支鏈烴基，芐基，環(huán)己基，芳香基Ar，5-7元芳香雜環(huán)(含有1-3個選自氧、硫、氮的雜原子)；R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；籱是0-3的整數(shù)，n是0-3的整數(shù)；2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型各自獨(dú)立的選R型或S型。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于當(dāng)式(IB)所示2-取代酰氨基二羧酸類化合物時， 其中，R2可選自氫，C1-C3直鏈或支鏈烴基，芐基，環(huán)己基，芳香基Ar，5-7元芳香雜環(huán)(含有1-3個選自氧、硫、氮的雜原子)；R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C6直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；籱是0-3的整數(shù)，n是0-3的整數(shù)；2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型各自獨(dú)立的選R型或S型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于當(dāng)式(IC)所示2-取代酰氨基二羧酸類化合物時， 其中R4，R5各自獨(dú)立自氫，鹵素，C1-C3直鏈或支鏈烴基，氰基，硝基，氨基，羥基，羥甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，C1-C4烷氧基，巰基，C1-C4?；?；m是0-3的整數(shù)，n是0-3的整數(shù)；2位和3’位手性碳原子的絕對構(gòu)型各自獨(dú)立的選R型或S型。
9.如權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法如下 IA類化合物的合成是以3-取代吲哚烷基氨基酸為原料，與BOC酸酐在二氧六環(huán)/水/四氫呋喃4∶4∶1V/V/V溶劑中，在無機(jī)堿存在下0～20℃反應(yīng)得分別經(jīng)叔丁氧?；?BOC)保護(hù)的化合物，酯活化，再在NMM，氯甲酸異丁酯，EtoAC或CH2Cl2或CH3Cl3低于10℃反應(yīng)得酯化合物，然后N-?；摫Ｗo(hù)基制得；Scheme 1α α(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H2O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，無機(jī)堿(如NaHCO3)，0-20℃(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸異丁酯，EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜0℃，CF3COOH；IB類化合物的合成是以取代苯烷基氨基酸為原料，分別經(jīng)叔丁氧?；?BOC)保護(hù)，酯活化，酯化，N-酰化，脫保護(hù)基制得；Scheme 2α α(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H2O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，無機(jī)堿(如NaHCO3)，0-20℃(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸異丁酯，EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(e)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜0℃，CF3CCOH；IC類化合物的合成是以2-取代萘烷基氨基酸為原料，分別經(jīng)叔丁氧?；?BOC)保護(hù)，酯活化，酯化，N-?；砘?，脫保護(hù)基制得； α(a)(i)BOC酸酐，dioxane/H2O/DMF(4∶4∶1，v/v/v)，無機(jī)堿(如NaHCO3)，0-20℃(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(b)NMM，氯甲酸異丁酯，EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(c)MeOH，SOCl2(或HCl)，20-40℃；(d)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜10℃；(e)(i)MeOH(或THF，或兩者混合液)，無機(jī)堿(如LiOH)(ii)無機(jī)酸(如HCl)；(f)EtOAc(或CH2Cl2或CHCl3)，＜0℃，CF3COOH
10.如權(quán)利要求1所述的2-取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途作為在制備預(yù)防、治療糖尿病、肥胖癥疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供具有如右通式(I)結(jié)構(gòu)的2－取代酰氨基二羧酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該類化合物與PPAR蛋白配體結(jié)構(gòu)域具有很高結(jié)合活性(K
文檔編號C07D209/14GK1789240SQ20041009318
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者沈旭, 蔣華良, 沈建華, 葉飛, 鄧光輝, 柳紅, 羅小民, 陳凱先 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所