專利名稱：一種磺化甾醇、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明提供了一種新的磺化甾醇、其制備方法的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甾醇是天然產(chǎn)物中普遍存在的一類化合物，但其中的磺化甾醇相對(duì)較少存在(Tetrahedron 2001，57，4091-4094；.J.Med.Chem.1994，37，793-797；.J.Org.Chem.1987，52(18)，3947-3951.；C.J.Org.Chem.1998，63，7382-7388.)。從海綿和海星中提純得到的幾種磺化甾醇類化合物Toxiusol具有抗HIV-1和HIV-2活性(J Med Chem，1994，37(6)，793-7)，該文中所有提及甾醇類化合物均顯示對(duì)HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性具有抑制作用，文獻(xiàn)還提到Toxiusol可發(fā)展成為潛在高特異性抗RT化合物，因?yàn)樗鼜?qiáng)烈抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性，而不抑制DNA聚合酶活性。
然而，到目前為止，還沒有報(bào)導(dǎo)公開過本發(fā)明的磺化甾醇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的磺化甾醇。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種該磺化甾醇的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種上述磺化甾醇的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種新的磺化甾醇，它被命名為Arenicolsterol A(海蚯蚓磺化甾醇A)，其分子式為C28H45O5SNa，熔點(diǎn)為169～171℃，分子量為517。其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
本發(fā)明Arenicolsterol A的結(jié)構(gòu)是通過核磁共振和高分辨電噴霧質(zhì)譜(HRESIMS)數(shù)據(jù)測(cè)定的。
HRESIMS給出的分子離子峰為m/z 539.7043([M+Na]，Δ-1.8mmu)。核磁共振具體數(shù)據(jù)見表1。核磁共振測(cè)得Arenicolsterol A分子量為516.7145。
表1.Arenicolsterol A的核磁共振數(shù)據(jù)


本發(fā)明還使用電噴霧質(zhì)譜(EIMS)和一維及二維核磁共振譜進(jìn)一步確定了其結(jié)構(gòu)。
ESIMS/MS給出m/z 142.9([NaHSO4+Na]+)的碎片離子，以及EIMS給出m/z396的碎片離子(正好對(duì)應(yīng)樣品分子失去NaHSO4后的部分)都進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明Arenicolsterol A分子式的正確性。此分子式含有六個(gè)不飽和度，包括四個(gè)環(huán)和兩個(gè)雙鍵。紅外波譜存在1246cm-1的強(qiáng)吸收帶，對(duì)應(yīng)于磺酸基團(tuán)的特征吸收峰。
Arenicolsterol A的平面結(jié)構(gòu)通過解析同核和異核二維核磁共振譜得以確立。一維氫核磁共振譜1HNMR含有兩個(gè)甲基單峰信號(hào)(δ0.73，0.93ppm)，四個(gè)甲基雙峰信號(hào)(δ0.98，0.84，0.82，0.84ppm)，一個(gè)氧次甲基信號(hào)(δ3.82ppm)和兩個(gè)三取代烯質(zhì)子信號(hào)(δ5.18，5.27ppm)。碳核磁共振譜(CNMR)中烯碳信號(hào)(δ175.3)的存在表明了磺酸鈉基團(tuán)OSO3Na是同烯碳相連的，這也解釋了沒有氧次甲基同磺酸鈉基團(tuán)OSO3Na相連，同時(shí)也解釋了三取代質(zhì)子(δ5.18ppm)具有的雙峰信號(hào)和三取代質(zhì)子(δ5.27ppm)具有的多重峰信號(hào)。具體結(jié)果可見圖2。
環(huán)A/B系統(tǒng)的排列由HMBC(異核多鍵相關(guān)譜)相關(guān)和COSY(同核位移相關(guān)譜)相關(guān)得以確立。HMBC相關(guān)為Me-19到C-1，C-5，C-9和C-10的相關(guān)以及H-7到C-8，C-9和C-14的相關(guān)；COSY相關(guān)為從H1α和H1β經(jīng)過H2α和H2β，H-3，H4α和H4β，H-5，H6α和H6β到H-7的依次兩兩相關(guān)。環(huán)C/D系統(tǒng)的排列也由HMBC相關(guān)和COSY相關(guān)確立。HMBC相關(guān)為Me-18到C-12，C-13，C-14和C-17，以及C-9到H-11和H-12；COSY相關(guān)為從H-14經(jīng)過H15α和H15β，H16α和H16β，H-17的依次兩兩相關(guān)。Δ7(8)雙鍵的位置由從H-7到C-8，C-9和C-14的HMBC相關(guān)得以證實(shí)。側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)仍由HMBC相關(guān)和COSY相關(guān)推得。COSY相關(guān)為H-20到H-17，H-21，H-22，和從H-25到H-24，Me-26與Me-27，以及Me-28到H-24的兩兩相關(guān)；HMBC相關(guān)為從C-23到H-22和H-24的相關(guān)。
Arenicolsterol A的相對(duì)立體化學(xué)通過NOESY(二維偶極偶合相關(guān)譜)相關(guān)數(shù)據(jù)得以確立，如圖3所示。通過從Me-19到H-4β和H-6β的NOE相關(guān)可以確立環(huán)A/B的反式連接排列；而從Me-18到H-11β和H-15β且不到H-12的NOE相關(guān)可知C/D環(huán)系統(tǒng)也是反式連接。羥基的相對(duì)立體化學(xué)被確定為3β位是由于H-4α和H-3之間存在NOE相關(guān)。側(cè)鏈的相對(duì)立體化學(xué)根據(jù)NOESY數(shù)據(jù)被推得為20R和24S構(gòu)型，這同stellasterol的情況也是一致的(J.Med.Chem.1994，37，793-797)。Stellasterol的結(jié)構(gòu)見圖4。
本發(fā)明還提供了Arenicolsterol A的一種制備方法，該方法包括(1)將沙蠋屬無(wú)脊椎動(dòng)物組織干燥后用極性有機(jī)溶劑浸泡提??；(2)將(1)得到的提取物真空干燥后分散在水中；(3)將(2)的產(chǎn)物先后用C3-C6的酯和C3-C7的醇萃取；(4)將上述C3-C7的醇溶解部分進(jìn)行液相色譜分離；(5)將(4)的產(chǎn)物重結(jié)晶，得到權(quán)利要求1所述的磺化甾醇。
本發(fā)明中使用的沙蠋屬無(wú)脊椎動(dòng)物是可以是海蚯蚓。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用了采集自中國(guó)大陸東海岸的海蚯蚓(Arenicola cristata)。
本發(fā)明中用于浸泡沙蠋屬無(wú)脊椎動(dòng)物組織的有機(jī)溶劑是沸點(diǎn)為40-80℃的極性有機(jī)溶劑，可在室溫下?lián)]發(fā)且不影響Arenicolsterol A分子結(jié)構(gòu)?？刹捎玫挠袡C(jī)溶劑如乙醇及其水溶液等。有機(jī)溶劑/水溶液的濃度視具體實(shí)驗(yàn)條件而定。以乙醇水溶液為例，濃度較適宜采用60％-95％，更好的采用75-85％。
本發(fā)明中通過制備方法步驟(1)得到的提取物是無(wú)色玻璃態(tài)固體。
本發(fā)明中制備方法步驟(2)中用于分散提取物的水可以采用蒸餾水、雙蒸水、三蒸水等。使用的水越不純，對(duì)后續(xù)的純化步驟要求越高。本發(fā)明專利的一個(gè)實(shí)施例中采用去離子水。
本發(fā)明中使用的本發(fā)明中使用的C3-C6的酯和C3-C7的醇用于初步分離Arenicolsterol A與動(dòng)物組織提取物中的其他成分，以去除動(dòng)物組織提取物中的大部分雜質(zhì)。C3-C6的酯可采用甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸丁酯等，C3-C7的醇可采用丙醇、丁醇或戊醇等。
本發(fā)明中使用的液相色譜可采用硅膠色譜、凝膠色譜和高效液相色譜等。
本發(fā)明中硅膠色譜的使用是為了將提取物中各組分按極性進(jìn)行分離?？墒褂脙?nèi)徑為4厘米-8厘米的硅膠柱，并用體積比為20∶1的氯代甲烷/甲醇逐級(jí)添加甲醇到100％甲醇進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫。
本發(fā)明中凝膠色譜是為了進(jìn)一步純化樣品，可以采用葡萄糖凝膠色譜，以體積比為7∶6-7∶1的氯代甲烷/甲醇作為流動(dòng)相。
本發(fā)明采用高效液相色譜作最后的純化處理，以體積比為5∶4-10∶3的甲醇水溶液作為高效液相色譜流動(dòng)相。通過多次反復(fù)分離后得到純的Arenicolsterol A。
本發(fā)明還提供了一種磺化甾醇Arenicolsterol A的應(yīng)用，即將該磺化甾醇用于制備抑制腫瘤的藥物。
細(xì)胞毒模型的藥理學(xué)研究結(jié)果表明，本發(fā)明的Arenicolsterol A具有很好的抗腫瘤生物活性，將其制成藥物，將為癌癥的預(yù)防和治療提供一種新的途徑。


圖1是Arenicolsterol A的分子結(jié)構(gòu)式。
圖2是Arenicolsterol A分子結(jié)構(gòu)中的重要HMBC相關(guān)圖。一維氫核磁共振譜1HNMR含有兩個(gè)甲基單峰信號(hào)(δ0.73，0.93ppm)，四個(gè)甲基雙峰信號(hào)(δ0.98，0.84，0.82，0.84ppm)，一個(gè)氧次甲基信號(hào)(δ3.82ppm)和兩個(gè)三取代烯質(zhì)子信號(hào)(δ5.18，5.27ppm)。碳核磁共振譜13CNMR中烯碳信號(hào)(δ175.3)的存在表明了磺酸鈉基團(tuán)OSO3Na是同烯碳相連的，這也解釋了沒有氧次甲基同磺酸鈉基團(tuán)OSO3Na相連，同時(shí)也解釋了三取代質(zhì)子(δ5.18ppm)具有的雙峰信號(hào)和三取代質(zhì)子(δ5.27ppm)具有的多重峰信號(hào)。
環(huán)A/B系統(tǒng)的排列由HMBC相關(guān)和COSY相關(guān)得以確立。HMBC相關(guān)為Me-19到C-1，C-5，C-9和C-10的相關(guān)以及H-7到C-8，C-9和C-14的相關(guān)；COSY相關(guān)為從H1α和H1β經(jīng)過H2α和H2β，H-3，H4α和H4β，H-5，H6α和H6β到H-7的依次兩兩相關(guān)。環(huán)C/D系統(tǒng)的排列也由HMBC相關(guān)和COSY相關(guān)確立。HMBC相關(guān)為Me-18到C-12，C-13，C-14和C-17，以及C-9到H-11和H-12；COSY相關(guān)為從H-14經(jīng)過H15α和H15β，H16α和H16β，H-17的依次兩兩相關(guān)。Δ7(8)雙鍵的位置由從H-7到C-8，C-9和C-14的HMBC相關(guān)得以證實(shí)。側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)仍由HMBC相關(guān)和COSY相關(guān)推得。COSY相關(guān)為H-20到H-17，H-21，H-22，和從H-25到H-24，Me-26與Me-27，以及Me-28到H-24的兩兩相關(guān)；HMBC相關(guān)為從C-23到H-22和H-24的相關(guān)。
圖3是Arenicolsterol A的分子結(jié)構(gòu)中的NOESY相關(guān)圖。通過從Me-19到H-4β和H-6β的NOE相關(guān)可以確立環(huán)A/B的反式連接排列；而從Me-18到H-11β和H-15β且不到H-12的NOE相關(guān)可知C/D環(huán)系統(tǒng)也是反式連接。羥基的相對(duì)立體化學(xué)被確定為3β位是由于H-4α和H-3之間存在NOE相關(guān)。側(cè)鏈的相對(duì)立體化學(xué)根據(jù)NOESY數(shù)據(jù)被推得為20R和24S構(gòu)型，這同stellasterol的情況也是一致的。
圖4是Stellasterol的分子結(jié)構(gòu)式。
圖5 Arenicolsterol A對(duì)子宮頸癌細(xì)胞(Hela)和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-h6)的生長(zhǎng)抑制作用圖。人肺成纖維細(xì)胞(929)為對(duì)照。MTT方法檢測(cè)表明，不同濃度的Arenicolsterol A對(duì)癌細(xì)胞均有一定的抑制作用。濃度達(dá)8μg/ml時(shí)，對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率為98.44％，對(duì)NCI-h6細(xì)胞的抑制率為51.8％，對(duì)929細(xì)胞的抑制率為66.4％(圖5)。
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。文中所用比例均為體積比。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一磺化甾醇的制備(1)原材料以海蚯蚓Arenicola cristata為原料，于2002年冬季在位于中國(guó)浙江省東海岸的舟山島沙灘上采集而得。樣品采集后立即冷凍保存。
(2)樣品的分離和純化在化合物的分離和純化過程中使用的所有溶劑在用前均已重蒸。所有核磁共振實(shí)驗(yàn)均在Varian-Inova-400MHz核磁共振儀上進(jìn)行，應(yīng)用DEPT實(shí)驗(yàn)測(cè)定碳的多重性。電噴霧質(zhì)譜(ESIMS)數(shù)據(jù)在Q-TOF micro YA019質(zhì)譜儀上獲得。EI數(shù)據(jù)在Agilent 5973N MSD型質(zhì)譜儀上獲得。旋光度數(shù)據(jù)在波長(zhǎng)為589nm下在Rudulph Autopol III型的旋光儀上測(cè)的。紅外波譜記錄在Nicolet Impact 420型傅利葉變換紅外波譜儀上。
烘干的海蚯蚓樣品(干重5000g)切碎后用85％的乙醇水溶液提取，得到500g的有機(jī)提取物的乙醇濃縮液，然后分散在1升水中，先后用乙酸乙脂和正丁醇萃取。正丁醇層溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空下抽干后加樣到內(nèi)徑為8cm的硅膠柱上進(jìn)行色譜分離，采用從9∶1 CH3Cl/MeOH到MeOH的連續(xù)梯度洗脫。其中的6∶4CH3Cl/MeOH洗脫液在真空下濃縮后加樣到Sephadex LH20凝膠柱((Pharmacia，2.5cm×200cm，流速5mL/min)上，以6∶4 CH3Cl/MeOH為流動(dòng)相進(jìn)行凝膠色譜分離，獲得13個(gè)分離片斷。我們對(duì)最后一個(gè)分離片斷進(jìn)行高效液相色譜分離，色譜柱采用Supelco C-18 HPLC柱(4.5mm×250mm)，流動(dòng)相為7∶3 MeOH/H2O體系。經(jīng)過多次反復(fù)分離后得到純的Arenicolsterol A(16mg)。
所得Arenicolsterol A的特征為無(wú)色玻璃態(tài)固體；[α]D＝+7.8°(c 0.28，MeOH)；熔點(diǎn)169~171℃。UV(MeOH)250nm；IR(KBr)3488，2952，2871，1643，1246cm-1；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)參見表1；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)參見表1；HRESIMS m/z 539.7043[M+Na].
實(shí)施例二Arenicolsterol A對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-h6)、子宮頸癌細(xì)胞系(Hela)和正常的人肺成纖維細(xì)胞系(929)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。所有的細(xì)胞系均培養(yǎng)在Dulbecco修正的Eagle培養(yǎng)液(含有1％的非基本氨基酸和10％的小牛血清)中，培養(yǎng)環(huán)境是在37℃下潮濕的5％的二氧化碳?xì)夥铡?br> 兩千個(gè)NCI-h6細(xì)胞、Hela細(xì)胞或人肺成纖維細(xì)胞接種在96孔平底板中。第二天，在培養(yǎng)板中加入不同濃度的Arenicolsterol A，每一濃度下的平行樣為三個(gè)，然后將培養(yǎng)板置入具有37℃下潮濕的5％的二氧化碳?xì)夥盏暮銣嘏囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)48個(gè)小時(shí)。此后，棄去殘余培養(yǎng)液并加入100μL的MTT溶液(MTT購(gòu)自Sigma公司，500μg溶解在1倍的Dulbecco修正的Eagle培養(yǎng)液中)，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)四個(gè)小時(shí)。再棄去培養(yǎng)液并加入150μL DMSO的PBS溶液。在室溫下溫和振搖10min后由酶標(biāo)儀(Bio-Rad)在波長(zhǎng)570nm下記錄吸光度。每一次做三個(gè)平行試驗(yàn)并重復(fù)三次。為了更好地分析樣品的細(xì)胞毒活性，我們也利用顯微成像系統(tǒng)拍攝了不同濃度下的細(xì)胞照片，顯微成像系統(tǒng)由Sony電視監(jiān)視器、CCD彩色數(shù)碼照相機(jī)(Sony DXC-93 OP)和Leica DMR顯微鏡。
MTT方法檢測(cè)表明，不同濃度的Arenicolsterol A對(duì)癌細(xì)胞均有一定的抑制作用。濃度達(dá)8μg/mL時(shí)，對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率為98.44％，對(duì)NCI-h6細(xì)胞的抑制率為51.8％，對(duì)929細(xì)胞的抑制率為66.4％(圖5)。計(jì)算ArenicolsterolA對(duì)Hela、NCI-h6和929細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50)分別為3.1±0.6μg/ml，7.6±0.8μg/ml和5.6±0.5μg/ml。相似結(jié)果由兩次三組平行樣的獨(dú)立試驗(yàn)獲得(結(jié)果見表2)。
表2 Arenicolsterol A對(duì)Hela干細(xì)胞集落形成的影響(以929細(xì)胞系為對(duì)照細(xì)胞)

權(quán)利要求
1.一種磺化甾醇，其特征在于，它的分子式為C28H45O5SNa，分子量為516.7145，結(jié)構(gòu)為
2.一種如權(quán)利要求1所述磺化甾醇的制備方法，其特征在于，該方法包括(1)將沙蠋屬無(wú)脊椎動(dòng)物組織干燥后用使用極性有機(jī)溶劑浸泡提??；(2)將(1)得到的提取物真空干燥后分散在水中；(3)將(2)的產(chǎn)物先后用C3-C6的酯和C3-C7的醇萃??；(4)將上述C3-C7的醇溶解部分進(jìn)行液相色譜分離；(5)將(4)的產(chǎn)物重結(jié)晶，得到權(quán)利要求1所述的磺化甾醇。
3.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，該方法中(1)中使用的沙蠋屬無(wú)脊椎動(dòng)物是海蚯蚓。
4.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，該方法中(1)中使用的有機(jī)溶劑是沸點(diǎn)為40-80℃的極性有機(jī)溶劑。
5.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，該方法中(2)中使用的水為去離子水。
6.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，該方法中(3)中使用的C3-C6的酯是甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸丁酯。
7.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，該方法中(4)中使用的液相色譜包括硅膠色譜、凝膠色譜或高效液相色譜。
8.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，該方法中(3)中使用的C3-C7的醇是丙醇、丁醇或戊醇。
9.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，該方法中硅膠色譜使用內(nèi)徑為4厘米-8厘米的硅膠柱，并用體積比為20∶1的氯代甲烷/甲醇逐級(jí)添加甲醇到100％甲醇進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫。
10.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，該方法中凝膠色譜為葡萄糖凝膠色譜，以體積比為7∶6-7∶1的氯代甲烷/甲醇作為流動(dòng)相。
11.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，該方法中以體積比為5∶4-10∶3的甲醇水溶液作為高效液相色譜流動(dòng)相。
12.一種權(quán)利要求1或2所述磺化甾醇的應(yīng)用，其特征在于，將該磺化甾醇用于制備抑制腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明提供了一種新的磺化甾醇、其制備方法和應(yīng)用。更具體的說，本發(fā)明提供了磺化甾醇Arenicolsterol A，并通過質(zhì)譜、核磁共振譜和紅外波譜等多種波譜的測(cè)定確定了它的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了Arenicolsterol A的一種制備方法。細(xì)胞毒模型的藥理學(xué)研究結(jié)果表明，Arenicolsterol A具有很好的抗腫瘤生物活性，將其制成藥物，將為癌癥的預(yù)防和治療提供一種新的途徑。
文檔編號(hào)C07J9/00GK1660885SQ20041009346
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者孔繼烈, 沈先榮, 陳彬 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)