專利名稱：堿性磷酸酶標(biāo)記游離甲狀腺激素的合成工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)中的堿性磷酸酶標(biāo)記游離甲狀腺激素的合成工藝。
背景技術(shù)：
甲狀腺激素包括甲狀腺素(Thyroxine，T4)和三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)，它們?cè)谘獫{中絕大部分以蛋白結(jié)合形式存在，只有不超過0.2％的比例以游離甲狀腺素(Free Thyroxine，F(xiàn)T4)和游離三碘甲腺原氨酸(Free Triiodothyronine，F(xiàn)T3)形式存在，但是只有游離的形式才有生理活性，因而游離三碘甲腺原氨酸(FT3)和游離甲狀腺激素(FT4)是診斷甲狀腺疾病的重要指標(biāo)。
目前常用的放射免疫分析(RIA)是用125I標(biāo)記類似物來實(shí)現(xiàn)的，其合成工藝復(fù)雜、有效期短，對(duì)環(huán)境有一定污染，影響檢測結(jié)果的因素較多。近10余年來化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CLIA)的研究取得了突破性進(jìn)展，無論是靈敏度、簡便快速和自動(dòng)化程度等多項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均達(dá)到或超過RIA水平，特別是標(biāo)記物的穩(wěn)定性和不污染環(huán)境是RIA無可比擬的。目前國內(nèi)大中型醫(yī)院均進(jìn)口了CLIA全自動(dòng)分析系統(tǒng)。但儀器和試劑價(jià)格昂貴，特別是試劑盒中堿性磷酸酶(Apase)的標(biāo)記工藝是國外廠家高度保密的專有技術(shù)，截止目前，國內(nèi)外尚未見此工藝的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡便易行的以堿性磷酸酶聚合體標(biāo)記游離甲狀腺激素的合成工藝，其合成的堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素結(jié)合物是化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測游離甲狀腺激素試劑盒的關(guān)鍵組分。
本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，依照游離甲狀腺激素的分子結(jié)構(gòu)及堿性磷酸酶的理化特性，對(duì)堿性磷酸酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造，并與游離甲狀腺激素偶聯(lián)以制備標(biāo)記抗原，研制出一種簡便易行的合成工藝。
具體地說，本發(fā)明堿性磷酸酶標(biāo)記游離甲狀腺激素的合成工藝，包括將堿性磷酸酶聚合體與游離甲狀腺激素反應(yīng)生成堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素結(jié)合物。
其中，所述的堿性磷酸酶聚合體與游離甲狀腺激素反應(yīng)為偶聯(lián)反應(yīng)。
所述偶聯(lián)反應(yīng)為堿性磷酸酶聚合體和游離甲狀腺激素在偶聯(lián)劑存在下的反應(yīng)，例如堿性磷酸酶聚合體和游離甲狀腺激素混合后，在pH 6～8的溶液中滴加偶聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)。
在所述偶聯(lián)反應(yīng)中，各反應(yīng)物及偶聯(lián)劑的用量可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的用量。堿性磷酸酶聚合體和游離甲狀腺激素的用量也可以是堿性磷酸酶聚合體游離甲狀腺激素為1nmol∶2～10nmol的比例。偶聯(lián)劑用量可以是按照每1nmol的堿性磷酸酶聚合體用20～50μL的偶聯(lián)劑。反應(yīng)介質(zhì)可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的介質(zhì)，例如pH 6～8的生理鹽水。
所述堿性磷酸酶聚合體和游離甲狀腺激素混合，可以是先準(zhǔn)備堿性磷酸酶聚合體的生理鹽水溶液，再加入游離甲狀腺激素，混合；反之也可。
所述偶聯(lián)反應(yīng)可以是取堿性磷酸酶聚合體裝入透析袋中，用生理鹽水透析6～8小時(shí)，中間換液1次，取堿性磷酸酶聚合體2nmol加生理鹽水至1000μL，加入5～20nmol游離甲狀腺激素100μL，充分混合，向混合液中逐滴加入40～100μL偶聯(lián)劑，室溫反應(yīng)2～4小時(shí)。
所述的偶聯(lián)劑可以是本領(lǐng)域的常規(guī)或已知的偶聯(lián)劑，例如戊二醛。
本發(fā)明合成工藝還包括從反應(yīng)體系中分離產(chǎn)物，所述從反應(yīng)體系中分離產(chǎn)物的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的分離方法，例如采用葡聚糖凝膠柱分離法分離產(chǎn)物。
所述采用葡聚糖凝膠柱分離法分離產(chǎn)物的條件可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的，例如將反應(yīng)液加入預(yù)先用pH 6～8的緩沖液平衡后的SephadexG100柱中，用pH 6～8的緩沖液淋洗，流速0.1～0.4ml/min，收集淋洗液，選擇紫外280nm的第二個(gè)吸收峰的淋洗液，即為所需的產(chǎn)物。
所述的堿性磷酸酶聚合體是用堿性磷酸酶通過偶聯(lián)反應(yīng)生成4～6個(gè)分子的聚合體，也可采用市售產(chǎn)品。
所述堿性磷酸酶聚合體可以通過本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法制備。所述堿性磷酸酶聚合體可采用如下方法制備將偶聯(lián)劑按每毫克堿性磷酸酶加20～50μL偶聯(lián)劑的比例逐滴加入pH6～8堿性磷酸酶溶液中進(jìn)行反應(yīng)，然后將反應(yīng)液用葡聚糖凝膠柱分離法從反應(yīng)體系中分離出堿性磷酸酶聚合體。
更優(yōu)選的，所述堿性磷酸酶聚合體采用如下方法制備取堿性磷酸酶經(jīng)生理鹽水透析18～24小時(shí)后，按每毫克堿性磷酸酶加20～50μL偶聯(lián)劑的比例逐滴加入，室溫反應(yīng)1～2小時(shí)后，用生理鹽水4℃透析18～24小時(shí)，中間換液1～3次，然后將反應(yīng)液加入預(yù)先用pH 6～8的緩沖液平衡后的Sephadex G100柱中，用pH 6～8的緩沖液淋洗，流速0.1～0.4ml/min，收集淋洗液，取紫外280nm的吸收峰的中間部分且分子量為30～60萬Da的堿性磷酸酶聚合物液。
所述的偶聯(lián)劑是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的偶聯(lián)劑，優(yōu)選為戊二醛。
本發(fā)明堿性磷酸酶聚合體標(biāo)記游離甲狀腺激素合成工藝最佳的技術(shù)方案，包括以下步驟(一)堿性磷酸酶聚合體的制備取堿性磷酸酶經(jīng)生理鹽水透析18～20小時(shí)，加生理鹽水至5mg/mL，按每毫克堿性磷酸酶加20～50μL偶聯(lián)劑的比例逐滴加入偶聯(lián)劑，室溫反應(yīng)1～2小時(shí)后，將反應(yīng)液裝入直徑8mm的透析袋中，用生理鹽水4℃透析18～20小時(shí)，中間換液2次，將反應(yīng)液加入預(yù)先用pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液(PBS)平衡的Sephadex G100柱中，用pH 7.0 PBS淋洗，流速0.2ml/min，將淋洗液分管收集，取紫外280nm的吸收峰的中間部分且分子量為30～60萬Da的堿性磷酸酶聚合物液，加入等量丙三醇，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素的制備(1)取上述制備的堿性磷酸酶聚合體裝入透析袋中，用生理鹽水透析6～8小時(shí)，中間換液1次，取堿性磷酸酶聚合體2nmol加生理鹽水至1000μL，加入5～20nmol游離甲狀腺激素100μL，充分混合，向混合液中逐滴加入40～100μL偶聯(lián)劑，室溫反應(yīng)2～4小時(shí)；(2)將反應(yīng)液加入預(yù)先用pH 7.5 Tris-HCl緩沖液平衡后的SephadexG100柱中，用pH 7.5 Tris-HCl緩沖液淋洗，流速0.2ml/min，收集淋洗液，選擇紫外280nm的第二個(gè)吸收峰峰值的淋洗液；(3)將選出的淋洗液轉(zhuǎn)入干凈的玻璃瓶中，分別加入MgCl2和ZnCl2使其濃度為2mmol/L和0.2mmol/L，再加入NaN3和牛血清蛋白(BSA)使其濃度為0.1％和10mg/mL，待充分溶解后加入等量丙三醇，充分混勻后分裝，4℃保存。
上述工藝步驟中，所述的偶聯(lián)劑優(yōu)選均為戊二醛。所述的反應(yīng)體系優(yōu)選為pH 7.5的生理鹽水。
所述的堿性磷酸酶可以采用市售產(chǎn)品，例如sigma公司的產(chǎn)品P5521。其他使用的試劑如偶聯(lián)劑和儀器也均為市售產(chǎn)品。
本發(fā)明方法解決了一直困擾化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域中檢測游離甲狀腺激素試劑盒的關(guān)鍵組分堿性磷酸酶標(biāo)記物難以制備的難題。采用本發(fā)明方法制備堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素結(jié)合物簡便易行、成本低廉，且堿性磷酸酶通過交聯(lián)劑與靶分子相連，其活性損失小。
具體實(shí)施例方式
下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征所作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1堿性磷酸酶聚合體的制備(1)取堿性磷酸酶5mg(sigma產(chǎn)品P5521)經(jīng)生理鹽水透析20小時(shí)，加生理鹽水至1.0ml，逐滴加入150μL偶聯(lián)劑戊二醛，室溫反應(yīng)1小時(shí)后，裝入直徑8mm透析袋中，用生理鹽水4℃透析18小時(shí)，中間換液2次。將反應(yīng)液加入預(yù)先用20mmol/L pH 7.0 PBS平衡的1.0×35cm SephadexG100柱中，用20mmol/L pH 7.0 PBS淋洗，流速0.2ml/min，每0.5mL收集1管，共收集約20管，用紫外280nm檢測各管，將280nm的吸收峰分為3個(gè)部分，分別在紫外分光光度計(jì)上測OD值，計(jì)算出3部分各自的蛋白質(zhì)量，每部分加等量AR級(jí)丙三醇，4℃保存。
(2)取經(jīng)柱分離的3個(gè)部分各200μg的酶聚合物液，在AmershamBiosciences SE400標(biāo)準(zhǔn)垂直凝膠電泳系統(tǒng)用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白作對(duì)照測定3個(gè)部分的酶聚合物分子量。測得第一部分的分子量平均＞60萬Da，第二部分的分子量約30～60萬Da，第三部分的分子量約＜30萬Da。其聚合物分別是6～8聚合體、4～6聚合體和2～4聚合體，將第二部分的液體保留，即為可供標(biāo)記的堿性磷酸酶聚合物。
實(shí)施例2-3堿性磷酸酶聚合體的制備按照實(shí)施1的方法制備堿性磷酸酶聚合體，只是加入偶聯(lián)劑戊二醛為100μL、250μL，室溫反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，淋洗流速為0.1ml/min、0.4ml/min。
實(shí)施例4堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素的制備(1)取實(shí)施例1所得堿性磷酸酶聚合體1mg(即2nmol)裝入透析袋中，對(duì)生理鹽水透析6小時(shí)，中間換液一次，加生理鹽水至1000μL，加入10nmol游離甲狀腺激素100μL，充分混合，向混合液中逐滴加入60μL偶聯(lián)劑戊二醛，室溫反應(yīng)2.5小時(shí)；(2)將反應(yīng)液加入預(yù)先用0.1mol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液平衡后的1.0×35cm Sephadex G100柱中，用0.1mol/LpH 7.5 Tris-HCl緩沖液淋洗，流速0.2ml/min，收集淋洗液每0.5mL1管，選擇紫外280nm的第二個(gè)吸收峰的峰值淋洗液；(3)將收集的淋洗液轉(zhuǎn)入干凈的玻璃瓶中，分別加入MgCl2和ZnCl2使其濃度為2mmol/L和0.2mmol/L，再加入NaN3和牛血清蛋白(BSA)使其濃度分別為0.1％和10mg/mL，充分溶解后加入等量丙三醇，充分混勻后分裝100μL/支，密封放4℃保存。
實(shí)施例5-7堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素的制備按照實(shí)施4的方法制備堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素，只是加入5nmol、15nmol、20nmol游離甲狀腺激素，加入偶聯(lián)劑戊二醛為40μL、80μL、100μL，室溫反應(yīng)2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)。
實(shí)施例8堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素結(jié)合物應(yīng)用試驗(yàn)將實(shí)施例4合成的堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素結(jié)合物(Apase-FT3，Apase-FT4)和意大利的ADALTIS公司的Apase-FT3和Apase-FT4結(jié)合物分別應(yīng)用于FT3和FT4化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒中進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)比結(jié)果見表1表1試劑盒的質(zhì)量參數(shù)對(duì)比結(jié)果

分別對(duì)216例血清樣品同時(shí)進(jìn)行檢測，結(jié)果如下表2所示表2血清樣品檢測結(jié)果

從以上的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出本工藝合成的堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素結(jié)合物與國外的同類產(chǎn)品應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒中，無論是試劑盒的質(zhì)量參數(shù)還是檢測臨床血清樣品的結(jié)果都十分接近，達(dá)到優(yōu)良效果，本發(fā)明的堿性磷酸酶標(biāo)記游離甲狀腺激素合成新工藝具有很好適用性和先進(jìn)性。
權(quán)利要求
1.一種堿性磷酸酶標(biāo)記游離甲狀腺激素的合成工藝，其特征在于該工藝包括堿性磷酸酶聚合體與游離甲狀腺激素通過偶聯(lián)反應(yīng)生成堿性磷酸酶聚合體-游離甲狀腺激素結(jié)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成工藝，其特征在于所述偶聯(lián)反應(yīng)為堿性磷酸酶聚合體和游離甲狀腺激素混合后，在pH6～8的溶液中滴加偶聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成工藝，其特征在于所述偶聯(lián)反應(yīng)中堿性磷酸酶聚合體和游離甲狀腺激素的比例為堿性磷酸酶聚合體∶游離甲狀腺激素為1nmol∶2～10nmol，偶聯(lián)劑用量為每nmol的堿性磷酸酶聚合體用20～50μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成工藝，其特征在于所述偶聯(lián)反應(yīng)為取堿性磷酸酶聚合體裝入透析袋中，用生理鹽水透析6～8小時(shí)，中間換液1次，取堿性磷酸酶聚合體2nmol加生理鹽水至1000μL，加入5～20nmol游離甲狀腺激素100μL，充分混合，向混合液中逐滴加入40～100μL戊二醛，室溫反應(yīng)2～4小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成工藝，其特征在于還包括用葡聚糖凝膠柱分離法從反應(yīng)體系中分離產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的合成工藝，其特征在于所述葡聚糖凝膠柱分離法分離產(chǎn)物是將反應(yīng)液加入預(yù)先用pH6～8的緩沖液平衡后的Sephadex G100柱中，用pH6～8的緩沖液淋洗，流速0.1～0.4ml/min，收集淋洗液，選擇紫外280nm的第二個(gè)吸收峰的淋洗液為所需的產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的任一合成工藝，其特征在于所述堿性磷酸酶聚合體是用堿性磷酸酶通過偶聯(lián)反應(yīng)生成4～6個(gè)分子的聚合體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成工藝，其特征在于所述堿性磷酸酶聚合體采用如下方法制得將偶聯(lián)劑按每毫克堿性磷酸酶加20～50μL偶聯(lián)劑的比例加入pH6～8的堿性磷酸酶溶液中進(jìn)行反應(yīng)，然后將反應(yīng)液用葡聚糖凝膠柱分離法從反應(yīng)體系中分離出堿性磷酸酶聚合體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成工藝，其特征在于所述堿性磷酸酶聚合體采用如下方法制得取堿性磷酸酶經(jīng)生理鹽水透析18～24小時(shí)，按每毫克堿性磷酸酶加20～50μL偶聯(lián)劑的比例逐滴加入戊二醛，室溫反應(yīng)1～2小時(shí)后，用生理鹽水4℃透析18～24小時(shí)，中間換液1～3次，然后將反應(yīng)液加入預(yù)先用pH6～8的緩沖液平衡后的Sephadex G100柱中，用pH6～8的緩沖液淋洗，流速0.1～0.4ml/min，收集淋洗液，取紫外280nm的吸收峰的中間部分且分子量為30～60萬Da的堿性磷酸酶聚合物液。
10.根據(jù)權(quán)利要求3、8之任一所述的合成工藝，其特征在于所述偶聯(lián)劑為戊二醛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種堿性磷酸酶標(biāo)記游離甲狀腺激素的合成工藝。它是通過對(duì)堿性磷酸酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使之與游離甲狀腺激素偶聯(lián)以制備標(biāo)記抗原，本發(fā)明工藝簡便易行、成本低廉，它解決了一直困擾化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域中檢測游離甲狀腺激素試劑盒的關(guān)鍵組分堿性磷酸酶標(biāo)記物難以制備的難題。
文檔編號(hào)C07K14/575GK1683407SQ200410097170
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月17日
發(fā)明者胡國茂, 李振甲, 馬世俊 申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司, 北京北免東雅生物技術(shù)研究所