專利名稱：高粘度黃原膠聚合物制備物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物產(chǎn)品領(lǐng)域。特別地，它涉及對于各種工業(yè)用途具有改良性質(zhì)的微生物產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
黃原膠(xanthan)的化學結(jié)構(gòu)由具有三糖側(cè)鏈的線形纖維質(zhì)(1→4)-β-D-葡萄糖聚合物組成，所述三糖側(cè)鏈由甘露糖、葡萄糖醛酸和甘露糖組成，它們交替地結(jié)合到骨架中的葡萄糖殘基上。(Milas and Rinaudo，Carbohydrate Research，76，189-196，1979)。因此，黃原膠可以描述為具有五糖重復(fù)單元的帶支鏈的聚合物；通常的黃原膠一般具有2000-3000個五糖重復(fù)單元。黃原膠聚合物通常通過對甘露糖殘基進行乙?；饔煤捅饔?pyruvylation)而被修飾。
通過黃單胞菌屬(Xanthomonas)細菌的作用，由碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生生物合成的水溶性多糖黃原膠是公知的。最早的工作是由美國農(nóng)業(yè)部開展的，并描述于美國專利3,000,790中。黃單胞菌屬親水性膠體(“黃原膠”)是胞外雜多糖。
黃原膠由黃單胞菌屬的細菌通過需氧深層發(fā)酵(aerobic submergedfermentation)產(chǎn)生。發(fā)酵培養(yǎng)基通常含有碳水化合物(諸如糖)、微量元素和其他營養(yǎng)物。發(fā)酵完成后，通常對所得到的發(fā)酵肉湯(溶液)加熱處理。眾所周知，在轉(zhuǎn)變溫度(TM)或轉(zhuǎn)變溫度以上對黃原膠發(fā)酵肉湯和溶液進行熱處理，導(dǎo)致天然黃原膠的構(gòu)象發(fā)生變化，產(chǎn)生高粘度的黃原膠。熱處理也具有破壞黃原膠中存活的微生物和不想要的酶活性的有益效果。熱處理之后，利用乙醇沉淀回收黃原膠。然而，對黃原膠發(fā)酵肉湯進行熱處理也有其不利之處，諸如引起黃原膠的熱降解。將黃原膠溶液或肉湯加熱至超過TM，或?qū)⑺鼈儽３衷赥M之上的溫度若干秒時間以上，會導(dǎo)致黃原膠發(fā)生熱降解。黃原膠的熱降解不可挽回地降低它的粘度。因此，熱處理是控制黃原膠的質(zhì)量或稠度的重要技術(shù)。
黃原膠的質(zhì)量主要通過兩種粘度測試來測定低剪切率粘度(Low Shear RateViscosity)(″LSRV″)，這在自來水溶液中進行的；和海水粘度(Sea Water Viscosity)(″SWV″)，這在高鹽水溶液中進行。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對黃原膠發(fā)酵肉湯在TM溫度或高于TM溫度下進行巴氏消毒產(chǎn)生更高粘度的黃原膠，這通過更高的LSRV和SWV值顯示出。
黃原膠聚合物用于許多場合中。黃原膠有廣泛的工業(yè)應(yīng)用，包括用在油井鉆探泥漿(oil well drilling muds)中，其作為通過注水二次回收石油時的粘度控制添加劑，它還用作食品增稠劑，用作穩(wěn)定劑，用作乳化劑、懸浮劑和膠黏劑(Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，2nd Edition，Editors John Wiley& Sons，901-918，1989)。黃原膠也可以用于化妝品制劑、藥物載體(pharmaceuticalvehicles)和類似的組合物。
在本領(lǐng)域中需要產(chǎn)生在未經(jīng)巴氏消毒的狀態(tài)中具有更高的比粘度特性的黃原膠聚合物。例如在食品、工業(yè)和油田應(yīng)用中，此種具有更高的比粘度的黃原膠聚合物在等同的黃原膠濃度下可以提供更多的粘度。
發(fā)明概述[10]在第一種實施方案中，提供了未經(jīng)巴氏消毒的黃原膠組合物。該組合物可以由過量表達gumB和gumC的細胞產(chǎn)生。它的特性粘度(intrinsic viscosity)比由不過量表達gumB和gumC的相應(yīng)菌株產(chǎn)生的黃原膠高至少20％。
在第二種實施方案中，提供了黃原膠組合物。它包含一群(population)分子，其具有各種分子長度。該群中至少1％的黃原膠的長度大于3μm，這由原子力顯微術(shù)測定得到。
在本發(fā)明的第三種實施方案中，提供了生產(chǎn)黃原膠聚合物制劑的方法，與由野生型菌株產(chǎn)生的黃原膠聚合物制劑相比，該制劑具有增加的粘度。在野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)培養(yǎng)物中，gumB和gumC基因產(chǎn)物的數(shù)量選擇性地增加。orfX因產(chǎn)物的數(shù)量未被選擇性地增加。選自gumD-gumG的基因產(chǎn)物的數(shù)量也未選擇性地增加。更高粘度的黃原膠聚合物制劑由此由培養(yǎng)物產(chǎn)生。
在本發(fā)明的第四種實施方案中，提供了生產(chǎn)黃原膠聚合物制劑的方法，與由野生型菌株產(chǎn)生的黃原膠聚合物制劑相比，該制劑具有增加的粘度。野油菜黃單胞菌菌株在其可產(chǎn)生黃原膠聚合物的條件下，被培養(yǎng)在培養(yǎng)基中。相比起野生型菌株，該菌株選擇性地產(chǎn)生更多的gumB和gumC基因產(chǎn)物，而orfX或選自gumD-gumG的基因的基因產(chǎn)物沒有被選擇性地增加。
在本發(fā)明的第五種實施方案中，提供了未經(jīng)巴氏消毒的黃原膠組合物。該組合物由過量表達gumB和gumC的細胞產(chǎn)生。該組合物的海水粘度比由不過量表達gumB和gumC的相應(yīng)菌株產(chǎn)生的黃原膠高至少10％。
因此，本發(fā)明為本領(lǐng)域提供了黃原膠組合物，其相比起由相應(yīng)野生型菌株類似地產(chǎn)生的黃原膠組合物，具有增加的粘度。
附圖簡述[16]

圖1示出了涉及gumB-M操縱子的遺傳圖譜的遺傳結(jié)構(gòu)，gumB-M操縱子也稱為xpsB-M(黃原膠多糖合成)操縱子。
圖2A和2B分別示出了gumB和gumC蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達的蛋白質(zhì)印跡分析。
圖3示出了黃原膠樣品的特性粘度(intrinsic viscosity)圖，因存在攜帶有過量拷貝的基因的質(zhì)粒的緣故，其中一個樣品過量表達gumB和gumC基因產(chǎn)物。
發(fā)明詳述[19]本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是，相比起它們的操縱子中的其他基因，gumB和gumC基因產(chǎn)物的過量表達，產(chǎn)生具有更高粘度的黃原膠產(chǎn)物，基于重量單位來計算(on a perweight basis)。盡管申請人不希望受到任何特定的操作理論的限制，似乎是某些基因產(chǎn)物的比率的變化，導(dǎo)致黃原膠聚合物分子的尺寸分布的變化。相當數(shù)量的分子的分子長度比由野生型細胞產(chǎn)生的黃原膠更長。這些更長的分子產(chǎn)生更高粘度的群體或制劑。
在本領(lǐng)域中已知，粘度的增加可以通過對黃原膠制劑進行巴氏消毒而實現(xiàn)。參見Talashek等的美國專利6,391,596。然而，觀察到，即使不進行巴氏消毒，gumB和gumC的過量表達也能夠?qū)е抡扯鹊脑黾印１M管如此，隨后對本發(fā)明的產(chǎn)物進行巴氏消毒，將產(chǎn)生更具粘性的制劑。
看來，gumB和gumC的過量表達是實現(xiàn)增加的粘度所必需的。當對任一基因單獨測試時，則未觀察到粘度增加。通過與gumB-M操縱子中的其他基因相比較，可以評價gumB和gumC的過量表達。盡管相對于那些基因中的任何一個的過量表達都可足以取得該效果，但相對于orfX和gumD的過量表達是特別顯著的。orfX是之前作為該基因組的片段公布的小型開放閱讀框，命名為gumA，就在gumB的上游。最近在先前的gumA區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個開放閱讀框，ihf和orfX。相對于gumD-gumM中的所有基因的過量表達可以被期望。
通過本領(lǐng)域任何已知的方法，可以實現(xiàn)所期望的基因產(chǎn)物的過量表達，方法包括但不限于將編碼期望的基因產(chǎn)物的基因的更多拷貝導(dǎo)入野油菜黃單胞菌細胞或產(chǎn)生黃原膠的其他細菌中，和使用如誘導(dǎo)型啟動子來誘導(dǎo)期望的基因產(chǎn)物。產(chǎn)生黃原膠的其他細菌包括那些已經(jīng)經(jīng)過遺傳工程處理而含有黃原膠生物合成基因的細菌。gumB和gumC基因可以被導(dǎo)入一個或多個載體，即它們是聯(lián)合的或單獨的。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用的誘導(dǎo)型啟動子包括本領(lǐng)域任何已知的啟動子，包括lac啟動子、ara啟動子啟動子、tet啟動子和tac啟動子。用于這些啟動子的天然和人造誘導(dǎo)劑是本領(lǐng)域已知的，且可以方便地使用。例如，額外拷貝數(shù)的基因可以被導(dǎo)入到質(zhì)?；虿《据d體上。被期望的基因的額外拷貝可以保持在染色體外，或可以整合入基因組中。
從培養(yǎng)肉湯中回收黃原膠通常涉及一個或多個操作步驟。黃原膠可以進行熱處理。黃原膠可以用醇沉淀，諸如異丙醇、乙醇或丙醇沉淀。通常，細胞不特別地從培養(yǎng)肉湯中除去。
生物合成產(chǎn)生的黃原膠分子通常具有尺寸分布。通過增加長度比平均長度長得多的分子的數(shù)量，或通過將長度比平均長度長一些的分子的數(shù)量增加到更大的程度，可以實現(xiàn)本發(fā)明的粘度增加。具有增加的長度的分子的數(shù)量不必是極為巨大的。至少1％、3％、5％、7％、9％或11％的分子具有增加的長度，可以是足夠的。長度增加的分子可以大于3、4、5、6、7、8或9μm，這用原子力顯微術(shù)測定。長度大于3、4、5、6、7、8或9μm的分子對整個黃原膠群體的質(zhì)量所貢獻的百分比，大于它們在群中的數(shù)量比例。因此，黃原膠分子總質(zhì)量的至少1％、3％、5％、10％、15％、20％或25％，由長度大于3μm的分子構(gòu)成。
特性粘度測定是表征本發(fā)明的制劑的另一種方法。使用這種測定方法，觀察到的特性粘度相比起由野生型菌株產(chǎn)生的要增加5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％。用于比較目的的合適的對照是那些與正被測試的菌株最為相關(guān)的對應(yīng)菌株。因此，如果測試菌株具有過量拷貝的gumB和gumC，最好的對照將具有同樣的遺傳組成，但不存在過量拷貝的gumB和gumC。如果測試培養(yǎng)物已由誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)以產(chǎn)生更多的gumB和gumC基因產(chǎn)物，那么最好的對照將是未被誘導(dǎo)的同樣的菌株的培養(yǎng)物。海水粘度也可以被用于表征本發(fā)明的制劑。使用這種類型的測定，觀察到的粘度比由野生型菌株產(chǎn)生的要增加達5％、10％、15％、20％、25％、30％或35％。
黃原膠作為組成成分而被用于許多產(chǎn)品中，以改善產(chǎn)品特性。舉例來說，特性可以包括粘度、顆粒懸浮性、口感、大小。其他的特性包括水結(jié)合性(water-binding)、增稠性、乳劑穩(wěn)定性、增泡性和剪切弱化。此類產(chǎn)品包括食品、諸如色拉調(diào)味劑、糖漿、果汁飲料和冷凍甜點。此類產(chǎn)品也包括印刷染料、石油鉆井液、陶瓷釉和藥物組合物。在后一種情況中，黃原膠可以用作載體和受控釋放(controlled release)基質(zhì)。其他可以使用黃原膠的產(chǎn)品包括，清洗液、油漆和墨水、墻紙粘合劑、殺蟲劑、牙膏以及酶和細胞固定劑。
盡管本發(fā)明通過具體的實施例—包括目前實施本發(fā)明的優(yōu)選方式—來描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，對上述系統(tǒng)和技術(shù)可以有大量的變化和置換，它們落入權(quán)利要求書所描述的發(fā)明精神和范圍內(nèi)。
實施例實施例1-菌株構(gòu)建[29]為了分離出攜帶野油菜黃單胞菌的完整gum基因區(qū)域的片段，野油菜黃單胞菌野生型菌株，NRRL B-1459(1)的基因組文庫，用廣宿主范圍的柯斯質(zhì)粒載體pRK311(2)構(gòu)建，其通過克隆用Sau3AI部分消化的總DNA來實現(xiàn)。該文庫整個地由大腸桿菌S17-1(3)交配到Gum-野油菜黃單胞菌突變株2895(4)。從若干粘液樣接合后體分離出的柯斯質(zhì)粒中的一個，稱為pIZD15-261(5)，含有包括了整個gum區(qū)域的16kb片段。參見圖1的圖解說明和表1的操縱子基因列表。
表1在編碼黃原膠雜多糖合成的染色體區(qū)域中的基因名稱列表


*基因位置依據(jù)野油菜黃單胞菌野油菜變種(X.campestris pv.campestris)ATCC33913(GenBank保存AE008922)的基因組序列，如da Silva，A.C.R.，et al.，(Nature，Vol.417，pg.459-463，2002)描述。
為了構(gòu)建pBBR5-BC質(zhì)粒，用SpeI-BglII對pIZD15-261進行消化，將所得的4026bp的片段克隆在pKmob19(8)的XbaI和BamHI位點之間，產(chǎn)生pGum02-19S(5)。用SphI對質(zhì)粒pGum02-19S進行消化，得到2855bp的片段。將該片段克隆入pUC18(9)，其之前用SphI消化，形成pUC18-BCAS。
通過將含有g(shù)um啟動予以及gumB和gumC基因的HindIII-XbaI片段克隆入用HindIII-XbaI消化的pBBR1-MCS5(10)(GenBank編號U25061)，構(gòu)建得到最終質(zhì)粒(pBBR5-BC)。
所得到的pBBR5-BC質(zhì)粒的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO1中。(對gumB和gumC預(yù)測的氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO2和3中)。該廣宿主范圍的、中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒為7.6kb長，并與IncP、IncQ和IncW組的質(zhì)粒以及基于ColEl和P15a的復(fù)制子相容。當RK2轉(zhuǎn)移功能以反式方式(in trans)提供時，轉(zhuǎn)移起始點(mobRK2)的存在使得它能夠通過與廣范圍的細菌接合而發(fā)生轉(zhuǎn)移。它也攜帶慶大霉素抗性基因，且它含有位于編碼LacZα肽的基因內(nèi)的pBluescript II KS多克隆位點(pBluescript II KS，來自Stratagene，La Jolla，Ca，USA)。
為了確證來自pBBR5-BC的GumB和GumC蛋白質(zhì)的表達，將質(zhì)粒導(dǎo)入野油菜黃單胞菌突變株1231，野油菜黃單胞菌突變株1231中的整個gum(xps)基因簇被剔除掉。兩種蛋白質(zhì)在突變菌株中用蛋白質(zhì)印跡法檢測到。
表2.在本工作中使用或構(gòu)建的細菌菌株和質(zhì)粒

a對應(yīng)于gum區(qū)域的核苷酸序列中的位置的編號(GenBank，編號U22511)[34]細菌菌株、質(zhì)粒和生長條件。本研究中所使用的菌株和質(zhì)粒列于表2中。大腸桿菌菌株于37℃，培養(yǎng)于Luria-Bertani培養(yǎng)基中。野油菜黃單胞菌菌株于28℃，培養(yǎng)于TY(每升H2O，含5g胰蛋白胨、3g酵母提取物，和0.7g CaCl2)或YM培養(yǎng)基中(12)。依需要補充Sigma(St.Louis，Mo.)的抗生素，濃度如下(按每毫升微克數(shù)計算)對于野油菜黃單胞菌，慶大霉素30；和四環(huán)素10；對于大腸桿菌，慶大霉素10；卡那霉素30；氨芐青霉素100；和四環(huán)素10。
DNA生物化學。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN，Hilden，Germany)，制備來自大腸桿菌和野油菜黃單胞菌的質(zhì)粒DNA。DNA限制性內(nèi)切、瓊脂糖凝膠電泳和克隆程序，根據(jù)已有的方法(13)實施。所有結(jié)構(gòu)由DNA測序確認。利用Bio-Rad(Richmond，Calif.)(所使用的參數(shù)大腸桿菌200Ω、25μF、2500V和野油菜黃單胞菌1000Ω、25μF、2500V)教導(dǎo)的電穿孔法，將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入大腸桿菌和野油菜黃單胞菌細胞中。
核苷酸和蛋白質(zhì)序列分析。使用Mac Vector Sequence Analysis Software(OxfordMolecular Limited，Cambridge，UK)，對核苷酸和氨基酸序列進行分析。
實施例2-gumB和gumC表達的蛋白質(zhì)印跡分析[37]蛋白質(zhì)印跡分析證實，gumB和gumC基因產(chǎn)物在攜帶額外拷貝的gumB和gumC的野油菜黃單胞菌菌株中是被過量表達的。參見圖2。
實施例3-特性粘度測定[38]將由攜帶(XWCM1/pBBR5BC)或不攜帶(XWCM1)多個gumB和gumC基因的質(zhì)粒編碼拷貝的野油菜黃單胞菌菌株制備的黃原膠樣品進行比較。使用葡萄糖作為碳源，進行搖瓶發(fā)酵，從這些菌株獲得黃原膠。
通過測量純化的和未純化的黃原膠樣品的粘度，確定特性粘度。觀察到，具有多拷貝gumB和gumC的野油菜黃單胞菌菌株產(chǎn)生的黃原膠的特性粘度增加。當在相同的溶劑和溫度條件下測量時，特性粘度與給定的聚合物類型的分子量成正比。因此，相比起來自對照菌株的黃原膠，具有多拷貝的gumB和gumC的野油菜黃單胞菌菌株產(chǎn)生的黃原膠具有更高的分子量。
方法對于這兩種肉湯中的每一種，均有5個搖瓶被測量。將每一種類型的肉湯合在一起，測定總體積。然后將肉湯在異丙醇中沉淀。(注意估計培養(yǎng)液含有約3％的膠。測量總?cè)鉁w積，并乘以3％，得到近似的干膠重量。該近似值用于計算產(chǎn)生大約0.5％膠溶液所需要的水量)。濕的纖維沉淀物然后立即混合在0.01MNaCl中，再次進行水合，以產(chǎn)生近似0.5％的膠溶液。通過使用3葉的2英寸直徑螺旋槳攪拌器，以良好的剪切，將該纖維混合3小時，然后，使其保持過夜。下面的步驟用于制備樣品，該樣品用于特性粘度測定。
使用Gelman Science 293mm加壓過慮裝置，過濾上面制備的～0.5％的膠溶液。該溶液首先過濾通過20μMagna尼龍過濾器(N22SP29325)。將過濾器加壓到～60psi，將溶液收集于干凈的燒杯中。(注意當流速降低到每分鐘～5滴時，更換過濾器)。
第一次過濾步驟之后，使用上面的過濾裝置將樣品再過濾兩次。首先，通過Millipore 8.0μ過濾器(SCWP 29325)，然后通過Gelman Versapor293mm 1.2μ過濾器(66397)。每一過濾步驟之后，將過濾的樣品回收在干凈的燒杯中。
過濾之后，將～600ml的膠溶液置于Spectra/Por透析管，28.6mm直徑Spectrum#S732706(MWCO 12,000至14,000)。將管切割成～18-20英寸的長度，并在一端打結(jié)。將溶液加入到管中，將其充滿至距離端部的2英寸內(nèi)。將管打第二個結(jié)，這樣，盡可能少的空氣留于管中。繼續(xù)直到所有的膠溶液都置于透析管中。
用去離子水沖洗含有膠溶液的管的外部約1分鐘，然后，將管置于含0.01MNaCl的容器中。鹽溶液應(yīng)該全部覆蓋透析管。
將管保持在0.01M NaCl溶液中4天，每天更換NaCl溶液。4天后，切開管的一端，并小心地將膠溶液轉(zhuǎn)移到干凈的燒杯中。
使用下述程序，計算過濾透析溶液中的固體[47]使用能夠稱量±0.0002g的分析天平，稱量并記錄干凈的鋁稱重盤VWR Cat#25433-008的重量。(A)[48]使用干凈的移液管，將近似10ml的膠溶液加到鋁盤上，并記錄盤和膠溶液的精確的總重量。(B)[49]將盤連同溶液置于105℃干燥爐中，并保持24小時。
24小時后，將盤從爐中拿出，冷卻并重新稱重。記錄下盤和剩余干膠的總重量(C)。
將鋁盤和膠溶液的重量(B)減去鋁盤的重量(A)。將干膠和盤的重量(C)減去鋁盤的重量(A)。將第一個值(B-A)除以第二個值(C-A)。并將該值乘以100，得到％固體。
注意使用上述程序，對每一過濾透析溶液中固體的計算分三次重復(fù)進行。然后將每一樣品的計算得到的％固體進行平均，并使用所得到的平均值。
基于對每一溶液的固體的測定，使用0.01M NaCl將樣品稀釋至0.25％的總膠濃度。
特性粘度測定通過使用Vilastic Viscoelasticity Analyzer(Vilastic Scientific，Inc.，Austin，TX，配置有半徑0.0537cm、長度6.137cm的管)來進行。該儀器在進行測定之前用水校準，并在測定完成之后進行校驗。使用該儀器的TIMET軟件實驗方案進行測定，設(shè)置頻率為2.0Hz，恒應(yīng)變?yōu)?.0，積分時間(integration time)為10秒。溫度維持在23.5℃。通過稀釋0.25％的膠溶液，制備樣品。將每一稀釋液混合20分鐘，并在測定之前將其冷藏過夜。將每一稀釋液進行6次測定，并算出平均值。下表3示出了稀釋過程和每一制備得到的樣品所測得的平均粘度。
表3
根據(jù)ηsp＝(ηc-ηo)/ηo)，其中ηc＝膠溶液的粘度，將比濃粘度(ηsp/c)對膠濃度作圖，測定特性粘度。截距為特性粘度。參見圖3。
相信，XWCM1/pBBR5-BC變體的特性粘度的增加，是由于分子量增加的緣故。當在與該實驗進行時相同的溶劑和溫度條件下測量時，特性粘度與給定的聚合物類型的分子量成正比。[η]和分子量之間的關(guān)系由Mark-Houwink方程式[η]＝kMa給出，其中，k和a在特定的溶劑中和特定的溫度下，對于特定的聚合物類型是恒定的。因為常數(shù)“a”是正數(shù)，只有分子量(M)增加時，[η]才增加，除非樣品具有不同的分子構(gòu)型，在這時，Mark-Houwink方程不適用。
實施例4-程序-低剪切率粘度測定[57]低剪切率粘度測定以純化的黃原膠為對象來實施。用于測定LSRV的程序在下面有詳細描述。觀察到，相比起由對照菌株產(chǎn)生的黃原膠，由具有多拷貝的gumB和gumC的菌株產(chǎn)生的黃原膠的粘度增加。數(shù)據(jù)顯示，gumB和gumC的過量表達是鏈長度的增加所需要的；gumB或者gumC的單獨過量表達不足以增加鏈長度。
材料和設(shè)備1.標準(合成)自來水(含有1000ppm NaCl和40ppm Ca++或147ppmCaCl2·2H2O的水)通過將20gm的試劑級NaCl和2.94gm的試劑級CaCl2·2H2O溶解于合適容器中的20升蒸餾水中來制備。
2.能夠精確測量至0.01gm的天平。
3.Brookfield LV粘度計，心軸#1和心軸保護裝置。
4.標準實驗室玻璃器皿。
5.標準實驗室攪拌臺(stirring bench)。RAE攪拌動力器(stirring motor)(C25U)和攪拌軸(stirring shaft)(5/16”)，帶有3葉螺旋槳，可以被替換。
程序1.用600ml Berzelius(高式)量杯稱量299ml的合成自來水，向其中緩慢加入0.75gm(稱量至最接近的0.01gm)的產(chǎn)物，同時以800rpm的轉(zhuǎn)速攪拌。
2.在800rpm攪拌4小時后，將溶液從攪拌臺移去，使之保持30分鐘。
3.將溫度調(diào)節(jié)到室溫，并使用Brookfield LV粘度計，1#心軸在3rpm轉(zhuǎn)速時測量粘度。在將心軸旋轉(zhuǎn)3分鐘之后，記錄粘度。
實施例5-蛋白質(zhì)表達的定量[60]將細胞裂解物進行蛋白質(zhì)印跡和免疫檢測分析，以確定質(zhì)粒編碼的gumB和gumC的水平。四次獨立的印跡被分析。盡管在每一次定量分析中，同一樣品的絕對值不能被重復(fù)，但是在所有測定中，樣品之間的相對數(shù)量保持相同。
針對GumB和GumC產(chǎn)生的抗體的制備。利用PCR擴增，產(chǎn)生編碼GumC蛋白氨基酸殘基53-447的、長為1184bp的DNA片段。使用下述引物F21355′GGAATTCCATATGTTGATGCCCGAGAAGTAC-3’(SEQ ID NO4)和B33195′CGGGATCCTCAAAAGATCAGGCCCAACGCGAGG-3’(SEQ ID NO5)。PCR產(chǎn)物用NdeI和BamHI消化，并亞克隆入pET22b(+)，將所得到的質(zhì)粒(pET-C)導(dǎo)入大腸桿菌菌株BL21(DE3)。
將大腸桿菌BL21(pET-C)培養(yǎng)在含50μg羧芐青霉素/ml的L-培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600為0.6，然后用1mM IPTG誘導(dǎo)3小時。通過在37℃，用裂解緩沖液(50mMTris/HCl pH8，1mM EDTA pH8，100mM NaCl，1mM PMSF，0.1mg DNase ml-1，0.5％Triton X-100)中的1mg/ml的溶菌酶處理30分鐘，再在冰上超聲處理，制備總細胞裂解物。通過低速離心(Eppendof，4000×g，5分鐘)，去除細胞碎片，通過在14000×g離心10分鐘，上清液被分離為可溶組分和沉淀(包涵體)組分。沉淀組分用裂解緩沖液洗滌2次，所用裂解緩沖液的體積與原細胞裂解物的體積相同，用含2mg/ml的DOC的裂解緩沖液洗滌1次，然后用水洗滌3次。處理完之后，蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離，切下含有過量產(chǎn)生的GumC蛋白質(zhì)的主要條帶，并洗滌以用于對兔子進行免疫。
將大腸桿菌JM109(pQE-Xps#6，pREP4)培養(yǎng)在含50μg/ml羧芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的L-培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD600為0.6，然后用1mM IPTG誘導(dǎo)3小時。通過在37℃，用裂解緩沖液(50mM Tris/HCl pH8，1mM EDTApH8，100mM NaCl，1mM PMSF，0.1mg DNase ml-1，0.5％Triton X-100)中的1mg/ml的溶菌酶處理30分鐘，再在冰上超聲處理，制備總細胞裂解物。通過低速離心(Eppendof，4000×g，5分鐘)，去除細胞碎片，通過在14000×g離心10分鐘，上清液被分離為可溶組分和沉淀(包涵體)組分。沉淀組分用裂解緩沖液洗滌2次，并重新懸浮于含6M鹽酸胍的100mM磷酸緩沖液(pH7)，5mM DTT，5mM EDTA中，包涵體在用緩沖液D(4MGdnHCl，50mM磷酸緩沖液(pH7)，150mM NaCl)進行預(yù)平衡的FPLC SuperdexHR200(Pharmacia Biotech)上進行色譜分析，收集含有GumB的級分并用于免疫小鼠。
質(zhì)粒pFD5、pBBR-promC和pBBR5-B的構(gòu)建。通過用BamHI(#318和#3459)部分消化pIZD15-261，獲得含有g(shù)umB和gumC基因的3141bp的片段，并將其克隆入BamHI消化的pRK404，產(chǎn)生質(zhì)粒pFD5。通過用EcoRI(#1979)和BamHI(#3459)消化pGum02-19，分離出1480bp的片段，并將其克隆入之前用同樣的酶消化的pBBRlMCS-5中，產(chǎn)生pBBR-promC。用MCS中的HindIII和EcoRI(#1979)消化pGum02-19，產(chǎn)生1233bp的片段，將其克隆入pBBR1MCS-5，產(chǎn)生質(zhì)粒pBBR5-B。
用上面制備的GumC來免疫新西蘭白雌兔。初次給兔注射500μg蛋白質(zhì)和弗氏完全佐劑(complete Freund′s adjuvant)，然后每隔一周注射250μg的蛋白質(zhì)和不完全佐劑，共3次。用上面制備的GumB來免疫BALB/c雌鼠。初次給小鼠注射100μg蛋白質(zhì)和弗氏完全佐劑，然后每周一次注射50μg的蛋白質(zhì)和不完全佐劑，共3次。按照Harlow & Lane((1999)Using antibodiesa laboratory manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)中描述的方法制備多克隆抗體，并將抗血清保存在-70℃。為了獲得GumC特異性抗體，血清用大腸桿菌BL21(pET22b+)和Xc1231丙酮粉來吸附(Harlow & Lane，supra)。
蛋白質(zhì)提取物。通過電穿孔法將質(zhì)粒導(dǎo)入親代菌株P(guān)RM-1。將所得的菌株在28℃，培養(yǎng)在YM培養(yǎng)基中，250rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期。離心收集細胞，并測定濕重。用10mM Tris/HCl，10mM EDTA(pH 8.0)洗滌沉淀兩次，以去除外多糖，并以100mg/ml的濃度重新懸浮于同樣的緩沖液中。將100μl緩沖液A(10mM Tris/HCl，10mM EDTA(pH 8.0)，1.5％SDS)加入到50μl的每一樣品中后，將混合物在室溫溫育10分鐘，然后在100℃溫育12分鐘。將細胞裂解物在14000×g(Eppendorf5415C)離心5分鐘，收集得到的上清液稱為總蛋白質(zhì)提取物。在SDS存在下，使用BSA作為標準，通過Markwell((1978)A modification of the Lowry procedure to simplifyprotein determination in membrane and lipoprotein samples.Anal Biochena 87(1)，206-10)描述的方法，測定每一裂解物的蛋白質(zhì)濃度。
SDS-PAGE和免疫檢測。將細胞裂解物(每泳道30μg)與樣品緩沖液(125mMTris/HCl，pH6.8；4％SDS；20mM DTT；0.05％溴酚蘭；20％甘油)混合，并煮沸2分鐘。蛋白質(zhì)用Schgger and von Jagow((1987)Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to100kDa.Analytical Biochemistry 166(2)，368-79)中描述的SDS-10％聚丙烯酰胺凝膠分離。使用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(semi-dry transfer system)進行電印跡(Hoefer Semiphorunit)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜(PVDF，Millipore)上。轉(zhuǎn)移在含有10mMCAPS(pH11)，10％(v/v)甲醇的緩沖液中進行30分鐘，2.5mA/cm2凝膠表面積。電轉(zhuǎn)移完成之后，印跡用0.5％麗春紅染色，以評價轉(zhuǎn)移質(zhì)量，并用Milli-Q-級水洗滌。印跡用含有5％脫脂奶粉的TBST(150mM NaCl，10mM Tris/HCl pH8，0.05％Tween-20)(Harlow & Lane，supra)在4℃封閉過夜，然后用含抗-GumB(1∶3000)或抗-GumC(1∶5000)抗體的、含有3％脫脂奶粉的TBST在室溫下溫育3h。堿性磷酸酯酶結(jié)合的羊抗鼠IgG或抗兔IgG(Sigma)分別用于檢測，如制造商所述。印跡用TBST洗滌三次，然后在含氮藍四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(NBT/BCIP，Promega)的溶液中顯影?？梢允褂蒙虡I(yè)上可獲得的蛋白質(zhì)標記MW-SDS-70L(Sigma)來校準SDS-PAGE。
印跡定量分析。GumB和GumC蛋白質(zhì)條帶的強度通過用UVP攝像密度儀(Densitometer)(Ultra Violet Products)掃描用NBT/BCIP顯影的濾膜，而得以確定，并用GelWorks 1D分析軟件(NonLinear Dynamics Ltd)進行量化。每一濾膜含有PRM-1(pBBR-prom)提取物的參考泳道，以確定野生型細胞中染色體編碼的GumB和GumC的水平。觀察到GumB和GumC的相對數(shù)量。參見圖2A和2B。
實施例6-程序-使用原子力顯微術(shù)測定分子長度或分子量[69]使用稱為原子力顯微術(shù)(AFM)或掃描探針顯微術(shù)(SPM)的直接觀察技術(shù)(direct visualization technique)，對野油菜黃單胞菌菌株產(chǎn)生的黃原膠分子的長度進行成像，這些野油菜黃單胞菌菌株攜帶(XWCM1/pBBR5-BC)或不攜帶(XWCM1)多拷貝的gumB和gumC。用于進行AFM的程序?qū)⒃谙旅嬖敿毭枋?。觀察到，由攜帶多拷貝的gumB和gumC的菌株產(chǎn)生的黃原膠分子的平均分子輪廓(contour)長度比親代菌株產(chǎn)生的要長得多。
通過將0.1g的膠混合在100g的蒸餾水中大約3小時，制備0.1wt％的膠溶液。通過將20μl的0.1wt％溶液稀釋入20g 0.1M醋酸銨溶液，制備1ppm的貯存液。將20μl的1ppm貯存液噴灑到新鮮切割的云母片上(～1cm2)。這些云母片然后置于加熱的(～60℃)真空室中～1小時，以去除過量的水。干燥的云母片然后用AFM的輕叩模式(Tapping Mode)進行掃描。用Digital Instruments提供的軟件測量所有AFM圖像的分子輪廓長度。
測量一群黃原膠分子的輪廓長度。該研究的結(jié)果總結(jié)于表4中。(每一尺寸級別的分子小于或等于示出的長度；尺寸級別中示出的分子數(shù)量不包括納入在更小尺寸級別中的分子)。這些結(jié)果顯示，由具有多拷貝的gumB和gumC的野油菜黃單胞菌菌株產(chǎn)生的黃原膠分子明顯大于由對照菌株產(chǎn)生的黃原膠分子。原子力顯微術(shù)(AFM)或掃描探針顯微術(shù)(SPM)利用商業(yè)可獲得的儀器(Nanoscope IIIa，DigitalInstruments，Santa Barbara，CA)，使用氮化硅懸臂尖(cantilever tip)進行。
表4 黃原膠分子輪廓長度的AFM測定


實施例-耐海水粘度評價[72]評測由XWCM-1/pBBR5-BC菌株產(chǎn)生的黃原膠的耐海水粘度(SWV)，將之與商業(yè)渠道獲得的黃原膠產(chǎn)品(XanvisTM)進行比較。XanvisTM黃原膠產(chǎn)品的典型的SWV在18至22范圍內(nèi)。
使用下述程序測定耐海水粘度。將41.95g的海鹽(ASTM D1141-52，來自LakeProducts Co.，Inc.Maryland Heights，Missouri)溶解于1升的去離子水中，制備海水溶液。將300ml的海水溶液轉(zhuǎn)移到混合杯，該混合杯連接有Hamilton-Beach 936-2混合器(Hamilton-Beach Div.，Washington，D.C.)?；旌掀魉俣瓤刂票辉O(shè)置于低速，并將單槽紋盤(single fluted disk)附著到混合軸(mixing shaft)。在低速設(shè)置時，混合軸以近似4,000-6,000rpm的速度旋轉(zhuǎn)。將0.86g的生物膠(biogum)在15-30秒的時間里緩慢加入到混合杯，并允許混合5分鐘。將混合器速度控制設(shè)置至高速(11,000±1,000rpm)，允許測試溶液混合近似5分鐘。從加入生物膠產(chǎn)品的時間算起，混合物允許混合共45分鐘。45分鐘的混合時間結(jié)束時，加入2-3滴Bara Defoam(NL Baroid/NL industries，Inc.，Houston，TX)，并繼續(xù)再攪拌30秒。
將混合杯從混合器移去，并浸入冷卻水，以將液體的溫度降至25±0.5℃。為了確保溶液的均勻，冷卻之后，在11,000±1,000rpm轉(zhuǎn)速下，將溶液再次混合5秒鐘。將溶液從混合杯移至400ml的Pyrex燒杯，并測量Fann粘度(Fann Viscometer，Model35A)。這通過在低速(約3rpm)下混合而完成。穩(wěn)定讀數(shù)，然后從表盤讀出剪應(yīng)力值，作為3rpm轉(zhuǎn)速時的SWV值記錄下來。
表5.XWCM-1/pBBR5-BC黃原膠和XanvisTM黃原膠的品質(zhì)

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序列表<110>Y·帕特爾L·耶爾皮J·C·施奈德M·V·耶爾米尼<120>高粘度黃原膠聚合物制備物<130>012047.00047<150>60/456,245<151>2003-03-21<160>5<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>7604<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)<220>
<221>CDS<222>(2715)...(4133)<223>gumC<221>CDS<222>(2014)...(2712)<223>gumB<221>misc_feature<222>(1915)...(1915)<223>+1<221>misc_feature<222>(5812)...(5150)<223>REP(互補鏈)<221>misc_feature<222>(794)...(261)<223>genatmicin乙?；D(zhuǎn)移酶(互補鏈)<22>-35_信號<222>(1840)...(1845)<400>1accttcggga gcgcctgaag cccgttctgg acgccctggg gccgttgaat cgggatatgc 60aggccaaggc cgccgcgatc atcaaggccg tgggcgaaaa gctgctgacg gaacagcggg120aagtccagcg ccagaaacag gcccagcgcc agcaggaacg cgggcgcgca catttccccg180aaaagtgcca cctggcggcg ttgtgacaat ttaccgaaca actccgcggc cgggaagccg240
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Asp Asn Leu Met Pro Val Glu Ser Pro Gln Asp Arg Asp Phe Tyr Gln310 315 320 325acc cag tac cag ttg ctg cag agc cgt tcg ctg gcg cgt gcg gtg atc3041Thr Gln Tyr Gln Leu Leu Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Ala Val Ile330 335 340cgg gaa gcc aag ctc gat cag gag ccg gcg ttc aag gag cag gtg gag3089Arg Glu Ala Lys Leu Asp Gln Glu Pro Ala Phe Lys Glu Gln Val Glu345 350 355gag gcg ctg gcc aaa gcc gcc gaa aag aat ccc gag gcg ggt aag tcg3137Glu Ala Leu Ala Lys Ala Ala Glu Lys Asn Pro Glu Ala Gly Lys Ser360 365 370ctc gat tcg cgg cag gcg atc gtc gag cgc agc ctc acc gat acg ttg3185Leu Asp Ser Arg Gln Ala Ile Val Glu Arg Ser Leu Thr Asp Thr Leu375 380 385ctc gcc ggg ctg gtg gtc gag ccg atc ctc aac tcg cgc ctg gtg tac3233Leu Ala Gly Leu Val Val Glu pro Ile Leu Asn Ser Arg Leu Val Tyr390 395 400 405gtc aat tac gat tcg cca gac ccg gtg ctg gcc gcc aag atc gcc aat3281Val Asn Tyr Asp Ser pro Asp Pro Val Leu Ala Ala Lys Ile Ala Asn410 415 420acg tac ccg aag gtg ttc atc gtc agc acc cag gaa cgc cgc atg aag3329Thr Tyr Pro Lys Val Phe Ile Val Ser Thr Gln Glu Arg Arg Met Lys425 430 435gcg tct tcg ttt gcg aca cag ttt ctg gct gag cgc ctg aag cag ttg3377Ala Ser Ser Phe Ala Thr Gln Phe Leu Ala Glu Arg Leu Lys Gln Leu440 445 450cgc gag aag gtc gaa gac tct gaa aag gat ctg gtc tcg tat tcg acc3425Arg Glu Lys Val Glu Asp Ser Glu Lys Asp Leu Val Ser Tyr Ser Thr455 460 465gaa gag cag atc gtg tcg gtt ggc gat gac aag ccc tcg ctg cct gcg3473Glu Glu Gln Ile Val Ser Val Gly Asp Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ala470 475 480 485cag aat ctg acc gat ctc aat gcg ttg ctg gca tcc gca cag gac gcc3521Gln Asn Leu Thr Asp Leu Asn Ala Leu Leu Ala Ser Ala Gln Asp Ala490 495 500cgg atc aag gcc gag tca gct tgg cgg cag gct tcc agt ggc gat ggc3569Arg Ile Lys Ala Glu Ser Ala Trp Arg Gln Ala Ser Ser Gly Asp Gly505 510 515atg tca ttg ccg cag gtg ttg agc agc ccg ctg att caa agc ctg cgc3617Met Ser Leu Pro Gln Val Leu Ser Ser Pro Leu Ile Gln Ser Leu Arg520 525 530
agc gag cag gtg cgt ctg acc agc gag tac cag cag aaa ctg tcg acc 3665Ser Glu Gln Val Arg Leu Thr Ser Glu Tyr Gln Gln Lys Leu Ser Thr535 540 545ttc aag ccg gat tac ccg gag atg cag cgc ctc aag gcg cag atc gaa 3713Phe Lys Pro Asp Tyr Pro Glu Met Gln Arg Leu Lys Ala Gln Ile Glu550 555 560 565gag tcg cgt cgt cag atc aat ggc gaa gtc atc aat atc cgt cag tcg 3761Glu Ser Arg Arg Gln Ile Asn Gly Glu Val Ile Asn Ile Arg Gln Ser570 575 580ctg aag gcg acc tac gac gcc tcc gtg cat cag gag cag ctg ctc aac 3809Leu Lys Ala Thr Tyr Asp Ala Ser Val His Gln Glu Gln Leu Leu Asn585 590 595gac cgc atc gcc ggt ctg cgg tcc aac gag ctg gat ctg cag agc cgc 3857Asp Arg Ile Ala Gly Leu Arg Ser Asn Glu Leu Asp Leu Gln Ser Arg600 605 610agc atc cgc tac aac atg ctc aag cgc gac gtc gac acc aac cgc cag 3905Ser Ile Arg Tyr Asn Met Leu Lys Arg Asp Val Asp Thr Asn Arg Gln615 620 625ctc tac gat gcg ctc ctg cag cgc tac aag gaa atc ggc gtg gcg agc 3953Leu Tyr Asp Ala Leu Leu Gln Arg Tyr Lys Glu Ile Gly Val Ala Ser630 635 640 645aac gtg ggc gcc aac aac gtg acc atc gtc gat acc gca gac gtg cct 4001Asn Val Gly Ala Asn Asn Val Thr Ile Val Asp Thr Ala Asp Val Pro650 655 660acg tct aag act tcg ccg aaa ctc aaa ttg aac ctc gcg ttg ggc ctg 4049Thr Ser Lys Thr Ser Pro Lys Leu Lys Leu Asn Leu Ala Leu Gly Leu665 670 675atc ttt ggc gta ttc ctg ggc gtg gct gtg gct ctg gtt cgc tac ttc 4097Ile Phe Gly Val phe Leu Gly Val Ala Val Ala Leu Val Arg Tyr Phe680 685 690ctg cgt ggg cct tct ccg agg tcg cgg ttg aac tga catcgtgatg 4143Leu Arg Gly Pro Ser Pro Arg Ser Arg Leu Asn *695 700ttgcaaaacg atggttaatt gaagtgacaa ctgattcagc gtggaaaagg tgggatcccg4203taaggtgcgg gctccctcgt ttgaaggttt gtctctgttg aaacaaaggg ctgtcgtgcg4263atctggggtc ggtaggtatt accgcggtga tcggacgaca ggatgattga aagctcgcgt4323gcgattcgta tgttcccccg catgcctgca ggtcgactct agagcggccg ccaccgcggt4383ggagctccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac4443aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc4503ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc4563gcagcctgaa tggcgaatgg aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa4623tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgac tgcgatgagt ggcagggcgg4683ggcgtaattt ttttaaggca gttattggtg cccttaaacg cctggtgcta cgcctgaata4743agtgataata agcggatgaa tggcagaaat tcgaaagcaa attcgacccg gtcgtcggtt4803
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1 5 10 15Leu Cys Ser Met Ser Leu Gly Ala Cys Ser Thr Gly Pro Glu Met Ala20 25 30Ser Ser Leu Pro His Pro Asp Pro Leu Ala Met Ser Thr Val Gln Pro35 40 45Glu Tyr Arg Leu Ala Pro Gly Asp Leu Leu Leu Val Lys Val Phe Gln50 55 60Ile Asp Asp Leu Glu Arg Gln Val Arg Ile Asp Gln Asn Gly His Ile65 70 75 80Ser Leu Pro Leu Ile Gly Asp Val Lys Ala Ala Gly Leu Gly Val Gly85 90 95Glu Leu Glu Lys Leu Val Ala Asp Arg Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Gln100 105 110Gln Pro Gln Ile Ser Val phe Val Gln Glu Ser Asn Gly Arg Arg Val115 120 125Thr Val Thr Gly Ala Val Asp Glu Pro Gly Ile Tyr Pro Val Ile Gly130 135 140Ala Asn Leu Thr Leu Gln Gln Ala Ile Ala Gln Ala Lys Gly Val Ser145 150 155 160Thr Val Ala Ser Arg Gly Asn Val Ile Val Phe Arg Met Val Asn Gly165 170 175Gln Lys Met Ile Ala Arg Phe Asp Leu Thr Glu Ile Glu Lys Gly Ala180 185 190Asn Pro Asp Pro Glu Ile Tyr Gly Gly Asp Ile Val Val Val Tyr Arg195 200 205Ser Asp Ala Arg Val Trp Leu Arg Thr Met Leu Glu Leu Thr Pro Leu210 215 220Val Met Val Trp Arg Ala Tyr Arg225 230<210>3<211>472<212>PRT<213>野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)<400>3Met Asn Ser Asp Asn Arg Ser Ser Ser Ser Gln Arg His Gly His Leu1 5 10 15Glu Leu Ala Asp Val Asp Leu Met Asp Tyr Trp Arg Ala Leu Val Ser20 25 30Gln Leu Trp Leu Ile Ile Leu Ile Ala Val Gly Ala Leu Leu Leu Ala35 40 45Phe Gly Ile Thr Met Leu Met Pro Glu Lys Tyr Arg Ala Thr Ser Thr50 55 60Leu Gln Ile Glu Arg Asp Ser Leu Asn Val Val Asn Val Asp Asn Leu65 70 75 80Met Pro Val Glu Ser Pro Gln Asp Arg Asp Phe Tyr Gln Thr Gln Tyr85 90 95Gln Leu Leu Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Ala Val Ile Arg Glu Ala100 105 110Lys Leu Asp Gln Glu Pro Ala Phe Lys Glu Gln Val Glu Glu Ala Leu115 120 125Ala Lys Ala Ala Glu Lys Asn Pro Glu Ala Gly Lys Ser Leu Asp Ser130 135 140Arg Gln Ala Ile Val Glu Arg Ser Leu Thr Asp Thr Leu Leu Ala Gly
145 150 155 160Leu Val Val Glu Pro Ile Leu Asn Ser Arg Leu Val Tyr Val Asn Tyr165 170 175Asp Ser Pro Asp Pro Val Leu Ala Ala Lys Ile Ala Asn Thr Tyr Pro180 185 190Lys Val Phe Ile Val Ser Thr Gln Glu Arg Arg Met Lys Ala Ser Ser195 200 205Phe Ala Thr Gln Phe Leu Ala Glu Arg Leu Lys Gln Leu Arg Glu Lys210 215 220Val Glu Asp Ser Glu Lys Asp Leu Val Ser Tyr Ser Thr Glu Glu Gln225 230 235 240Ile Val Ser Val Gly Asp Asp Lys Pro Ser Leu Pro Ala Gln Asn Leu245 250 255Thr Asp Leu Asn Ala Leu Leu Ala Ser Ala Gln Asp Ala Arg Ile Lys260 265 270Ala Glu Ser Ala Trp Arg Gln Ala Ser Ser Gly Asp Gly Met Ser Leu275 280 285Pro Gln Val Leu Ser Ser Pro Leu Ile Gln Ser Leu Arg Ser Glu Gln290 295 300Val Arg Leu Thr Ser Glu Tyr Gln Gln Lys Leu Ser Thr Phe Lys Pro305 310 315 320Asp Tyr Pro Glu Met Gln Arg Leu Lys Ala Gln Ile Glu Glu Ser Arg325 330 335Arg Gln Ile Asn Gly Glu Val Ile Asn Ile Arg Gln Ser Leu Lys Ala340 345 350Thr Tyr Asp Ala Ser Val His Gln Glu Gln Leu Leu Asn Asp Arg Ile355 360 365Ala Gly Leu Arg Ser Asn Glu Leu Asp Leu Gln Ser Arg Ser Ile Arg370 375 380Tyr Asn Met Leu Lys Arg Asp Val Asp Thr Asn Arg Gln Leu Tyr Asp385 390 395 400Ala Leu Leu Gln Arg Tyr Lys Glu Ile Gly Val Ala Ser Asn Val Gly405 410 415Ala Asn Asn Val Thr Ile Val Asp Thr Ala Asp Val Pro Thr Ser Lys420 425 430Thr Ser Pro Lys Leu Lys Leu Asn Leu Ala Leu Gly Leu Ile Phe Gly435 440 445Val Phe Leu Gly Val Ala Val Ala Leu Val Arg Tyr Phe Leu Arg Gly450 455 460Pro Ser Pro Arg Ser Arg Leu Asn465 470<210>4<211>31<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)<400>4ggaattccat atgttgatgc ccgagaagta c 31<210>5<211>33<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)
<400>5cgggatcctc aaaagatcag gcccaacgcg agg
權(quán)利要求
1.未經(jīng)巴氏消毒的黃原膠組合物，其來自于過量表達gumB和gumC的細胞，其中，所述的組合物的特性粘度比由不過量表達gumB和gumC的相應(yīng)菌株產(chǎn)生的黃原膠高至少20％。
2.如權(quán)利要求1所述的未經(jīng)巴氏消毒的黃原膠組合物，其特性粘度比由所述的相應(yīng)菌株產(chǎn)生的黃原膠高至少25％。
3.如權(quán)利要求1所述的未經(jīng)巴氏消毒的黃原膠組合物，其特性粘度比由所述的相應(yīng)菌株產(chǎn)生的黃原膠高至少30％。
4.黃原膠組合物，其包含一群具有分子長度范圍的黃原膠分子，其中，所述群中至少1％的黃原膠分子具有至少3μm的長度，所述長度用原子力顯微術(shù)測定。
5.如權(quán)利要求4所述的黃原膠組合物，其中所述群中至少5％的黃原膠分子具有至少3μm的長度，所述長度用原子力顯微術(shù)測定。
6.黃原膠組合物，其包含一群具有分子長度范圍的黃原膠分子，其中，所述群中至少1％的黃原膠分子具有至少4μm的長度，所述長度用原子力顯微術(shù)測定。
7.如權(quán)利要求6所述的黃原膠組合物，其中所述群中至少1％的黃原膠分子具有至少5μm的長度。
8.如權(quán)利要求6所述的黃原膠組合物，其中所述群中至少1％的黃原膠分子具有至少7um的長度。
9.黃原膠組合物，其包含一群具有分子長度范圍的黃原膠分子，其中，所述組合物中黃原膠分子的總質(zhì)量的至少5％是歸因于分子長度大于3μm的黃原膠分子，所述長度用原子力顯微術(shù)測定。
10.如權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物，其中，所述組合物中黃原膠分子的總質(zhì)量的至少10％是歸因于分子長度大于3μm的黃原膠分子，所述長度用原子力顯微術(shù)測定。
11.如權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物，其中，所述組合物中黃原膠分子的總質(zhì)量的至少15％是歸因于分子長度大于3μm的黃原膠分子，所述長度用原子力顯微術(shù)測定。
12.如權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物，其中，所述組合物中黃原膠分子的總質(zhì)量的至少20％是歸因于分子長度大于3μm的黃原膠分子，所述長度用原子力顯微術(shù)測定。
13.食物產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求1所述的黃原膠組合物。
14.食物產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求4所述的黃原膠組合物。
15.食物產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求6所述的黃原膠組合物。
16.食物產(chǎn)品，其包含權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物。
17.權(quán)利要求1、4、6和9中的任意一項所述的食物產(chǎn)品，其中所述食物選自色拉調(diào)味劑、糖漿、果汁飲料和冷凍甜點。
18.印刷染料，其包含權(quán)利要求1所述的黃原膠組合物。
19.印刷染料，其包含權(quán)利要求4所述的黃原膠組合物。
20.印刷染料，其包含權(quán)利要求6所述的黃原膠組合物。
21.印刷染料，其包含權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物。
22.石油鉆井液，其包含權(quán)利要求1所述的黃原膠組合物。
23.石油鉆井液，其包含權(quán)利要求4所述的黃原膠組合物。
24.石油鉆井液，其包含權(quán)利要求6所述的黃原膠組合物。
25.石油鉆井液，其包含權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物。
26.陶瓷釉，其包含權(quán)利要求1所述的黃原膠組合物。
27.陶瓷釉，其包含權(quán)利要求4所述的黃原膠組合物。
28.陶瓷釉，其包含權(quán)利要求6所述的黃原膠組合物。
29.陶瓷釉，其包含權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物。
30.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的黃原膠組合物。
31.藥物組合物，其包含權(quán)利要求4所述的黃原膠組合物。
32.藥物組合物，其包含權(quán)利要求6所述的黃原膠組合物。
33.藥物組合物，其包含權(quán)利要求9所述的黃原膠組合物。
34.如權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其是受控釋放制劑。
35.如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其是受控釋放制劑。
36.如權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其是受控釋放制劑。
37.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其是受控釋放制劑。
38.如權(quán)利要求34所述的藥物組合物，其是受控釋放制劑。
39.生產(chǎn)黃原膠聚合物制備物的方法，所述的黃原膠聚合物制備物相比起由野生型菌株產(chǎn)生的黃原膠聚合物制備物具有增加的粘度，所述方法包括在野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)培養(yǎng)物中，選擇性增加gumB和gumC基因產(chǎn)物的數(shù)量，而不增加orfX的基因產(chǎn)物的數(shù)量，也不增加選自gumD-gumG的基因的基因產(chǎn)物的數(shù)量，從而由所述培養(yǎng)物產(chǎn)生更高粘度的黃原膠聚合物制備物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述選擇性增加的步驟，是通過將一個或多個額外的gumB和gumC拷貝導(dǎo)入野油菜黃單胞菌來完成的。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述選擇性增加的步驟，是通過將一個或多個額外的gumB和gumC拷貝導(dǎo)入野油菜黃單胞菌，而不導(dǎo)入gumD-gumG的額外拷貝來完成的。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述選擇性增加的步驟，是通過將一個或多個額外的gumB和gumC拷貝導(dǎo)入野油菜黃單胞菌，而不導(dǎo)入orfX和gumD-gumG的額外拷貝來完成的。
43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的額外拷貝是在染色體外遺傳元件上。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述的染色體外遺傳元件是質(zhì)粒。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述質(zhì)粒是廣宿主范圍的質(zhì)粒。
46.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，額外的gumB和gumC拷貝被整合到野油菜黃單胞菌的基因組中。
47.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述選擇性增加的步驟，是通過使用誘導(dǎo)型啟動子和誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)gumB和gumC表達而完成的，所述誘導(dǎo)劑增加所述誘導(dǎo)型啟動子指導(dǎo)的表達。
48.如權(quán)利要求39所述的方法，進一步包括從所述制備物中回收更高粘度的黃原膠聚合物的步驟。
49.如權(quán)利要求39所述的方法，進一步包括從所述的更高粘度的黃原膠聚合物制備物中沉淀出黃原膠聚合物的步驟。
50.生產(chǎn)黃原膠聚合物制備物的方法，所述黃原膠聚合物制備物相比起由野生型菌株產(chǎn)生的黃原膠聚合物制備物具有增加的粘度，所述方法包括將野油菜黃單胞菌菌株在產(chǎn)生黃原膠聚合物的條件下，培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，其中，所述菌株相比起野生型菌株選擇性地產(chǎn)生更多的gumB和gumC基因產(chǎn)物，而不產(chǎn)生更多的orfX和選自gumD-gumG的基因產(chǎn)物。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，對于每一拷貝的gumD，所述菌株具有一個以上拷貝的gumB和gumC。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，對于每一拷貝的gumD-gumG，所述菌株具有一個以上拷貝的gumB和gumC。
53.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，對于選自gumD-gumG的基因的每一拷貝，所述菌株具有一個以上拷貝的gumB和gumC。
54.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，對于每一拷貝的orfX，所述菌株具有一個以上拷貝的gumB和gumC。
55.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，對于每一拷貝的orfX和gumD-gumG，所述菌株具有一個以上拷貝的gumB和gumC。
56.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述菌株攜帶一個或多個質(zhì)粒，所述質(zhì)?？偣矓y帶至少一個拷貝的gumB和gumC。
57.如權(quán)利要求50所述的方法，進一步包括從培養(yǎng)基中回收更高粘度的黃原膠聚合物的步驟。
58.如權(quán)利要求50所述的方法，進一步包括從培養(yǎng)基中沉淀黃原膠聚合物的步驟。
59.未經(jīng)巴氏消毒的黃原膠組合物，其來自于過量表達gumB和gumC的細胞，其中，所述的組合物的耐海水粘度比由不過量表達gumB和gumC的相應(yīng)菌株產(chǎn)生的黃原膠高至少10％。
60.如權(quán)利要求59所述的黃原膠組合物，當所述的耐海水粘度是在每1升去離子水含41.95g海鹽的溶液中，在0.86g黃原膠/升的濃度下進行測量時，所述耐海水粘度DR＞25。
61.如權(quán)利要求59所述的黃原膠組合物，其耐海水粘度比由不過量表達gumB和gumC的相應(yīng)菌株產(chǎn)生的黃原膠高至少15％。
62.石油鉆井液，其包含權(quán)利要求59所述的黃原膠組合物。
63.石油鉆井液，其包含權(quán)利要求61所述的黃原膠組合物。
全文摘要
增加黃原膠聚合物的分子長度，制備得到高粘度的黃原膠組合物。在食品、工業(yè)和油田應(yīng)用中，具有高的比粘度特性的黃原膠在等量濃度下提供更大的粘度。增加黃原膠粘度的方法包括誘導(dǎo)特定的關(guān)鍵基因，和增加特定的關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)。
文檔編號C07K14/195GK1829727SQ200480005602
公開日2006年9月6日 申請日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者Y·帕特爾, L·耶爾皮, J·C·施奈德, M·V·耶爾米尼 申請人:斯比凱克公司, 萊洛伊爾研究所基金會