專利名稱：免疫抑制劑化合物及組合物的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請要求美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/471,931(于2003年5月19日提交)的優(yōu)先權(quán)。這些申請的全部公開內(nèi)容整體引入本文作為參考，并用于所有目的。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了一類新的用于治療或預(yù)防由淋巴細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂、特別是與EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的疾病的免疫抑制劑化合物。
背景EDG受體屬于緊密相關(guān)的脂活化G-蛋白偶聯(lián)受體家族。EDG-1、EDG-3、EDG-5、EDG-6及EDG-8(還分別稱為S1P1、S1P3、S1P2、S1P4及S1P5)作為1-磷酸鞘氨醇(S1P)的特異性受體而被識別。EDG2、EDG4及EDG7(還分別稱為LPA1、LPA2及LPA3)是溶血磷脂酸(LPA)的特異性受體。在同型的S1P受體中，EDG-1、EDG-3及EDG-5在多種組織中被廣泛表達(dá)，而EDG-6的表達(dá)主要限于淋巴組織和血小板，EDG-8的表達(dá)限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。EDG受體負(fù)責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且被認(rèn)為在包括細(xì)胞生長、增殖、維持、遷移、分化、可塑性及細(xì)胞凋亡在內(nèi)的細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用。某些EDG受體與由淋巴細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的疾病、例如移植排斥、自身免疫性疾病、炎性疾病、傳染性疾病及癌癥有關(guān)。EDG受體活性的改變對這些疾病的病理學(xué)和/或癥候?qū)W而言是有益的。因此，本身能改變EDG受體活性的分子作為治療劑在治療這些疾病中是有用的。
發(fā)明概述本申請涉及式I化合物及其N-氧化物衍生物、前藥衍生物、被保護(hù)的衍生物、單獨(dú)的異構(gòu)體及異構(gòu)體的混合物以及這些化合物的可藥用的鹽和溶劑化物(例如水合物) 其中A選自-C(O)OR5、-OP(O)(OR5)2、-P(O)(OR5)2、-S(O)2OR5、-P(O)(R5)OR5和1H-四唑-5-基；其中每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫和C1-6烷基；X1和X2各自獨(dú)立地選自鍵或C1-6亞烷基；Z選自 和
其中Z的左右星號分別表示式I中-C(R3)(R4)-與A之間的連接點(diǎn)；R6選自氫和C1-6烷基；且J1和J2獨(dú)立地為亞甲基或選自S、O和NR5的雜原子；其中R5選自氫和C1-6烷基；R1選自C6-10芳基和C2-9雜芳基；其中R1的任何芳基或雜芳基任選被選自鹵代、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基的基團(tuán)取代；其中R1的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基基團(tuán)可任選被選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基的一至五個(gè)基團(tuán)取代；且R1的任何烷基基團(tuán)的亞甲基可任選被選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR5-及-O-的原子或基團(tuán)替換；其中R5選自氫或C1-6烷基；R2選自C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-12環(huán)烷基C0-4烷基、鹵代、鹵素取代的C1-6烷基以及鹵素取代的C1-6烷氧基；R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-6烷基、鹵代、羥基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是含有與一種或多種適宜賦形劑混合的式I化合物或其N-氧化物衍生物、單獨(dú)的異構(gòu)體或異構(gòu)體的混合物、或者其可藥用鹽的藥物組合物。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是治療動物疾病的方法，其中EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變可預(yù)防、抑制或改善該疾病的病理學(xué)和/或癥候?qū)W，該方法包括給動物施用治療有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、單獨(dú)的異構(gòu)體或異構(gòu)體的混合物、或者其可藥用鹽。
本發(fā)明的第四個(gè)方面是式I化合物在制備用于治療動物疾病的藥物中的用途，其中EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變可引起該疾病的病理學(xué)和/或癥候?qū)W。
本發(fā)明的第五個(gè)方面是制備式I化合物及其N-氧化物衍生物、前藥衍生物、被保護(hù)的衍生物、單獨(dú)的異構(gòu)體及異構(gòu)體的混合物及其可藥用鹽的方法。
優(yōu)選實(shí)施方案的敘述本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防由淋巴細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂的化合物。還提供了治療這些疾病或紊亂的方法。
定義在本說明中，除非另有定義，否則作為基團(tuán)及作為其它基團(tuán)(例如鹵素取代的烷基、烷氧基、?；?、烷硫基、烷基磺酰基及烷基亞磺?；?結(jié)構(gòu)成分的“烷基”可以是直鏈或支鏈。作為基團(tuán)及作為其它基團(tuán)結(jié)構(gòu)成分的“鏈烯基”含有一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵，且可以是直鏈或支鏈。任何雙鍵可以是順式或反式構(gòu)型。作為基團(tuán)及作為其它基團(tuán)和化合物結(jié)構(gòu)成分的“炔基”含有至少一個(gè)C≡C三鍵且還可含有一個(gè)或多個(gè)C＝C雙鍵，并且只要可能就可以是直鏈或支鏈。單獨(dú)的或作為其它基團(tuán)結(jié)構(gòu)成分的任何環(huán)烷基可以含有3至8個(gè)碳原子，優(yōu)選3至6個(gè)碳原子?！皝喭榛焙汀皝喯┗狈謩e為由“烷基”和“鏈烯基”基團(tuán)衍生的二價(jià)基團(tuán)。在本申請中，R1的任何烷基基團(tuán)可任選地插入選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR20-和-O-(其中R20為氫或C1-6烷基)基團(tuán)的一個(gè)基團(tuán)。這些基團(tuán)包括-CH2-O-CH2-、-CH2-S(O)2-CH2-、-(CH2)2-NR20-CH2-和-CH2-O-(CH2)2-等。
“芳基”表示含有六至十個(gè)環(huán)碳原子的單環(huán)或稠合二環(huán)芳香環(huán)組合。例如，C6-12芳基可以是苯基、聯(lián)苯基或萘基，優(yōu)選苯基。稠合二環(huán)可以是部分飽和的，例如1，2，3，4-四氫萘等?！皝喎蓟北硎居煞蓟鶊F(tuán)衍生的二價(jià)基團(tuán)。例如，本申請中所用的亞芳基可以是亞苯基、亞聯(lián)苯基和亞萘基等。
“鹵代”或“鹵素”表示F、Cl、Br或I，優(yōu)選F或Cl。鹵素取代的烷基基團(tuán)和化合物可以被部分鹵代或全鹵代，由此對于多鹵代，鹵素取代基可以相同或不同。優(yōu)選的全鹵代烷基基團(tuán)例如是三氟甲基或三氟甲氧基。
“雜芳基”表示本申請中定義的芳基加上至少一個(gè)選自N、O或S的雜原子部分，并且除非另有說明，每個(gè)環(huán)包括5至6個(gè)環(huán)原子。例如C2雜芳基包括噁二唑和三唑等。C9雜芳基包括喹啉和1，2，3，4-四氫-喹啉等。本申請中所用的C2-9雜芳基包括噻吩基、吡啶基、呋喃基、異噁唑基、苯并噁唑基或苯并[1，3]二氧雜環(huán)戊烯基，優(yōu)選噻吩基、呋喃基或吡啶基?！皝嗠s芳基”表示環(huán)組合包含二價(jià)基團(tuán)的本申請中定義的雜芳基。稠合二環(huán)的雜芳基環(huán)系可以是部分飽和的，例如，2，3-二氫-1H-異吲哚和1，2，3，4-四氫-喹啉等。
本發(fā)明中所用的EDG-1選擇性化合物(藥物或調(diào)節(jié)劑)具有特異性，與EDG-3以及與EDG-5、EDG-6和EDG-8中的一種或多種相比，該特異性對EDG-1是選擇性的。本文所用的對一種EDG受體(“選擇性受體”)相對于另一種EDG受體(“非選擇性受體”)而言的選擇性表示該化合物在誘導(dǎo)由選擇性EDG受體(例如EDG-1)介導(dǎo)的活性方面比非選擇性S1P-特異性EDG受體具有高得多的效力。如果在GTP-γS結(jié)合試驗(yàn)中進(jìn)行測定(如下文實(shí)施例中所述)，則EDG-1選擇性化合物對選擇性受體(EDG-1)的EC50(產(chǎn)生最大響應(yīng)50％的有效濃度)比非選擇性受體(例如EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8中的一種或多種)的EC50一般低至少5、10、25、50、100、500或1000倍。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防由淋巴細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，對于式I化合物，R1為任選被鹵代、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基取代的苯基、萘基、呋喃基或噻吩基；其中R1的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基基團(tuán)可任選被選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基的一至五個(gè)基團(tuán)取代；且R1的任何烷基基團(tuán)的亞甲基可任選被選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR5-及-O-的原子或基團(tuán)替換；其中R5為氫或C1-6烷基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R1選自
和 其中星號為R1和X2的連接點(diǎn)；R8為鹵代、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基；其中R8的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基基團(tuán)可任選被選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基的一至三個(gè)基團(tuán)取代；且R8的任何烷基基團(tuán)的亞甲基可任選被選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR5-及-O-的原子或基團(tuán)替換；其中R5為氫或C1-6烷基；且R9選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，A為-C(O)OH；Z選自 其中Z的左右星號分別表示式I中-C(R3)(R4)-和A之間的連接點(diǎn)；R6選自氫和C1-6烷基；且R3和R4均為氫。
在另一實(shí)施方案中，R2選自甲基、乙基、環(huán)丙基、氯、溴、氟和甲氧基。
在另一實(shí)施方案中，R1選自 和 其中R8選自鹵代、苯基、環(huán)己基、噻吩基、3，3-二甲基-丁基、吡啶基、環(huán)戊基和哌啶基；其中R8可任選被選自三氟甲基、甲氧基、氟、三氟甲氧基和甲基的1至3個(gè)基團(tuán)取代；且R9選自三氟甲基、氟、甲基、氯、甲氧基和乙基。
本發(fā)明優(yōu)選的化合物選自1-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，1-[4-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(4-溴-3-甲基-苯基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，1-[4-(2-甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-芐氨基]-丙酸，3-[4-(2′-乙基-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(2′-乙基-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲基亞磺?；?-芐氨基]-丙酸，和3-[4-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐氨基]-丙酸。
此外，優(yōu)選的化合物還顯示在下文的實(shí)施例和表1中。
本發(fā)明提供了具有以被保護(hù)形式存在的羥基或氨基基團(tuán)的化合物形式，這些形式作為前藥而起作用。前藥是施用后通過一種或多種化學(xué)或生化轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚运幬镄问降幕衔?。在生理?xiàng)l件下易于轉(zhuǎn)變?yōu)樗蠡衔锏谋景l(fā)明化合物的形式是所要求化合物的前藥，并且在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。前藥的實(shí)例包括羥基基團(tuán)被?；纬上鄬Σ环€(wěn)定的酯、例如乙酸酯的形式，以及氨基基團(tuán)被甘氨酸或L-氨基酸如絲氨酸的羧化基團(tuán)?；纬蓪ζ胀ùx酶水解特別敏感的酰胺鍵的形式。
式I化合物可以以游離形式或以鹽的形式、例如與無機(jī)或有機(jī)酸的加成鹽的形式存在。當(dāng)存在羥基基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)還可以以鹽的形式、例如銨鹽或金屬鹽(例如鋰、鈉、鉀、鈣、鋅或鎂的鹽)或者其混合物的形式存在。水合物或溶劑化物形式的式I化合物及其鹽同樣是本發(fā)明的一部分。
當(dāng)式I化合物在分子中具有不對稱中心時(shí)，可得到多種旋光異構(gòu)體。本發(fā)明還包括對映異構(gòu)體、外消旋物、非對映異構(gòu)體及其混合物。此外，當(dāng)式I化合物包括幾何異構(gòu)體時(shí)，本發(fā)明還包括順式化合物、反式化合物及其混合物。當(dāng)涉及顯示出上文提到的不對稱碳原子或不飽和鍵的原料時(shí)，應(yīng)有類似的考慮。
治療免疫調(diào)節(jié)性病癥的方法和藥物組合物游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物顯示出有價(jià)值的藥理特性，例如淋巴細(xì)胞再循環(huán)調(diào)節(jié)特性，例如由實(shí)施例5的體外和體內(nèi)試驗(yàn)所表明的，因此表明可用于治療。式I化合物的EC50優(yōu)選為1×10-11至1×10-5M，優(yōu)選小于50nM。該化合物對一種或多種EDG/S1P受體、優(yōu)選EDG-1/S1P-1顯示出選擇性。本發(fā)明的EDG-1/S1P-1選擇性調(diào)節(jié)劑可以通過測定化合物與EDG-1/S1P-1及一種或多種其它EDG/S1P受體(例如EDG-3/S1P-3、EDG-5/S1P-2、EDG-6/S1P-4和EDG-8/S1P-5)的結(jié)合來鑒別。EDG-1/S1P-1選擇性調(diào)節(jié)劑對于EDG-1/S1P-1受體的EC50通常為1×10-11至1×10-5M，優(yōu)選小于50nM，更優(yōu)選小于5nM。它對一種或多種其它EDG/S1P受體的EC50比對EDG-1/S1P-1的EC50高至少5、10、25、50、100、500或1000倍。因此，一些EDG-1/S1P-1調(diào)節(jié)性化合物對EDG-1/S1P-1的EC50將小于5nM，而對一種或多種其它EDG/S1P受體的EC50為至少100nM或更高。除了測定與EDG/S1P受體的結(jié)合活性外，EDG-1/S1P-1選擇性藥物還可以通過檢查測試藥物修飾細(xì)胞過程的能力或由EDG/S1P受體介導(dǎo)的活性來鑒別。
因此，式I化合物在治療和/或預(yù)防由淋巴細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂中是有用的，例如在移植中，例如細(xì)胞、組織或器官的同種異體移植物或異種移植物急性或慢性排斥或者延遲移植物功能、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、I型或II型糖尿病及與其有關(guān)的紊亂、脈管炎、惡性貧血、Sjoegren綜合征、眼色素層炎、牛皮癬、Graves眼病、局限性脫發(fā)等、過敏性疾病如過敏性哮喘、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎/結(jié)膜炎、過敏性接觸性皮炎，任選伴有潛在異常反應(yīng)的炎性疾病如炎性腸病、節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎、內(nèi)源性哮喘、炎性肺損傷、炎性肝損傷、炎性腎小球損傷、動脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、刺激性接觸性皮炎及另外的濕疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫介導(dǎo)性紊亂的皮膚表現(xiàn)、炎性眼病、角膜結(jié)膜炎、心肌炎或肝炎、缺血/再灌注損傷如心肌梗塞、中風(fēng)、腸缺血、腎衰竭或出血性休克、創(chuàng)傷性休克、T細(xì)胞淋巴瘤或T細(xì)胞白血病，傳染性疾病如中毒性休克(例如超抗原誘導(dǎo)的)、敗血癥性休克、成人呼吸窘迫綜合征或病毒性感染如AIDS、病毒性肝炎、慢性細(xì)菌感染或者老年性癡呆。細(xì)胞、組織或?qū)嶓w器官移植物的實(shí)例包括例如胰島、干細(xì)胞、骨髓、角膜組織、神經(jīng)組織、心臟、肺、聯(lián)合性心-肺、腎臟、肝臟、腸、胰臟、氣管或食管。對于上述用途，所需劑量當(dāng)然可以根據(jù)施用方式、所治療的具體病癥及所需效應(yīng)而改變。
此外，式I化合物在癌癥的化療中、特別是對實(shí)體瘤如乳腺癌的癌癥化療是有用的，或者用作抗血管生成劑。
所需劑量當(dāng)然可以根據(jù)施用方式、所治療的具體病癥及所需效應(yīng)而改變。通常，以約0.03至2.5mg/kg體重的每日劑量全身施用可得到滿意的結(jié)果。在較大的哺乳動物、例如人類中，標(biāo)示的每日劑量為約0.5mg至約100mg，以例如至多一日四次的分開劑量或以延遲的形式方便地施用。適用于口服施用的單位劑型包含約1至50mg活性成分。
式I化合物可以通過任何常規(guī)的途徑來施用，特別是腸內(nèi)施用(例如口服，例如以片劑或膠囊劑的形式施用)或胃腸道外施用，例如以可注射溶液或混懸液的形式施用，局部施用(例如以洗劑、凝膠劑、軟膏劑或乳膏劑的形式施用)，或者經(jīng)鼻施用或以栓劑形式施用。包含游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及至少一種可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物可以按常規(guī)方法通過與可藥用載體或稀釋劑混合來生產(chǎn)。
式I化合物可以以游離形式或以可藥用鹽的形式施用，例如上文所說明的。這些鹽可以按常規(guī)方法來制備并且顯示出與游離化合物相同級別的活性。
根據(jù)前文所述，本發(fā)明還提供了1.1在需要這種治療的受試者中預(yù)防或治療例如上文表明的由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的紊亂或疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用有效量的式I化合物或其可藥用鹽；1.2在需要這種治療的受試者中預(yù)防或治療例如上文表明的急性或慢性移植排斥或T-細(xì)胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用有效量的式I化合物或其可藥用鹽；1.3在需要其的受試者中抑制或控制血管生成失常、例如1-磷酸鞘氨醇(S1P)介導(dǎo)的血管生成的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的式I化合物或其可藥用鹽；1.4在需要其的受試者中預(yù)防或治療由新血管生成過程介導(dǎo)的或與血管生成失常有關(guān)的疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的式I化合物或其可藥用鹽；2.游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物，用作藥物，例如用于上文1.1至1.4項(xiàng)下表明的任何一種方法中；3.藥物組合物，例如用于上文1.1至1.4項(xiàng)中的任何一種方法中，該組合物包含游離形式或可藥用鹽形式的式I化合物以及用于其的可藥用稀釋劑或載體；4.式I化合物或其可藥用鹽，用于制備在上文1.1至1.4項(xiàng)的任何一種方法中使用的藥物組合物。
式I化合物可以作為唯一的活性成分施用或者例如作為輔助藥與其它藥物組合施用，所述的其它藥物例如是免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑或者其它抗炎藥物(例如用于治療或預(yù)防同種異體移植物或異種移植物的急性或慢性排斥或者炎性或自身免疫性紊亂)，或者是化療劑(例如惡性細(xì)胞抗增殖劑)。例如，式I化合物可以與如下藥物組合使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢菌素A或FK 506；mTOR抑制劑，例如雷帕霉素、40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578或AP23573；具有免疫抑制特性的子囊霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤(azathioprene)；甲氨蝶呤；來氟米特；咪唑立賓；麥考酚酸；麥考酚酸嗎乙酯；15-脫氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、類似物或衍生物；免疫抑制單克隆抗體，例如對白細(xì)胞受體的單克隆抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配體；其它免疫調(diào)節(jié)化合物，例如具有至少一部分CTLA4或其突變體的胞外域的重組結(jié)合分子，例如與非-CTLA4蛋白序列結(jié)合的CTLA4或其突變體的至少細(xì)胞外部分，例如CTLA4Ig(例如指定的ATCC 68629)或其突變體，例如LEA29Y；粘附分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或者化療劑。
術(shù)語“化療劑”表示任何的化療劑，并且它包括但不限于i.芳香酶抑制藥，ii.抗雌激素藥、抗雄激素藥(特別是患前列腺癌時(shí))或戈那瑞林激動劑，iii.拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑或拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，iv.微管活化劑、烷化劑、抗腫瘤抗代謝藥物或鉑配合物，v.靶向/減小蛋白或脂類激酶活性或者蛋白或脂類磷酸酶活性的化合物，其它抗血管生成化合物或可誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程的化合物，vi.緩激肽1受體或血管緊張素II拮抗劑，vii.環(huán)加氧酶抑制劑、二膦酸酯化合物、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、肝素酶(heparanase)抑制劑(防止硫酸乙酰肝素降解)如PI-88、生物應(yīng)答修飾劑，優(yōu)選淋巴因子或干擾素，例如干擾素γ、遍在蛋白化抑制劑或能阻斷抗細(xì)胞凋亡途徑的抑制劑，viii.Ras致癌同種型抑制劑，例如H-Ras、K-Ras或N-Ras，或法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，例如L-744,832或DK8G557，
ix.端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑，例如telomestatin，x.蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、蛋氨酸氨基肽酶抑制劑，例如bengamide或其衍生物，或蛋白體抑制劑，例如PS-341，和/或xi.mTOR抑制劑。
如本文所用的術(shù)語“芳香酶抑制劑”涉及能抑制雌激素生成，即將雄甾烯二酮和睪酮底物分別轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇的化合物。該術(shù)語包括但不限于甾類，尤其是阿他美坦、依西美坦和福美坦，和特別是非甾類，尤其是氨魯米特、羅谷亞胺、吡魯米特、曲洛司坦、睪內(nèi)酯、酮康唑、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和來曲唑。包含芳香酶抑制劑化療劑的本發(fā)明的組合對于治療激素受體陽性腫瘤如乳腺瘤是特別有用的。
如本文所用的術(shù)語“抗雌激素藥”涉及在雌激素受體水平對抗雌激素效應(yīng)的化合物。該術(shù)語包括但不限于他莫昔芬、氟維司群、雷洛昔芬和鹽酸雷洛昔芬。包含抗雌激素化療劑的本發(fā)明的組合對于治療雌激素受體陽性腫瘤如乳腺瘤是特別有用的。
如本文所用的術(shù)語“抗雄激素藥”涉及能夠抑制雄性激素生物效應(yīng)的任一物質(zhì)，包括但不限于比卡魯胺。
如本文所用的術(shù)語“戈那瑞林激動劑”包括但不限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和乙酸戈舍瑞林。
如本文所用的術(shù)語“拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑”包括但不限于托泊替康、依立替康、9-硝基喜樹堿和大分子喜樹堿軛合物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)。
如本文所用的術(shù)語“拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑”包括但不限于蒽環(huán)霉素類如阿霉素、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和奈莫柔比星(nemorubicin)、蒽醌米托蒽醌和洛索蒽醌，以及鬼臼脂素(podophilltoxines)依托泊苷和替尼泊苷。
術(shù)語“微管活性劑”涉及微管穩(wěn)定劑和微管去穩(wěn)定劑，包括但不限于紫杉烷類如紫杉醇和多西他賽，長春生物堿如長春花堿且特別是硫酸長春花堿、長春新堿且特別是硫酸長春新堿，以及長春瑞濱，discodermolides以及埃坡霉素及其衍生物，例如埃坡霉素B或其衍生物。
如本文所用的術(shù)語“烷化劑”包括但不限于白消安、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥或亞硝基脲(BCNU或GliadelTM)。
術(shù)語“抗腫瘤抗代謝物”包括但不限于5-氟尿嘧啶、卡培他濱、吉西他濱、阿糖胞苷、氟達(dá)拉濱、硫鳥嘌呤、甲氨蝶呤和依達(dá)曲沙。
如本文所用的術(shù)語“鉑配合物”包括但不限于卡鉑、順鉑和奧沙利鉑。
如本文所用的術(shù)語“靶向/減小蛋白或脂類激酶活性的化合物，其它抗血管生成化合物”包括但不限于蛋白酪氨酸激酶和/或絲氨酸和/或蘇氨酸激酶抑制劑或脂激酶抑制劑，例如能靶向、減小或抑制以下酶活性的化合物酪氨酸激酶受體的表皮生長因子家族(EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4作為同或異二聚物)、酪氨酸激酶受體的血管內(nèi)皮生長因子家族(VEGFR)、血小板源性生長因子受體(PDGFR)、成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)、胰島素樣生長因子受體-1(IGF-1R)、Trk酪氨酸激酶受體家族、Axl酪氨酸激酶受體家族、Ret酪氨酸激酶受體、Kit/SCFR酪氨酸激酶受體、c-Abl家族成員及其基因融合物(例如BCR-Abl)、蛋白激酶C(PKC)和絲氨酸/蘇氨酸激酶的Raf家族成員、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK或PI(3)激酶家族成員或與PI(3)激酶有關(guān)的激酶家族成員、和/或細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族(CDK)成員和有其它例如與蛋白或脂類激酶抑制無關(guān)的活性機(jī)理的抗血管生成化合物。
靶向、減小或抑制VEGFR活性的化合物尤其是能抑制VEGF酪氨酸激酶受體、抑制VEGF受體或與VEGF結(jié)合的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，和特別是在下述文獻(xiàn)中一般和具體公開的化合物、蛋白質(zhì)或單克隆抗體，例如WO 98/35958中的1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶基甲基)酞嗪或其可藥用鹽，如琥珀酸鹽；WO 00/27820中的N-芳基(硫代)氨基苯甲酸酰胺衍生物，例如2-[(4-吡啶基)甲基]氨基-N-[3-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺或2-[(1-氧-4-吡啶基)甲基]氨基-N-[3-三氟甲基苯基]苯甲酰胺，或者WO 00/09495、WO 00/59509、WO 98/11223、WO 00/27819和EP0769947中的那些；如M.Prewett等人在Cancer Research59(1999)5209-5218中、F.Yuan等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第93卷，第14765-14770頁，1996年12月中、Z.Zhu等人在Cancer Res.58，1998，3209-3214中和J.Mordenti等人在Toxicologic Pathology，第27卷第1期，第14-21頁，1999中描述的那些；WO 00/37502和WO 94/10202中的那些；M.S.O’Reilly等人在Cell79，1994，315-328中描述的AngiostatinTM；M.S.O’Reilly等人在Cell 88，1997，277-285中描述的EndostatinTM；鄰氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；或抗VEGF抗體或抗-VEGF受體抗體，例如RhuMab。
抗體表示完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體以及抗體碎片，只要該抗體碎片能顯示出所需的生物活性。
靶向、減小或抑制表皮生長因子受體家族活性的化合物尤其是能抑制EGF酪氨酸激酶受體家族成員如EGF受體、ErbB2、ErbB3和ErbB4或結(jié)合EGF或EGF有關(guān)配體的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，或者是對ErbB及VEGF激酶受體具有雙重抑制作用的那些，它們特別是下述文獻(xiàn)中概括和具體公開的化合物、蛋白質(zhì)或單克隆抗體WO 97/02266，如實(shí)施例39的化合物，或者EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0520722、EP 0 566 226、EP 0 787 722、EP 0 837 063、US 5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983，尤其是在WO 96/30347(例如稱為CP 358774的化合物)、WO 96/33980(例如化合物ZD 1839)及WO 95/03283(例如化合物ZM105180)或PCT/EP02/08780中公開的那些；例如曲妥單抗(HerpetinR)、西妥昔單抗、Iressa、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3。
靶向、減小或抑制PDGFR活性的化合物尤其是能抑制PDGF受體的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如伊馬替尼。
靶向、減小或抑制c-AbI家族成員及其基因融合產(chǎn)物活性的化合物例如是N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如伊馬替尼；PD180970；AG957或NSC 680410。
靶向、減小或抑制蛋白激酶C、Raf、MEK、SRC、JAK、FAK和PDK家族成員或PI(3)激酶或與PI(3)激酶有關(guān)家族成員和/或細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族(CDK)成員活性的化合物，尤其是EP 0 296 110中公開的星孢素衍生物如米哚妥林；其它化合物的實(shí)例包括例如UCN-01、沙芬戈、BAY 43-9006、苔蘚抑素1、哌立福辛；伊莫福新；RO 318220和RO 320432；GO 6976；Isis 3521；或LY333531/LY379196。
其它抗血管生成化合物例如是薩力多胺(THALOMID)和TNP-470。
靶向、減小或抑制蛋白或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物例如是磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25如岡田酸或其衍生物的抑制劑。
能誘導(dǎo)細(xì)胞變異過程的化合物例如是視黃酸、α-、γ-或6-生育酚或α-、γ-或6-生育三烯酚。
如本文所用的術(shù)語環(huán)加氧酶抑制劑包括但不限于例如塞來考昔(CelebrexR)、羅非考昔(VioxxR)、etoricoxib、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸如5-甲基-2-(2’-氯-6’-氟苯氨基)苯基乙酸。
如本文所用的術(shù)語“組蛋白脫乙酰酶抑制劑”包括但不限于MS-27-275、SAHA、pyroxamide、FR-901228或丙戊酸。
如本文所用的術(shù)語“二膦酸酯化合物”包括但不限于依替膦酸、氯膦酸、替魯膦酸、帕米膦酸、阿侖膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑來膦酸。
如本文所用的術(shù)語“基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑”包括但不限于膠原模擬肽和非模擬肽抑制劑、四環(huán)素衍生物例如異羥肟酸模擬肽抑制劑巴馬司他及其口服生物可接受類似物馬立馬司他、普啉司他、BMS-279251、BAY12-9566、TAA211或AAJ996。
如本文所用的術(shù)語“mTOR抑制劑”包括但不限于雷帕霉素(西羅莫司)或其衍生物，例如32-去氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32-去氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氫-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素及更優(yōu)選的40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素。雷帕霉素衍生物的其它實(shí)例包括例如CCI779或40-[3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸鹽]-雷帕霉素或其可藥用鹽(如USP 5,362,718中所公開的)，ABT578或40-(四唑基)-雷帕霉素、特別是40-表-(四唑基)-雷帕霉素(例如WO 99/15530中所公開的)，或者是如例如WO 98/02441和WO01/14387中公開的rapalogs，例如AP23573。
當(dāng)式I化合物與其它免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)、抗炎或化療療法組合施用時(shí)，共同施用的免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗炎或化療化合物的劑量當(dāng)然可以根據(jù)所共用藥物的類型(例如它是類固醇還是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑)、所用的具體藥物和所治療的病癥等而變化。
根據(jù)前文所述，本發(fā)明在另一方面還提供了5.上文定義的方法，該方法包括共同施用、例如同時(shí)或依次施用治療有效的非中毒量的式I化合物以及至少第二種藥物物質(zhì)，例如免疫抑制藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、抗炎藥物或化療藥物，例如上文所指出的；6.藥物組合，例如藥盒，包含a)第一種藥物，為游離形式或可藥用鹽形式的如本文所公開的式I化合物，及b)至少一種共用藥物，例如免疫抑制藥物、免疫調(diào)節(jié)藥物、抗炎藥物或化療藥物，例如上文所指出的。該藥盒可以包含其施用說明。
如本文所用的術(shù)語“共同施用”或“組合施用”等意欲囊括給單個(gè)患者施用選定的治療藥物，并且意欲包括其中藥物不一定通過相同施用途徑或在相同時(shí)間施用的治療方案。
如本文所用的術(shù)語“藥物組合”表示將一種以上的活性成分混合或組合而得到的產(chǎn)品，包括活性成分的固定組合及非固定組合。術(shù)語“固定組合”表示以單一實(shí)體或劑量的形式給患者同時(shí)施用活性成分(例如式I化合物)及共用藥物。術(shù)語“非固定組合”表示活性成分(例如式I化合物)及共用藥劑作為單獨(dú)的實(shí)體沒有具體時(shí)間限制地同時(shí)、共同或依次施用于患者，其中這種施用在患者體內(nèi)可提供這兩種化合物的治療有效水平。后者還應(yīng)用于雞尾酒療法，例如施用三種或三種以上的活性成分。
制備本發(fā)明化合物的方法本發(fā)明還包括制備本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)化合物的方法。在所述的反應(yīng)中，有必要保護(hù)反應(yīng)活性官能團(tuán)來避免它們不被希望地參與反應(yīng)，例如羥基、氨基、亞氨基、硫基或羧基基團(tuán)，這些基團(tuán)在終產(chǎn)物中是希望存到的。常規(guī)的保護(hù)基團(tuán)可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐來使用，例如，參見T.W.Greene和P.G.M.Wuts的“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)”(Protective Groups inOrganic Chemistry，John Wiley and Sons，1991)。
式I化合物可以通過以下反應(yīng)流程
圖1中的過程來制備反應(yīng)流程圖1 其中，R1、R2、R3、R4、X1、X2、A和Z如上述式I中定義。式I化合物可通過使式2化合物與式3化合物在適宜溶劑(例如DCM或DMF等)和適宜堿(例如DIEA或NaOH等)的存在下反應(yīng)來制備。反應(yīng)在約0℃至約100℃溫度下進(jìn)行，并且進(jìn)行約48小時(shí)使反應(yīng)完全。
其中R3是氫或C1-6烷基且R4是氫的式I化合物可以通過以下反應(yīng)流程圖2中的過程來制備反應(yīng)流程圖2
其中R1、R2、X1、X2、A和Z如上述式I中定義。式I化合物可通過使式4化合物與式3化合物在適宜溶劑(例如MeOH等)、適宜堿(例如TEA等)和適宜還原劑(NaCNBH3等)的存在下反應(yīng)來制備。反應(yīng)在約0℃至約100℃溫度下進(jìn)行，并且進(jìn)行約48小時(shí)使反應(yīng)完全。
制備本發(fā)明化合物的額外方法本發(fā)明的化合物的可藥用的酸加成鹽可以通過使化合物的游離堿形式與可藥用的無機(jī)或有機(jī)酸反應(yīng)來制備?；蛘?，本發(fā)明化合物的可藥用的堿加成鹽可以通過使化合物的游離酸形式與可藥用的無機(jī)或有機(jī)堿反應(yīng)來制備?；蛘?，本發(fā)明化合物的鹽形式可以使用原料或中間體的鹽來制備。
本發(fā)明化合物的游離酸或游離堿的形式可以分別由相應(yīng)的堿加成鹽或酸加成鹽來制備。例如酸加成鹽形式的本發(fā)明的化合物可以通過用適宜的堿(例如氫氧化銨溶液或氫氧化鈉等)處理而轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的游離堿。堿加成鹽形式的本發(fā)明的化合物可以通過用適宜的酸(例如鹽酸等)處理而轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的游離酸。
未氧化形式的本發(fā)明的化合物可以由本發(fā)明化合物的N-氧化物通過用還原劑(例如硫、二氧化硫、三苯膦、硼氫化鋰、硼氫化鈉、三氯化磷、三溴化合物等)在適宜的惰性有機(jī)溶劑(例如乙腈、乙醇、二噁烷水溶液等)中于0至80℃處理來制備。
本發(fā)明化合物的前藥衍生物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來制備(例如，進(jìn)一步的詳情參見Saulnier等人，(1994)，Bioorganicand Medicinal Chemistry Letters，第4卷，第1985頁)。例如，適宜的前藥可以通過使非衍生化的本發(fā)明化合物與適宜的氨甲酰劑(例如1，1-酰氧基烷基碳酸酯氯化物(1，1-acyloxyalkylcarbonatechloridate)、對硝基苯基碳酸酯等)反應(yīng)來制備。
本發(fā)明化合物的被保護(hù)的衍生物可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來制備?？捎糜诒Ｗo(hù)基團(tuán)的產(chǎn)生及其除去的詳細(xì)技術(shù)描述可以在T W.Greene的“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)”(Protecting Groups in OrganicChemistry，第3版，John Wiley and Sons，Inc.，1999)中找到。
本發(fā)明的化合物可以作為溶劑化物(例如水合物)方便地制備或在本發(fā)明的方法中形成。本發(fā)明的化合物的水合物可以使用有機(jī)溶劑如二氧芑、四氫呋喃或甲醇從水性/有機(jī)溶劑的混合物中重結(jié)晶來方便地來制備。
單獨(dú)立體異構(gòu)體形式的本發(fā)明的化合物可如下制備使化合物的外消旋混合物與旋光活性拆分劑反應(yīng)形成一對非立體異構(gòu)體化合物，分離非立體異構(gòu)體并回收旋光純的對映異構(gòu)體。當(dāng)采用本發(fā)明化合物的共價(jià)非立體異構(gòu)體衍生物進(jìn)行對映異構(gòu)體的拆分時(shí)，優(yōu)選可分離的復(fù)合物(例如結(jié)晶性非立體異構(gòu)的鹽)。非立體異構(gòu)體具有不同的物理特性(例如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、溶解度、反應(yīng)活性等)，并且可以通過利用這些差異而易于分離。非立體異構(gòu)體可以通過色譜法或優(yōu)選通過基于溶解度差異的分離/拆分技術(shù)來分離。然后通過任何不會導(dǎo)致外消旋的可行方法來回收旋光純的對映異構(gòu)體及拆分劑?？捎糜趶钠渫庀旌衔镏胁鸱只衔锏牧Ⅲw異構(gòu)體的更詳細(xì)的技術(shù)描述見于Jean Jacques，Andre Collet和SamuelH.Wilen的“對映異構(gòu)體、外消旋物及拆分”(Enantiomers，Racematesand Resolutions，John Wiley And Sons，Inc.，1981)中。
總之，式I化合物可以通過包括如下步驟的方法來制備(a)上述反應(yīng)流程圖1或2；及(b)任選將本發(fā)明的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榭伤幱名}；(c)任選將本發(fā)明化合物的鹽形式轉(zhuǎn)變?yōu)榉躯}形式；(d)任選將本發(fā)明化合物的未氧化形式轉(zhuǎn)變?yōu)榭伤幱玫腘-氧化物；(e)任選將本發(fā)明化合物的N-氧化物形式轉(zhuǎn)變?yōu)槠湮囱趸问剑?f)任選從本發(fā)明化合物的異構(gòu)體混合物中拆分出單獨(dú)異構(gòu)體；(g)任選將非衍生化的本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榭伤幱玫那八幯苌?；?h)任選將本發(fā)明化合物的前藥衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)槠浞茄苌问健?br>
在沒有具體描述原料制備的情況下，化合物是已知的或者可類似于本領(lǐng)域已知的或在下文實(shí)施例中公開的方法來制備。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解上述轉(zhuǎn)化僅是制備本發(fā)明化合物的方法的示范，可以類似地使用其它眾所周知的方法。
實(shí)施例以下實(shí)施例提供了制備代表性化合物的詳述，用來說明而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例11-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸 向4-溴-3-(三氟甲基)苯胺(360mg，1.50mmol，1當(dāng)量)在DMF(5mL)中的溶液中加入苯基硼酸(274mg，2.25mmol，1.5當(dāng)量)、K2CO3(621mg，4.5mmol，3當(dāng)量)和四(三苯膦)鈀(0)(173mg，0.15mmol，0.1當(dāng)量)。將混合物用N2(g)凈化5分鐘，于120℃加熱20小時(shí)。冷卻至室溫后，反應(yīng)物用EtOAc稀釋，用H2O洗滌，然后用飽和NaCl水溶液洗滌，有機(jī)溶液經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，殘余物通過梯度硅膠色譜法純化(己烷至3∶1己烷/EtOAc)，得到2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基胺。[MS(ES+)238.1(M+1)+]。
將2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基胺(175mg，0.7377mmol，1當(dāng)量)溶于CH3OH(0.75mL)、H2O(0.75mL)和濃HCl水溶液(0.4mL)的混合物中。將溶液冷卻至0℃，在1小時(shí)內(nèi)緩慢加入NaNO2(71mg，1.033mmol，1.4當(dāng)量)溶于H2O(0.30mL)中的溶液，保持反應(yīng)溫度為0℃。加入完成后，將反應(yīng)混合物快速加入預(yù)加熱至65℃的O-乙基-黃原酸鉀鹽(237mg，1.475mmol，2當(dāng)量)在H2O(0.70mL)中的溶液中。反應(yīng)混合物于65℃攪拌15分鐘。冷卻至室溫后，反應(yīng)物用EtOAc稀釋，用H2O、然后用飽和NaCl水溶液洗滌。有機(jī)溶液經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(9∶1己烷/EtOAc)，得到二硫代甲酸O-乙基酯S-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)酯。
向二硫代甲酸O-乙基酯S-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基)酯(128mg，0.3738mmol)在EtOH(5mL)中的溶液中加入NaOH水溶液(1N，5mL)?；旌衔镉?5℃加熱3小時(shí)。冷卻至室溫后，加入1N HCl(aq)直至反應(yīng)物pH調(diào)節(jié)為約pH＝5。反應(yīng)物用EtOAc稀釋，用H2O、然后飽和NaCl水溶液洗滌。有機(jī)溶液經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，將所得2-三氟甲基-聯(lián)苯基-4-硫醇粗品(64mg，0.2519mmol)溶于EtOH(5mL)中。向該溶液中加入NaBH4(19mg，0.5039mmol，2當(dāng)量)。所得混合物于室溫?cái)嚢?5分鐘，此時(shí)向該反應(yīng)物中加入在DMF(1.5mL)中的4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(58mg，0.2519mmol，1當(dāng)量)?；旌衔镉谑覝亓硗鈹嚢?0分鐘。真空除去EtOH。所得DMF溶液用EtOAc稀釋，用H2O、然后用飽和NaCl水溶液洗滌。有機(jī)溶液經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(3∶1己烷/EtOAc)，得到4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-苯甲酸甲酯。[MS(ES+)425.1(M+23)+]。
向4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-苯甲酸甲酯(83mg，0.2062mmol，1當(dāng)量)在無水甲苯(5mL)中的冷卻至-78℃的溶液中加入DIBAL-H(1M，在甲苯中，0.41mL，0.41mmol，2當(dāng)量)?；旌衔镉?78℃攪拌30分鐘。反應(yīng)通過加入飽和NH4Cl水溶液使之淬滅，之后使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。反?yīng)物用EtOAc稀釋，用1N HCl(aq)、H2O和飽和NaCl水溶液洗滌。有機(jī)溶液經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(1∶1己烷/EtOAc)，得到[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-苯基]-甲醇。[MS(ES+)397.1(M+23)+]。
向[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-苯基]-甲醇(162mg，0.4327mmol，1當(dāng)量)在無水DCM(5mL)中的溶液中加入PPh3(148mg，0.5625mmol，1.3當(dāng)量)。混合物于室溫?cái)嚢?分鐘。此時(shí)將反應(yīng)物冷卻至0℃。向0℃的反應(yīng)混合物中加入CBr4(187mg，0.5625mmol，1.3當(dāng)量)在無水DCM(2mL)中的溶液。使反應(yīng)物緩慢溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢?2小時(shí)。反應(yīng)混合物直接進(jìn)行硅膠色譜法(6∶1 己烷/EtOAc)，得到4-(4-溴甲基-芐基硫基)-2-三氟甲基-聯(lián)苯。
向4-(4-溴甲基-芐基硫基)-2-三氟甲基-聯(lián)苯(185mg，0.4230mmol，1當(dāng)量)在無水DCM(7mL)中的溶液中加入氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸甲酯(HCl鹽，96mg，0.6345mmol，1.5當(dāng)量)和DIEA(0.74mL，4.230mmol，10當(dāng)量)?；旌衔镉谑覝?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)混合物直接進(jìn)行硅膠色譜法(梯度為5∶1己烷/EtOAc至1∶2己烷/EtOAc)，得到1-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸甲酯。
向1-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸甲酯(129mg，0.2736mmol，1當(dāng)量)在MeOH(5mL)與H2O(0.5mL)的混合物中的溶液中加入LiOH-H2O(23mg，0.5472mmol，2當(dāng)量)?；旌衔镉谑覝?cái)嚢?小時(shí)。在濃縮后，粗品經(jīng)制備型RP LC-MS純化，得到1-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸1H NMR(CD3OD，400MHz)67.61(s，1H)，7.60(d，1H)，7.56(d，2H)，7.46-7.39(m，6H)，7.29(d，2H)，4.42(s，2H)，4.35(s，2H)，4.31(d，4H)，3.73-3.61(m，1H)；MS(ES+)(458.1，M+1)+。
實(shí)施例23-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸
如上所述，通過4-(4-溴甲基-芐基硫基)-2-三氟甲基-聯(lián)苯與3-氨基-丙酸叔丁酯的反應(yīng)類似地合成3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸叔丁酯。
向3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸叔丁酯(24mg，0.0478mmol，1當(dāng)量)在DCM(2mL)中的溶液中加入三乙基硅烷(0.038mL，0.2392mmol，5當(dāng)量)，然后加入TFA(2mL)?；旌衔镉谑覝?cái)嚢?小時(shí)。在濃縮后，粗品經(jīng)制備型RP LC-MS純化，得到3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸1H NMR(CD3OD，400MHz)67.66(s，1H)，7.60(d，1H)，7.55-7.38(m，7H)，7.28-7.21(m，3H)，4.33(s，2H)，4.18(s，2H)，3.26(t，2H)，2.72(t，2H)；MS(ES+)(446.1，M+1)+。
實(shí)施例31-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸 步驟1中間體的合成4-溴甲基-1-環(huán)己基-2-三氟甲基-苯于0℃向4-氯-3-三氟甲基-苯甲醛(2.1g，10mmol)在甲醇(30mL)中的溶液中加入NaBH4(400mg，10.6mmol)。2小時(shí)后，通過加入H2O(20mL)、然后加入HCl水溶液(1N，10mL)使反應(yīng)淬滅。混合物用EtOAc(3×20mL)萃取。所合并的有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，粗品(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-甲醇未經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一步驟。
于0℃向(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-甲醇粗品在DMF(無水，40mL)中的溶液中加入NaH(600mg，15mmol)。攪拌30分鐘后，將4-甲氧基芐基溴(2.21g，11mmol)經(jīng)注射器逐滴加入。于室溫?cái)嚢?小時(shí)后，將反應(yīng)物傾入冰與飽和NH4Cl水溶液的混合物中使之淬滅?；旌衔镉肊tOAc(3×30mL)萃取，所合并的有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，粗品經(jīng)硅膠色譜法純化(5％EtOAc的己烷溶液)，得到1-氯-4-(4-甲氧基-芐氧基甲基)-2-三氟甲基-苯，為無色油狀物。
向1-氯-4-(4-甲氧基-芐氧基甲基)-2-三氟甲基-苯(1.5g，4.5mmol)和環(huán)己基溴化鋅的THF溶液(0.5M，27mL)在NMP(30mL)中的混合物中加入雙(三叔丁基膦)鈀(0)(115mg，0.225mmol)。將混合物用N2凈化5分鐘，然后在N2下于120℃加熱12小時(shí)。冷卻至室溫后，加入H2O(100mL)和HCl水溶液(1N，20mL)使反應(yīng)淬滅?；旌衔镉肊tOAc(3×40mL)萃取。所合并的有機(jī)相用飽和NaHCO3水溶液、飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(5％EtOAc的己烷溶液)，得到1-環(huán)己基-4-(4-甲氧基-芐氧基甲基)-2-三氟甲基-苯，為無色油狀物。
將所得的1-環(huán)己基-4-(4-甲氧基-芐氧基甲基)-2-三氟甲基-苯溶于TFA與DCM(8mL，1∶1 v/v)的混合物中。于室溫?cái)嚢?小時(shí)后，蒸發(fā)所有的揮發(fā)性物質(zhì)，所得殘余物溶于EtOAc中，用飽和NaHCO3水溶液洗滌。分離有機(jī)層，用飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(20％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-苯基)-甲醇，為無色油狀物。
于0℃向(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-苯基)-甲醇(300mg，1.16mmol)和PPh3(460mg，1.74mmol)在DCM(5mL)中的混合物中加入溶于DCM(2mL)中的CBr4(580mg，1.74mmol)。反應(yīng)物于0℃攪拌1小時(shí)，然后濃縮。所得殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(5％EtOAc的己烷溶液)，得到4-溴甲基-1-環(huán)己基-2-三氟甲基-苯，為白色固體。
步驟21-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸的合成在配有Dean-Stark裝置的圓底燒瓶中，將4-甲硫基苯甲醛(5g，32.8mmol)、1，3-丙二醇(2.75g，36.1mmol)和甲苯磺酸(550mg，3.28mmol)在甲苯(300mL，無水)中的混合物在N2下于回流加熱。5小時(shí)后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用飽和NaHCO3水溶液(3×40mL)洗滌。有機(jī)相濃縮，所得粗品經(jīng)硅膠柱色譜法純化(15％EtOAc的己烷溶液)，得到2-(4-甲硫基-苯基)-[1，3]二噁烷，為黃色油狀物。
于0℃向2-(4-甲硫基-苯基)-[1，3]二噁烷(2g，9.5mmol)在DCM(50mL)中的溶液中加入m-CPBA(2.46g，10.5mmol)。將混合物于0℃攪拌1小時(shí)，之后加入Ca(OH)2(770mg，10.5mmol.)。反應(yīng)物另外攪拌30分鐘，然后將反應(yīng)混合物用DCM稀釋，經(jīng)硅藻土過濾。收集濾液并濃縮，得到2-(4-甲基亞磺?；?苯基)-[1，3]二噁烷，為白色固體。
將2-(4-甲基亞磺?；?苯基)-[1，3]二噁烷(400mg，1.76mmol)溶于乙腈(20mL)中。加入2，6-二甲基吡啶(0.64mL，5.5mmol)，并將溶液冷卻至-10℃。經(jīng)注射器逐滴加入TFAA(0.75mL，5.3mmol)。反應(yīng)物于-10至0℃攪拌1小時(shí)。所有揮發(fā)性物質(zhì)被蒸發(fā)，同時(shí)維持反應(yīng)混合物為0℃。加入預(yù)冷卻至0℃的MeOH與三乙胺的混合物(50mL，1∶1 v/v)。溫?zé)崴没旌衔锊⒂谑覝財(cái)嚢?0分鐘。蒸發(fā)所有揮發(fā)性物質(zhì)。將所得殘余物溶于乙醚中，用飽和NH4Cl水溶液洗滌。分離有機(jī)層，經(jīng)Na2SO4干燥，并濃縮，得到4-[1，3]二噁烷-2-基-苯硫酚粗品，為黃色油狀物，其未經(jīng)進(jìn)一步純化立即用于下一步驟。
將4-[1，3]二噁烷-2-基-苯硫酚粗品(0.9mmol)溶于DMF(15mL，無水)中。溶液冷卻至0℃，然后加入NaH(76mg，1.8mmol)。攪拌30分鐘后，將上述制備的溶于DMF(2mL)中的4-溴甲基-1-環(huán)己基-2-三氟甲基-苯(0.8mmol)經(jīng)注射器逐滴加入。混合物攪拌1小時(shí)，然后傾入冰與飽和NH4Cl水溶液的混合物中。水相用乙醚萃取(3×30mL)。所合并的有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，并濃縮。所得殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(10％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到2-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-苯基]-[1，3]二噁烷，為白色固體。
向2-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-苯基]-[1，3]二噁烷(90mg，0.2mmol)在THF(10mL)中的溶液中加入HCl水溶液(2N，0.7mL)。溶液于室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶液用乙醚(30mL)稀釋，用飽和NaHCO3水溶液(3×10mL)洗滌。有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，并部分濃縮，然后用MeOH(10mL)稀釋。向所得溶液中加入三乙胺(0.5mL)和氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸(46mmol，0.4mmol)。所得混合物于50℃攪拌30分鐘。將反應(yīng)物冷卻至室溫，加入NaCNBH3(63mg，1mmol)。所得混合物攪拌30分鐘，然后濃縮至干。粗品經(jīng)制備型RP LC-MS純化，得到1-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，為無色油狀物。1HNMR(400MHz，CD3OD)δ7.55-7.54(m，2H)，7.52-7.35(m，5H)，4.39(s，2H)，4.35(m，4H)，4.17(s，2H)，3.68(tt，1H)，2.90(tt，1H)，1.87-1.75(m，5H)，1.72-1.48(m，5H)；MS(ES+)(464.2，M+1)+。
實(shí)施例41-[4-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸 步驟1中間體的合成4-溴甲基-2-乙基-聯(lián)苯向4-氨基-3-乙基芐腈(4g，27.4mmol)和CuBr2(9.2g，41.1mmol)在乙腈(150mL)中的混合物中逐滴加入亞硝酸異戊酯(5.5mL，41.1mmol)。加入完成后，將混合物于60℃加熱4小時(shí)。冷卻至室溫后，將反應(yīng)混合物部分濃縮。加入乙醚，混合物用飽和NH4Cl水溶液洗滌。有機(jī)層經(jīng)Na2SO4干燥，并濃縮。所得殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化，得到4-溴-3-乙基芐腈，為淺褐色油狀物。
將4-溴-3-乙基芐腈(1g，4.76mmol)、苯基硼酸(1.16g，9.5mmol)、K2CO3(1.97g，14.3mmol)和Pd(PPh3)4(543mg，0.48mmol)在DMF(無水，15mL)中的混合物在密閉試管中于120℃加熱12小時(shí)。冷卻至室溫后，將反應(yīng)混合物傾入冰與飽和NH4Cl水溶液的混合物中?；旌衔镉肊tOAc(3×30mL)萃取。所合并的有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，并濃縮。所得粗品經(jīng)硅膠色譜法純化(5％EtOAc的己烷溶液)，得到2-乙基-聯(lián)苯-4-甲腈，為無色油狀物。
向2-乙基-聯(lián)苯-4-甲腈(0.95g，4.58mmol)在乙醇(50mL)中的溶液中加入固體KOH(2.56g，45.8mmol)。所得混合物于回流加熱12小時(shí)。冷卻至室溫后，將溶劑減壓蒸發(fā)至干。加入H2O(100mL)，并緩慢加入HCl水溶液(2N)至pH調(diào)節(jié)為約pH＝1?；旌衔镉肊tOAc(3×50mL)萃取。所合并的有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，并濃縮。將所得2-乙基-聯(lián)苯-4-甲酸粗品溶于甲醇(20mL)中。加入濃HCl水溶液(5mL)，混合物于回流加熱4小時(shí)。冷卻至室溫后，將反應(yīng)混合物減壓濃縮。所得殘余物溶于乙醚中，用飽和NaHCO3水溶液(3×10mL)洗滌。分離有機(jī)層，經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，將2-乙基-聯(lián)苯-4-甲酸甲酯粗品溶于THF(5mL)中，逐滴加入LAH(200mg，5.2mmol)在THF(15mL，無水)中的0℃混合物中。1小時(shí)后，緩慢加入H2O使反應(yīng)淬滅，然后加入HCl水溶液(1N，20mL)?；旌衔镉肊tOAc(3×40mL)萃取。所合并的有機(jī)層用飽和NaHCO3水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。在濃縮后，粗品經(jīng)硅膠色譜法純化(20％EtOAc的己烷溶液)，得到(2-乙基-聯(lián)苯-4-基)-甲醇，為無色油狀物。
于0℃向(2-乙基-聯(lián)苯-4-基)-甲醇(780mg，3.67mmol)和PPh3(1.44g，5.5mmol)在DCM(15mL)中的混合物中加入在DCM(2mL)中的CBr4(1.82g，5.5mmol)。將反應(yīng)物于0℃攪拌1小時(shí)，然后濃縮。所得殘余物經(jīng)硅膠色譜法純化(5％EtOAc的己烷溶液)，得到4-溴甲基-2-乙基-聯(lián)苯，為無色油狀物。
步驟21-[4-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸的合成在前述方法中采用4-溴甲基-2-乙基-聯(lián)苯代替4-溴甲基-1-環(huán)己基-2-三氟甲基-苯，得到1-[4-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸1HNMR(400MHz，CD3OD)δ7.44-7.23(m，11H)，7.12(s 1H)，4.50(s，2H)，4.39-4.33(m，5H)，4.27(s，2H)，3.68(tt，1H)，2.54(q 2H)，1.03(t，3H)；MS(ES+)(418.2，M+1)+。
通過采用適宜的原料重復(fù)上述實(shí)施例的方法，可以合成下述式I化合物(表1)。
表1
實(shí)施例5式I化合物顯示出生物活性A.體外測定GTP[γ-35S]與由表達(dá)人EDG受體的CHO細(xì)胞制備的膜結(jié)合的GPCR活化試驗(yàn)EDG-1(S1P1)GTP[γ-35S]結(jié)合試驗(yàn)勻化膜由穩(wěn)定表達(dá)人EDG-1N末端c-myc標(biāo)記的CHO細(xì)胞克隆來制備。收集前，細(xì)胞在兩個(gè)850cm2滾瓶的懸浮液中生長三或四天。將細(xì)胞離心下來，用冷PBS沖洗一次并重新混懸于≤20ml的緩沖液A(20mM HEPES，pH7.4，10mM EDTA，不含EDTA的完全蛋白酶抑制劑混合片[1片/25ml])中。將細(xì)胞混懸液在冰上使用Polytron勻化器以30000rpm勻化4次，每次間隔15秒。首先將勻化物在臺式低速離心機(jī)中以2000rpm離心10分鐘。然后將上清液經(jīng)過細(xì)胞滲濾器后于4C以50,000xg再離心25分鐘。將沉淀物重新混懸于緩沖液B(15％甘油，20mM HEPES，pH 7.4，0.1mM EDTA，不含EDTA的完全蛋白酶抑制劑混合片[1片/10ml])中。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)、使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce)測定制備的蛋白質(zhì)濃度。將膜等分并于-80C冷凍保存。
在DMSO中制備10mM至0.01nM的受試化合物溶液。將S1P用4％BSA溶液稀釋作為陽性對照。將所需量的制備膜用冰冷的分析緩沖液(20mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，10mM MgCl2，0.1％不含脂肪酸的BSA，5μM GDP)稀釋并充分渦旋。將2μl或更少的化合物分配至圓底96孔聚苯乙烯分析板的每個(gè)孔中，然后加入100μl稀釋的膜(3-10μg/孔)，于冰上保存直至加入熱的GTPγS。用冷分析緩沖液將[35S]-GTPγS以1∶1000(v/v)稀釋，每個(gè)孔中加入100μl。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行90分鐘，然后用Packard Filtermate收集器將膜收集到Perkin-Elmer UnifilterGF/B-96過濾板上。用洗滌緩沖液(20mM HEPES，pH7.4，100mM NaCl，10mM MgCl2)洗滌數(shù)次并用95％乙醇漂洗后，將過濾器在37℃的烘箱中干燥30分鐘。加入MicroScint-20，將板密封，在TopCount上進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。用GraphPad Prism的劑量響應(yīng)曲線擬合工具對GTP[γ-35S]結(jié)合曲線(原始數(shù)據(jù))擬合，得到EC50值。使用6或12個(gè)不同的濃度來產(chǎn)生濃度響應(yīng)曲線(每個(gè)濃度使用3個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn))。
以與EDG-1GTP[γ-35S]結(jié)合試驗(yàn)相當(dāng)?shù)姆椒ǎ褂脕碓从诜€(wěn)定表達(dá)c-末端c-myc標(biāo)記或未標(biāo)記受體的CHO細(xì)胞的膜進(jìn)行EDG-3、-5、-6和-8GTP[γ-35S]結(jié)合試驗(yàn)。對于每次膜制備，首先用S1P對照進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)以確定每個(gè)分析孔中膜的最佳加入量。根據(jù)上述試驗(yàn)對本發(fā)明的化合物進(jìn)行測定，觀察到顯示對EDG-1受體的選擇性。例如，在上述試驗(yàn)中，化合物9的EC50為0.82nM，與一種或多種包括EDG-3、EDG-5、EDG-6和EDG-8的其它受體相比，對EDG-1的選擇性至少是其它受體的1000倍。
B.體外FLIPR鈣流分析用FLIPR鈣流分析測定本發(fā)明的化合物對EDG-1、EDG-3、EDG-5和EDG-6的激動劑活性。簡言之，表達(dá)EDG受體的CHO細(xì)胞用含有5％FBS和500ug/ml G418的F-12K培養(yǎng)基(ATCC)維持。試驗(yàn)之前，將細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔/25μl含有1％FBS的F-12K培養(yǎng)基的密度鋪在384黑色透明底的板中。第二天，用洗滌緩沖液將細(xì)胞洗滌3次(25μl/次)。向每孔中加入約25μl染料并在37℃和5％CO2下孵育1小時(shí)。然后用洗滌緩沖液將細(xì)胞洗滌4次(25μl/次)。向每孔細(xì)胞中加入25μl SEQ2871溶液后分析鈣流。用表達(dá)每個(gè)不同EDG受體的細(xì)胞進(jìn)行相同的試驗(yàn)。在FLIPR鈣流分析中以3分鐘間隔記錄滴定，并以與EDG-1活化有關(guān)的最大峰高百分?jǐn)?shù)響應(yīng)來定量。
C.體內(nèi)測定血液淋巴細(xì)胞耗竭和評價(jià)心臟影響的篩選實(shí)驗(yàn)循環(huán)淋巴細(xì)胞的測定化合物溶解于DMSO中并稀釋得到4％DMSO(v/v，終濃度)的終濃度，然后進(jìn)一步用恒定體積的Tween8025％/H2O(v/v)稀釋。分別包含Tween8025％/H2O(200μl)、4％DMSO和FTY720(10μg)作為陰性和陽性對照。在短期異氟烷麻醉下，通過管飼給大鼠(C57bl/6雄性，6-10周齡)口服施用250-300μL化合物溶液。
在短期異氟烷麻醉下施藥后的6和24小時(shí)從后眼竇取血。將全血樣品進(jìn)行血液學(xué)分析。使用自動分析儀測定外周淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。用連結(jié)有熒光色素的特異性抗體對外周血液淋巴細(xì)胞亞組進(jìn)行染色，并使用熒光活化細(xì)胞分類器(Facscalibur)進(jìn)行分析。使用兩只大鼠來評價(jià)每種所篩選化合物的淋巴細(xì)胞耗竭活性。結(jié)果為ED50，該值定義為使50％的血液淋巴細(xì)胞耗竭所需的有效劑量。根據(jù)上述試驗(yàn)對本發(fā)明的化合物進(jìn)行測定，優(yōu)選發(fā)現(xiàn)顯示的ED50小于1mg/kg，更優(yōu)選ED50小于0.5mg/kg。例如，化合物9顯示的ED50＜0.1mg/kg。
心臟影響的評價(jià)使用AnonyMOUSE ECG篩選系統(tǒng)監(jiān)測化全物對心臟功能的影響。在化合物施用前后，記錄清醒大鼠(C57bl/6雄性，6-10周齡)的心電圖。然后采用e-MOUSE軟件對ECG信號進(jìn)行處理和分析。將進(jìn)一步稀釋于200μl水、15％DMSO中的90μg化合物腹膜內(nèi)注射。使用四只大鼠來評價(jià)每種化合物對心臟的影響。
D體內(nèi)抗血管生成活性將含有在0.5ml 0.8％w/v瓊脂(含有肝素，20U/ml)中的(i)1-磷酸鞘氨醇(5μM/室)或(ii)人VEGF(1μg/室)的多孔室皮下植入大鼠側(cè)腹。S1P或VEGF誘導(dǎo)室周血管生成組織的生長。這種響應(yīng)呈劑量依賴性，并且可以通過測定組織的重量和含血量來定量。從植入多孔室之前4-6小時(shí)開始，大鼠用式I化合物經(jīng)口服或靜脈內(nèi)處理，每日一次，持續(xù)4天。在最后劑量后的24小時(shí)，處死動物以測定血管生成組織。測定室周血管生成組織的重量和含血量。與僅用載體處理的動物相比，用式I化合物處理的動物的血管生成組織的重量和/或含血量減少。當(dāng)以約0.3至約3mg/kg的劑量施用時(shí)，式I化合物具有抗血管生成作用。
E體外抗腫瘤活性使用最初從乳腺癌中分離的小鼠乳腺癌細(xì)胞系，例如JygMC(A)。步驟開始前，將細(xì)胞數(shù)目調(diào)至5×105，用于鋪在新鮮培養(yǎng)基中。細(xì)胞用含有2.5mM胸苷的不含F(xiàn)CS的新鮮培養(yǎng)基孵育12小時(shí)，然后用PBS洗滌兩次，隨后加入含有10％FCS的新鮮培養(yǎng)基并另外孵育12小時(shí)。然后將細(xì)胞用含有2.5mM胸苷的不含F(xiàn)CS的新鮮培養(yǎng)基孵育12小時(shí)。為了使細(xì)胞從板上釋放，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，重新鋪在含有10％FCS的新鮮培養(yǎng)基中。同步化后，將細(xì)胞用或不用多種濃度的式I化合物孵育3、6、9、12、18或24小時(shí)。用0.2％EDTA處理后收集細(xì)胞，用70％冰冷乙醇溶液固定，用250μg/ml RNaseA(1-A型Sigma化學(xué)公司)于37℃水解30分鐘，并用10mg/ml碘化丙啶染色20分鐘。孵育期之后，通過在Coulter計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)細(xì)胞和通過SRB比色分析來測定細(xì)胞數(shù)目。在這些情形下，式I化合物在10-12至10-6M的濃度范圍內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
可以理解本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅是為了說明的目的，它們的各種變通方式或變化將提示給本領(lǐng)域技術(shù)人員，并且它們意欲包括在本發(fā)明的宗旨和理解以及所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利及專利申請被引入作為所有目的的參考。
權(quán)利要求
1.化合物，選自式I化合物及其可藥用的鹽、水合物、溶劑化物、異構(gòu)體和前藥 其中A選自-C(O)OR5、-OP(O)(OR5)2、-P(O)(OR5)2、-S(O)2OR5、-P(O)(R5)OR5和1H-四唑-5-基；其中每個(gè)R5獨(dú)立地選自氫和C1-6烷基；X1和X2各自獨(dú)立地選自鍵或C1-6亞烷基；Z選自 和 其中Z的左右星號分別表示式I中-C(R3)(R4)-與A之間的連接點(diǎn)；R6選自氫和C1-6烷基；且J1和J2獨(dú)立地為亞甲基或選自S、O和NR5的雜原子；其中R5選自氫和C1-6烷基；R1選自C6-10芳基和C2-9雜芳基；其中R1的任何芳基或雜芳基任選被選自鹵代、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基的基團(tuán)取代；其中R1的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基基團(tuán)可任選被選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基的一至五個(gè)基團(tuán)取代；且R1的任何烷基基團(tuán)的亞甲基可任選被選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR5-及-O-的原子或基團(tuán)替換；其中R5選自氫或C1-6烷基；R2選自C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-12環(huán)烷基C0-4烷基、鹵代、鹵素取代的C1-6烷基以及鹵素取代的C1-6烷氧基；R3及R4獨(dú)立地選自氫、C1-6烷基、鹵代、羥基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為任選被鹵代、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基取代的苯基、萘基、呋喃基或噻吩基；其中R1的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基基團(tuán)可任選被選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基的一至五個(gè)基團(tuán)取代；且R1的任何烷基基團(tuán)的亞甲基可任選被選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR5-及-O-的原子或基團(tuán)替換；其中R5為氫或C1-6烷基。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自 和 其中星號為R1和X2的連接點(diǎn)；R8為鹵代、C6-10芳基C0-4烷基、C2-9雜芳基C0-4烷基、C3-8環(huán)烷基C0-4烷基、C3-8雜環(huán)烷基C0-4烷基或C1-6烷基；其中R8的任何芳基、雜芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基基團(tuán)可任選被選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基的一至三個(gè)基團(tuán)取代；且R8的任何烷基基團(tuán)的亞甲基可任選被選自-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR5-及-O-的原子或基團(tuán)替換；其中R5為氫或C1-6烷基；且R9選自鹵代、C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵素取代的C1-6烷基及鹵素取代的C1-6烷氧基。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中A為-C(O)OH；Z選自 其中Z的左右星號分別表示式I中-C(R3)(R4)-和A之間的連接點(diǎn)；R6選自氫和C1-6烷基；且R3和R4均為氫。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中R2選自甲基、乙基、環(huán)丙基、氯、溴、氟和甲氧基。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中R1選自 和 其中R8選自鹵代、苯基、環(huán)己基、噻吩基、3，3-二甲基-丁基、吡啶基、環(huán)戊基和哌啶基；其中R8可任選被選自三氟甲基、甲氧基、氟、三氟甲氧基和甲基的1至3個(gè)基團(tuán)取代；且R9選自三氟甲基、氟、甲基、氯、甲氧基和乙基。
7.權(quán)利要求6的化合物，選自1-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，1-[4-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(4-溴-3-甲基-苯基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，1-[4-(2-甲基-聯(lián)苯-4-基硫甲基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-芐基硫基)-芐氨基]-丙酸，3-[4-(2′-乙基-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐氨基]-丙酸，1-[4-(2′-乙基-2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐基]-氮雜環(huán)丁烷-3-甲酸，3-[4-(2-三氟甲基-聯(lián)苯-4-基甲基亞磺?；?-芐氨基]-丙酸，和3-[4-(2-乙基-聯(lián)苯-4-基甲硫基)-芐氨基]-丙酸。
8.藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1的化合物以及可藥用的賦形劑。
9.治療動物疾病的方法，其中EDG/S1P受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變可預(yù)防、抑制或改善該疾病的病理學(xué)和/或癥候?qū)W，該方法包括給動物施用治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
10.在受試者中預(yù)防或治療由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的紊亂或疾病、預(yù)防或治療急性或慢性移植排斥或T-細(xì)胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病、抑制或控制血管生成失?；蛘哳A(yù)防或治療由新血管生成過程介導(dǎo)的或與血管生成失常有關(guān)的疾病的方法，該方法包括給需要其的受試者施用有效量的權(quán)利要求1的化合物或其可藥用鹽。
11.權(quán)利要求1的化合物在制備用于治療動物疾病的藥物中的用途，其中EDG/S1P受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變對該疾病的病理學(xué)和/或癥候?qū)W而言是有益的。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫抑制劑、其制備方法、其用途以及含有它們的藥物組合物。本發(fā)明提供了一類新的用于治療或預(yù)防由淋巴細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂、特別是與EDG受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的疾病的化合物。
文檔編號C07D207/12GK1787817SQ200480013194
公開日2006年6月14日 申請日期2004年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月19日
發(fā)明者T·H·馬爾西利耶, N·S·格雷, 江濤, 陸文碩, 潘世風(fēng) 申請人:Irm責(zé)任有限公司