專利名稱：：從抗凝全血生產(chǎn)的自體或同種促凝劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從抗凝全血生產(chǎn)速效的自體或同種促凝劑的方法。
背景技術(shù)：
：來源于人或動(dòng)物血漿的凝血酶是一種有效的血液和血液衍生物(純化血纖蛋白原、富血小板血漿(PRP)、血小板濃縮物(PC)、貧血小板血漿(PPP))的促凝劑。它作用于血纖蛋白原，將其轉(zhuǎn)化為血纖蛋白，血纖蛋白導(dǎo)致血纖蛋白基質(zhì)的形成。牛凝血酶(BT)作為止血?jiǎng)┑呐R床使用是常見的，不過人血漿源凝血酶只被許可與人血漿源血纖蛋白粘合劑，例如TISSEEL血纖蛋白粘合劑(Baxter公司)聯(lián)合使用作為各種外科操作中的局部止血?jiǎng)┖蛡谡澈蟿?。牛源凝血酶已?jīng)被用作外科處置(surgicalsetting)中實(shí)現(xiàn)臨床止血的標(biāo)準(zhǔn)(standard-of-care)數(shù)十年。它已經(jīng)被用作制備溶劑洗滌劑處理的混合人血漿來源的血纖蛋白粘合劑的工具。牛凝血酶也被用于凝血實(shí)驗(yàn)室(clotlaboratory)(例如血庫)制備的冷沉物和醫(yī)療點(diǎn)制備的(point-of-care-prepared)自體或同種富血小板血漿、血小板濃縮物或貧血小板血漿(分別為PRP、PC和PPP)。與牛凝血酶使用相關(guān)的危險(xiǎn)包括疾病傳播(牛海綿樣腦病，BSE)和抗人因子V抗體產(chǎn)生的可能性。盡管文獻(xiàn)還沒有報(bào)道臨床應(yīng)用牛凝血酶引起B(yǎng)SE傳播，但已經(jīng)報(bào)道了抗體的產(chǎn)生，其導(dǎo)致凝固時(shí)間異常(1-5)。已經(jīng)報(bào)道局部接觸經(jīng)層析法純化的牛凝血酶后出現(xiàn)人因子V的抑制物(6)。對局部牛凝血酶的接觸導(dǎo)致抗多種蛋白和糖抗原的抗體產(chǎn)生。已經(jīng)報(bào)道30％到50％的被接觸患者有這些抗體，它們是心磷脂性質(zhì)以及抗核抗體(7，8)。由于牛凝血酶的使用所相關(guān)的這些問題，已經(jīng)研究了從患者自身的血(自體)或供體血(同種)制備得到其它的促凝劑。目前，本發(fā)明的發(fā)明人生產(chǎn)了一種具有1到5分鐘凝固時(shí)間的前凝血?jiǎng)?，已證實(shí)當(dāng)它與PRP或PPP合用施用于硬組織移植材料(例如，自體移植、同種異體移植、異種移植和人造的)時(shí)是有效的。施用于這些移植材料的組合物導(dǎo)致這些移植材料的固結(jié)，這提供了顯著改善的操作性能以及簡化的對手術(shù)缺損部位的轉(zhuǎn)運(yùn)。獲得的這種形式的移植材料可與缺損部位適合并保持穩(wěn)定。PRP和PC中的某些蛋白的存在也有助于缺損的更快速的愈合。盡管具有1到5分鐘凝固時(shí)間的前凝血?jiǎng)┰谏鲜鲞m應(yīng)征中是有效的，但是它對某些軟組織施用可能不是有效的，使得需要一種具有更快凝固時(shí)間的非牛促凝劑。實(shí)現(xiàn)止血通常需要大約10秒的凝固時(shí)間(一般用牛凝血酶)。更長的凝固時(shí)間是不太理想的，并且可能在控制毛細(xì)血管出血上是不太有效的。迄今為止，對開發(fā)非牛、速效促凝劑的研究已經(jīng)集中于分離血液的細(xì)胞成分，然后應(yīng)用各種方法從血漿部分中分離蛋白。使用了例如冷沉淀法、物理化學(xué)沉淀法、微濾技術(shù)的使用、密度梯度技術(shù)等方法。已經(jīng)分離和表征了血漿部分。另外，也已研究了各種通常已知的沉淀劑，例如聚乙二醇(PEG)、硫酸銨和乙醇。這些試劑中的每一種在分離特定蛋白上都有某些優(yōu)點(diǎn)，但也導(dǎo)致其它蛋白的部分沉淀。盡管如此，為實(shí)現(xiàn)分離方法的最大效率，這些沉淀劑已經(jīng)被利用并施用于無細(xì)胞血漿。直到最近，主要的焦點(diǎn)已集中在施用于無細(xì)胞血漿的各種強(qiáng)度例如10％到25％的乙醇的使用(例如參見美國專利6,274,090，其公開了一種從單個(gè)供體的血漿制備穩(wěn)定的凝血酶成分的方法)。用這種方法制備凝血酶是費(fèi)時(shí)的并需要多個(gè)步驟包括在將血漿與乙醇接觸之前需要首先從全血制備血漿部分。雖然某些強(qiáng)度的施用于血漿的乙醇已經(jīng)提供了改進(jìn)的凝固時(shí)間，例如5到10秒凝固PRP或PPP(美國專利6,274,090)，但是在制備組合物1小時(shí)后，凝固時(shí)間增加到大于25秒，并且在制備后2小時(shí)，凝固時(shí)間增加到大于40秒。因此需要一種制備自體或同種促凝劑的方法，其中所述方法需要少量體積的全血，獲得于少于20秒內(nèi)導(dǎo)致凝塊的促凝劑的產(chǎn)生；生產(chǎn)保持活性大于4小時(shí)的促凝劑；并且生產(chǎn)需要總制備時(shí)間少于60分鐘的促凝劑。
發(fā)明內(nèi)容目前，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過去除血漿分離步驟以及通過將沉淀劑直接加入抗凝全血中，得到了一種具有由組合物長時(shí)間保持的快速凝固時(shí)間的人促凝劑。因此，通過減少從全血中分離血漿部分所需的時(shí)間量減少了制備促凝劑所需的總時(shí)間。重要的是，由于去除血漿分離步驟所發(fā)生的輕微溶血并沒有降低本發(fā)明方法所生產(chǎn)的促凝劑的工作效率。而且，不被任何具體的理論所限制，目前認(rèn)為紅細(xì)胞的存在實(shí)際上可能有助于細(xì)胞的凝集和抑制物蛋白的沉淀。因此，一方面本發(fā)明涉及從抗凝全血制備速效促凝劑的快速方法，所述方法包括從供體得到一體積抗凝全血；將所述抗凝全血與沉淀劑混合；溫育混合物一段足以使細(xì)胞和血漿成分發(fā)生沉淀的時(shí)間，之后分離沉淀物得到上清液，其中所述上清液含有速效促凝劑。在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及從抗凝全血制備自體促凝劑的快速方法，所述方法包括從為其制備促凝劑的患者得到一體積抗凝全血；將所述抗凝全血與沉淀劑混合；溫育混合物一段足以使細(xì)胞和特定的血漿成分發(fā)生沉淀的時(shí)間，之后分離獲得的沉淀物以得到上清液，其中所述上清液含有自體或同種促凝劑。本發(fā)明的方法可按規(guī)模來生產(chǎn)各種所需體積的促凝劑以及用從患者或同種供體獲得的相對少量體積，約8到10ml的全血生產(chǎn)促凝劑。用抗凝劑例如ACD抗凝全血，ACD任選含有濃度為5-10mg/mlACD的甘露糖醇。在另一方面，本發(fā)明涉及無需血漿分離而制備自體促凝劑的方法。本發(fā)明的方法包括用沉淀劑，例如乙醇直接沉淀抗凝全血，其與先前從全血分離的血漿相反。在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及由上述方法生產(chǎn)的人血部分，其包含80-90％的凝血酶原-凝血酶蛋白、檢測不到量的血纖蛋白原和20-30％基線水平的ATIII、蛋白C和蛋白S。圖1是描述五個(gè)供體的從經(jīng)凝血酶激活的血小板濃縮物血樣釋放的PDGF-AB的水平與血小板計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性的圖。圖2是描述五個(gè)供體的從經(jīng)凝血酶激活的血小板濃縮物血樣釋放的TGF-β1的水平與血小板計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性的圖。圖3-7是描述經(jīng)牛凝血酶和自體凝血酶激活的五個(gè)供體的血小板濃縮物樣本的PDGF-AB和TGF-β1的生長因子釋放動(dòng)力學(xué)的圖。具體實(shí)施例方式將本文所列出的所有專利、申請、出版物或其它參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。在隨后的描述中，關(guān)于術(shù)語的使用將遵循以下的一些約定ACD枸櫞酸-葡萄糖CaCl2氯化鈣CPD枸櫞酸鹽磷酸鹽葡萄糖EDTA乙二胺四乙酸EtOH酒精，乙醇PEG聚乙二醇PPP貧血小板血漿PRP富血小板血漿PC血小板濃縮物術(shù)語“抗凝劑”是指一種能阻止全血凝固的物質(zhì)。術(shù)語“自體血”是指患者自身的血。術(shù)語“同種血”是指從不同于為其制備促凝劑的個(gè)體的血液供體得到的血。術(shù)語“促凝劑”是指一種能導(dǎo)致全血或血液成分(血漿、血小板)形成凝塊的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明分離自體促凝劑的方法學(xué)是基于乙醇分級分離的改變。不過，與標(biāo)準(zhǔn)或常用的原材料例如血漿或冷沉淀貧血漿相反，所描述的方法利用了全血樣本。因此，本發(fā)明的方法包括a)從供體得到一體積抗凝全血；b)將所述抗凝全血與沉淀劑混合；c)將b)的混合物溫育一段足以使細(xì)胞和特定的血漿成分發(fā)生沉淀的時(shí)間；d)將c)中得到的沉淀物與上清液分離(通常用離心和/或過濾)；和e)收集上清液，其中所述上清液用作促凝劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將供體的血取到含有抗凝劑例如枸櫞酸-葡萄糖的血液收集管或注射器中而得到少量體積的抗凝全血。在充分但輕輕的混合后，將抗凝全血轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃或塑料管中，并將一種沉淀劑例如乙醇與抗凝全血混合。在室溫下溫育所得到的混合物一段足以使血液的細(xì)胞和特定的血漿成分發(fā)生沉淀的時(shí)間，約為20-60分鐘。充分的沉淀將通過凝集的細(xì)胞和不溶性的蛋白組成的粘性沉淀物的形成來證實(shí)。然后將混合物以1000-3000×g離心約5-30分鐘以將沉淀物壓縮在管的底部。最后，從管中取出沉淀物上的上清液；上清液為含有所需的促凝劑的混合物部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備促凝劑的全血的體積將是小的，例如少到為8到10ml。將血液取到含有非肝素抗凝劑的血液收集管(例如VACUTAINER管)或注射器中?？捎糜诒景l(fā)明的抗凝劑的實(shí)例包括結(jié)合或螯合鈣離子的抗凝劑，例如枸櫞酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖(CPD)或枸櫞酸-葡萄糖(ACD)、枸櫞酸鈉等等。在一般的情況下，優(yōu)選的抗凝劑是枸櫞酸-葡萄糖(ACD)和ACD/甘露糖醇。一般的沉淀劑將包括例如聚乙二醇、硫酸銨或乙醇，以及如氯化鈣或氯化鎂這樣的成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用乙醇作為沉淀劑。乙醇的終濃度將優(yōu)選為在10％和25％之間。因此，對于8到10ml體積的起始全血，將1到2ml100％或95％的乙醇加入該全血中。另外將約0.05到0.4ml的10％氯化鈣溶液加入抗凝全血和沉淀劑的混合物中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，對于8ml體積的起始抗凝全血，使用1.6ml乙醇和0.1ml10％氯化鈣的混合物。關(guān)于足以使細(xì)胞和特定的血漿成分發(fā)生沉淀的時(shí)間，預(yù)期在約5到45分鐘內(nèi)在管中形成沉淀。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用ACD和甘露糖醇的混合物來抗凝起始體積的全血，其中甘露糖醇的濃度為約5-10ml/1mlACD。為了舉例說明本發(fā)明的方法，提供了以下的實(shí)施例。實(shí)施例1利用放射免疫擴(kuò)散法(RID)進(jìn)行自體凝血酶中和全血樣本中的相關(guān)血漿蛋白水平的比較。將全血收集在含有ACD-甘露糖醇抗凝劑的試管中。然后將抗凝全血與2ml95％乙醇溶液一起溫育30分鐘。之后在SMARTPREPTM系統(tǒng)(HarvestTechnologies，Plymouth，MA)中離心混合物，同時(shí)制備了血小板濃縮物。使用血清過濾系統(tǒng)例如血清過濾式分離器(例如FisherBrand，F(xiàn)isherScientific，Rochester，NY)或通過使用注射器吸取上清液將含有凝血酶的上清液與沉淀的細(xì)胞和特定的血漿成分分離。如下制備貧血小板血漿。將來自用于制備自體凝血酶的同一供體的全血收集到ACD抗凝劑溶液(CytosolLaboratories，Braintree，MA)中。離心血樣并得到用于測試的等分血漿。將等分血漿用作用于放射免疫擴(kuò)散法(RID)分析的基線樣本。如先前的描述制備自體凝血酶(AT)?；镜兀瑢⒕?9)毫升全血收集到1mlACD-甘露糖醇抗凝劑(CytosolLaboratories，Braintree，MA)中。將八(8)ml抗凝血與1.7ml乙醇-氯化鈣溶液(CytosolLaboratories，Braintree，MA)在室溫下一起溫育30分鐘。然后在SMARTPREP2系統(tǒng)中離心混合物。用血清過濾系統(tǒng)將含有自體凝血酶的上清液與沉淀的蛋白和紅細(xì)胞分離。使用RID分析所得到的上清液。對14個(gè)供體進(jìn)行所有的RID。分析以下蛋白的水平蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III、白蛋白、血纖蛋白原、因子XIII。分析PPP樣本以得到上述蛋白的基線水平。分析含有AT的AT上清液樣本的上述所提及的蛋白的水平以確定乙醇分級分離導(dǎo)致的這些蛋白的去除率。放射免疫擴(kuò)散操作從BindingSiteLtd.(BirminghamUK)得到RID板，并按廠家說明書使用。從箔袋中取出RID板，檢查破損并在室溫下敞開放置10-15分鐘。接著，輕輕地混合校準(zhǔn)溶液并根據(jù)需要稀釋。在測定前以1/10稀釋對照和測試樣本。在使用前即刻輕輕混合校準(zhǔn)、對照和測試樣本。用5μl樣本填裝所需數(shù)目的孔并容許擴(kuò)散30分鐘。對于白蛋白分析，將板在室溫下平放至少48小時(shí)，對于抗凝血酶III分析為至少72小時(shí)，對于因子XIII、蛋白C和S以及血纖蛋白原為至少96小時(shí)。從RID參照表中直接讀取對應(yīng)于每個(gè)環(huán)的直徑的樣本濃度。表1和2中顯示了研究結(jié)果。通過凝固血小板濃縮物來證實(shí)自體凝血酶制劑的活性。兩種比例的平均凝固時(shí)間都在我們的預(yù)期范圍內(nèi)。在外面的實(shí)驗(yàn)室所分析的三個(gè)樣本中，制劑中保留了85％的凝血酶原。血纖蛋白原被完全從自體凝血酶制劑中去除?？鼓窱II，一種凝血酶活化的有效抑制劑，平均減少了79.86±2.6％。剩余的20％抗凝血酶III水平被認(rèn)為是在臨床缺乏(clinicaldeficiency)的范圍內(nèi)。在另外溫育4小時(shí)時(shí)，ATIII、蛋白C和蛋白S的去除沒有增加(數(shù)據(jù)沒有顯示)。表1提供了自體凝血酶和制備自體凝血酶的全血樣本的血漿中的蛋白C、蛋白S和抗凝血酶III的蛋白水平的比較。表2顯示在這些相同的樣本中因子XIII、白蛋白和血纖蛋白原的水平。表1血漿和自體凝血酶中的蛋白水平*基線水平(即血漿樣本)**自體凝血酶中的水平***去除的占基線水平的百分比表2血漿和自體凝血酶中的蛋白水平*基線水平(即血漿樣本)**自體凝血酶中的水平***去除的占基線水平的百分比因此，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的上清液含有80-90％凝血酶原-凝血酶蛋白。在上清液中沒有檢測到血纖蛋白原，以及只有基線水平的20-30％的ATIII、蛋白C和蛋白S。上清液中的血紅蛋白的測定大于6％的乙醇濃度可造成全血樣本的溶血。如先前所提及的，將甘露糖醇加入抗凝劑中以減少微囊泡的形成并減輕由乙醇引入造成的溶血。如表3所示，在自體凝血酶制劑中的平均總血紅蛋白為69mg。這相應(yīng)于8％的平均溶血百分比，其對于局部應(yīng)用是無關(guān)緊要的。表3殘余乙醇水平的測定用經(jīng)認(rèn)證的測試實(shí)驗(yàn)室(ChemicLaboratories，Canton，MA)測定乙醇百分比(v/v)。測試的產(chǎn)品包括制備自體凝血酶的全血樣本的血漿、自體凝血酶產(chǎn)品和血小板濃縮物凝固后得到的上清液。后一種產(chǎn)品血小板凝膠將含有局部施用后將存在的乙醇水平。在使用自體凝血酶作為凝固激活劑的血小板濃縮物中形成凝塊。獲得來自全血的PPP樣本、AT上清液和凝塊釋放物(releastate)樣本用于如上所述的測試。對五個(gè)供體進(jìn)行測試。將0.5mlPC加入12×75mm硼硅玻璃培養(yǎng)管中。用校準(zhǔn)的移液管以1∶3或1∶5比例加入AT。來回傾斜試管直到形成結(jié)實(shí)的凝塊。然后離心凝塊得到上清液。由ChemicLaboratories，Canton，Massachusetts進(jìn)行乙醇分析。結(jié)果顯示在表4中。在全血樣本中觀察到的痕量乙醇顯然是用于準(zhǔn)備靜脈取血部位的乙醇的結(jié)果。在自體凝血酶和血小板凝膠中測得的水平均在預(yù)期的參數(shù)內(nèi)。表4自體凝血酶及其產(chǎn)品中存在的乙醇百分比(v/v)因此，當(dāng)體外將促凝劑與血小板濃縮物組合產(chǎn)生凝膠時(shí)，殘余的乙醇水平少于4％。當(dāng)體內(nèi)施用于受傷部位時(shí)，這一殘余濃度將進(jìn)一步顯著地降低。自體凝血酶激活的血小板濃縮物和貧血小板血漿的凝固時(shí)間的比較進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)室凝固時(shí)間研究以證實(shí)促凝劑的功效。使用自體凝血酶引發(fā)凝血以對血小板濃縮物和貧血小板血漿進(jìn)行凝固時(shí)間的測定。對14個(gè)供體進(jìn)行所有的測試。對凝固時(shí)間進(jìn)行測試兩次。進(jìn)行測試的個(gè)體和計(jì)時(shí)/記錄凝固時(shí)間的個(gè)體獨(dú)立進(jìn)行。在離心后四個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行凝固測試傾倒和回收AT后即刻的0時(shí)間、制備自體凝血酶后的2小時(shí)、4小時(shí)和6小時(shí)。簡單地，將0.5mlPC加入12×75mm硼硅玻璃培養(yǎng)管中。用校準(zhǔn)的移液管以1∶3或1∶5的比例將AT加入含有PC的試管中。當(dāng)加入AT時(shí)，立即啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。來回傾斜試管直到形成結(jié)實(shí)的凝塊。停止計(jì)時(shí)器并記錄凝固時(shí)間。在指定的時(shí)間間隔重復(fù)該操作。自體凝血酶激活的血小板濃縮物的凝固時(shí)間顯示在表5中。表5AT激活的血小板濃縮物的凝固時(shí)間(秒)*0時(shí)間＝制備后即刻在0時(shí)間和6小時(shí)時(shí)，兩個(gè)比例的凝固時(shí)間沒有顯著性差異。在2小時(shí)(p＝0.004)和4小時(shí)(p＝0.013)時(shí)，兩個(gè)比例的凝固時(shí)間的差異具有顯著性。更重要的事實(shí)為以3∶1的比例，2、4和6小時(shí)的凝固時(shí)間顯著地短于0時(shí)間的凝固時(shí)間(p＝0.001)。如表6所示，以3∶1的比例，在0時(shí)間時(shí)28.75％的凝固時(shí)間為20秒或更長，僅僅50％為10秒或更短。在其它時(shí)間間隔，兩個(gè)比例的所有的凝固時(shí)間都小于20秒使用3∶1的比例，64-85％的凝固時(shí)間為10秒或更短。這與在這些研究中同時(shí)進(jìn)行的觀察到的4到6秒的牛凝固時(shí)間相比更有利。表6自體凝血酶激活的血小板濃縮物的凝固時(shí)間的分布盡管自體凝血酶激活的貧血小板血漿的凝固時(shí)間的結(jié)果稍微更長些，但它與那些用血小板濃縮物得到的結(jié)果平行(表7)。在0時(shí)間的兩個(gè)比例之間沒有顯著性差異(p＝0.695)。以3∶1的比例，在2和4小時(shí)的凝固時(shí)間顯著短于0時(shí)間的凝固時(shí)間(p＝0.0013)。雖然貧血小板血漿的凝固時(shí)間有輕微的重新分布，但凝固時(shí)間與血小板濃縮物的凝固時(shí)間相似(表8)。表7自體凝血酶激活的貧血小板血漿的凝固時(shí)間(秒)表8自體凝血酶激活的貧血小板血漿的凝固時(shí)間的分布凝血酶等價(jià)性的測定血小板濃縮物的凝固時(shí)間的比較利用血小板濃縮物和三個(gè)水平的人血纖蛋白原作為評價(jià)材料檢查與牛凝血酶比較自體凝血酶的效價(jià)。如下制備牛凝血酶(BT)。將5.0ml10％CaCl2溶液注入5000單位冷凍干燥的凝血酶的小瓶中并輕輕倒轉(zhuǎn)。然后將BT連續(xù)稀釋為1000、500、250、125和62.5單位/ml。隨后將BT以1∶10比例加入血小板濃縮物中。如上所述測定凝固時(shí)間。表9比較了范圍為466×103/μl到1428×103/μl水平的血小板濃縮物的凝固時(shí)間。血小板濃縮物對自體凝血酶的比例為3∶1時(shí)，用自體凝血酶獲得的平均凝固時(shí)間為9.17±1.7秒。用濃度為250單位/ml的牛凝血酶獲得相當(dāng)?shù)钠骄虝r(shí)間(9.00±1.7秒)?？紤]到以10∶1配給(血小板濃縮物比凝血酶)進(jìn)行的牛凝血酶研究的事實(shí)，這表明自體凝血酶與25單位/ml水平的牛凝血酶相當(dāng)。如表10所示，以5∶1比例的自體凝血酶的凝固時(shí)間(10.83秒)在相似的范圍內(nèi)。表9使用牛和自體凝血酶激活的血小板濃縮物的凝固時(shí)間(秒)不同水平的純化的人血纖蛋白原的凝固時(shí)間根據(jù)使用說明書，使用SMARTPREP2系統(tǒng)如下制備血小板濃縮物(PC)和貧血小板血漿(PPP)。用設(shè)有隔片的30ml注射器取出PPP，以留下7ml容積在PlasticDisposable(PD)中，并將取出的PPP轉(zhuǎn)移到50ml試管中。測量總體積。將血小板重懸于該7ml體積中，轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的50ml試管中，并測量總體積。將0.5mlPC和PPP樣本轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中以進(jìn)行CBC分析。通過將5.0ml10％CaCl2注入5000單位干燥的凝血酶的小瓶中來制備所用的牛凝血酶(BT來自JonesPharmaInc.，MiddletonWI)。制備BT的5種稀釋液1000、500、250、125和62.5單位/ml。以1∶10比例將BT加入血纖蛋白原中，其中血纖蛋白原的體積為0.5ml。如下制備自體凝血酶(BT)。將九(9)ml全血收集到1mlACD-甘露糖醇抗凝劑中。將八(8)ml抗凝血與1.7ml乙醇-氯化鈣溶液一起溫育45分鐘。然后在SMARTPREP2系統(tǒng)中離心混合物，同時(shí)制備了血小板濃縮物。使用分離管將沉淀的蛋白和紅細(xì)胞與含有凝血酶的上清液分離。以1∶3和1∶5的比例將AT加入血纖蛋白原中。從SigmaBiologicals(St.Louis，MO)得到干燥形式的人血纖蛋白原，并分析其具有91％的可凝固性(clottable)。測試在蒸餾水中的600、300和150mg/dL三個(gè)水平的血纖蛋白原。用自體凝血酶和牛凝血酶作為凝血起始劑進(jìn)行血纖蛋白原的凝固時(shí)間測定。從9個(gè)全血樣本制備自體凝血酶。如上述的其它凝固研究一樣，進(jìn)行測試的個(gè)體和計(jì)時(shí)/記錄凝固時(shí)間的個(gè)體獨(dú)立工作。血纖蛋白原測試使用校準(zhǔn)的移液管將0.5ml血纖蛋白原轉(zhuǎn)入12×75mm硼硅玻璃培養(yǎng)管中。使用校準(zhǔn)的移液管以1∶3或1∶5比例加入AT。當(dāng)全部體積的AT均加入時(shí)，啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。來回傾斜玻璃管直到形成結(jié)實(shí)的凝塊。然后停止計(jì)時(shí)器并記錄凝固時(shí)間。用牛凝血酶/CaCl2激活劑代替自體凝血酶重復(fù)上述測試。發(fā)現(xiàn)Children’sHospital和Brigham&Women’sHospital(Boston，MA)的100個(gè)連續(xù)外科患者的平均血纖蛋白原水平為268±27mg/dL。血纖蛋白原是一種急性期反應(yīng)物；在具有慢性臨床病況的患者(即慢性靜脈或糖尿病性潰瘍、關(guān)節(jié)炎、椎間盤脫出)中，600-800mg/dL水平不是罕見的。這是本研究中選擇的血纖蛋白原水平的基礎(chǔ)。如表10所示，使用3∶1和5∶1兩個(gè)比例的自體凝血酶三個(gè)水平的血纖蛋白原的凝固時(shí)間均顯著長于對血小板濃縮物觀察到的凝固時(shí)間。這不是意料之外的，因?yàn)檠“逶隗w外和體內(nèi)的凝塊形成中均扮演著必不可少的作用(7)。表10自體凝血酶激活的不同水平的血纖蛋白原的凝固時(shí)間(秒)當(dāng)用不同的牛凝血酶稀釋液評價(jià)不同水平的血纖蛋白原的凝固時(shí)間時(shí)，觀察到了這一相同的模式。125單位/ml牛凝血酶激活的600mg/dL水平的血纖蛋白原的凝固時(shí)間為13.75±0.9秒，以及300mg/dL時(shí)為16.25±3.8秒。這些數(shù)值與當(dāng)用3∶1比例的自體凝血酶凝固600和300mg/dL水平的血纖蛋白原時(shí)觀察到的結(jié)果相似(表11)。表11使用根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的自體凝血酶(AT)的凝固時(shí)間(8-12秒)與我們以前使用100單位/ml牛凝血酶(BT)和500單位/ml人凝血酶的研究是等價(jià)的。組織培養(yǎng)物研究Slater等已證明血小板濃縮物對人胎兒成骨細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)揮刺激作用并保持它們的分化功能(10)。也已證明高水平的血小板濃縮物釋放物增強(qiáng)人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的增殖(11)。本研究的目的是評價(jià)與血小板濃縮物組合的自體凝血酶中的殘余乙醇是否抑制培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞和hMSC的生長。在一個(gè)共培養(yǎng)系統(tǒng)中，用放置在用人成纖維細(xì)胞鋪板的培養(yǎng)孔上面的插入物中的自體凝血酶或牛凝血酶凝固血小板濃縮物。培養(yǎng)細(xì)胞3天和5天。將鋪板的hMSC與血小板濃縮物釋放物一起培養(yǎng)。從由AT或BT激活并溫育3天和5天的凝塊制得釋放物。將釋放物直接加入培養(yǎng)基中并與細(xì)胞一起培養(yǎng)。根據(jù)使用說明書，用SMARTPREP2系統(tǒng)制備血小板濃縮物。然后將血小板重懸于7ml體積中，將其轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的50ml管中并測量總體積。將冷凍的人成纖維細(xì)胞(CambrexCorp.，EastRutherford，NJ)解凍并以～3.3×104細(xì)胞/孔的密度鋪于6孔板中。在補(bǔ)充有MSCGMbulletkit、谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC(CambrexCorp.，EastRutherford，NJ)，并將其以～3.3×104細(xì)胞/孔的密度種植在6孔板中。如前述制備牛凝血酶(BT)/CaCl2和自體凝血酶(AT)。將BT和AT分別以1∶10和1∶3的比例加入PC中。在成纖維細(xì)胞和hMSC生長的研究中，使用自體凝血酶和牛凝血酶作為凝固激活劑使血小板濃縮物形成凝塊。將供給培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的混合物溫育3、5和7天，而將施用給hMSC的混合物溫育2小時(shí)以及3和5天。對照由在上面的培養(yǎng)基空插入物組成。通過血小板凝膠插入物將凝塊釋放物供給成纖維細(xì)胞。通過離心含有凝塊的試管并將釋放物直接施用到hMSC上將凝塊釋放物供給hMSC。為如下每種混合物準(zhǔn)備6個(gè)無菌管1.血小板濃縮物和牛凝血酶；2.血小板濃縮物和自體凝血酶；和3.血小板濃縮物和自體前凝血?jiǎng)?。向培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入2ml新鮮培養(yǎng)基。制備自體凝血酶、牛凝血酶或自體前凝血?jiǎng)┑哪げ迦胛?，使其凝固并將其放置在含有成纖維細(xì)胞的孔的上面。對照用在上面的空插入物和培養(yǎng)基制備。然后向每個(gè)插入物的上面加入1.5ml預(yù)加溫的培養(yǎng)基。在37℃5％CO2下培養(yǎng)培養(yǎng)物48小時(shí)。在培養(yǎng)開始時(shí)，取出其中每種插入物的一個(gè)并將細(xì)胞拍照。在第5天，取出全部插入物并將細(xì)胞拍照。重復(fù)測試，將所有插入物培養(yǎng)3、5或7天，每次都取出插入物檢查并拍照細(xì)胞的外觀。人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞種植于培養(yǎng)板后，容許細(xì)胞粘附大約2.5小時(shí)。將PC-激活劑混合物溫育2小時(shí)。從培養(yǎng)物中吸取舊培養(yǎng)基，并將含有10％AT-PC釋放物或10％BT-PC釋放物的新鮮預(yù)加溫培養(yǎng)基直接加入細(xì)胞中。48小時(shí)后，檢查培養(yǎng)板并拍照。用3和5天的釋放物重復(fù)測試。與對照細(xì)胞相比，用AT或BT制備的凝塊培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞看起來全部很健康并生長很好(數(shù)據(jù)沒有顯示)。與對照細(xì)胞相比，用AT和BT的釋放物培養(yǎng)的hMSC外觀看起來很健康并生長很好。還使用與AT和BT兩種促凝劑與血小板濃縮物混合后的凝塊上清液一起培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行組織培養(yǎng)物研究。接觸測試混合物1小時(shí)，對照或處理組之間的細(xì)胞形態(tài)或密度沒有變化。剩下與BT上清液接觸24小時(shí)的培養(yǎng)物表現(xiàn)為具有致密核的圓細(xì)胞。AT處理的物質(zhì)的細(xì)胞形態(tài)與對照相似。生長因子釋放動(dòng)力學(xué)血小板在傷口愈合中具有雙重作用。它們參與實(shí)現(xiàn)止血的凝固過程，并且是它們釋放的啟動(dòng)傷口愈合級聯(lián)反應(yīng)的生長因子的儲(chǔ)庫。盡管生長因子非常有效，但是當(dāng)它們被注射或攝取時(shí)，很快降解。因此，來自血小板凝膠的生長因子以持續(xù)方式的控釋是本發(fā)明在傷口愈合中的重要部分。為釋放血小板α顆粒的生長因子，必需使用激活劑。下面的研究中所利用的方法與那些臨床上用于產(chǎn)生血小板凝膠的方法一致，并接近地模擬了體內(nèi)發(fā)生的過程。目前，通過將血小板濃縮物與牛凝血酶/氯化鈣混合物混合來啟動(dòng)生長因子的釋放。這個(gè)研究比較了牛凝血酶和自體凝血酶的釋放動(dòng)力學(xué)。通過收集接觸激活劑、牛凝血酶和自體凝血酶的血小板濃縮物形成的凝塊(血小板凝膠)析出(express)的上清液測定釋放動(dòng)力學(xué)。在制備血小板凝膠后1、2和4小時(shí)以及此后的每天共6天離心后收集上清液。將上清液儲(chǔ)存于-80℃下直到檢測。用酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(ELISA)測定生長因子(人血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB))的水平。如下制備血小板濃縮物和貧血小板血漿。用60ml注射器獲取全血。根據(jù)使用說明書，用SMARTPREP2系統(tǒng)制備血小板濃縮物(PC)和貧血小板血漿(PPP)。將血小板重懸于10ml血漿中，并將濃縮物轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的50ml小瓶中。將0.5mlPC和PPP樣本轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中以用于CBC分析。如上所述制備牛凝血酶(BT)，并以1000單位/ml的稀釋液使用。將BT以1∶10比例加入PC中。如上所述制備自體凝血酶(AT)并以1∶3比例將其加入PC中。使用自體凝血酶和牛凝血酶作為凝固激活劑，在PC中形成凝塊。對已經(jīng)溫育1、2、4小時(shí)以及此后每天共6天時(shí)間的凝塊析出的上清液進(jìn)行檢測。測試所有樣本的PDGF-AB生長因子的水平。如下所有測試進(jìn)行兩次。用校準(zhǔn)的移液管將1.0mlPC轉(zhuǎn)移到硼硅玻璃培養(yǎng)管中。然后使用以1∶10比例添加的BT或以1∶3比例添加的AT使樣本凝固。一旦將激活劑加入PC中，在室溫下溫育凝塊一段指定的時(shí)間。溫育結(jié)束時(shí)，用H4000轉(zhuǎn)子的SorvalRC3C離心機(jī)(SorvallInstruments，Newton，CT)2500rpm離心凝塊10分鐘。取出上清液，測量其體積，并將其轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中，儲(chǔ)存于-80℃下直到檢測。在1、2和4小時(shí)以及之后每天共6天時(shí)間進(jìn)行以上操作。根據(jù)使用說明書，使用用ELISA試劑盒(R&DSystems，Minneapolis，MN)得到的測量計(jì)算出所有時(shí)間點(diǎn)的生長因子的濃度。與在所有的生物學(xué)模型中一樣，血小板濃度、血小板產(chǎn)量和生長因子釋放具有個(gè)體變異。下面的數(shù)據(jù)顯示激活劑激活的血小板生長因子的釋放存在一定程度的變異性。無論激活劑是牛凝血酶、ADP或自體凝血酶，這種變異性均存在。圖3到圖7顯示用牛凝血酶和自體凝血酶激活的五個(gè)供體的血小板濃縮物血樣的生長因子的體外釋放動(dòng)力學(xué)(PDGF-AB和TGF-β1)。在這一體外測試模型中，用牛凝血酶，生長因子完全釋放發(fā)生在凝塊形成后的最初4小時(shí)內(nèi)，之后在7天時(shí)間內(nèi)其水平逐漸降低。用自體凝血酶，生長因子釋放逐漸增加，在48到72小時(shí)后達(dá)到最高水平。取決于生長因子，這些最高水平最少達(dá)到用牛凝血酶時(shí)所看到的生長因子水平的80％，或超過用牛凝血酶時(shí)的最高生長因子水平。以前，我們已證明血小板數(shù)目和生長因子水平之間正相關(guān)(8)。在本研究中，將血小板濃縮物懸浮于10ml中。臨床上，自體凝血酶將與懸浮于7ml中的血小板濃縮物一起使用。這將增加這些血小板濃縮物所釋放的生長因子水平～30％。已報(bào)道注射的生長因子的體內(nèi)半衰期為數(shù)分鐘，因此持續(xù)緩慢增加將是更為有利的(9)。用自體凝血酶，生長因子的釋放動(dòng)力學(xué)支持緩慢持續(xù)增加。牛凝血酶使生長因子立即釋放，沒有隨時(shí)間的進(jìn)一步增加。因此，本發(fā)明的方法提供一種系統(tǒng)，其提供能應(yīng)用于臨床的生長因子的緩釋。為測定釋放動(dòng)力學(xué)，通過在凝固后的規(guī)定時(shí)間收集BT或AT與相同的血小板濃縮物形成的凝塊的上清液測定生長因子。BT應(yīng)用于血小板濃縮物導(dǎo)致生長因子的立即釋放；并且在5天的觀察時(shí)間內(nèi)沒有進(jìn)一步的增加。使用AT的生長因子釋放的動(dòng)力學(xué)表明在應(yīng)用4小時(shí)內(nèi)有20-30％的釋放，并且有每天都增加的釋放，在應(yīng)用后5天達(dá)到最高。為便于容易地應(yīng)用所公開的速效非牛促凝劑的制備方法，可以將各種試劑和所需的醫(yī)療器械包裝并作為完備的試劑盒提供。用于實(shí)踐本發(fā)明的方法的試劑盒的一個(gè)實(shí)施方案可以包括·帶有塞子的玻璃或塑料管·血清過濾系統(tǒng)，例如血清分離器裝置、適用于從沉淀物中吸取上清液的鈍頭管或移液管系統(tǒng)·帶鈍針頭的3ml注射器·帶鈍針頭的10ml注射器·含有ACD或ACD/甘露糖醇的小瓶·含有EtOH/CaCl2的小瓶·TrayPakTM和說明書。因此，本發(fā)明提供了具有以下特征的自體或同種促凝劑的制備方法1.其可以從全血樣本制備；2.可以在室溫下進(jìn)行用于制備方法的溫育；3.該方法可使用SMARTPREP系統(tǒng)同時(shí)制備血小板濃縮物或作為獨(dú)立的操作制備；4.全血和沉淀物的溫育時(shí)間為45分鐘或更短；5.獲得的自體促凝劑制劑在臨床可接受的時(shí)間內(nèi)足夠強(qiáng)地凝固血小板濃縮物或貧血小板血漿；6.可通過各種技術(shù)或裝置將自體促凝劑連同血小板濃縮物或貧血小板血漿一起傳輸；7.本發(fā)明的自體促凝劑可被直接應(yīng)用于傷口創(chuàng)面。參考文獻(xiàn)1.OrtelTL，CharlesLA，KellerFGetal.Topicalthrombinandacquiredcoagulationfactorinhibitorsclinicalspectrumandlaboratorydiagnosis.Am.J.Hematol.1994；45128.2.FastenauDRandMcIntyre.Immunochemicalanalysisofpolyspecificantibodiesinpatientsexposedtobovinefibrinsealant.Ann.Thorac.Surg.2000；691867.3.BanningerH，HardeggerI，ToblerAetal.FibringlueinsurgeryfrequentdevelopmentofinhibitorsofbovinethrombinandhumanfactorV.Br.J.Haematol.1993；85528.4.StreiffMBandNessPM.AcquiredfactorVinhibitorsaneedlessiatrogeniccomplicationofbovinethrombinexposure.Transfusion2002；4218.5.ArnoutJ.Thepathogenesisoftheantiphospholipidsyndrome；ahypothesisbasedonparaHelismwithheparin-inducedthrombocytopenia.ThrombosisandHaemostasis1996；75536.6.SandsJJ，NudoSA，AshfordRG，etal.Antibodiestotopicalbovinethrombincorrelatewithaccessthrombosis.Am.J.Kid.Dis.2000；45796.7.GottumukkalaVNR，SharmaSK.andPhilipJ.Assessingplateletandfibrinogencontributiontoclotstrengthusingmodifiedthromboelastographyinpregnantwomen.Anesth.Analg.1999；891453.8.BabbushCA，KevySVandJacobsonMS.Aninvitroandinvivoevaluationofautologousplateletconcentrateinoralreconstruction.ImplantDentistry2003；1224.9.LeeSJ.Cytokinedeliveryandtissueengineering.YonseiMedicalJoumal2000；41704.10.SlaterM，PatavaJ，KinghamK，etal.Involvementofplateletsinstimulatingosteogenicactivity.J.Orthop.Res.1995；13655.11.HaynesworthSE，KadiyalaS，LiangLN，etal.Chemotacticandmitogenicstimulationofhumanmesenchymalstemcellsbyplateletrichplasmasuggestsamechanismforenhancementofbonerepair.48thAnnualMeetingOrthopedicResearchSociety，Dallas，TX，2002.權(quán)利要求1.一種從抗凝全血生產(chǎn)促凝劑的方法，所述方法包括a)從受試者得到一體積抗凝全血；b)將所述抗凝全血與沉淀劑混合；c)將b)的混合物溫育一段足以產(chǎn)生細(xì)胞和特定血漿成分沉淀物和上清液的時(shí)間；d)將沉淀物與上清液分離；和e)回收上清液，其中所述上清液用作促凝劑。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗凝全血的體積為8至10ml。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述全血用選自如下一組的抗凝劑抗凝ACD、ACD/甘露糖醇、CPD和EDTA。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述全血用枸櫞酸-葡萄糖抗凝。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述全血用ACD/甘露糖醇抗凝。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述甘露糖醇以7.5mg/mlACD的濃度存在。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述沉淀劑為乙醇。8.權(quán)利要求7的方法，其中使用的所述乙醇的起始濃度為約10％至100％。9.權(quán)利要求8的方法，其中使用的所述乙醇的起始濃度為約25％到95％。10.權(quán)利要求9的方法，其中使用的所述乙醇的起始濃度為約50％到95％。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述沉淀劑是乙醇和氯化鈣的混合物。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述溫育步驟需要少于45分鐘。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述溫育步驟需要少于30分鐘。14.權(quán)利要求1的方法，其中制備的所述促凝劑為自體的。15.權(quán)利要求1的方法，其中制備的所述促凝劑為同種的。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離步驟通過離心混合物來完成。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離步驟通過過濾混合物來完成。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離步驟通過離心和過濾混合物的組合來完成。19.一種用于從抗凝全血制備促凝劑的試劑盒，所述試劑盒包括a)帶有塞子的試管；b)血清過濾式分離器；c)帶有鈍針頭的3ml注射器；d)帶有鈍針頭的10ml注射器；e)含有ACD或ACD/甘露糖醇的小瓶；f)含有EtOH/CaCl2的小瓶；和g)說明書。20.通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的人血部分，所述人血部分包含80-90％的凝血酶原-凝血酶蛋白、檢測不到量的血纖蛋白原和20-30％基線水平的ATIII、蛋白C和蛋白S。全文摘要本發(fā)明公開一種從全血制備穩(wěn)定的自體或同種促凝劑的方法。抗凝全血的直接沉淀避免了對具有不可預(yù)料后果的血漿分離步驟的需要。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的自體或同種促凝劑表現(xiàn)等同于可商購獲得的牛凝血酶和人凝血酶制劑的凝固時(shí)間，與牛凝血酶制劑相比具有改進(jìn)的激活的血小板的生長因子釋放動(dòng)力學(xué)。文檔編號(hào)C07K14/745GK1764372SQ200480008352公開日2006年4月26日申請日期2004年1月27日優(yōu)先權(quán)日2003年1月27日發(fā)明者舍溫·V.·凱維,舍雷爾·沙利文,梅·雅各布森,盧·布拉塞蒂申請人:哈維斯特科技公司