專利名稱：化學(xué)修飾的白細(xì)胞介素偶聯(lián)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了化學(xué)修飾的白細(xì)胞介素偶聯(lián)物，用以改善蛋白自身的物理化學(xué)性質(zhì)。特別是，本發(fā)明提供了一種聚乙二醇丙酸活性酯修飾白細(xì)胞介素2生成的偶聯(lián)物。
背景技術(shù)：
Morgan等發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有一種刺激胸腺細(xì)胞生長的因子，稱為T細(xì)胞生長因子(T cell growth factor)，1979年統(tǒng)一命名為白細(xì)胞介素2(interleukin2，IL-2)。IL-2主要由T細(xì)胞或T細(xì)胞系產(chǎn)生，目前應(yīng)用基因工程技術(shù)所制備和純化的IL-2已用于臨床治療某些腫瘤和其它疾病。
IL-2的分子結(jié)構(gòu)和基因人IL-2含有133氨基酸殘基，分子量為15.5kDa。天然IL-2在N端含有糖基，但糖基對IL-2的生物學(xué)活性無明顯影響，等電點在6.6～8.2。IL-2分子含有3個半胱氨酸，分別位于第58、105和125位氨基酸，其中58位與105位半胱氨酸之間所形成的鏈內(nèi)二硫鍵對于保持IL-2生物學(xué)活性起重要作用。在IL-2基因產(chǎn)物的提純和復(fù)性過程中，如二硫鍵配錯或分子間形成二硫鍵都會降低IL-2的活性。現(xiàn)已有應(yīng)用點突變，將第125號位半胱氨酸突變?yōu)榱涟彼峄蚪z氨基，使只能形成一種二硫鍵，保證了在IL-2復(fù)性過程的活性。還有報道用蛋白工程技術(shù)生產(chǎn)新型rIL-2，將IL-2分子第125位半胱氨酸改為丙氨酸，改構(gòu)后IL-2比活性比天然IL-2明顯增加。人IL-2基因定位于第4號染色體，長約5kb，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。人和小鼠IL-2基因DNA序列有63％同源性。
多數(shù)天然的或重組的蛋白質(zhì)藥物，在擁有良好臨床應(yīng)用前景的同時，也存在諸如免疫反應(yīng)、水不溶性、體內(nèi)半衰期短等缺點，使藥物在機(jī)體內(nèi)很難達(dá)到有效的治療濃度。然而，這些缺陷是可以在一定程度上得到解決的。其方法是，將蛋白分子表面共價結(jié)合上一定數(shù)量的水溶性多聚物。例如，使用聚乙二醇共價修飾蛋白質(zhì)分子，可以達(dá)到以上多種目的。Davis.等人在美國專利US4179337中提到用聚乙二醇與胰島素結(jié)合，其偶聯(lián)物表現(xiàn)出較低的免疫原性和較高的體內(nèi)活性；同時，還提到了一種制備該偶聯(lián)物的方法。Kater等人在美國專利US4766106中公開了多種高聚物修飾的水溶性蛋白分子，特別是白細(xì)胞介素2、干擾素β和免疫毒素而聚乙二醇通過戊二酰基與蛋白連接。其偶合物與原蛋白分子相比，減少了免疫原性，提高了血漿藥物濃度。Nishimura的歐洲專利申請EP154316，Tomasi的PCT/US85/02572，Nitecki的US4902502使用聚乙二醇碳酸酯修飾蛋白和Katre的US5206344使用聚乙二醇對甲基苯磺酸酯修飾蛋白，公開了類似的蛋白偶合物。
聚合物與蛋白的偶聯(lián)方法，在該技術(shù)中起重要作用。不同的偶聯(lián)方法會在特異性、方便可行性和產(chǎn)物穩(wěn)定性等方面具有各自的特點。本發(fā)明提供的偶聯(lián)物及其制備方法與上述公開文獻(xiàn)不同，同時具有以上三方面的優(yōu)勢。與未偶聯(lián)的白細(xì)胞介素2(IL-2)相比，偶聯(lián)物增加了水溶性，因此更加容易做成制劑，而且延長了體內(nèi)半衰期，增加了藥物體內(nèi)活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種聚乙二醇與白細(xì)胞介素2(IL-2)的偶聯(lián)物。
本發(fā)明提供一種化學(xué)修飾的IL-2偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)如I式所示 其中，R表示C1～4烷烴端基，m表示1～10之間的任一整數(shù)，IL-2表示天然IL-2、基因重組IL-2或同樣具有天然IL-2功能的基因突變產(chǎn)物。
其中所述R表示C1～4烷烴端基為甲基、乙基、丙基或丁基，優(yōu)選甲基。聚乙二醇分子量在1kDa～100kDa之間，可選5kDa～40kDa之間的分子量，優(yōu)選10kDa～20kDa之間的分子量，最優(yōu)值為10kDa或20kDa。M優(yōu)選1～3之間，最佳為1或2，最優(yōu)選1。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可知，本發(fā)明所述聚乙二醇(PEG)分子結(jié)構(gòu)中n表示20～2270范圍內(nèi)的整數(shù)值，可選113～900之間的整數(shù)值，優(yōu)選226～450之間的整數(shù)值，最佳范圍值為226或450。
本發(fā)明所用的連接到蛋白分子上的高聚物分子，是由線性分子通過丙酸分子與保護(hù)基N-琥珀酰亞胺酯基相連，即mPEG-SPA，具有較高的化學(xué)反應(yīng)活性。該項技術(shù)已有專利報道(US5672662)，也可參考J.M.Harris，Jms-Rev.Macromol.Chem.Phys.，C25(3)，325-373(1985)。
IL-2可以是天然的、重組蛋白或同樣具有天然IL-2功能的基因突變產(chǎn)物。當(dāng)然，也包括通過組織培養(yǎng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞培養(yǎng)(天然、重組細(xì)胞或突變體)方法得到的產(chǎn)品。天然、重組IL-2或突變體的提取和分離方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，詳細(xì)介紹可以參考US4778879；US473892；US4518584；US4752585；USTaniguchi，T.，et al.，Nature，302305～310(1983)；Devos，R.，Nucleic Acids Research，114307～4323(1983)。
結(jié)構(gòu)式I所示的偶聯(lián)物是由IL-2與聚乙二醇丙酸活性酯共價結(jié)合而成。該合成方法是本領(lǐng)域所熟知的，生成酰胺鍵連接，產(chǎn)物主要由修飾上1～10個mPEG的偶聯(lián)物組成。該反應(yīng)條件為，pH值在5～10之間；溫度在4℃～25℃之間；反應(yīng)時間為30分鐘～8小時之間。反應(yīng)物摩爾比例，IL-2mPEG在1∶1至1∶100之間。一般情況下，選擇低溫、低pH值、短時間條件，反應(yīng)趨向于生成連接單一偶聯(lián)物；常溫、堿性條件(例如，pH＝9.2)、長時間反應(yīng)，反應(yīng)趨向于生成連接1和2個mPEG的偶聯(lián)物。
不同修飾度偶聯(lián)物可以用常用的分子排阻色譜法或陽離子交換色譜法逐一純化。例如，使用Sephacryl S-200，S-300或S-400HR分子排阻色譜介質(zhì)，混合物上柱后，pH值可以在4～9之間，最佳為pH5.5～7.5；使用Sulfopropyl(SP)離子交換介質(zhì)的Fraetogel EMD SO3-650S(EM Separations，Gibbstown，N.J.)預(yù)裝柱，pH3～10/10～30mM的醋酸鈉平衡，反應(yīng)副產(chǎn)物和無吸收組分在穿透部分，修飾產(chǎn)物可用含0.1～0.5M氯化鈉的平衡液洗脫得到，監(jiān)測UV280nm吸收值，收集到的組分，可以使用質(zhì)譜、SDS-PAGE等方法，通過檢測分子量來確認(rèn)。
另外，本發(fā)明提供的化學(xué)修飾的IL-2偶聯(lián)物的生物活性，可以使用本領(lǐng)域所熟知的使用HT-2細(xì)胞增殖的MTT法檢測(Gillis，et al.，J.Immunol.，1202027～2032，1978)。
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇丙酸修飾的白細(xì)胞介素2。其作用與IL-2具有相同的用途，但本發(fā)明偶聯(lián)物具有更好的水溶性，更長的體內(nèi)半衰期。與已有技術(shù)中偶聯(lián)物相比，本發(fā)明偶聯(lián)物具有更為專一的結(jié)合位點，更低的免疫原性，產(chǎn)物穩(wěn)定性好，更少的活性損失和產(chǎn)品收率高等優(yōu)點。


圖1為凝膠色譜圖色譜條件ZORAX GF250(9.4*250)流動相50Mm PB，150Mm NaCL，pH7.0，1ml/minUV檢測280nm組分1為雙取代IL-2產(chǎn)物；組分2為單取代IL-2產(chǎn)物；組分3為未反應(yīng)IL-2。
圖2為SDS-PAGE檢測結(jié)果電泳條件15％SDS-PAGE，恒壓200V，45min，銀染檢測。
組分1、組分2和組分3含義均與圖1表示含義相同。
圖3為離子交換色譜結(jié)果，組分1、組分2和組分3含義均與圖1表示含義相同。
具體實施例方式
實施例1、mPEG-SPA修飾IL-2的制備與鑒定表1

各種PEG-SPA試劑分子量及結(jié)構(gòu)如表1所示，由北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司提供，合成方法參考美國專利US5672662。
mPEG-SPA修飾反應(yīng)影響修飾反應(yīng)的因素有，1)pH值，2)溫度，3)反應(yīng)時間，4)IL-2與mPEG-SPA的摩爾比，5)蛋白濃度。通過控制其中單個或若干個因素的變化，可以使反應(yīng)向不同的方向進(jìn)行，產(chǎn)生不同的主產(chǎn)物，例如單取代、雙取代、三取代或四取代。反應(yīng)過程以Ic(分子量為20kDa)化合物舉例說明，1)pH值9.2，2)室溫條件下，主產(chǎn)物為單取代和雙取代產(chǎn)物，3)反應(yīng)時間為30分鐘，4)IL-2與mPEG-SPA的摩爾比為1∶4。凝膠色譜結(jié)果見圖1所示，SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示。反應(yīng)產(chǎn)物的其它mPEG-SPA試劑的反應(yīng)數(shù)據(jù)列于表2。反應(yīng)后，用冰醋酸調(diào)節(jié)終止，并保存與-20℃條件下。
表2


分離反應(yīng)混合物Sephacryl S-200分子排阻色譜柱(φ9.4mm*25cm)用pH5.5/50mM乙酸鈉預(yù)平衡；將反應(yīng)混合液，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.5，該混合溶液上柱，以2ml/分鐘流速，pH5.5/50mM醋酸鈉洗脫，色譜結(jié)果如圖3所示。收得的rhIL-2偶聯(lián)物溶液用0.2μm無菌濾器過濾，-20℃條件下保存。
IL-2偶聯(lián)物的鑒定蛋白檢測紫外檢測純化后的偶聯(lián)物的A280值。
SDS-PAGE檢測使用12％和15％的聚酰胺凝膠或者8～16％的聚酰胺分離膠，還原條件參考laemmli.nature 227680-685，1970。
分子量檢測MALDI-TOF檢測。
內(nèi)毒素檢測LAL法檢測，檢測用試劑購自廈門鱟試劑廠。
生物活性檢測HT-2細(xì)胞增殖的MTT法，檢測方法如前所述(Gillis，et al.，J.Immunol.，1202027～2032，1978)。
實施例2、rhIL-2的制備與鑒定反應(yīng)過程以Ib(分子量為10kDa)化合物舉例說明，蛋白濃度為5mg/ml，1)pH值7.3，2)在室溫下反應(yīng)，產(chǎn)物以單取代為主，3)反應(yīng)時間為30分鐘時，主產(chǎn)物為單取代產(chǎn)物，4)rhIL-2與mPEG-SPA的摩爾比為1∶30。反應(yīng)后，反應(yīng)液用冰醋酸終止，并保存與-20℃條件下。
層析介質(zhì)為強(qiáng)陽離子交換樹脂Sulfopropyl(SP)首先，將5mg蛋白偶合物溶于10倍的蒸餾水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5。該稀溶液加載至2ml柱體積的Fractogel EMI)SO3-650S(EM Separations，Gibbstown，N.J.).
預(yù)裝柱應(yīng)事先用pH4.5/20mM的醋酸鈉平衡。反應(yīng)副產(chǎn)物和無吸收組分在穿透部分，修飾產(chǎn)物可用含0.15M氯化鈉的平衡液洗脫得到，未反應(yīng)的IL-2可用含0.5M氯化鈉的平衡液步級洗脫得到。收得的IL-2偶聯(lián)物溶液用0.2μm無菌濾器過濾，-20℃條件下保存。
反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定同實施例1鑒定方法。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種化學(xué)修飾的IL-2偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)如I式所示 其中，R表示C1～4烷烴端基，n表示22～2270之間的任一整數(shù)，m表示1～10之間的任一整數(shù)，IL-2表示天然IL-2、基因重組IL-2或同樣具有天然IL-2功能的基因突變產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述的偶合物，其特征是，R為甲基、乙基、丙基或丁基。
3.權(quán)利要求2所述的偶合物，其特征是，R為甲基。
4.權(quán)利要求1所述的偶合物，其特征是，n為113～910之間的整數(shù)。
5.權(quán)利要求4所述的偶合物，其特征是，n為226～450之間的整數(shù)。
6.權(quán)利要求1所述的偶合物，其特征是，m為1、2或3。
7.權(quán)利要求6所述的偶合物，其特征是，m為1或2。
8.權(quán)利要求7所述的偶合物，其特征是，m為1。
9.權(quán)利要求1所述的偶合物的制備方法為，將mPEG-SPA與IL-2混合，生成酰胺鍵產(chǎn)物，產(chǎn)物主要由修飾上1～3個mPEG的偶聯(lián)物組成，該反應(yīng)條件為，pH值在5～10之間；溫度在4C～25℃之間；反應(yīng)時間為30分鐘～8小時之間；反應(yīng)物摩爾比例，IL-2∶mPEG-SPA在1∶1至1∶100之間。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種化學(xué)修飾的白細(xì)胞介素偶聯(lián)物，用以改善蛋白自身的物理化學(xué)性質(zhì)。特別是聚乙二醇丙酸修飾的白細(xì)胞介素2。與已有技術(shù)中偶聯(lián)物相比，本發(fā)明偶聯(lián)物具有更為專一的結(jié)合位點，更低的免疫原性，產(chǎn)物穩(wěn)定性好，更少的活性損失和產(chǎn)品收率高等優(yōu)點。
文檔編號C07K14/435GK1765926SQ200410155408
公開日2006年5月3日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者劉謙, 嚴(yán)玖鳳, 張曉偉, 李軍, 張利萍, 李晉峰, 李先鐘, 侯廣才, 許可 申請人:北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司