專利名稱：缺氧條件下的蛋白質(zhì)分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分離方法。更特別地，本發(fā)明提供了分離其天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
人的肽激素胰島素控制進(jìn)食和禁食過程中血液中的葡萄糖水平并且通過肝臟和脂肪組織細(xì)胞的細(xì)胞表面受體發(fā)揮作用。除了控制葡萄糖的吸收、貯藏和產(chǎn)生之外，胰島素還尤其參與脂類的產(chǎn)生和分解控制。
胰島素供應(yīng)不足導(dǎo)致血液中的葡萄糖濃度升高(高血糖癥)，并且以慢性的形式通過糖尿病(DM)的典型癥狀顯示。每天給患糖尿病的病人施用胰島素。
成熟的人胰島素是由通過兩個(gè)鏈間二硫橋連接的A(alpha)鏈和B(beta)鏈組成的肽。第三個(gè)二硫橋連接A鏈的兩個(gè)殘基。在生物合成前體胰島素原中，A鏈和B鏈通過C肽互相連接，C肽的作用是幫助A片段和B片段之間形成正確的二硫橋并且使胰島素原分子正確折疊。在成熟的最后階段，蛋白水解酶切割特異性氨基酸殘基釋放C肽從而形成成熟的胰島素。
目前尤其以表達(dá)于例如大腸桿菌和酵母中的胰島素原樣多肽形式制造生物合成的重組人胰島素(參見例US 5,593,860)。在大多數(shù)情況下，胰島素原以一種融合蛋白質(zhì)或重組雜合物的形式被生產(chǎn)出來，其中，胰島素原通過甲硫氨酸殘基與異源蛋白(如人銅/鋅超氧化物歧化酶(hSOD))交聯(lián)。通常地，這些雜合物以細(xì)胞內(nèi)沉淀的蛋白質(zhì)或包涵體的形式積聚在重組細(xì)胞中。
在制造重組胰島素原的過程中，細(xì)胞裂解后離心得到的包涵體，用低濃度的去污劑或變性劑洗滌。重復(fù)這種處理以增加所需蛋白質(zhì)的純度。為了使分子間疏水作用和不正確二硫鍵的形成最小化，洗滌后的包涵體溶解在變性劑，如包括還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇的尿素或鹽酸胍溶液中，并且通過沉淀回收。
為了從異源蛋白中釋放胰島素原多肽，通常用溴化氰(CNBr)分離和切割雜合物。胰島素原通過氧化亞硫酸鹽解被進(jìn)一步修飾成胰島素原S-磺酸鹽(參見例如EP 0 055 945和EP 0 196 056)。然后在還原條件下用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇等或氧化還原系統(tǒng)如谷胱甘肽將胰島素原S-磺酸鹽進(jìn)一步純化和折疊為天然構(gòu)象。胰島素原轉(zhuǎn)化為胰島素，也就是去除C肽，通過胰蛋白酶和羧肽酶B的聯(lián)合作用完成。最后利用例如反相高效液相層析(RP-HPLC)純化胰島素和任選結(jié)晶。
在整個(gè)分離過程中，從重組細(xì)胞裂解直到胰島素原正確折疊，包含在(融合)蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基的游離硫醇基，可能形成不正確或非特異性的分子內(nèi)或分子間二硫橋。這導(dǎo)致混雜的肽和無活性的激素或所需蛋白質(zhì)和污染蛋白質(zhì)形成‘聚集體’(US 6,150,134)。因此，或者應(yīng)該封閉游離的硫醇基以防止形成不正確的二硫橋或者程序應(yīng)該包括選擇性切割不正確的二硫鍵。
二硫鍵切割可尤其通過以下方法完成a)通過半胱磺酸氧化或過甲酸處理將半胱氨酸殘基修飾為半胱磺酸；b)通過亞硫酸鹽解將半胱氨酸修飾為S-磺基-半胱氨酸()；c)利用某些還原劑，如膦或硫醇的還原作用(參見例EP 0 379 162)。
然而，蛋白質(zhì)分離后防止形成不正確的二硫鍵優(yōu)于使用“氧化-變換(oxido-shuffling)”劑，并且為了達(dá)到這個(gè)目的，最常見的是，再一次使用幾種還原劑，例如二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、E-巰基乙胺或巰基乙酸。
然而，使用所有上述還原劑造成的問題是它們引起中毒的危險(xiǎn)、它們很昂貴，以及它們污染產(chǎn)品需要額外純化。
因此，合成重組胰島素原的傳統(tǒng)方法被證實(shí)不甚滿意因?yàn)樗藦?fù)雜的溶解和磺化、純化、濃縮步驟，其中胰島素原無效率地進(jìn)行重折疊，導(dǎo)致所需蛋白質(zhì)產(chǎn)率減少。
相應(yīng)地，需要一種改進(jìn)方法以有效和少污染的方式分離天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)。
發(fā)明概述本發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在含有二硫鍵的蛋白質(zhì)分離中還原劑的使用可以通過在基本缺氧的氣氛下實(shí)施所述分離來避免或至少相當(dāng)程度地減少。
本發(fā)明提供了一種分離天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在基本缺氧的條件下分離所述蛋白質(zhì)。
利用本發(fā)明方法，現(xiàn)在可以不需要使用令人不快的還原劑從環(huán)境中提取和分離含有二硫鍵的蛋白質(zhì)。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不再需要從被分離和被純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中提取此類還原劑，因而使分離步驟更有效率。而且，本發(fā)明方法防止蛋白質(zhì)混雜構(gòu)象的形成并且產(chǎn)生高產(chǎn)率的處于穩(wěn)定的天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)。
附圖描述

圖1是本發(fā)明方法包括的主要程序步驟的示意流程圖。
圖2圖解說明實(shí)施例2中所描述的噴射40mL分離的包涵體懸浮液等分試樣的影響。
發(fā)明詳述本文使用的術(shù)語“純化”或“將……純化”和“分離”和“將……分離”被定義為從成分的混合物中，例如從重組細(xì)胞的培養(yǎng)物中，釋放和獲得單個(gè)成分例如某一特定的大分子種類的方法。特別地，本文的分離步驟包括收獲和裂解細(xì)胞，從由所述裂解得到的粗細(xì)胞提取物中提取特定蛋白質(zhì)并且可能進(jìn)一步包括從其他細(xì)胞成分例如核酸或多糖中分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如包含所需蛋白質(zhì)的包涵體的各種步驟。更特別地，本文的純化程序包括以一種相當(dāng)純的方式分離蛋白質(zhì)的過程，也就是在分離時(shí)使其免于進(jìn)一步雜質(zhì)污染。
“被分離的”和“被純化的”是指從其自然環(huán)境中分離出來并且是約60％至約99％，優(yōu)選地80％至99％沒有與之自然結(jié)合的其他成分的任何分子或化合物。
本文使用的術(shù)語“重組的”是指重組地或合成地產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或核酸結(jié)構(gòu)，例如，在蛋白質(zhì)的情況下，通過宿主細(xì)胞中與特定載體或質(zhì)粒關(guān)聯(lián)的指定核酸元件系列或表達(dá)盒的RNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯產(chǎn)生。本文使用的術(shù)語“重組的”不包括由于自然發(fā)生的事件(如，自發(fā)性突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)例如那些沒有故意的人為干預(yù)而發(fā)生的事件造成的細(xì)胞或載體的改變。
“宿主細(xì)胞”是指一種細(xì)胞，它包含載體或表達(dá)盒并支持其復(fù)制和/或表達(dá)。宿主細(xì)胞可能是原核細(xì)胞例如大腸桿菌，或真核細(xì)胞例如酵母、昆蟲、兩棲動(dòng)物、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是細(xì)菌或原核細(xì)胞。生產(chǎn)胰島素的一種特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌菌株Sφ733。
正如本文所使用的，“載體”包括意指一種用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并可插入多核苷酸的核酸。載體通常是復(fù)制子。
本文使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指多肽或其任何部分。
術(shù)語“多肽”是指氨基酸的聚合物而不是指特定長度的產(chǎn)物；因此，多肽的定義中包括了肽、寡肽和蛋白質(zhì)。這個(gè)術(shù)語也不是指或排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙?；饔?、磷酸化作用等等。定義中包括的是，例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸(包括，例如，非天然氨基酸，等)類似物的多肽、有取代鍵的多肽、以及本領(lǐng)域已知的修飾，既包括自然發(fā)生的也包括非自然發(fā)生的修飾。
本文使用的術(shù)語“重組蛋白質(zhì)”是指(1)利用重組DNA技術(shù)連接的不同來源的DNA分子組合表達(dá)產(chǎn)生的半合成或合成起源的多肽；(2)半合成或合成起源的多肽，憑借其起源或處理，其不再與自然狀態(tài)下關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)的全部或部分關(guān)聯(lián)；(3)與其自然狀態(tài)下連接的多肽以外的多肽連接的半合成或合成起源的多肽；或(4)在自然狀態(tài)下不存在的半合成或合成起源的多肽。
術(shù)語“包涵體”和“折射體”是指由單個(gè)蛋白質(zhì)非特異性沉淀產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)聚集體。包涵體和折射體的形成是細(xì)胞質(zhì)中高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的常見結(jié)果。它們是通過折疊中的中間產(chǎn)物而不是天然的或未折疊的蛋白質(zhì)積聚形成。包涵體或折射體可由以下任一或全部原因形成所表達(dá)多肽的異源性；高蛋白質(zhì)表達(dá)率；非共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致的相對高數(shù)量的疏水蛋白質(zhì)分子間聚集；伴侶蛋白如輔助蛋白缺乏或不能充分獲得。
本文使用的術(shù)語“二硫鍵”被定義為由半胱氨酸殘基氧化形成的多肽鏈間或一條多肽鏈的多個(gè)部分間的一個(gè)或多個(gè)交聯(lián)。由此產(chǎn)生的二硫化物被稱為胱氨酸。
本文使用的術(shù)語“基本缺氧”被定義為氧氣極度不足或相當(dāng)程度的缺乏并且可能的變動(dòng)范圍從空氣中正常遇到的氧氣水平的減少，到完全無氧條件的例如氣氛、液體環(huán)境或組織。
“蛋白質(zhì)構(gòu)象”是指蛋白質(zhì)特征性的三維形態(tài)，包括肽鏈的二級結(jié)構(gòu)(螺旋、折疊)、超二級結(jié)構(gòu)(基序)、三級結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)域)和四級結(jié)構(gòu)(多體蛋白)。
本文使用的術(shù)語“天然構(gòu)象”是指以生物學(xué)活性形式存在于活系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)特征性的狀態(tài)、構(gòu)成、形狀或結(jié)構(gòu)，其中它折疊為C.B.Anfinsen定義的(Nobe1 Lecture，1972年12月11日)總體吉布斯自由能最低。
“重折疊”是指在通過二硫鍵的還原性切割完全變性后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的體外過程。
除了巰基氧化還原酶外，含有二硫鍵的蛋白質(zhì)通常不存在于細(xì)胞質(zhì)中。然而，從細(xì)胞質(zhì)輸出的蛋白質(zhì)，例如胰島素和堿性磷酸酶，典型地含有二硫鍵。這通常歸因于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外環(huán)境間還原電位的差異，其中，細(xì)胞質(zhì)中硫氧還蛋白還原酶的存在被認(rèn)為構(gòu)成一個(gè)重要的因素。有幾項(xiàng)研究表明需要細(xì)胞活性和硫氧還蛋白還原酶活性來維持細(xì)胞外蛋白質(zhì)以一種無活性和還原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，這些蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象中將含有氧化的二硫鍵(Derman等，1993.Science 2621744-47；Derman和Bechwith.1995.J.Bacteriol.1773764-70)。
裂解(或細(xì)胞死亡或由于培養(yǎng)基耗盡停止生長)后硫氧還蛋白還原酶不再能使蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基保持還原形式并且伴隨著半胱氨酸殘基氧化形成二硫鍵，蛋白質(zhì)隨意折疊開始。這個(gè)過程經(jīng)常導(dǎo)致異常折疊或混雜蛋白。
為了從重組材料中獲得天然構(gòu)象的、含有二硫鍵存在的蛋白質(zhì)純提取物，例如胰島素，關(guān)鍵步驟是形成正確的二硫鍵。
天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)分離的傳統(tǒng)方法依賴于還原劑的存在。目前已發(fā)現(xiàn)，從硫氧還蛋白還原酶的還原能力減弱時(shí)直到蛋白質(zhì)能夠被穩(wěn)定或提供了正確折疊的條件時(shí)應(yīng)用缺氧條件，可以有效地防止混雜蛋白質(zhì)的形成。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的分離方法，包括在基本缺氧的氣氛下分離所述蛋白質(zhì)。
使用本發(fā)明方法將得到分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，它基本上沒有如上所述的污染的還原劑，其中蛋白質(zhì)的大且實(shí)質(zhì)性的部分都是有活性的并且處于天然構(gòu)象狀態(tài)并且有生物學(xué)活性。
可用于本發(fā)明方法的適宜的蛋白質(zhì)基本上是天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，但其他的肽也可能利用本發(fā)明方法分離。舉例來說，非常合適的蛋白質(zhì)是肽類激素如胰島素、加壓素、促生長素抑制素、善得定(octreotide)、內(nèi)皮素I、knottin樣蛋白，酶例如核糖核酸酶，表位例如Cn2蝎毒素的表位，芋螺毒素，和/或LDL受體表位模塊。
通常地，富二硫化物的蛋白質(zhì)、肽或其片段，或來源于病毒、細(xì)菌、真菌(包括酵母)、植物、動(dòng)物或人類，對在例如藥物設(shè)計(jì)中結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究很有價(jià)值。因此，對于這個(gè)科學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明更有效地獲得天然構(gòu)象的此類蛋白質(zhì)的可能性有著重大的利益。
本發(fā)明方法適用于分離任何來源的天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，例如與病毒或朊病毒結(jié)合的或由原核生物，例如細(xì)菌，產(chǎn)生的，或由真核生物，例如酵母、真菌、植物、動(dòng)物或人類細(xì)胞產(chǎn)生的。優(yōu)選的所述蛋白質(zhì)是細(xì)胞外蛋白質(zhì)，它在表達(dá)于生產(chǎn)的生物體細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中時(shí)以還原形式或狀態(tài)存在并且在氧化狀態(tài)時(shí)獲得其天然構(gòu)象。
技術(shù)人員能夠確定含有二硫鍵的蛋白質(zhì)是否以天然構(gòu)象正確地(重)折疊。舉例來說，此類確定可能包括通過HPLC分析測量正確折疊的、氧化的和消化的賴氨酸-精氨酸-胰島素中間產(chǎn)物。
本發(fā)明方法優(yōu)選用于分離重組生產(chǎn)的、天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)。重組生產(chǎn)的蛋白質(zhì)既可以直接表達(dá)也可以作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)的蛋白質(zhì)的檢測通過本領(lǐng)域已知的方法例如，舉例來說，放射免疫測定法、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)或免疫沉淀法完成。
生產(chǎn)或(生物)合成(重組)蛋白質(zhì)的方式與本發(fā)明方法無關(guān)。重組蛋白質(zhì)原則上可以用本領(lǐng)域已知的任何方法制備，舉例來說，用被用于制備重組蛋白質(zhì)的方法，例如用重組酵母，更優(yōu)選用重組細(xì)菌，最優(yōu)選用重組大腸桿菌細(xì)胞，例如US 5,593,860中所述的那些來制備。在許多，但不必然是所有實(shí)例中，此類方法會(huì)導(dǎo)致形成融合蛋白質(zhì)或雜合物。因此，本發(fā)明方法非常適用于分離融合蛋白質(zhì)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本方法被用于分離可在包涵體中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法被用于分離由重組大腸桿菌菌株Sφ733產(chǎn)生的包涵體中含有的胰島素前體蛋白，該菌株攜帶和表達(dá)質(zhì)粒pDBAST-RAT-N 71(Bio-Technology GeneralLtd.，Rehovot，Israel)，它來源于pDBAST-LAT載體(見US 6,001,604或WO96/20724)。
本方法包括了實(shí)施分離蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法，其中本方法基本上在缺氧條件下進(jìn)行。在本發(fā)明方法中，最初的收獲、裂解和蛋白質(zhì)提取步驟在缺氧條件下進(jìn)行而不使用上述還原劑。
本發(fā)明方法包括在基本缺氧條件下分離蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，通過給分離環(huán)境提供缺氧氣氛，例如氮?dú)夥铡⒍趸細(xì)夥?、或氦氣氛或其他惰性氣體氣氛，獲得缺氧條件。最優(yōu)選地，在分離天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的過程中本發(fā)明方法利用N2氣氛來提供缺氧條件。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法采用的缺氧條件是這樣一種條件，它等于含0-1體積％，優(yōu)選0-0.5體積％，更優(yōu)選0-0.05％O2的氣氛，或與所述氣氛平衡的液體。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，缺氧條件是等于含有基本上0體積％O2的氣氛，或與所述氣氛相平衡的液體的條件。
簡而言之，本發(fā)明用于分離天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的方法不包括細(xì)胞生長和/或蛋白質(zhì)本身的生產(chǎn)。然而，本發(fā)明方法在生產(chǎn)蛋白質(zhì)的材料，例如含有蛋白質(zhì)的生產(chǎn)細(xì)胞上進(jìn)行，從收獲細(xì)胞開始，包括細(xì)胞收獲后的洗滌，直到分離的蛋白質(zhì)通過冷凍，例如，通過冷凍分離的包涵體而穩(wěn)定化。
更具體地，當(dāng)細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的還原電位作為硫氧還蛋白還原酶活性降低的后果而減小時(shí)，例如，當(dāng)細(xì)胞停止生長時(shí)，例如，在收獲和收獲后洗滌時(shí)，細(xì)胞優(yōu)選已經(jīng)被置于缺氧條件下。缺氧條件優(yōu)選地保持在整個(gè)過程中直至蛋白質(zhì)開始重折疊。
本發(fā)明方法可適宜地包括細(xì)胞裂解等步驟，例如通過酶的預(yù)處理，接著破碎或斷裂細(xì)胞，例如，利用超聲處理、弗式壓碎器處理或高剪切混合例如Ultra-Turrax處理，條件是所述裂解在缺氧條件下進(jìn)行。本發(fā)明方法的更進(jìn)一步的步驟可能包括在缺氧條件下從胞質(zhì)溶膠中分開或分離包涵體，如果所需蛋白質(zhì)在其中產(chǎn)生的話。這個(gè)步驟后可以貯藏分離的包涵體并且穩(wěn)定包含在其中的蛋白質(zhì)，例如通過冷凍(舉例來說，在-20℃)，或冷藏(例如在2-8℃)。蛋白質(zhì)分離和純化中進(jìn)一步的加工步驟不需要在缺氧條件下進(jìn)行。
在儲(chǔ)藏后，或直接在上述分離步驟后，被分離和任選進(jìn)一步純化的蛋白質(zhì)可被重折疊為天然構(gòu)象。一般地，為了避免形成非天然的分子間二硫橋，對于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，此類重折疊在稀釋溶液中進(jìn)行。一個(gè)非常適合重折疊胰島素的方法包括將蛋白質(zhì)溶解在含有NaHCO3和EDTA、pH值為12.0的緩沖液中，將pH值降至11.2，用木炭處理和過濾。通過向溶液施加空氣以氧化二硫化物來折疊多肽。
對于融合產(chǎn)物，可利用適當(dāng)?shù)牡鞍姿饷鸽S后消化融合蛋白來釋放所需重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明方法可能進(jìn)一步包括利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化蛋白質(zhì)至基本上純，包括去污劑溶解、用硫酸銨類物質(zhì)選擇性沉淀、柱層析、免疫純化法、親合層析，以及其他方法。舉例來說，參見R.Scopes，Protein PurificationPrinciples andPractice，Springer-VerlagNew York(1982)；Deutscher，Guideto Protein Purification，Academic Press(1990)。
現(xiàn)在通過下列非限制性的實(shí)施例來例證本發(fā)明。
實(shí)施例發(fā)酵后通過關(guān)閉壓縮空氣的加入、除去剩余壓力并且用氮?dú)鉀_洗培養(yǎng)基和處理液上方的頂端空間，培養(yǎng)液被置于缺氧環(huán)境。在所有的后續(xù)處理步驟中持續(xù)用氮沖洗頂端空間，這些步驟包括細(xì)胞的收獲和洗滌、細(xì)胞裂解、以及包涵體的另外處理。氮沖洗也應(yīng)用于加工設(shè)備例如容器、收集器以及輔助設(shè)備例如離心機(jī)、勻漿器、以及過濾器。利用固定管道進(jìn)行氮?dú)鉀_洗。
實(shí)施例1兩個(gè)相同的450L規(guī)模的產(chǎn)生重組人胰島素前體的生產(chǎn)菌株Sφ733/pDBAST-RAT-N-7-1的培養(yǎng)物是從相同工作細(xì)胞庫安瓿的內(nèi)容物生長起來的。隨后進(jìn)行發(fā)酵過程并且利用驗(yàn)證有效的分析程序分析兩個(gè)培養(yǎng)物的樣品。結(jié)果表明兩種培養(yǎng)物以非常相似的方式進(jìn)行并且所得到的吸光度、干重、蛋白質(zhì)和相對的胰島素前體最終濃度顯示差異為8％或更低。
發(fā)酵后，兩種培養(yǎng)物都經(jīng)歷了相同的包涵體(IB)回收程序，該程序圖解地顯示在圖1的流程圖中。
在IB回收程序過程中只有后一培養(yǎng)物采用了氮?dú)飧采w；前一培養(yǎng)物在有氧環(huán)境中處理。
為了用HPLC測定正確折疊的胰島素前體蛋白的量，在IB回收后將所得到的包涵體產(chǎn)物進(jìn)行小規(guī)模重折疊和純化。
分析表明每升有氧處理的培養(yǎng)物，正確氧化、折疊和消化的胰島素前體的產(chǎn)率與缺氧處理的培養(yǎng)物的產(chǎn)率相比僅為8.1％。
實(shí)施例2我們已能夠證實(shí)不同氣氛條件對胰島素肽分離的影響。利用將缺氧回收的包涵體懸浮液分成3個(gè)40mL的等分試樣的實(shí)驗(yàn)證明這點(diǎn)。分別用相同流速的氮?dú)?、壓縮空氣、或氧氣噴射這些等分試樣16個(gè)小時(shí)。接著，將懸浮液和起始材料進(jìn)行小規(guī)模重折疊和純化以測量可得到的胰島素的量。分析顯示，用壓縮空氣或氧氣噴射包涵體懸浮液導(dǎo)致正確折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)率急劇減少，而用氮?dú)鈬娚淞?6個(gè)小時(shí)沒有對產(chǎn)率產(chǎn)生這種影響。這證實(shí)，使用本發(fā)明方法，當(dāng)在處理過程中從胰島素前體包涵體排除氧氣時(shí)正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率可以顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖2。
權(quán)利要求
1.天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的分離方法，所述方法包括在基本缺氧的條件下分離所述蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述基本缺氧的條件包括基本缺氧的氣氛。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白質(zhì)是作為重組細(xì)胞的包涵體存在的重組雜合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的分離包括收獲和破碎所述細(xì)胞，分離所述包涵體和/或使分離的產(chǎn)物穩(wěn)定。
5.根據(jù)任何一個(gè)前述的權(quán)利要求的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是前體蛋白。
6.根據(jù)任何一個(gè)前述的權(quán)利要求的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是胰島素。
7.根據(jù)任何一個(gè)前述的權(quán)利要求的方法，其中所述的基本缺氧的氣氛是氮?dú)夥铡?br> 8.根據(jù)任何一個(gè)前述的權(quán)利要求的方法，其中所述的重組細(xì)胞是攜帶和表達(dá)質(zhì)粒pDBAST-RAT-N-7-1的大腸桿菌菌株Sφ733的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天然構(gòu)象中含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的分離方法?；旧?，本發(fā)明方法使還原劑例如β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇在蛋白質(zhì)分離方法中的使用過時(shí)。本發(fā)明方法特別適合從重組細(xì)胞中分離前體蛋白例如胰島素原。
文檔編號C07K14/62GK1745092SQ200480003097
公開日2006年3月8日 申請日期2004年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月31日
發(fā)明者P·范德梅耶丹, G·W·K·范德丹姆, M·H·M·艾平克, R·W·瓦瑟納爾 申請人:阿克佐諾貝爾公司