專利名稱：用于光動(dòng)力治療的水溶性單－peg化四吡咯衍生物及其制備方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物學(xué)活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，即，涉及一種制備水溶性單-聚乙二醇化四吡咯衍生物的新方法，尤其是二氫卟酚，菌綠素，脫鎂葉綠甲酯酸和1，2和3型細(xì)菌葉綠甲酯酸衍生物。本發(fā)明的化合物可被用作癌癥，感染及其他疾病的光動(dòng)力治療的光敏劑，以及在其它情況下用于光輻射治療的光敏劑。
其中B是具有以下結(jié)構(gòu)的環(huán) 或 或 或 或
其中R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，CH2OH和CH2OAlk；R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R5＝OH，-OAlk，-NH-Alk，-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R6＝H和-COOAlk；R7＝NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R8＝H和-Alk；R9＝-(CH2CH2O)nCH2CH2-；R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14；R11＝-CH2CONR8，-NHCOO-；R12＝H和-Alk；R13＝H和-Alk；和R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；其中m＝2-12；n＝8-500；和Alk＝烷基取代基。
2.發(fā)明詳述光動(dòng)力治療(PDT)是目前被探索用于各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用最有希望的新技術(shù)之一，具體是用于破壞腫瘤的精確識別治療(E.D.Sternberg等，“用于光力學(xué)的治療的基于卟啉的光敏劑”，Tetrahedron 54(1998)4151-4202)。
提供了化合物在某種程度上必須滿足的標(biāo)準(zhǔn)以有效用于PDT。(R.Bonnett，“光力學(xué)的治療回顧”，Rev.Contemp.Pharmacother.1999，10，1-17)標(biāo)準(zhǔn)如下1.活性反應(yīng)組分的高量子產(chǎn)量，比如單態(tài)氧或自由基；2.對受體相對低毒性；3.被高波長照射(優(yōu)選在光譜的紅光或近紅外區(qū))作用激活的能力，其與具有較短波長的照射作用相比能更深入滲透進(jìn)入組織；4.由與給定的病理情況相關(guān)的細(xì)胞選擇性的積累和從未受病理情況影響的組織迅速清除；5.結(jié)合到大分子載體的潛力，而保持光致敏作用功效的特征，和6.在合適的溶劑中的溶解性以促進(jìn)對病人的給藥和生理吸收和在病人身體之內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
四吡咯是廣泛用于PDT的化合物。四吡咯藥物應(yīng)用較重要的問題是它們在生理溶液中的低溶解度。這使得難以制備用于PDT及其他應(yīng)用的有效的藥物等級注射溶液。
制備用于PDT的水溶性的四吡咯衍生物的方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的，Smith等的美國專利5,330,741公開了制備賴氨?；溥卜觩6三鈉的方法，包括在吡啶存在的條件下來自甲基脫鎂葉綠甲酯酸a轉(zhuǎn)化的紅紫素18甲酯和含水賴胺酸的二氯甲烷溶液之間的反應(yīng)。所述混合物在室溫下攪拌12小時(shí)，繼之以在高真空條件下除去溶劑。如此制備的粗制品通過反相高效液相色譜(HPLC)純化并隨后凍干。為制備用于癌癥PDT的可注射的溶液，所述制劑首先溶于磷酸鹽緩沖液然后添加0.1N的氫氧化鈉。所述溶液的pH值使用0.1N HCl被調(diào)整為pH7.35，隨后通過微孔濾器無菌過濾。上述方法的缺點(diǎn)包括缺少可重復(fù)性和逐漸完成(work-up)的困難以及毒性試劑的使用，使得難以適合于藥物制造。另外，制備的所需水溶性產(chǎn)物在水溶液中在暗處4℃僅24小時(shí)是穩(wěn)定的，以及以固態(tài)在4℃在暗處直至4個(gè)月是穩(wěn)定的[M.W.Leach，R.J.Higgins，J.E.Boggan，S.-.-J.Lee，S.Autry，K.M.Smith，賴氨?；溥卜觩6/二氫卟酚p6混合物在大鼠中皮下9L膠質(zhì)瘤的光力學(xué)的治療中的功效。Cancer Res.，1992，52，1235-1239；美國專利5,330,741]。
Nakazato的美國專利5,378,835描述了制備水溶性脫鎂葉綠甲酯酸a(4)鈉鹽的方法。依據(jù)該發(fā)明，脫鎂葉綠甲酯酸a(5)溶于二乙醚，正丙醇、異丙醇或其混合物的很稀的堿性溶液被逐滴和緩慢加入到所述溶液。所述反應(yīng)持續(xù)到完成脫鎂葉綠甲酯酸a鹽(4)沉淀完成，其通過離心分離并真空干燥。然后所述產(chǎn)品溶于水中得到濃度0.5％和pH9.2-9.5的溶液，其然后用pH7.4-7.8的磷酸鹽緩沖液稀釋。Nakazato描述的方法的缺點(diǎn)是通過該技術(shù)不能產(chǎn)生濃縮的(＞1％)的可注射的脫鎂葉綠甲酯酸a水溶液。另外，本發(fā)明的作者注意到這種鹽當(dāng)干燥存儲(chǔ)時(shí)的化學(xué)不穩(wěn)定性，以及它們在以干燥狀態(tài)存儲(chǔ)之后不能完全溶于水。
(4)R=Na(5)R=HG.v.Ponomarev等的Russian專利RU 2144538公開了通過多步驟順向化學(xué)反應(yīng)制備具有大規(guī)模的有機(jī)胺包括N甲基-D-葡糖胺的二氫卟酚e6(6)水溶性復(fù)合物的方法，包括從螺旋藻屬(Platensis)藍(lán)藻細(xì)菌生物量制備葉綠素A，進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化為二氫卟酚e6[S.Ltj nen，P.H.Hynninen，用于制備(10R)和(10S)-脫鎂葉綠素a和b的改進(jìn)的方法，Synthesis 1983，705-708；P.H.Hynninen，S.Ltj nen，從葉綠素混合物利用優(yōu)選水解原則制備脫鎂葉綠環(huán)衍生物，Synthesis.1980，539-541；S.Ltj nen，P.H.Hynninen，用于制備濕的二氫卟酚e6和rhodin g7三甲基酯的便利方法，Synthesis，1980，541-543]，通過逐步添加水到其丙酮溶液中沉淀二氫卟酚e(6)，隨后通過離心分離并用水洗滌3次和用2g-eq大規(guī)模的有機(jī)胺的水溶液處理濕的二氫卟酚e6總回收率超過50％。使人遺憾的是根據(jù)上述方法制備的二氫卟酚e6的水溶性鹽樣品包含各種非-四吡咯雜質(zhì)和不能與目標(biāo)二氫卟酚e6產(chǎn)品使用常規(guī)方法分離的四吡咯類型的雜質(zhì)。
一種制備高純度藥物等級水溶性四吡咯衍生物的方法包含步驟一個(gè)或兩個(gè)直接酸式醇解生物原料產(chǎn)生結(jié)晶性的烷基脫鎂葉綠甲酯酸的步驟，轉(zhuǎn)化獲得的烷基脫鎂葉綠甲酯酸為脫鎂葉綠甲酯酸，并將后者與親水性的有機(jī)胺在選自水和含水有機(jī)溶液的介質(zhì)中反應(yīng)(Nifantiev等的美國專利申請10/151,764)。所述親水性有機(jī)胺選自N-甲基-D-葡萄糖胺，氨基烷基葡萄糖苷，三(羥甲基)氨基甲烷(“TRIS”)和其衍生物，氨基酸和寡肽。
通過聚乙二醇化獲得用于藥物應(yīng)用的水溶性化合物，即通過直接的或間接的(通過接頭)連接聚乙二醇鏈(PEG)，是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。PEG是非毒性的，增加藥物分子的水溶性，并改變生物分散度，其可以導(dǎo)致有利的藥物動(dòng)力學(xué)特性(Bradley等的國際申請WO 01/66550)。
用于PDT的水溶性聚乙二醇化化合物公開在Sinn等的美國專利5,622,685中，其中所述化合物具有至少兩個(gè)酚式羥基和/或氨基，至少一個(gè)脂族氨基，或至少一個(gè)酚式羥基和/或氨基和至少一個(gè)脂族氨基，并且這些基團(tuán)被聚乙二醇鏈取代，聚乙二醇聚合度n是5到250并且其末端羥基被C1-C12烷基酯或醚取代，各物質(zhì)被至少兩個(gè)這種聚乙二醇鏈取代。美國專利5,622,685也描述含有通過接頭連接的PEG鏈的化合物，其中所述聚乙二醇鏈通過生物學(xué)非可水解的或不良水解的接頭連接。
與本發(fā)明最接近的是Sinn等的U.S.專利6,147,207公開的方法，題為“用于生產(chǎn)含有聚醚的二氫卟酚和菌綠素的方法”。所述方法包括聚醚與卟啉的結(jié)合和含有聚醚的卟啉通過還原劑的轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚醚是聚乙二醇(PEG)。所述方法主要的缺點(diǎn)是由于所述方法的化學(xué)物質(zhì)只可以獲得很有限數(shù)量的化合物。此外，所述申請(以及Sinn等其它的申請)公開了二-，三或四-聚乙二醇化化合物，而不是單聚乙二醇化化合物。在實(shí)踐中有可能只得到含PEG殘基的化合物的異構(gòu)體和寡聚體的復(fù)雜混合物。這個(gè)事實(shí)使得藥物產(chǎn)品的制備所必須的可靠的定量分析和質(zhì)量控制幾乎不可能。此外，美國專利6,147,207公開了帶有只可以用OH和OMe基終止的PEG鏈的產(chǎn)品的制備，因此限制了獲得的化合物的實(shí)際用途。
因此需要提供用于光動(dòng)力治療新的水溶性單聚乙二醇化四吡咯衍生物，和提供生產(chǎn)這種水溶性單聚乙二醇化化合物的容易的和有效的方法。本發(fā)明滿足這些需要。
發(fā)明目的和發(fā)明簡述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于癌癥，感染及其他疾病光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)的改進(jìn)的光敏劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供水溶性四吡咯衍生物，其能被用作PDT的光敏劑并經(jīng)延長的時(shí)間期限而仍然穩(wěn)定。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于制造用于PDT的改進(jìn)的水溶性四吡咯衍生物的可重復(fù)的有效方法。
簡單地說，此處提供的是生產(chǎn)水溶性單聚乙二醇化四吡咯衍生物(1)-(3)的方法，包括化合物(7)-(10)之一與含有功能化的末端片段的氨基聚乙二醇的反應(yīng)?；衔?7)-(10)提供如下
其中B是具有以下結(jié)構(gòu)的環(huán) 或 或 或 或 其中R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3，和-CH2CH2CH(OH)CH3；
R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，CH2OH，和CH2OAlk；R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；R5＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；R6＝H和-COOAlk；R15＝OH，-NH(CH2)m-R16；R16＝-COOH，-NH2；其中M＝2-12；和Alk＝烷基取代基。
所述功能化的末端片段(指R10(參見通式(1)-(3))優(yōu)選選自以下基團(tuán)R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14，其中R12＝H和-Alk；R13＝H和-Alk；R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；和Alk＝烷基取代基。OAlk優(yōu)選為OMe。含有功能化的末端片段的氨基聚乙二醇分子量為500-30000。
還提供水溶性單聚乙二醇化四吡咯衍化物，選自以下
或 或， 其中B是具有下列結(jié)構(gòu)的環(huán) 或 或 或 或 其中R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3，和-CH2CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，CH2OH，和CH2OAlk；R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R5＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R6＝H和-COOAlk；R7＝-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R8＝H和-Alk；R9＝-(CH2CH2O)nCH2CH2-；
R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAeyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14；R11＝-CH2CONR8-，-NHCOO-；R12＝H和-Alk；R13＝H和-Alk；R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；其中m＝2-12；n＝8-500；和Alk＝烷基取代基，通過上述的方法獲得。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，公開了上述水溶性單聚乙二醇化四吡咯衍生物作為光敏劑在光動(dòng)力治療中的運(yùn)用。
本發(fā)明上述及其他目的，特征和優(yōu)點(diǎn)將通過以下說明書和附圖
變得更加清楚。
優(yōu)選實(shí)施方式除非另外說明，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常理解的意思一致。
四吡咯是具有一個(gè)碳原子橋的大環(huán)化合物，連接四個(gè)吡咯單位和其改性的衍生物。有許多不同種類的四吡咯，包括那些含有二氫吡咯單元的四吡咯。這里使用的術(shù)語四吡咯指適合用于光動(dòng)力治療(PDT)和藥物制劑的脫鎂葉綠甲酯酸，細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸，二氫卟酚，菌綠素及其衍生物。
這里使用的PEG指聚乙二醇鏈。本發(fā)明單PEG化的四吡咯衍生物是含聚乙二醇鏈的化合物，并通過四吡咯與含功能化的末端片段(FTF)的氨基聚乙二醇反應(yīng)而獲得(11-13)。該氨基聚乙二醇被稱為PEG胺衍生物。
其中R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14；R12＝H和-Alk；R13＝H和-Alk；R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；m＝2-12；n＝8-500；和Alk＝烷基取代基作為本發(fā)明主題的產(chǎn)品的制備通過將(11)-(13)類型的PEG胺衍生物與各自的母四吡咯偶聯(lián)而完成。為此，可以使用傳統(tǒng)的將有機(jī)伯胺和仲胺連接到帶有自由和激活的羧基基團(tuán)的化合物上的方法，以及其他形成酰胺鍵的方便方法。當(dāng)母四吡咯是脫鎂葉綠甲酯酸的情況下，也可以使用通過打開環(huán)戊酮的環(huán)從而連接胺(11)-(13)的方法，如實(shí)施例3和6所示。
這里使用的氨基聚乙二醇(11)-(13)可以包含在母聚乙二醇中存在的一個(gè)母OH基團(tuán)，或其他位于氨基聚乙二醇鏈末端的功能化的末端片段(FTF，R10)。優(yōu)選的FTFs選自O(shè)Alk，NH2，NAlk2，COOH，OCH2COOH，NHAcyl，NAcyl2(包括苯二酰亞氨基，馬來酰(maleido)和其他環(huán)酰亞胺基團(tuán))。OAlk優(yōu)選為OMe。
當(dāng)R10是能夠在將四吡咯與氨基聚乙二醇偶聯(lián)的條件下反應(yīng)的基團(tuán)時(shí)，選擇合適選擇改性的化合物(11)-(13)的類似物以在R10部分?jǐn)y帶暫時(shí)的封閉基團(tuán)，阻止四吡咯單位偶聯(lián)到一起。尤其是，(11)-(13)(R10＝NH2)類二胺的使用需要使用過量二胺以避免將兩個(gè)四吡咯單位連接到二胺上。由于將過量二胺與其和四吡咯的結(jié)合物目標(biāo)產(chǎn)物層析分析的難度，這是不方便的。因此，在R10包含伯氨基或仲氨基基團(tuán)的情況下，使用帶有叔丁氧基羰基、芐氧基羰基、三氯乙酰和其他合適的暫時(shí)N-封閉基團(tuán)暫時(shí)N-取代的衍生物是優(yōu)選的。
相似的，從在取代基R10上帶有羧基的PEG胺衍生物(11)-(13)制備本發(fā)明的化合物可以通過使用帶有游離羧基，處于鹽狀態(tài)的羧基基團(tuán)，或烷基酯狀態(tài)的臨時(shí)保護(hù)的羧基的衍生物(11)-(13)來進(jìn)行，所述烷基比如甲基，乙基，叔丁基及其他慣用于保護(hù)羧基功能的烷基。
本發(fā)明的單-聚乙二醇化化合物不僅具有高度水溶性，它們還具有在典型有機(jī)溶劑中良好的溶解性。這使得用柱及其他類型層析的可靠的純化和用HPLC和TLC的分析成為可能。用于本發(fā)明產(chǎn)品層析的優(yōu)選的有機(jī)溶劑包括慣例被用來純化和分析有機(jī)化合物尤其是藥物產(chǎn)品的氯化烴，醚，酯，乙腈，甲苯，丙酮，醇和其組合。
適合的連接于聚乙二醇鏈的FTF的存在容許進(jìn)一步化學(xué)修飾，包括通過各個(gè)帶有標(biāo)記，載體，蛋白質(zhì)，分子載體及其他分子的FTF容易的結(jié)合作用。尤其是，實(shí)施例6描述了水溶性單-聚乙二醇化酯化合物的合成及其進(jìn)一步通過皂化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為各自的酸衍生物。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的水溶性單-聚乙二醇化四吡咯衍生物在癌癥及其他增殖異常疾病和感染的光動(dòng)力治療(PDT)中的應(yīng)用。PDT通過將衍生物引入到藥物可接受的用于遞送到特定治療位置的介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，尤其是用于治療皮膚癌及其他皮膚學(xué)疾病的實(shí)施方案中，所述介質(zhì)可以是乳膏劑，凝膠或在某些情況下氣溶膠液體分散劑的形式。在將介質(zhì)中的衍生物遞送到治療區(qū)域之后，經(jīng)過足夠的時(shí)間使得所述四吡咯衍生物優(yōu)先積累在疾病組織中。最后治療區(qū)域用充足動(dòng)力和特定波長的光照射使四吡咯衍生物活化以殺死疾病組織的細(xì)胞。暗毒性(描述于實(shí)施例7)和光毒性(描述于實(shí)施例8)的測定顯示本發(fā)明的化合物供PDT應(yīng)用的優(yōu)良性質(zhì)。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例更進(jìn)一步說明，而不是限制于此。以下實(shí)施例是僅僅用于例證性目的，不是用于限制本發(fā)明的范圍。所有獲得的化合物具有正確的MS譜(CI-MS)，并且是按照反相HPLC均一純化的。
實(shí)施例1細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(14)的制備 細(xì)菌葉綠素a(15)(45mg，0.05mmol，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品)的三氯乙酸(1.2mL)和水(0.3mL)混合物的溶液置于室溫3小時(shí)，在室溫下真空(～20mmHg)濃縮，用水稀釋并且用二氯甲烷提取。提取物用水洗滌，干燥，濃縮，并在硅膠上用5％MeOH-CHCl3的混合物純化以產(chǎn)生31mg(98％)的細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(14)。
實(shí)施例2焦-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(16)的制備。
細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(14)(65mg，0.11mmol)和吡啶(4mL)的混合物被回流12小時(shí)，冷卻，蒸發(fā)至干燥，用水稀釋并用二氯甲烷提取。提取物用1N鹽酸和水洗滌，干燥，濃縮，并在硅膠上用5％MeOH-CHCl3的混合物純化以產(chǎn)生59mg(94％)的焦-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(16)。
實(shí)施例3水溶性單-聚乙二醇化二氫卟酚e6衍生物的制備(17和18)。
(17)R＝NH-PEG750-OMe (19)(18)R＝NH-PEG2000-OMe甲基脫鎂葉綠甲酯酸a(19)(10mg，0.017mmol)和MeO-PEG750-NH2或MeO-PEG2000-NH2(0.068mmol，4eq.)(RAPP Polymere GmbH產(chǎn)品)的混合物的四氫呋喃(0.5mL)溶液在室溫放置3天，用二氯甲烷稀釋，用0.5N HCl水溶液，水洗滌，干燥，濃縮，并在硅膠上用5％MeOH-CHCl3的混合物純化。得到的(17)或(18)的溶液被蒸發(fā)至干燥，重新溶解于水(2mL)，通過45μm濾膜過濾并冷凍干燥以分別產(chǎn)生60-70％的水溶性化合物(17)和(18)。
實(shí)施例4用于制備水溶性單-聚乙二醇化中-焦-脫鎂葉綠甲酯酸a衍生物(20)-(25)，脫鎂葉綠甲酯酸a(26)和(27)，細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(28)和焦-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(29)的通用方法。
(20)R＝NH-PEG750-Ome(26)R＝NH-PEG750-OMe(21)R＝NH-PEG2000-OMe (27)R＝NH-PEG2000-OMe(22)R＝NH-PEG5000-OMe (32)R＝五氟苯氧基(23)R＝NH-PEG10000-OMe(24)R＝NH-PEG20000-OMe(25)R＝H-PEG3000-OCH2COOH(30)R＝OH(31)R＝五氟苯氧基
(28)R＝NH-PEG2000-OMe(33)R＝五氟苯氧基 (29)R＝NH-PEG2000-OMe(34)R＝五氟苯氧基中-焦-脫鎂葉綠甲酯酸a(30)，脫鎂葉綠甲酯酸a(5)，細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(14)或焦-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸(16)(0.03mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，然后添加0.05mL三乙胺繼之以添加0.01mL(0.058mmol，1.9eq.)的五氟苯基三氟乙酸酯?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘，以分別產(chǎn)生化合物(31)，(32)，(33)或(34)，用二氯甲烷稀釋，用水洗滌，干燥，然后得到的溶液被添加到MW750，2000，5000，10000，20000的合適的MeO-PEG-NH2(RAPP GmbH產(chǎn)品)，或HOOCCH2O-PEG3000-NH2(GlycoSense AG產(chǎn)品)的二氯甲烷(1.0mL)溶液中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?.5-10小時(shí)，用二氯甲烷稀釋，然后用0.5NHCl水溶液洗滌。所述混合物然后用水洗滌，干燥，濃縮，在硅膠上用5％MeOH-CHCl3的混合物純化。得到的對應(yīng)的PEG酰胺溶液蒸發(fā)至干燥，重新溶解在水中(2-5mL)，通過45μm濾膜過濾并冷凍干燥以產(chǎn)生總得率70-99％的純的水溶性化合物(20)-(29)。
實(shí)施例5
制備在四吡咯和PEG2000部分之間帶有庚亞甲基二氨基間隔物的水溶性單-聚乙二醇化的中-焦-脫鎂葉綠甲酯酸a衍生物(35)。
(35)R＝NH-(CH2)7NHCOO-PEG2000-OMe1，1’-碳酰二咪唑(25mg，0.15mmol，3eq.)被添加到MeO-PEG2000-OH(100mg，0.05mmol，(RAPP Polymere GmbH產(chǎn)品)的四氫呋喃N(2.0mL)溶液中。室溫下10分鐘后添加1，7-二氨基庚烷(33mg，0.25mmol，5eq.)的四氫呋喃(1.0mL)溶液。混合物在室溫放置30分鐘，產(chǎn)物通過添加醚而沉淀。后一產(chǎn)物溶解在二氯甲烷中(2mL)，得到的容易被添加到(31)[按照實(shí)施例6的描述從15mg(0.026mmol)中-焦-脫鎂葉綠甲酯酸a制備的(30)]的二氯甲烷(2mL)溶液中?；旌衔镌谑覝胤胖?0分鐘，用二氯甲烷稀釋并用0.5N HCl水溶液洗滌?；旌衔锶缓笥盟礈欤稍?，濃縮和在硅膠上用5％MeOH-CHCl3的混合物純化。得到的溶液(35)蒸發(fā)至干燥，重新溶解于水(2.0mL)中，通過45μm濾膜過濾并冷凍干燥以產(chǎn)生60mg(85％)的水溶性化合物(35)。
實(shí)施例6水溶性單-聚乙二醇化二氫卟酚e6衍生物(36)和(37)的制備
(36)R＝NH-PEG3000-OCH2COOMe(37)R＝NH-PEG3000-OCH2COOH甲基脫鎂葉綠甲酯酸a(20)(10mg，0.017mmol)和MeOOCCH2O-PEG3000-NH2(215mg，0.068mmol，4eq.)(GlycoSense AG產(chǎn)品)混合物的四氫呋喃(0.5mL)溶液在室溫放置3天，用二氯甲烷稀釋，用0.5N HCl水溶液洗滌，然后用水洗滌，干燥，濃縮，和在硅膠上用5％MeOH-CHCl3的混合物純化。得到的溶液(36)蒸發(fā)至干燥，然后重新溶解于二噁烷中(2mL)，將6N氫氧化鈉水溶液(0.01mL)添加到反應(yīng)混合物并回流10分鐘。然后冷卻混合物，用二氯甲烷稀釋，用0.5N HCl水溶液洗滌，用水洗滌，干燥，濃縮到干燥，重新溶解于水(2mL)，然后通過45μm濾膜過濾并冷凍干燥以產(chǎn)生42mg(70％)的水溶性化合物(37)。
實(shí)施例7HeLa細(xì)胞中水溶性單-聚乙二醇化脫鎂葉綠甲酯酸a(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脫鎂葉綠甲酯酸a(5)的鹽的暗毒性(細(xì)胞毒性)的測定為測定HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)中水溶性衍生物(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脫鎂葉綠甲酯酸a(5)的鹽(根據(jù)US專利申請10/151,764制備)的暗毒性，在96孔培養(yǎng)板中以2到500μg/mL范圍內(nèi)增加的光敏劑濃度培養(yǎng)細(xì)胞單層(接種密度含10％胎牛血清的Dulbeco修飾的基本培養(yǎng)基(DMEM)每孔7,000個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)48小時(shí)。
細(xì)胞用純DMEM洗滌并用10％福爾馬林在室溫處理15分鐘。細(xì)胞用水洗滌兩次，用0.1％結(jié)晶紫溶液(50μl/孔)溫育15分鐘，然后用水洗滌和用乙醇處理(100μl/孔)。形成的乙醇溶液的光學(xué)密度用Specord 100(Analytik Jena AG，德國)分光光度計(jì)在594nm測定以監(jiān)測細(xì)胞存活率。
數(shù)值表示為未溫育的對照的百分?jǐn)?shù)。對各溫育濃度進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1，其顯示了IC50和IC80值。
表1HeLa細(xì)胞中水溶性聚乙二醇化脫鎂葉綠甲酯酸a(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脫鎂葉綠甲酯酸a(5)的鹽的暗毒性(細(xì)胞毒性)數(shù)據(jù)(實(shí)施例7)
實(shí)施例8HeLa細(xì)胞中水溶性單-聚乙二醇化脫鎂葉綠甲酯酸a衍生物(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脫鎂葉綠甲酯酸a(5)的鹽在662nm照射下的光毒性的測定為測定光毒性，水溶性衍生物(35)或具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脫鎂葉綠甲酯酸a(5)的鹽(根據(jù)US專利申請10/151,764制備)和Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)單層培養(yǎng)物在96孔培養(yǎng)板中在增加光敏劑濃度0.01到40μg/mL的范圍培養(yǎng)(接種密度每孔含10％胎牛血清的Dulbeco修飾的基本培養(yǎng)基(DMEM)中30,000個(gè)細(xì)胞)。在30分鐘溫育期之后在662nm進(jìn)行照射(Ceralas PDT激光，BioLitec AG，德國；150mW/cm2，5-20J/cm2)。使用MTT分析測量細(xì)胞存活率。值表示為照射的但未溫育的對照的百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8次。實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示于表2，其顯示在10J/cm2照射后觀察到的IC50和IC90值。
表2.
HeLa細(xì)胞中水溶性聚乙二醇化脫鎂葉綠甲酯酸a(35)和具有N-甲基-D-葡萄糖胺的水溶性脫鎂葉綠甲酯酸a(5)的鹽的光毒性數(shù)據(jù)(實(shí)施例8)
參考附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明不限于這些具體的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行各種改變和修改而并不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書定義的范圍和實(shí)質(zhì)。
權(quán)利要求
1.水溶性單PEG化四吡咯衍生物，選自通式1，2和3 其中B是具有如下結(jié)構(gòu)的環(huán) 或 或 或 或 其中R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，-CH2OH，和-CH2OAlk；R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R5＝-OH，-OAlk，-NH-Alk，NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R6＝H和-COOAlk；R7＝-NR8-R9-R10，-NH(CH2)m-R11-R9-R10；R8＝H和-Alk；R9＝-(CH2CH2O)nCH2CH2-；R10＝-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14，-OCH2COR14；R11＝-CH2CONR8，-NHCOO-；R12＝H和-Alk；R13＝H和-Alk；和R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；其中m＝2-12；n＝8-500；和Alk＝烷基取代基。
2.生產(chǎn)權(quán)利要求1的水溶性單-PEG化四吡咯衍生物的方法，包括化合物與含有功能化末端片段的氨基聚乙二醇的相互作用，其中所述化合物選自通式7，8，9，和10 其中B是具有以下結(jié)構(gòu)的環(huán) 或 或 或 或 其中R1＝-CH＝CH2，-CH(OAlk)CH3，-CHO，-C(O)CH3，-CH2CH3，-CH(Alk)CH(COAlk)2，-CH2CH(COAlk)2，-CH(Alk)CH2COAlk，-CH(Alk)CH2CH(OH)CH3和-CH2CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3，-CHO，-CH(OH)Alk，-CH＝CHAlk，-CH2OH和-CH2OAlk；R3＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；R4＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；R5＝-OH，-OAlk，-NH-Alk；R6＝H and-COOAlk；R15＝-OH，-NH(CH2)m-R16；R16＝-COOH，-NH2；和其中m＝2-12；和Alk＝烷基取代基。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述功能化的末端片段選自-OH，-OAlk，-NH2，-NHAlk，-NHAcyl，-NAcyl2，-NR12R13，-COR14和-OCH2COR14，其中R12＝H和-Alk；R13＝H和-Alk；R14＝-OH，-OAlk，-NR12R13；和Alk＝烷基取代基。
4.權(quán)利要求3的方法，其中Oalk被OMe取代。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述含功能化末端片段的氨基聚乙二醇的分子量為500-30,000。
6.權(quán)利要求1的水溶性單-聚乙二醇化四吡咯衍生物作為光動(dòng)力治療中的光敏劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明說明書中公開了通式1，2或3的水溶性單PEG化四吡咯衍生物。還公開了制備上述水溶性單PEG化化合物的方法，包括四吡咯與含有功能化末端片段的氨基聚乙二醇的相互作用，以及其作為光動(dòng)力治療中的光敏劑的應(yīng)用。
文檔編號C07D487/22GK1777610SQ200480010894
公開日2006年5月24日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者尼古拉·尼凡季耶夫, 德米特里·V·亞順?biāo)够?申請人:塞拉莫普泰克工業(yè)公司