專利名稱：用于治療或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(sars)的甘草皂苷或其衍生物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2003年6月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/476,908的權(quán)益，并將其全部公開內(nèi)容完整收入本文作為參考。
1.引言本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染特別是嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的方法。更具體的說，本發(fā)明提供了通過施用甘草皂苷和/或其衍生物來預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法。本發(fā)明還提供了通過施用甘草皂苷和/或其衍生物并聯(lián)合甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑來預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法。
2.發(fā)明背景2.1.嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)在嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)患者中發(fā)現(xiàn)了一種新的冠狀病毒，經(jīng)鑒定它可能是SARS的病因(SARS；Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.3481967-76)。SARS是極其可能通過親密接觸傳播的傳染病。SARS的癥狀包括發(fā)燒(＞38℃)、干咳、呼吸短促或呼吸困難、和指示肺炎的胸部X射線變化。其它癥狀包括頭痛、肌肉僵硬、喪失食欲、不適、精神錯(cuò)亂、皮疹、和腹瀉。目前尚無用于預(yù)防或治療SARS相關(guān)冠狀病毒感染的特效療法?？紤]到SARS相關(guān)冠狀病毒的傳播能力和SARS的致命性，需要用于預(yù)防、治療、和/或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染的預(yù)防性和治療性療法。
2.2.甘草皂苷在歐亞甘草(Glycyhrrhizza glabra)中發(fā)現(xiàn)的最突出的化合物甘草皂苷是三萜糖苷。歐亞甘草原產(chǎn)于土耳其、伊朗、西班牙、希臘、和中國(guó)北部。使用歐亞甘草和甘草皂苷作為食品中的甜味劑和調(diào)味劑以及治療多種健康問題已有數(shù)千年歷史。
甘草皂苷的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)三萜部分(甘草亭酸)和兩個(gè)艾杜糖醛酸殘基。用于治療諸如胃潰瘍(甘草皂苷抑制15-羥基-前列腺素脫氫酶和δ-13-前列腺素還原酶)、感冒和其它病毒感染(甘草皂苷可刺激干擾素生成并據(jù)報(bào)道有化痰/抑制咳嗽的特性)、微生物和寄生蟲感染(甘草皂苷可刺激免疫系統(tǒng))、癌癥(可能也涉及免疫系統(tǒng)功能)等疾病已有較長(zhǎng)歷史。綜述參閱Wendell，1998年，U.S.Pharmacist23(4)，“草藥歐亞甘草”Herbal PharmacyLicorice。甘草皂苷抑制分解皮甾醇的酶，這延長(zhǎng)了天然產(chǎn)生的皮甾醇在體內(nèi)的作用，導(dǎo)致抗炎效果以及由糖皮質(zhì)激素引起的鈉保持、水保持、和鉀流失。
甘草皂苷的其它名稱包括甘草酸(Glycyrrhizic acid)、甘草亭酸糖苷、和(3-β，20-β)-20-羧基-11-氧-30-正齊墩果-12-烯-3-基2-O-β-D-葡糖吡喃糖基糖醛基-α-D-葡糖吡喃糖苷糖醛酸。
本申請(qǐng)書第二部分或任何其它部分中對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用并非承認(rèn)該文獻(xiàn)是本申請(qǐng)的現(xiàn)有技術(shù)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了以甘草皂苷為基礎(chǔ)的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染)。具體而言，本發(fā)明提供了以甘草皂苷為基礎(chǔ)的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀。更具體的說，本發(fā)明提供了預(yù)防和治療方案，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀，包括對(duì)有所需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物，以及任選的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑。除了甘草皂苷及其衍生物以外可用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的預(yù)防劑或治療劑的實(shí)例包括但不局限于抗病毒劑、抗生素、免疫調(diào)控劑、抗炎劑、和與病毒抗原(例如SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)免疫特異結(jié)合的抗體。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)有所需要的受試者(優(yōu)選人類受試者)施用預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)有所需要的受試者(優(yōu)選人類受試者)施用預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物以及預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑。依照這些實(shí)施方案，甘草皂苷或其衍生物優(yōu)選純化的。
本發(fā)明包括用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物包含甘草皂苷或其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含下文通式I的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含甘草皂苷或其衍生物以及一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含下文通式I的化合物以及一種或多種預(yù)防劑或治療劑。依照這些實(shí)施方案，組合物還可包含載體。預(yù)防劑或治療劑的非限制性實(shí)例包括免疫調(diào)控劑、抗炎劑、抗病毒劑、抗生素、以及與SARS相關(guān)冠狀病毒抗原免疫特異性結(jié)合的抗體、蛋白質(zhì)、多肽、或肽。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，藥物組合物包含藥用可接受載體、有效量的甘草皂苷或其衍生物、以及任選的有效量的一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑。依照該實(shí)施方案，藥物組合物優(yōu)選無菌的，且采取適合待施用方法的形式。
本發(fā)明提供了對(duì)有所需要的受試者單獨(dú)施用有效量的甘草皂苷或其衍生物或是與有效量的一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的治療劑聯(lián)合施用的流程，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀。本發(fā)明聯(lián)合療法的療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)可同時(shí)或順序施用于受試者。本發(fā)明聯(lián)合療法的療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)也可循環(huán)施用。循環(huán)施用包括施用第一種療法(例如第一種預(yù)防性或治療性試劑)一段時(shí)間，然后施用第二種治療劑(例如第二種預(yù)防性或治療性試劑)一段時(shí)間，并重復(fù)此順序進(jìn)行施用即循環(huán)施用，以減少對(duì)某種療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)的抗性，從而避免或減少某種療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)的副作用和/或提高功效。
本發(fā)明聯(lián)合療法的療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)可同時(shí)施用于受試者。術(shù)語“同時(shí)”并不局限于嚴(yán)格的在同一時(shí)間施用療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)，更意味著甘草皂苷或其衍生物和另一種(或多種)療法以某一順序且在某一時(shí)間間隔內(nèi)施用于受試者，從而使甘草皂苷或其衍生物可與其它療法一起發(fā)揮作用，以獲得高于其它方式施用的效率。例如，各種療法可以在同一時(shí)間或在不同時(shí)間點(diǎn)以任何次序順序施用于受試者，然而，如果不在同一時(shí)間施用，它們應(yīng)在足夠近的時(shí)間內(nèi)施用以便達(dá)到預(yù)期的治療或預(yù)防效果。各種療法可以以任何合適形式或任何合適途徑分開施用于受試者。在多個(gè)實(shí)施方案中，各種療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)施用于受試者的時(shí)間間隔少于15分鐘、間隔少于30分鐘、間隔少于1小時(shí)、間隔約1小時(shí)、間隔約1小時(shí)至約2小時(shí)、間隔約2小時(shí)至約3小時(shí)、間隔約3小時(shí)至約4小時(shí)、間隔約4小時(shí)至約5小時(shí)、間隔約5小時(shí)至約6小時(shí)、間隔約6小時(shí)至約7小時(shí)、間隔約7小時(shí)至約8小時(shí)、間隔約8小時(shí)至約9小時(shí)、間隔約9小時(shí)至約10小時(shí)、間隔約10小時(shí)至約11小時(shí)、間隔約11小時(shí)至約12小時(shí)、間隔24小時(shí)、間隔48小時(shí)、間隔72小時(shí)、或間隔1周。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在同一次患者就診時(shí)對(duì)患者施用兩種或多種療法例如預(yù)防性或治療性試劑)。
聯(lián)合療法的預(yù)防性或治療性試劑可以在同一藥用組合物中施用于受試者?；蛘撸?lián)合療法的預(yù)防性或治療性試劑可以在分開的藥用組合物中同時(shí)施用于受試者。預(yù)防性或治療性試劑可以以相同或不同的施用路徑施用于受試者。
可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的任何施用方法施用本發(fā)明的預(yù)防劑或治療劑(例如甘草皂苷或其衍生物)、組合物、或聯(lián)合療法，包括但不限于腸胃外施用(例如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、和皮下施用)、硬膜外施用、局部施用、肺部施用、和粘膜施用(例如鼻內(nèi)和口服路徑)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將預(yù)防性或治療性試劑或是藥用組合物皮下、肌肉內(nèi)、局部、或靜脈內(nèi)施用于受試者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，口服、鼻內(nèi)、或通過肺部施用將預(yù)防性或治療性試劑或是藥用組合物施用于受試者。預(yù)防性或治療性試劑或是藥用組合物可以全身或局部施用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的預(yù)防性或治療性試劑(例如甘草皂苷或其衍生物)、組合物、或是聯(lián)合療法可以局部施用于受試者有待治療的區(qū)域，這可以通過例如但不限于局部輸液、注射、或植入的手段來實(shí)現(xiàn)，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝膠材料，包括諸如硅膠膜等膜或纖維。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在介質(zhì)中將本發(fā)明的預(yù)防性或治療性試劑(例如甘草皂苷或其衍生物)、組合物、或聯(lián)合療法投遞至受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在受控釋放或緩釋系統(tǒng)中將本發(fā)明的預(yù)防性或治療性試劑(例如甘草皂苷或其衍生物)、組合物、或聯(lián)合療法投遞至受試者。
本發(fā)明提供了抑制或減少病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的方法，所述方法包括用甘草皂苷或其衍生物接觸細(xì)胞。本發(fā)明還提供了抑制或破壞病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)一個(gè)或多個(gè)階段的方法。所述病毒感染階段包括但不局限于進(jìn)入細(xì)胞、病毒復(fù)制、病毒基因產(chǎn)物的表達(dá)、病毒顆粒的產(chǎn)生、以及病毒顆粒的釋放。
本發(fā)明還提供了抑制或破壞病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)復(fù)制的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸甘草皂苷或其衍生物。本發(fā)明還提供了抑制或破壞病毒顆粒(例如冠狀病毒顆粒、丙型肝炎病毒顆粒、流感病毒顆粒、和西尼羅河病毒顆粒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒顆粒)產(chǎn)生和/或釋放的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸甘草皂苷或其衍生物。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，相對(duì)于諸如PBS等對(duì)照而言，在本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的體外和/或體內(nèi)測(cè)定法中，甘草皂苷或其衍生物將病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)抑制或破壞了至少25％、優(yōu)選至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于諸如PBS等對(duì)照而言，在本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的體外和/或體內(nèi)測(cè)定法中，甘草皂苷或其衍生物將病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)復(fù)制抑制或破壞了至少25％、優(yōu)選至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于諸如PBS等對(duì)照而言，在本文所述或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的體外和/或體內(nèi)測(cè)定法中，甘草皂苷或其衍生物將病毒顆粒(例如冠狀病毒顆粒、丙型肝炎病毒顆粒、流感病毒顆粒、和西尼羅河病毒顆粒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒顆粒)產(chǎn)生和/或釋放抑制或破壞了至少25％、優(yōu)選至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％。
本發(fā)明還提供了在容器中裝有預(yù)防性或治療性試劑(例如甘草皂苷或其衍生物)以及任選在同一容器或不同容器中裝有甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑的商品，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀。所述商品還可包括說明書。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的甘草皂苷衍生物 或其藥用可接受鹽，其中R1、R2、和R3是N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R4不是噻唑、尿嘧啶或
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物 或其藥用可接受鹽，其中R1和R2中的一個(gè)是
且R3及R1和R2中的另一個(gè)是獨(dú)立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、氨基酸、肽、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的甘草皂苷衍生物 或其藥用可接受鹽，其中R1、R2、和R3中的一個(gè)是氨基酸或肽，而R1、R2、和R3中的另兩個(gè)是獨(dú)立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的甘草皂苷衍生物
或其藥用可接受鹽，其中R1、R2和R3是 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的甘草皂苷衍生物
或其藥用可接受鹽，其中R1、R2、和R3是獨(dú)立的5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R1、R2和R3不全是脯氨酸。
通式I的甘草皂苷衍生物可用于治療或預(yù)防病毒感染，例如諸如SARS相關(guān)冠狀病毒等冠狀病毒的感染。
3.1.術(shù)語和縮寫附加的在用于本文時(shí)，術(shù)語“附加的”和“聯(lián)合的”可與“結(jié)合的”或“組合的”可互換使用。
抗體在用于本文時(shí)，術(shù)語“抗體”指單克隆抗體、多特異性抗體、人源抗體、人源化抗體、camelised抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab)片段、二硫鍵連接Fv(sdFv)、和抗獨(dú)特型(抗Id)抗體以及任何上述分子的表位結(jié)合片段。具體而言，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性片段，即含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。
免疫球蛋白分子可以是任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、和IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAI、和IgA2)或亞型。
抗病毒化合物在用于本文時(shí)，術(shù)語“抗病毒化合物”和“抗病毒劑”可互換使用。
有效量在用于本文時(shí)，術(shù)語“有效量”指足以降低或減輕病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的嚴(yán)重程度和/或持續(xù)時(shí)間，預(yù)防病毒(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)感染發(fā)展，預(yù)防與病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)有關(guān)的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)、發(fā)展、或發(fā)作，預(yù)防或減少病毒(例如，冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)的復(fù)制或增殖，預(yù)防或減少病毒顆粒(例如，冠狀病毒顆粒、丙型肝炎病毒顆粒、流感病毒顆粒、和西尼羅河病毒顆粒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒顆粒)的產(chǎn)生和/或釋放，或是增強(qiáng)或改進(jìn)另一種療法(例如預(yù)防劑或治療劑)的預(yù)防或治療效果。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，有效量的治療劑或預(yù)防劑將病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)生活周期中以下步驟中的一步或多步病毒顆粒?？吭诩?xì)胞上，病毒的遺傳信息引入細(xì)胞，病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)，新病毒顆粒的產(chǎn)生、以及病毒顆粒從細(xì)胞中釋放減少了至少5％、優(yōu)選至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在另一具體實(shí)施方案中，有效量的治療劑或預(yù)防劑使病毒的復(fù)制、增殖、或傳播減少了至少5％、優(yōu)選至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。下文描述了甘草皂苷有效量的非限制性實(shí)例。
老年人在用于本文時(shí)，術(shù)語“老年人”指65歲或65歲以上的人，優(yōu)選70歲或更老的人。
孩子在用于本文時(shí)，術(shù)語“孩子”指年齡在24個(gè)月至18歲之間的人。
嬰兒在用于本文時(shí)，術(shù)語“嬰兒”指小于24個(gè)月的人，優(yōu)選小于16個(gè)月、小于6個(gè)月、小于3個(gè)月、小于2個(gè)月、或小于1個(gè)月。
核酸序列的同一性為了測(cè)定兩個(gè)核酸序列的同一性百分率，將這些序列進(jìn)行比對(duì)以達(dá)到最理想的比較效果(例如，可以在第一種氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以便與第二種氨基酸序列或核酸序列進(jìn)行最理想的序列比對(duì))。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)序列中的某個(gè)位點(diǎn)被與第二個(gè)序列中相應(yīng)位置處核苷酸相同的核苷酸所占據(jù)時(shí)，則認(rèn)為這兩個(gè)分子在該位置是同樣的。兩個(gè)序列之間的同一性百分率是這兩個(gè)序列之間共有的相同位點(diǎn)數(shù)目的函數(shù)(即％同一性＝相同重疊位點(diǎn)數(shù)目/位點(diǎn)總數(shù)×100％)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的長(zhǎng)度是相同的。
兩個(gè)序列之間同一性百分率的測(cè)定也可利用數(shù)學(xué)運(yùn)算法則完成。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)運(yùn)算法則的優(yōu)選非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul運(yùn)算法則，1990年，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.872264-2268，Karlin和Altschul對(duì)其進(jìn)行了修改，1993年，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.905873-5877。將所述運(yùn)算法則摻入Altschul等，1990年，J.Mol.Biol.215403的NBLAST和XBLAST程序中?？梢杂肗BLAST核苷酸程序參數(shù)設(shè)置來進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，例如得分＝100，詞長(zhǎng)＝12，以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。為了獲得有缺口的比對(duì)以進(jìn)行比較，可以采用Altschul等，1997年，NucleicAcids Res.253389-3402中描述的帶缺口BLAST。或者，可以采用PSI-BLAST進(jìn)行重復(fù)搜尋以探測(cè)分子間較遠(yuǎn)的相互關(guān)系。在采用BLAST、帶缺口BLAST、和PSI-Blast程序時(shí)，可以采用各個(gè)程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)(參閱例如NCBI網(wǎng)址)。用于序列比較的數(shù)學(xué)運(yùn)算法則的另一個(gè)優(yōu)選非限制性實(shí)例是Myers和Miller的運(yùn)算法則，1988年，CABIOS 411-17。該運(yùn)算法摻入了ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG序列比對(duì)軟件包的一部分。在采用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120加權(quán)殘基表、缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償12、和缺口補(bǔ)償4。
與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)免疫特異結(jié)合在用于本文時(shí)，術(shù)語“與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)免疫特異結(jié)合”和類似術(shù)語指與病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)特異結(jié)合且與其它多肽不特異結(jié)合的肽、多肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白、和抗體或其片段。根據(jù)例如免疫測(cè)定法、BIAcore、或本領(lǐng)域知道的其它測(cè)定法的測(cè)定，與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)免疫特異結(jié)合的肽、多肽、蛋白質(zhì)、或抗體可能以低親和力與其它肽、多肽、或蛋白質(zhì)結(jié)合。與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)免疫特異結(jié)合的抗體或片段可能與相關(guān)抗原有交叉反應(yīng)性。優(yōu)選的是，與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)免疫特異結(jié)合的抗體或片段不與其它抗原發(fā)生交叉反應(yīng)?？梢酝ㄟ^例如免疫測(cè)定法、BIAcore、或本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它技術(shù)來鑒定與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)免疫特異結(jié)合的抗體或片段。若根據(jù)使用諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)的測(cè)定，在抗體或其片段以高于任何反應(yīng)性抗原的親和力與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)結(jié)合，則它與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原)特異結(jié)合。關(guān)于抗體特異性的討論參閱例如Paul編，1989年，《基礎(chǔ)免疫學(xué)》Fundamental Immunology，第2版，Raven出版社，紐約，第332-336頁。
聯(lián)合在用于本文時(shí)，術(shù)語“聯(lián)合”指使用超過一種療法(例如超過一種預(yù)防劑和/或治療劑)。術(shù)語“聯(lián)合”的使用并不約束對(duì)攜帶病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)的受試者施加各種療法(例如預(yù)防性和/或治療性試劑)的順序?？梢栽趯?duì)攜帶病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)的受試者施用第二種療法(例如第二種預(yù)防性或治療性試劑)之前(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、同時(shí)、或之后(例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)施用第一種療法。
感染在用于本文時(shí)，術(shù)語“感染”包括細(xì)胞或身體組織中病毒的入侵和/或繁殖，以及由病毒入侵和繁殖導(dǎo)致的病理狀態(tài)。病毒生活周期中的入侵和繁殖步驟包括但不限于下列步驟病毒顆粒停靠在細(xì)胞上，病毒的遺傳信息進(jìn)入細(xì)胞，病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)，新病毒顆粒的產(chǎn)生，以及由細(xì)胞釋放病毒顆粒。
處理在用于本文時(shí)，術(shù)語“處理”指受試者由某種療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)獲得的有益效果，但它不導(dǎo)致病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的治愈。在某些實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用一種或多種療法(例如一種或多種預(yù)防性或治療性試劑)以“處理”疾病，從而預(yù)防病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的發(fā)展或惡化。
非響應(yīng)性的在用于本文時(shí)，術(shù)語“非響應(yīng)性的”和“難治的”描述用目前可用的療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)治療患者的病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)在臨床上不足以減輕與感染有關(guān)的一種或多種癥狀。通常，這些患者患有嚴(yán)重的、持久活性感染，而且需要額外療法來改善與感染有關(guān)的癥狀。
預(yù)防在用于本文時(shí)，術(shù)語“預(yù)防”指通過施用療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)或施用聯(lián)合療法(例如預(yù)防性或治療性試劑的組合)實(shí)現(xiàn)的對(duì)受試者中病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的一種或多種癥狀復(fù)發(fā)、發(fā)作或發(fā)展的預(yù)防。
預(yù)防劑在用于本文時(shí)，術(shù)語“預(yù)防劑”指可用于預(yù)防病毒感染的任何試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“預(yù)防劑”指甘草皂苷或其衍生物。在另一些實(shí)施方案中，術(shù)語“預(yù)防劑”不指甘草皂苷或其衍生物。
預(yù)防有效量在用于本文時(shí)，術(shù)語“預(yù)防有效量”指足以導(dǎo)致對(duì)病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)發(fā)展、復(fù)發(fā)、或發(fā)作或其一種或多種癥狀的預(yù)防或者導(dǎo)致另一種療法(例如預(yù)防劑)的預(yù)防效果增強(qiáng)或改進(jìn)的療法(例如預(yù)防劑，諸如甘草皂苷或其衍生物)數(shù)量。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，預(yù)防劑的預(yù)防有效量將病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)生活周期的一個(gè)或多個(gè)下列步驟病毒顆粒?？吭诩?xì)胞上，病毒的遺傳信息進(jìn)入細(xì)胞，病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)，新病毒顆粒的產(chǎn)生，以及由細(xì)胞釋放病毒顆粒，減少了至少5％、優(yōu)選至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，預(yù)防劑的預(yù)防有效量將病毒的復(fù)制、繁殖、或傳播減少了至少5％、優(yōu)選至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。下文描述了甘草皂苷預(yù)防有效量的非限制性實(shí)例。
純化的在用于本文時(shí)，術(shù)語“純化的”指預(yù)防性或治療性試劑(例如甘草皂苷或其衍生物)基本上不含不同的預(yù)防性或治療性試劑。優(yōu)選的是，預(yù)防性或治療性試劑至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％不含第二種、不同的預(yù)防性或治療性試劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，甘草皂苷或其衍生物是純化的。
預(yù)防方案在用于本文時(shí)，“預(yù)防方案”指施用一種或多種預(yù)防劑的劑量和時(shí)間的攝生法。
方案在用于本文時(shí)，“方案”包括劑量日程和劑量攝生法。此處的方案是使用方法，而且包括預(yù)防性和治療性方案。
呼吸道在用于本文時(shí)，術(shù)語“呼吸道”指通向肺泡的所有器官和身體開口區(qū)域(例如鼻、口、眼(包括淚管)、和耳)。
副作用在用于本文時(shí)，術(shù)語“副作用”涵蓋預(yù)防性或治療性試劑的不希望的和不利的作用。不利的作用總是不希望的，而不希望的作用并非必定是不利的。來自預(yù)防性或治療性試劑的不利作用可能是有害的、或不舒服的、或危險(xiǎn)的。
受試者在用于本文時(shí)，術(shù)語“受試者”和“患者”可互換使用。在用于本文時(shí)，術(shù)語“受試者”指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括非靈長(zhǎng)類(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠、和小鼠)和靈長(zhǎng)類(例如猴，諸如獼猴、黑猩猩、和人類)，更優(yōu)選人類。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是患有SARS相關(guān)冠狀病毒感染的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是患有SARS相關(guān)冠狀病毒感染的家畜(例如馬、豬、或牛)或?qū)櫸?例如狗或貓)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生SARS相關(guān)冠狀病毒感染的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是人類嬰幼兒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是人類兒童或成年人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是公共機(jī)構(gòu)或教養(yǎng)院諸如但不限于療養(yǎng)院中的人。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，受試者對(duì)目前用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的療法是難治的或非響應(yīng)性的。
協(xié)同的在用于本文時(shí)，術(shù)語“協(xié)同的”指甘草皂苷或其衍生物與另一種療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)的聯(lián)合，它比任何兩種或多種單一療法(例如一種或多種預(yù)防性或治療性試劑)的加和效果更加有效。聯(lián)合療法(例如預(yù)防性或治療性試劑聯(lián)合)的協(xié)同作用允許對(duì)患有病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的受試者使用較低劑量的一種或多種療法(例如一種或多種預(yù)防性或治療性試劑)和/或較低頻率的施用所述療法。采用較低劑量療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)和/或較低頻率施用所述療法的能力降低了與對(duì)受試者施用所述療法有關(guān)的毒性而不降低所述療法對(duì)預(yù)防或治療病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的功效。另外，協(xié)同作用可以導(dǎo)致療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)在預(yù)防或治療病毒感染(例如，冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)中的功效得以改進(jìn)。最后，聯(lián)合療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)的協(xié)同作用可以避免或減少與使用單一療法有關(guān)的不利或不希望的副作用。
治療劑在用于本文時(shí)，術(shù)語“治療劑”和“治療性試劑”指可以用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染的一種或多種癥狀的任何試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“治療劑”指甘草皂苷或其衍生物。在其它實(shí)施方案中，術(shù)語“治療劑”不指甘草皂苷或其衍生物。
治療有效量在用于本文時(shí)，術(shù)語“治療有效量”指該數(shù)量的治療劑足以降低病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的嚴(yán)重程度、縮短病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的持續(xù)時(shí)間、改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染的一種或多種癥狀、預(yù)防病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的發(fā)展、引起病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的衰退、或者增強(qiáng)或改進(jìn)另一種治療劑的治療效果。對(duì)于病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的治療，治療有效量指治療劑的數(shù)量足以減少或抑制病毒的復(fù)制、抑制或減少病毒感染細(xì)胞、抑制或減少病毒顆粒的產(chǎn)生、抑制或減少病毒顆粒的釋放、抑制或減少病毒傳播至其它組織或受試者、或者改善與感染有關(guān)的一種或多種癥狀。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，治療有效量的治療劑將病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)生活周期中以下步驟中的一步或多步病毒顆粒停靠在細(xì)胞上，病毒的遺傳信息引入細(xì)胞，病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)，新病毒顆粒的產(chǎn)生、以及病毒顆粒從細(xì)胞中釋放減少了至少5％、優(yōu)選至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，治療有效量的治療劑使病毒的復(fù)制、增殖、或傳播減少了至少5％、優(yōu)選至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。下文描述了甘草皂苷治療有效量的非限制性實(shí)例。
治療方案在用于本文時(shí)，術(shù)語“治療方案”指施用一種或多種治療劑的劑量和時(shí)間的攝生法。
療法在用于本文時(shí)，術(shù)語“療法”指可用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的任何方案、方法、和/或試劑。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“療法”指熟練醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的可用于治療、處理、預(yù)防、或改善呼吸狀況或其一種或多種癥狀的抗病毒療法、抗生素療法、生物學(xué)療法、支持療法、和/或其它療法。
治療在用于本文時(shí)，術(shù)語“治療”指由于施用一種或多種療法(包括但不限于施用一種或多種預(yù)防性或治療性試劑)引起的病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)進(jìn)行程度、嚴(yán)重程度、和/或持續(xù)時(shí)間的降低或改善或其一種或多種癥狀的改善。在具體實(shí)施方案中，該術(shù)語指減少或抑制病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)復(fù)制、抑制或減少病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)傳播至其它組織或受試者、抑制或減少病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)感染細(xì)胞、或者改善與病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)有關(guān)的一種或多種癥狀。
在用于本文時(shí)，“5至7元雜環(huán)”指5至7個(gè)成員的碳原子和1至3個(gè)選自氧、氮、和硫的雜原子的芳族或非芳族環(huán)。5至7元雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于四氫呋喃基、二氧戊環(huán)基、吡咯烷基、嗎啉基、哌啶基、哌嗪基、四氫吡喃基、嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮、和2，3-二氫-2-硫氧嘧啶-4(1H)-酮。
在用于本文時(shí)，術(shù)語“氨基酸”指任何天然存在氨基酸和非天然存在氨基酸，諸如D-氨基酸。氨基酸可以是用保護(hù)基團(tuán)取代的。適于氨基的保護(hù)基團(tuán)包括乙?；?、叔丁氧基-C(O)-、芐氧基-C(O)-、諸如此類。適于羥基的保護(hù)基團(tuán)包括芐基等。適于羧基模塊的保護(hù)基團(tuán)包括芐基、叔丁基、諸如此類。其它合適的保護(hù)基團(tuán)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是眾所周知的，而且包括那些在T.W.Greene，《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》Protecting Groups in Organic Synthesis，JohnWiley & Sons公司，1981年中找到的。
在用于本文時(shí)，術(shù)語“肽”指兩個(gè)至六個(gè)氨基酸的序列。在某些實(shí)施方案中，肽指長(zhǎng)度為兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、或六個(gè)氨基酸。
在說本文所述基團(tuán)是“取代或未取代的”時(shí)，若取代，則它們可以用不會(huì)對(duì)化合物的期望活性產(chǎn)生不利影響的任何期望取代基取代。優(yōu)選取代基的實(shí)例是那些在本文所公開的例示性化合物和實(shí)施方案中找到的取代基，以及鹵素(氯、碘、溴、或氟)；C1-6烷基；C2-6烯基；C2-6炔基；羥基；C1-6烷氧基；氨基；硝基；巰基；硫醚；亞胺；氰；氨基(amido)；膦酸基；磷化氫；羧基；硫代羰基；磺?；换酋０?；酮；醛；酯；氧(＝O)；鹵代烷基(例如，三氟甲基)；碳環(huán)環(huán)烷基，可以是單環(huán)或者稠合的或非稠合的多環(huán)(例如，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、或環(huán)己基)、或雜環(huán)烷基，可以是單環(huán)或者稠合的或非稠合的多環(huán)(例如，吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、或噻嗪基)；碳環(huán)或雜環(huán)、單環(huán)或者融合或非融合的多環(huán)芳基(例如，苯基、萘基、吡咯基、吲哚基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、吡啶基、喹啉基、異喹啉基、吖啶基、吡嗪基、噠嗪基、嘧啶基、苯甲酰亞胺基、苯并硫苯基、或苯并呋喃基)；芐氧基；(伯、仲、或叔)氨基；-N(CH3)2；O-低級(jí)烷基；O-芳基、芳基；芳基-低級(jí)烷基；CO2CH3；-OCH2CH3；甲氧基；CONH2；OCH2CONH2；NH2；SO2NH2；OCHF2；CF3；OCF3；而且這些模塊也可以任選用稠合環(huán)結(jié)構(gòu)或橋例如-OCH2O-取代。
這些取代基可以任選用選自這些基團(tuán)的取代基進(jìn)一步取代。
應(yīng)當(dāng)注意，若所示結(jié)構(gòu)與給該結(jié)構(gòu)指定的名稱之間存在矛盾，則以所示結(jié)構(gòu)為準(zhǔn)。另外，如果結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)的一部分的立體化學(xué)未以例如粗線或虛線指示，那么解釋為結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)的一部分涵蓋它的所有立體異構(gòu)體。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1。甘草皂苷在Vero細(xì)胞中對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒復(fù)制的影響。細(xì)胞在感染后72小時(shí)用60份甲醇和40份丙酮固定。通過過氧化物酶染色檢測(cè)來自SARS患者的血清中的病毒。(A)偽受感染細(xì)胞；(B)未處理的受感染細(xì)胞；(C)用4,000mg/L甘草皂苷處理的受感染細(xì)胞；(D)用1,000mg/L甘草皂苷處理的受感染細(xì)胞。
圖2。甘草皂苷和利巴韋林在Vero細(xì)胞中對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒復(fù)制的影響。(A)未處理的受感染細(xì)胞；(B)用50mg/L利巴韋林處理的受感染細(xì)胞；(C)用100mg/L甘草皂苷處理的受感染細(xì)胞；和(D)用50mg/L利巴韋林和100mg/L甘草皂苷處理的受感染細(xì)胞。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了以甘草皂苷為基礎(chǔ)的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀。具體而言，本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的預(yù)防和治療方案，包括對(duì)有所需要的受試者施用預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物，以及任選的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑。
本發(fā)明提供了用于抑制或減少病毒感染(例如如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸甘草皂苷或其衍生物。本發(fā)明還提供了用于抑制或減少病毒(例如冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒)復(fù)制的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸甘草皂苷或其衍生物。本發(fā)明還提供了抑制或減少病毒顆粒(例如冠狀病毒顆粒、丙型肝炎病毒顆粒、流感病毒顆粒、和西尼羅河病毒顆粒，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒顆粒)產(chǎn)生和/或釋放的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸甘草皂苷或其衍生物。
本發(fā)明提供了包含甘草皂苷或其衍生物的藥用組合物和商品，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀。本發(fā)明還提供了包含甘草皂苷或其衍生物以及一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑的藥用組合物和商品，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀。
5.1.甘草皂苷及其衍生物本發(fā)明涉及使用具有下文所示結(jié)構(gòu)的甘草皂苷(“化合物1”)。
化合物1 甘草皂苷的衍生物包括這樣的任何化合物或其藥用可接受鹽、游離堿、溶劑化物、水化物、立體異構(gòu)體、包合物、或前藥，其中甘草皂苷的一個(gè)或多個(gè)羧酸基或羥基得到修飾(即進(jìn)行過合成轉(zhuǎn)化)。在一個(gè)實(shí)施方案中，甘草皂苷的衍生物是這樣的化合物或其藥用可接受鹽、游離堿、溶劑化物、水化物、立體異構(gòu)體、包合物、或前藥，其中甘草皂苷的一個(gè)、兩個(gè)、或三個(gè)羧酸基得到修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，甘草皂苷的衍生物是通式I的化合物，包括它的其它實(shí)施方案或其藥用可接受鹽、游離堿、溶劑化物、水化物、立體異構(gòu)體、包合物、或前藥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，甘草皂苷的衍生物包括化合物2-8或其藥用可接受鹽、游離堿、溶劑化物、水化物、立體異構(gòu)體、包合物、或前藥。
在某些實(shí)施方案中，甘草皂苷或其衍生物是純化的以用于本發(fā)明的方法。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，甘草皂苷的衍生物是18β-甘草亭酸。不受理論限制，18β-甘草亭酸是由腸中葡萄糖苷酸酶催化化合物I水解的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，甘草皂苷的衍生物是硫酸甘草皂苷。
甘草皂苷或其衍生物可以是其藥用可接受鹽、游離堿、溶劑化物、水化物、立體異構(gòu)體、包合物、或前藥的形式。
在某些實(shí)施方案中，甘草皂苷的衍生物是甘草皂苷的藥用可接受鹽。甘草皂苷的藥用可接受鹽可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。例如，將酸和甘草皂苷溶于兩種反應(yīng)物(即甘草皂苷的自由基和各種酸)在其中充分可溶的溶劑系統(tǒng)。在一種方法中，為了實(shí)現(xiàn)結(jié)晶或沉淀，使用產(chǎn)生的鹽在其中只是略微可溶或完全不溶的溶劑或溶劑混合物。或者，可以使用期望的鹽在其中非?？扇艿娜軇?，然后向溶液中添加抗溶劑(或產(chǎn)生的鹽在其中溶解欠佳的溶劑)。鹽形成或結(jié)晶的其它變量包括濃縮鹽溶液(例如如果需要通過在減壓下加熱，或者通過緩慢蒸發(fā)溶劑，例如在室溫)，或播種以添加種子晶體，或建立形成水合物所需要的水活度。
在用于本文時(shí)，術(shù)語“藥用可接受鹽”指由藥用可接受無毒酸或堿制備的鹽，包括無機(jī)酸和堿以及有機(jī)酸和堿。適于本發(fā)明化合物的的藥用可接受堿加成鹽包括但不限于由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、和鋅制成的金屬鹽或由賴氨酸、N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)、和葡魯卡因制成的有機(jī)鹽。合適的無毒酸包括但不限于無機(jī)和有機(jī)酸，諸如乙酸、褐藻酸、鄰氨基苯甲酸、苯磺酸、樟腦磺酸、乙烯磺酸、反丁烯二酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、氫溴酸、氫氯酸、羥乙磺酸、乳酸、順丁烯二酸、羥基丁二酸、苯基乙醇酸、甲基磺酸、粘酸、硝酸、pamoic、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、硫酸、酒石酸、和對(duì)甲苯磺酸。特效的無毒酸包括氫氯酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、甲基磺酸、和丁酸。特效鹽的其它實(shí)例包括氫氯化物和mesylate鹽。其它鹽在本領(lǐng)域是眾所周知的，參閱例如《雷明頓氏制藥科學(xué)》Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Publishing，伊斯頓，賓夕法尼亞，1990年；或《雷明頓制藥科學(xué)和實(shí)踐》RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，第19版，Mack Publishing，伊斯頓，賓夕法尼亞，1995年。
甘草皂苷的藥用可接受鹽還包括但不限于甘草皂苷的單或二銨鹽、甘草皂苷的單或二鈉鹽、甘草皂苷的單或二鉀鹽。
在某些實(shí)施方案中，甘草皂苷的衍生物是甘草皂苷或甘草皂苷衍生物的外消旋物和/或?qū)τ丑w。
在某些實(shí)施方案中，可以以多形體的形式使用甘草皂苷或其衍生物。在用于本文時(shí)，除非另有說明，術(shù)語“多晶型物”意味著甘草皂苷或其衍生物的特定晶體排列。可以通過使用不同的工作條件和/或溶劑來獲得晶型物。具體而言，可以通過甘草皂苷或其衍生物在特定溶劑中的再結(jié)晶來制備多晶型物。
在用于本文時(shí)，除非另有說明，術(shù)語“前藥”指在生物學(xué)條件下(在體外或在體內(nèi))能夠進(jìn)行水解、氧化、或其它反應(yīng)以提供活性化合物，具體說就是甘草皂苷或其衍生物的甘草皂苷衍生物。前藥的實(shí)例包括但不限于包含生物可水解模塊的甘草皂苷的衍生物和代謝物或其衍生物，諸如生物可水解酰胺、生物可水解酯、生物可水解氨基甲酸酯、生物可水解碳酸鹽、生物可水解酰脲、和生物可水解磷酸鹽類似物。優(yōu)選的是，甘草皂苷或其衍生物的前藥基團(tuán)是羧酸的低級(jí)烷基酯。可以方便的通過分子上存在的任何羧酸模塊的酯化來形成羧酸酯。通?？梢允褂帽娝苤姆椒ㄖ苽淝八?，諸如《Burger氏醫(yī)學(xué)化學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)》Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第6版(Donald J.Abraham編，2001年，Wiley)和《前藥的設(shè)計(jì)和應(yīng)用》Design and Application of Prodrugs(H.Bundgaard編，1985年，Harwood Academic Publishers GmfH)中所述。
在某些實(shí)施方案中，甘草皂苷或其衍生物是光學(xué)純的。在用于本文時(shí)，除非另有說明，術(shù)語“光學(xué)純的”或“立體異構(gòu)體純的”意味著化合物的一種立體異構(gòu)體基本上不含化合物的其它立體異構(gòu)體。例如，立體異構(gòu)體純的具有一個(gè)手性中心的化合物將基本上不含化合物的相對(duì)對(duì)映體。立體異構(gòu)體純的具有兩個(gè)手性中心的化合物將基本上不含化合物的其它非對(duì)映體。典型的立體異構(gòu)體純的化合物含有超過大約80％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的一種立體異構(gòu)體和低于大約20％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的其它立體異構(gòu)體，更優(yōu)選超過大約90％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的一種立體異構(gòu)體和低于大約10％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的其它立體異構(gòu)體，甚至更優(yōu)選超過大約95％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的一種立體異構(gòu)體和低于大約5％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的其它立體異構(gòu)體，且最優(yōu)選超過大約97％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的一種立體異構(gòu)體和低于大約3％(以質(zhì)量計(jì))的化合物的其它立體異構(gòu)體。
在某些實(shí)施方案中，為了獲得甘草皂苷的衍生物，可以將化合物I的至少一個(gè)-COOH基團(tuán)修飾成酯，例如但不限于甲酯、乙酯、正丙酯、異丙酯。
在某些實(shí)施方案中，為了獲得甘草皂苷的衍生物，化合物I三萜部分的至少一個(gè)六元環(huán)含有一個(gè)或多個(gè)雜原子。雜原子可以是但不限于N、O、或P。在某些實(shí)施方案中，A環(huán)、B環(huán)、C環(huán)、D環(huán)、或E環(huán)是雜環(huán)。在某些實(shí)施方案中，三萜部分中至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、或所有五個(gè)六元環(huán)是雜環(huán)。
在某些實(shí)施方案中，為了獲得甘草皂苷的衍生物，將額外雙鍵引入三萜部分的環(huán)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，三萜部分的環(huán)系統(tǒng)是芳香族的。
在某些實(shí)施方案中，為了獲得甘草皂苷的衍生物，可以將化合物I的一個(gè)或多個(gè)-OH基修飾成?；摹?br> 在某些實(shí)施方案中，為了獲得甘草皂苷的衍生物，化合物I中的至少一個(gè)氧用硫替換。
在某些實(shí)施方案中，甘草皂苷的藥用可接受鹽是甘草皂苷的單銨鹽 在某些實(shí)施方案中，甘草皂苷衍生物是通式I的化合物
其中R1、R2、和R3是獨(dú)立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、氨基酸、肽、或-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。在通式I的另一個(gè)實(shí)施方案中，R1、R2、和R3是獨(dú)立的-OH、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-甘氨酸-亮氨酸、或-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是-N(H)R4，其中每次出現(xiàn)的R4是獨(dú)立的5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R4不是噻唑、尿嘧啶或
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是-N(H)R4，其中每次出現(xiàn)的R4是獨(dú)立的5元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R4不是噻唑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是-N(H)R4，其中每次出現(xiàn)的R4是獨(dú)立的6元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R4不是尿嘧啶或 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1和R2中的一個(gè)是 且R3及R1和R2中的另一個(gè)是獨(dú)立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、氨基酸、肽、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，R3及R1和R2中的另一個(gè)是獨(dú)立的-OH、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-甘氨酸-亮氨酸、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3中的一個(gè)是氨基酸或肽，而R1、R2、和R3中的另兩個(gè)是獨(dú)立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，R1、R2、和R3中的另兩個(gè)是獨(dú)立的-OH、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3中的一個(gè)是-甘氨酸-亮氨酸，而R1、R2、和R3中的另兩個(gè)是獨(dú)立的-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，R1、R2、和R3中的另兩個(gè)是獨(dú)立的-OH、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3中的兩個(gè)是-甘氨酸-亮氨酸，而R1、R2、和R3中的另一個(gè)是-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，R1、R2、和R3中的另一個(gè)是-OH、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式I的化合物，其中R1、R2、和R3是獨(dú)立的5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R1、R2、和R3不全是脯氨酸。
在某些更加具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有如下結(jié)構(gòu)的甘草皂苷衍生物或其藥用可接受鹽化合物2R1、R2、和R3各自是 化合物3R3是-OH；且R1和R2各自是-甘氨酸-亮氨酸。
化合物4R3是 且R1和R2各自是OH；化合物5R3是OH，且R1和R2各自是 化合物6R1、R2、和R3各自是
化合物7
化合物8 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的甘草皂苷衍生物的EC50低于3,000mg/L、低于1,500mg/L、低于500mg/L、低于250mg/L、低于100mg/L、低于50mg/L、低于10mg/L、或低于1mg/L。EC50可以如下文6.1節(jié)所述測(cè)定。
在某些實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明方法的甘草皂苷衍生物的EC50低于3,000mg/L、低于1,500mg/L、低于500mg/L、低于250mg/L、低于100mg/L、低于50mg/L、低于10mg/L、或低于1mg/L。EC50可以如下文6.1節(jié)所述測(cè)定。
5.1.1甘草皂苷衍生物的合成甘草皂苷衍生物可以通過標(biāo)準(zhǔn)的、眾所周知的合成方法學(xué)獲得，參閱例如March，J.，《高級(jí)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，機(jī)制，和結(jié)構(gòu)》AdvancedOrganic ChemistryReactions，Mechanisms，and Structure，第4版，1992年?？捎糜谥苽浔景l(fā)明化合物及其中間物的起始材料可以通過商業(yè)途徑獲得，或者可以使用已知的合成方法和試劑由商品化材料制備得到。
用于合成甘草皂苷衍生物的例示性方法描述于Baltina，2003年，Current Medicinal Chemistry 10(2)155-171，將其完整收入本文作為參考。
5.2.可用于與甘草皂苷聯(lián)合的試劑可用于與甘草皂苷或其衍生物聯(lián)合以預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的治療性或預(yù)防性試劑包括但不限于小分子、合成藥物、肽(包括環(huán)肽)、多肽、蛋白質(zhì)、磺酸(例如DNA和RNA核苷酸，包括但不限于反義核苷酸序列、三鏈螺旋、RNAi、和編碼生物學(xué)活性蛋白質(zhì)、多肽或肽的核苷酸序列)、抗體、合成或天然的無機(jī)分子、模仿試劑、和合成或天然的有機(jī)分子。這些試劑的具體實(shí)例包括但不限于免疫調(diào)控劑(例如干擾素)、抗炎劑(例如腎上腺類皮質(zhì)激素、皮質(zhì)類固醇(例如氯地米松、布地奈德、氟尼縮松、氟替卡松、曲安西龍、甲潑尼龍、波尼松龍、波尼松、氫化可的松)、糖皮質(zhì)激素類、類固醇、和非類固醇抗炎藥物(例如阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸、和COX-2抑制劑)、鎮(zhèn)痛劑、白三烯拮抗劑(例如孟魯司特、甲基黃嘌呤、扎魯司特、和奇留通)、β2-激動(dòng)劑(例如沙丁胺醇、biterol、非諾特羅、isoetharie、metaproterenol、吡布特羅、沙丁胺醇、特布他林、福莫特羅、沙美特羅、和沙丁胺醇特布他林)、抗膽堿能試劑(例如異丙托溴胺和氧托溴銨)、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、氨苯砜、抗組胺劑、抗瘧劑(例如羥氯喹)、抗病毒劑(例如核苷類似物(例如奇多夫定、阿昔洛韋、甘昔洛韋(gangcyclovir)、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、和利巴韋林)、膦甲酸、金剛烷胺、金剛乙胺、沙奎那韋、印地那韋、利托那韋、和AZT)、以及抗生素(例如更生霉素(以前的放線菌素)、博來霉素、紅霉素、青霉素、光輝霉素、和氨曲霉素(AMC))。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，一種或多種下列試劑或是下列試劑組合可用于與甘草皂苷或其衍生物聯(lián)合以預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染、和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其癥狀金剛烷胺、利巴韋林、金剛乙胺、阿昔洛韋、泛昔洛韋、膦甲酸、更昔洛韋、三氟尿苷、阿糖腺苷、地達(dá)諾新、司他夫定、扎西他賓、奇多夫定、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β、和/或干擾素-γ)、和抗生素、免疫調(diào)控劑、和與病毒抗原(例如冠狀病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、流感病毒抗原、和西尼羅河病毒抗原，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒抗原；諸如例如非結(jié)構(gòu)蛋白、血凝素-酯酶糖蛋白、刺突糖蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白、和核蛋白)免疫特異結(jié)合的抗體或其片段(例如人源的、嵌和的、人源化的、camelized抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、sFv、Fab片段、和F(ab′)片段)。
已知有用或曾經(jīng)使用或目前用于預(yù)防、處理、治療、或改善病毒感染或呼吸狀況特別是病毒呼吸狀況或其一種或多種癥狀的任何療法可以依照本文所述發(fā)明用于與甘草皂苷或其衍生物聯(lián)合。關(guān)于曾經(jīng)或目前用于預(yù)防、治療、處理、或改善呼吸狀況或其一種或多種癥狀的療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)的信息參閱例如Gilman等，《Goodman和Gilman治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》Goodman and Gilman′sThePharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill，紐約，2001年；《診斷和治療的Merck指南》The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，Berkow，M.D.等編，第17版，Merck Sharp& Dohme Research Laboratories，羅韋，新澤西，1999年；《Cecil醫(yī)學(xué)課本》Cecil Textbook of Medicine，第20版，Bennett和Plum編，W.B.Saunders，費(fèi)城，1996年。
為了測(cè)試甘草皂苷或其衍生物與第二種化合物之間針對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、或西尼羅河病毒的協(xié)同作用，可以使用針對(duì)各種病毒的任何細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和/或動(dòng)物模型系統(tǒng)(見5.6節(jié)和6.1節(jié))。對(duì)照包括未處理的細(xì)胞/動(dòng)物，而且可以包括用單個(gè)化合物處理的細(xì)胞/動(dòng)物。
5.3.目標(biāo)感染本發(fā)明提供了基于甘草皂苷的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染，經(jīng)鑒定該病毒是嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的病原體。具體而言，本發(fā)明還提供了基于甘草皂苷的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，基于甘草皂苷的療法用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染，所述病毒具有表1中病毒株的核酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，基于甘草皂苷的療法用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒的感染，所述病毒在核酸水平與表1中參考的SARS相關(guān)冠狀病毒一個(gè)隔離群的核酸序列50-65％、優(yōu)選65-80％、更優(yōu)選75-85％、且最優(yōu)選85-99％相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基于甘草皂苷的療法用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒的感染，所述病毒在核酸水平與Drosten等，2003年，N Engl J Med 3481967-1976中所述牛冠狀病毒50-65％、優(yōu)選65-80％相同。
在某些實(shí)施方案中，基于甘草皂苷的療法用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染，其基因組或其片段在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.3481967-1976中描述的牛冠狀病毒的基因組或其片段發(fā)生雜交。作為例示而非限制，使用這些高嚴(yán)謹(jǐn)條件的流程如下含DNA濾膜的雜交在由6X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲科爾、0.02％BSA、和500pg/ml變性鮭魚精DNA組成的緩沖液中于65℃進(jìn)行8小時(shí)至過夜。將濾膜在含有100μg/ml變性鮭魚精DNA和5-20×106cpm32P標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合液中于65℃雜交48小時(shí)。濾膜的清洗在含有2X SSC、0.01％PVP、0.01％菲科爾、和0.01％BSA的溶液中于37℃進(jìn)行1小時(shí)。隨后在放射自顯影前在0.1X SSC中于50℃清洗45分鐘?？梢允褂玫钠渌邍?yán)謹(jǐn)條件在本領(lǐng)域是眾所周知的。
在某些實(shí)施方案中，基于甘草皂苷的療法用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染，其基因組或其片段在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.3481967-1976中描述的牛冠狀病毒的基因組或其片段發(fā)生雜交。作為例示而非限制，使用這些中等嚴(yán)謹(jǐn)條件的流程如下將含有DNA的濾膜在含有6X SSC、5XDenhart氏溶液、0.5％SDS、和100μg/ml變性鮭魚精DNA的溶液中于55℃預(yù)處理6小時(shí)。在相同溶液中進(jìn)行雜交，并且使用5-20×106cpm32P標(biāo)記探針。將濾膜在雜交混合液中于55℃保溫18-20小時(shí)，然后在含有1X SSC和0.1％SDS的溶液中于60℃清洗兩次各30分鐘。將濾膜吸干，并曝光即放射自顯影?？梢允褂玫钠渌械葒?yán)謹(jǐn)條件在本領(lǐng)域是眾所周知的。濾膜的清洗在含有2X SSC、0.1％SDS的溶液中于37℃進(jìn)行1小時(shí)。
在某些實(shí)施方案中，基于甘草皂苷的療法用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染，其基因組或其片段在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與Drosten等，2003年，N.Engl.J.Med.3481967-1976中描述的牛冠狀病毒的基因組或其片段發(fā)生雜交。作為例示而非限制，使用這些低嚴(yán)謹(jǐn)條件的流程如下(還可參閱Shilo和Weinberg，1981年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786789-6792)將含有DNA的濾膜在含有35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％菲科爾、1％BSA、和500μg/ml變性鮭魚精DNA的溶液中于40℃預(yù)處理6小時(shí)。在如下修改的相同溶液中進(jìn)行雜交0.02％PVP、0.02％菲科爾、0.2％BSA、100μg/ml鮭魚精DNA、10％(wt/vol)硫酸右旋糖苷，并且使用5-20×106cpm32P標(biāo)記探針。將濾膜在雜交混合液中于40℃保溫18-20小時(shí)，然后在含有2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mMEDTA、和0.1％SDS的溶液中于55℃清洗1.5小時(shí)。用新鮮溶液更換清洗液，并于60℃再保溫1.5小時(shí)。將濾膜吸干，并曝光即放射自顯影。如果需要，將濾膜于65-68℃清洗第三次并對(duì)膠片再次曝光?？梢允褂玫钠渌蛧?yán)謹(jǐn)條件在本領(lǐng)域是眾所周知的。
依照這些實(shí)施方案，SARS相關(guān)冠狀病毒更多引起淋巴細(xì)胞減少，而且適度提高轉(zhuǎn)氨酶水平。
表1.SARS相關(guān)冠狀病毒不同株的GenBank登錄
本發(fā)明提供了基于甘草皂苷的療法，用于保護(hù)受試者免于感染SARS相關(guān)冠狀病毒或在出現(xiàn)任何SARS癥狀前治療受到SARS相關(guān)冠狀病毒感染的受試者。本發(fā)明還提供了基于甘草皂苷的療法，用于曾經(jīng)或正在接觸受到SARS相關(guān)冠狀病毒感染的另一位受試者的受試者預(yù)防形成SARS相關(guān)冠狀病毒感染。本發(fā)明還提供了基于甘草皂苷的療法，用于暴露于SARS相關(guān)冠狀病毒的受試者預(yù)防SARS。熟練技術(shù)人員知道的任何方法都可用于檢測(cè)SARS相關(guān)冠狀病毒(見下文5.5節(jié))。
在某些實(shí)施方案中，依照本發(fā)明有待預(yù)防、治療、處理、或改善的SARS相關(guān)冠狀病毒感染在人類受試者中引起一種或多種下列癥狀或與其有關(guān)高燒(＞38℃)、干咳、呼吸短促或呼吸困難、以及指示肺炎的胸部X射線變化。依照這些實(shí)施方案，SARS相關(guān)冠狀病毒感染可能引起一種或多種下列額外癥狀或與其有關(guān)頭痛、肌肉僵硬、喪失食欲、不適、精神錯(cuò)亂、皮疹、和腹瀉。
本發(fā)明還提供了基于甘草皂苷的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染以外的病毒感染。在某些更加具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于甘草皂苷的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染，諸如但不限于DNA病毒，諸如乙型肝炎和丙型肝炎病毒；細(xì)小病毒，諸如腺伴隨病毒和細(xì)胞巨化病毒；乳多空病毒，諸如乳頭瘤病毒、多瘤病毒、和SV40；腺病毒；皰疹病毒，諸如單純皰疹病毒I型(HSV-I)、單純皰疹病毒II型(HSV-II)、和埃巴二氏病毒；痘病毒，諸如痘疹(天花)和牛痘病毒；以及RNA病毒，諸如人類免疫缺陷病毒I型(HIV-I)、人類免疫缺陷病毒II型(HIV-II)、人類T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒I型(HTLV-I)、人類T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒II型(HTLV-II)、流感病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、仙臺(tái)病毒；小核糖核酸病毒，諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒；囊膜病毒，諸如風(fēng)診病毒(德國(guó)麻疹)和Semliki森林病毒、蟲媒病毒、和甲型肝炎病毒。在某些甚至更加特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基于甘草皂苷的療法，用于預(yù)防、治療、處理、或改善冠狀病毒感染、丙型肝炎病毒感染、流感病毒感染和西尼羅河病毒感染，優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染。
5.4.治療和預(yù)防方法5.4.1 SARS相關(guān)冠狀病毒感染本發(fā)明提供了預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法，所述方法包括對(duì)有所需要的受試者施用甘草皂苷或其衍生物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法，所述方法包括對(duì)有所需要的受試者施用一個(gè)劑量的預(yù)防或有效量的甘草皂苷或其衍生物。SARS相關(guān)冠狀病毒感染可以通過熟練技術(shù)人員知道的任何方法來診斷。例示方法見下文5.5節(jié)。
本發(fā)明提供了預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法，所述方法包括對(duì)有所需要的受試者施用甘草皂苷或其衍生物以及一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防性或治療性試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法，所述方法包括對(duì)有所需要的受試者施用一個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物以及一個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷以外的預(yù)防性或治療性試劑。
本發(fā)明提供了預(yù)防SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)有風(fēng)險(xiǎn)感染SARS相關(guān)冠狀病毒的受試者施用甘草皂苷或其衍生物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)有風(fēng)險(xiǎn)感染SARS相關(guān)冠狀病毒的受試者施用一個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物。
本發(fā)明提供了預(yù)防SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)有風(fēng)險(xiǎn)感染SARS相關(guān)冠狀病毒的受試者施用甘草皂苷或其衍生物以及一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防性或治療性試劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)有風(fēng)險(xiǎn)感染SARS相關(guān)冠狀病毒的受試者施用一個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物以及一個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷以外的預(yù)防性或治療性試劑。
本發(fā)明聯(lián)合療法的成分(例如預(yù)防性或治療性試劑)可以順序或同時(shí)施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法包含甘草皂苷或其衍生物和至少一種與甘草皂苷或其衍生物具有不同作用機(jī)制的其它療法(例如至少一種其它預(yù)防性或治療性試劑)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法包含甘草皂苷或其衍生物和至少一種與甘草皂苷或其衍生物具有相同作用機(jī)制的其它療法(例如至少一種其它預(yù)防性或治療性試劑)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法通過與甘草皂苷或其衍生物一起發(fā)生作用以具有加和或協(xié)同作用而改善了甘草皂苷或其衍生物的預(yù)防或治療作用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合療法降低了與預(yù)防性或治療性試劑有關(guān)的副作用。
可以在相同藥用組合物中對(duì)受試者優(yōu)選人類受試者施用聯(lián)合療法的預(yù)防性或治療性試劑。在備選實(shí)施方案中，可以在分開的藥用組合物中對(duì)受試者順序或同時(shí)施用聯(lián)合療法的預(yù)防性或治療性試劑。可以通過相同或不同的施用路徑對(duì)受試者施用預(yù)防性或治療性試劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)受試者優(yōu)選人施用包含的甘草皂苷或其衍生物的藥用組合物以預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)受試者優(yōu)選人施用包含甘草皂苷或其衍生物及其一種或多種衍生物以及甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防性或治療性試劑的藥用組合物以預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀。
在某些實(shí)施方案中，在SARS或SARS相關(guān)冠狀病毒感染顯現(xiàn)之前或之后、或者在診斷為SARS相關(guān)冠狀病毒感染之前或之后，對(duì)受試者施用甘草皂苷或其衍生物。在具體實(shí)施方案中，例如，在受試者感染SARS相關(guān)冠狀病毒的風(fēng)險(xiǎn)增加時(shí)，諸如在受試者無免疫應(yīng)答或免疫受抑制時(shí)，或者在SARS相關(guān)冠狀病毒感染流行時(shí)，或者在受試者旅行或處于有較大風(fēng)險(xiǎn)感染SARS相關(guān)冠狀病毒的地區(qū)時(shí)，對(duì)受試者預(yù)防性施用甘草皂苷或其衍生物。在其它實(shí)施方案中，在SARS相關(guān)冠狀病毒感染的早期對(duì)受試者施用本發(fā)明的藥用組合物。在另一些實(shí)施方案中，在SARS相關(guān)冠狀病毒感染的晚期對(duì)受試者施用本發(fā)明的藥用組合物，例如用于預(yù)防進(jìn)行性SARS相關(guān)冠狀病毒感染在受影響受試者中的后果，或者預(yù)防病毒傳播至其他人。
5.4.2其它病毒感染本發(fā)明還提供了用于治療、預(yù)防、處理、或改善病毒感染的方法，包括對(duì)需要治療的患者施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了治療、處理、改善、或預(yù)防病毒感染的方法，包括對(duì)需要治療的患者聯(lián)合另一種療法(例如抗病毒劑；見5.2節(jié))施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了治療、處理、改善、或預(yù)防病毒感染的方法，包括對(duì)需要治療的患者聯(lián)合利巴韋林施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。
本發(fā)明還提供了用于治療、預(yù)防、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒以外的病毒感染的方法，諸如其它冠狀病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了治療、處理、改善、和預(yù)防丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒感染的方法，包括對(duì)需要治療的患者施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了治療、處理、改善、或預(yù)防丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒感染的方法，包括對(duì)需要治療的患者聯(lián)合利巴韋林施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。
可以使用熟練技術(shù)人員知道的任何動(dòng)物細(xì)胞模型系統(tǒng)來測(cè)試甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林)聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物針對(duì)丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒的功效。在某些更加具體的實(shí)施方案中，可以通過用不同濃度的甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林)聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物處理受感染細(xì)胞來測(cè)試甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林)聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物針對(duì)丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒的功效。在存在或缺乏甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林；見例如5.6節(jié)和6.1節(jié))聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物時(shí)，測(cè)量病毒感染的細(xì)胞病變效應(yīng)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療、預(yù)防、處理、或改善病毒感染的方法，其中病毒感染對(duì)其它處理沒有響應(yīng)。
可以使用熟練技術(shù)人員知道的任何動(dòng)物模型系統(tǒng)來測(cè)試甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林)聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物針對(duì)丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒的功效。在某些更加具體的實(shí)施方案中，可以通過用不同濃度的甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林)聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物處理受感染小鼠來測(cè)試甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林)聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物針對(duì)丙型肝炎病毒、流感病毒、和西尼羅河病毒的功效。在存在或缺乏甘草皂苷或其衍生物或者與另一種療法(如利巴韋林；見例如5.6節(jié)和6.1節(jié))聯(lián)合的甘草皂苷或其衍生物時(shí)，測(cè)量動(dòng)物中病毒的繁殖。在更加具體的實(shí)施方案中，對(duì)BALB/c小鼠鼻內(nèi)接種10(4)組織培養(yǎng)物50％感染劑量(TCID50)。兩天后，切下肺和鼻甲并保存于-70℃。將冷凍組織在細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中勻漿，并使用Vero細(xì)胞單層測(cè)定病毒滴度。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于治療、預(yù)防、改善、或處理SARS相關(guān)冠狀病毒以外的冠狀病毒感染的方法，其中這些方法包括對(duì)感染這種冠狀病毒的患者施用有效量的甘草皂苷或其衍生物。
在某些更加具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于治療、預(yù)防、改善、或處理可傳染腸胃炎病毒(TGEV)、豬呼吸道和生殖病毒、傳染性支氣管炎病毒、貓冠狀病毒(FECV)、和貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)感染。
5.4.3.目標(biāo)患者在某些實(shí)施方案中，對(duì)正在或曾經(jīng)密切接觸診斷為SARS的受試者的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。在某些實(shí)施方案中，對(duì)最近10天內(nèi)、最近15天內(nèi)、最近30天內(nèi)、最近50天內(nèi)、最近75天內(nèi)、或最近100天內(nèi)旅行經(jīng)過報(bào)告SARS病例的地區(qū)的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。在世界衛(wèi)生組織的網(wǎng)站上可以找到這些地區(qū)的更新列表。
在某些實(shí)施方案中，對(duì)具有一種或多種作為SARS特征的癥狀的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。這些癥狀包括但不限于高燒(＞38℃)、干咳、呼吸短促或呼吸困難、和指示肺炎的胸部X射線變化。與SARS有關(guān)或?yàn)槠涮卣鞯钠渌Y狀包括但不限于頭痛、肌肉僵硬、喪失食欲、不適、精神錯(cuò)亂、皮疹、和腹瀉。
在某些實(shí)施方案中，對(duì)老年人受試者或是無免疫應(yīng)答或免疫受抑制的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。在其它實(shí)施方案中，對(duì)嬰幼兒受試者或是教養(yǎng)院或公共機(jī)構(gòu)中的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。在另一些實(shí)施方案中，對(duì)年齡在0-10歲、10-20歲、30-40歲、40-50歲、50-60歲、60-70歲、70-80歲、80-90歲、90-100歲、100-120歲的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。
在某些實(shí)施方案中，對(duì)受到另一種病毒優(yōu)選呼吸道病毒感染的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。在其它實(shí)施方案中，對(duì)以前感染過另一種呼吸道病毒的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。在另一些實(shí)施方案中，對(duì)目前或以前患有肺炎的受試者施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物或聯(lián)合療法。
5.5.病毒感染的診斷可以由患者獲取樣品(例如唾液、粘液、血清、鼻吸樣、喉嚨拭樣、支氣管-肺泡洗液、或其它類型體液)并檢測(cè)病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)的存在以診斷病毒感染(例如SARS相關(guān)冠狀病毒感染)。在某些實(shí)施方案中，可以直接處理含完整細(xì)胞的樣品，而無完整細(xì)胞的分離物應(yīng)當(dāng)首先在允許的細(xì)胞系中進(jìn)行培養(yǎng)。在示例性實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液應(yīng)當(dāng)例如以300xg于室溫離心5分鐘以澄清，然后在同一條件下用PBS pH7.4漂洗。將細(xì)胞沉淀重懸于小體積PBS中待分析。將含完整細(xì)胞的臨床分離物與PBS混合并于室溫以300xg離心5分鐘。用無菌吸管從分界面去除粘液并在同樣條件下用PBS漂洗細(xì)胞沉淀。然后將沉淀重懸于小體積PBS中待分析。
可以通過熟練技術(shù)人員知道的任何方法來診斷病毒感染。用于診斷病毒感染(例如SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的示例性方法有但不限于檢測(cè)病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)的核苷酸序列，檢測(cè)病毒的抗原、以及與病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)免疫特異性結(jié)合的抗體或其片段。
SARS相關(guān)冠狀病毒的核苷酸序列的實(shí)例如Drosten等所述(2003年，N.Engl.J.Med.3481967-1976；參閱例如圖1)，將其完整收入全文作為參考。SARS相關(guān)冠狀病毒的基因組序列可以公開獲得，SARS相關(guān)冠狀病毒的不同分離株的GenBank編號(hào)參閱例如表1。這些序列可以由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的網(wǎng)頁獲得?？梢酝ㄟ^熟練技術(shù)人員知道的任何方法來檢測(cè)這些核苷酸序列，諸如但不限于用對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒核苷酸序列特異的探針進(jìn)行PCR、RT-PCR、或Northern印跡分析。用于檢測(cè)SARS相關(guān)冠狀病毒的特異引物和方法參閱世界衛(wèi)生組織的網(wǎng)頁和德國(guó)漢堡Bernhard Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所的網(wǎng)頁。
可以表達(dá)病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)的編碼序列以產(chǎn)生病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)的蛋白質(zhì)、多肽、或肽，它們可用于產(chǎn)生檢測(cè)病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)的抗體。與病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)免疫特異性結(jié)合的抗體可用于檢測(cè)病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)，可以使用諸如免疫測(cè)定法(例如免疫沉淀、Western印跡、ELISA、和流式細(xì)胞計(jì)數(shù))等本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)。
免疫沉淀的方案通常包括在諸如添加蛋白質(zhì)磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如EDTA、PMSF、159 aprotinin、釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1％NP-40或Triton X-100、1％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸鈉pH7.2、1％Trasylol)等裂解緩沖液中裂解細(xì)胞群，將目的抗體加入細(xì)胞裂解物中，于4℃保溫一段時(shí)間，向細(xì)胞裂解物中添加蛋白A和/或蛋白G瓊脂糖珠，于4℃保溫大約1小時(shí)或1小時(shí)以上，在裂解緩沖液中漂洗珠子并將珠子重懸于SDS/樣品緩沖液。目的抗體與特定抗原免疫沉淀的能力可通過例如Westem印跡分析進(jìn)行評(píng)估。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以修改有關(guān)參數(shù)以提高抗體與抗原的結(jié)合并降低背景(例如用瓊脂糖珠子預(yù)清除細(xì)胞裂解物)。有關(guān)免疫沉淀方案的進(jìn)一步討論參閱例如Ausubel等編，1994編，《分子生物學(xué)通用方法》Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，紐約，10.16.1部分。
Western印跡分析通常包括制備蛋白質(zhì)樣品、將蛋白質(zhì)樣品在聚丙烯酰胺凝膠(例如8％-20％SDS-PAGE，取決于抗原的分子量)進(jìn)行電泳，將蛋白質(zhì)樣品從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移到諸如硝酸纖維素、PVDF、或尼龍膜等膜上，在封閉液(例如含3％BSA或脫脂牛奶的PBS)中封閉膜，用漂洗緩沖液(例如PBSTween20)洗膜，將膜與稀釋于封閉緩沖液中的一抗(目的抗體)保溫，在漂洗緩沖液中洗膜，將膜與綴合了酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)或放射性分子(例如12P或121I)并稀釋于封閉緩沖液中的二抗一起保溫，在漂洗緩沖液中洗膜，并檢測(cè)抗原的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)參數(shù)進(jìn)行修改以增強(qiáng)被檢測(cè)的信號(hào)并降低噪音背景。有關(guān)Western印跡方案的進(jìn)一步討論參閱例如Ausubel等編，1994編，《分子生物學(xué)通用方法》CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，紐約，10.8.1部分。
ELISA包括制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的每個(gè)孔，洗去未與孔結(jié)合的抗原，將綴合了諸如酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測(cè)化合物的目的抗體加入孔中并保溫一段時(shí)間，洗去未結(jié)合的抗體或非特異性結(jié)合的抗體，并探測(cè)與包被孔的抗原特異結(jié)合的抗體的存在。在ELISA中目的抗體并非一定要與可檢測(cè)化合物綴合；換而言之，可將綴合了可檢測(cè)化合物的二抗加入孔中。此外，可以用抗體包被孔，而不是用抗原包被孔。在此情況下，可檢測(cè)分子可以是綴合了酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測(cè)化合物的抗原?？尚薷膮?shù)以增強(qiáng)被檢測(cè)的信號(hào)，而有關(guān)ELISA的其它變化方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。有關(guān)ELISA的進(jìn)一步討論參閱例如Ausubel等編，1994年，《分子生物學(xué)通用方法》Current Protocolsin Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons公司，紐約，第11.2.1頁。
抗體(包括scFv或是含有抗體片段或其變體或由其組成的其它分子)對(duì)抗原的結(jié)合親和力以及抗體-抗原相互作用的解離速率可通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法的一個(gè)實(shí)例是放射免疫測(cè)定法，包括將標(biāo)記(例如3H或121I)抗原與抗體在未標(biāo)記抗原量漸增的情況下一起保溫，檢測(cè)與標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體。
可以檢測(cè)受試者中與病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)免疫特異性結(jié)合的抗體的存在以診斷受試者中病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)的存在。熟練技術(shù)人員知道的任何方法都可用于檢測(cè)與病毒抗原免疫特異性結(jié)合的抗體的存在(例如SARS-相關(guān)性冠狀病毒抗原；包括諸如ELISA等免疫測(cè)定法)。
在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將SARS相關(guān)冠狀病毒抗原與固相支持物連接。隨后，將等待檢測(cè)其中是否存在與SARS相關(guān)冠狀病毒抗原免疫特異性結(jié)合抗體的材料與固相支持物在有益于抗體與SARS相關(guān)冠狀病毒抗原結(jié)合的條件下一起保溫。隨后，在去除任何非特異結(jié)合抗體的條件下清洗固相支持物。清洗后，可以使用熟練技術(shù)人員知道的任何技術(shù)來檢測(cè)被結(jié)合抗體的存在。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將SARS相關(guān)冠狀病毒抗原-抗體復(fù)合物與識(shí)別受試者物種所產(chǎn)生抗體的可檢測(cè)標(biāo)記抗體一起保溫，例如，如果受試者是人，所述可檢測(cè)標(biāo)記抗體是針對(duì)人的抗體，保溫條件是有益于可檢測(cè)標(biāo)記抗體與SARS相關(guān)冠狀病毒抗原所結(jié)合抗體結(jié)合的條件。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記抗體是與酶活性相結(jié)合的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記抗體是放射性標(biāo)記的。然后將SARS相關(guān)冠狀病毒抗原-抗體-可檢測(cè)標(biāo)記抗體的復(fù)合物進(jìn)行漂洗，隨后通過熟練技術(shù)人員知道的任何技術(shù)對(duì)可檢測(cè)標(biāo)記抗體的存在進(jìn)行定量，其中所用技術(shù)取決于可檢測(cè)標(biāo)記抗體的標(biāo)記物類型。
可以通過本領(lǐng)域眾所周知的任何方法來測(cè)定感染的頻率，例如但不限于可通過免疫熒光測(cè)定法(IFA)利用抗病毒抗原抗體(例如抗SARS相關(guān)冠狀病毒抗原抗體)檢測(cè)臨床樣品(例如鼻拭樣)中病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)的存在。在其它實(shí)施方案中，可以通過本領(lǐng)域知道的任何方法檢測(cè)病毒特異的(例如SARS相關(guān)冠狀病毒特異的)核苷酸序列。這些方法包括但不限于PCR、RT-PCR、和Northern印跡雜交。
5.6.生物學(xué)測(cè)定法在用于人類之前，優(yōu)選在體外、在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、和在動(dòng)物模型生物體中測(cè)試本發(fā)明療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)的幾個(gè)方面，諸如在嚙齒類動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試期望的治療活性。例如，可用于測(cè)定施用甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物與另一種抗病毒化合物的特定組合是否需要的測(cè)定法包括細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中將患者組織樣品進(jìn)行培養(yǎng)，暴露或以其它方式接觸甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物與另一種抗病毒化合物，并觀察這種/這些試劑對(duì)組織樣品的作用。組織樣品可以通過活組織檢查由患者獲得。這種測(cè)試能夠鑒定具有最大治療效果的甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物與另一種抗病毒化合物的組合。在多個(gè)具體實(shí)施方案中，可以用特定病毒感染所涉及的細(xì)胞類型的典型細(xì)胞進(jìn)行體外測(cè)定法，諸如例如由肺組織得到的細(xì)胞。
可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法對(duì)預(yù)防性或治療性試劑評(píng)估它們?cè)隗w外在培養(yǎng)細(xì)胞中改變病毒復(fù)制(通過例如噬斑形成來測(cè)定)或病毒蛋白生成(通過例如Western印跡分析、RT-PCR、或Northern印跡分析來測(cè)定)的能力。熟練技術(shù)人員知道的任何方法都可用于對(duì)甘草皂苷及其衍生物測(cè)試它們對(duì)病毒(例如SARS-相關(guān)冠狀病毒)感染細(xì)胞、在細(xì)胞中復(fù)制、或在細(xì)胞中繁殖的能力的影響。
可以通過熟練技術(shù)人員知道的任何技術(shù)來測(cè)定受到病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)感染的細(xì)胞的生存力。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量受病毒感染細(xì)胞的增殖來測(cè)定受病毒感染細(xì)胞的生存力。不同細(xì)胞類型(包括患者細(xì)胞和細(xì)胞系)都可用于該測(cè)定法，諸如但不限于Vero細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HeLa、16HBE140、HMEC-1、1301、和MOLT-4。這些細(xì)胞可以被SARS冠狀病毒感染。
在某些實(shí)施方案中，通過測(cè)量由受病毒感染細(xì)胞生成的感染性病毒顆粒來測(cè)定甘草皂苷及其衍生物對(duì)受病毒感染細(xì)胞的作用。在某些實(shí)施方案中，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)采集受感染細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基樣品，諸如感染后4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、和72小時(shí)，并且使用TCID50測(cè)試法測(cè)定上清液中的病毒滴度。
在某些其它實(shí)施方案中，測(cè)定由受感染細(xì)胞生成的病毒蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^SDS-PAGE及后續(xù)的使用針對(duì)病毒蛋白質(zhì)特異的抗體的Western印跡分析來測(cè)定病毒蛋白質(zhì)的水平。病毒蛋白質(zhì)包括例如非結(jié)構(gòu)蛋白、血凝素-酯酶糖蛋白、刺突糖蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白、和核蛋白。
本文所述測(cè)定法可用于測(cè)定病毒滴度隨時(shí)間的變化以測(cè)定病毒在存在或缺乏甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物與另一種抗病毒化合物的組合時(shí)的生長(zhǎng)特性。在具體實(shí)施方案中，如下測(cè)定病毒滴度，由受感染細(xì)胞或受感染受試者獲得樣品，將樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，并以能夠顯現(xiàn)單斑的病毒稀釋度感染易受病毒感染的細(xì)胞單層。然后可以對(duì)噬斑計(jì)數(shù)并將病毒滴度表述成噬斑形成單位每毫升樣品。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，通過受試者中針對(duì)病毒的抗體的滴度來估算受試者中本發(fā)明病毒的生長(zhǎng)速率?？梢酝ㄟ^熟練技術(shù)人員知道的任何方法由受試者獲得樣品。在某些實(shí)施方案中，樣品包括鼻吸樣、咽喉拭樣、唾液、或支氣管-肺泡洗液。
在某些實(shí)施方案中，受到病毒(例如SARS相關(guān)冠狀病毒)感染的細(xì)胞的存活率是甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物與另一種抗病毒化合物的組合效力的指征。本領(lǐng)域眾所周知的許多測(cè)定法可用于評(píng)估細(xì)胞存活和/或生長(zhǎng)；例如，可以通過測(cè)量溴脫氧尿苷(BRDU)摻入(參閱例如Hoshino等，1986年，Int.J.Cancer 38369；Campana等，1988年，J.Immunol.Meth.10779)或(3H)-胸苷摻入(參閱例如Chen，J.，1996年，Oncogene 131395-403；Jeoung，J.，1995年，J.Biol.Chem.27018367-73)，通過直接細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過檢測(cè)已知基因諸如原癌基因(例如fos、myc)或細(xì)胞周期標(biāo)記(Rb、cdc2、cyclin A、D1、D2、D3、E、等)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或活性變化來測(cè)定細(xì)胞增殖?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的任何方法來測(cè)定這些蛋白質(zhì)和mRNA的水平和活性。例如，可以通過已知的免疫診斷方法諸如使用商品化抗體的Western印跡或免疫沉淀來對(duì)蛋白質(zhì)定量。可以使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法，例如使用Northern分析、RNA酶保護(hù)、連同逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)mRNA定量?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域已知的錐蟲藍(lán)染色或其它細(xì)胞死亡或存活標(biāo)記來評(píng)估細(xì)胞生存能力。在具體實(shí)施方案，測(cè)量細(xì)胞ATP水平以測(cè)定細(xì)胞生存能力?？梢岳缭谝曈X上根據(jù)形態(tài)變化評(píng)估分化。
在用于人類之前可以在合適的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試本發(fā)明的療法(特別是預(yù)防性和/或治療性試劑的聯(lián)合)。這些動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔、等。可以使用本領(lǐng)域眾所周知的任何動(dòng)物系統(tǒng)。這些模型系統(tǒng)對(duì)于熟練技術(shù)人員而言是廣泛使用且眾所周知的?？梢苑磸?fù)施用預(yù)防性和/或治療學(xué)試劑。流程的幾個(gè)方面可以改變。所述方面包括施用預(yù)防性和/或治療性試劑的時(shí)間攝生法，以及是分開還是作為混合物施用這些試劑。
Utsunomiya等，1996年，Antimicrobial Agents and Chemotherapy41(3)551-556(如材料和方法部分)描述了用于測(cè)試甘草皂苷的抗病毒左右的例示性動(dòng)物模型系統(tǒng)，將其完整收入本文。可以根據(jù)諸如等參數(shù)來測(cè)定化合物在動(dòng)物模型系統(tǒng)中的抗病毒作用存活率、來自受感染動(dòng)物的樣品的病毒滴度、病毒感染對(duì)動(dòng)物中細(xì)胞、組織、和/或器官的病理作用。對(duì)照包括未受病毒感染的動(dòng)物和/或未用甘草皂苷或其衍生物處理的動(dòng)物。
可以對(duì)療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)評(píng)估它們?cè)隗w內(nèi)抑制或減少病毒感染(例如SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的能力。例如，可以對(duì)測(cè)試動(dòng)物優(yōu)選暴露于SARS相關(guān)冠狀病毒的測(cè)試動(dòng)物施用預(yù)防性或治療性試劑，隨后對(duì)測(cè)試病毒檢查病毒滴度、針對(duì)病毒的抗體、病毒的蛋白質(zhì)或核酸、或任何SARS相關(guān)癥狀。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)流程在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測(cè)定本發(fā)明預(yù)防性和/或治療學(xué)方案的毒性和/或功效，例如用于測(cè)定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體治療有效劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率即治療性指數(shù)，它可以表述成LD50/ED50比率。
由細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定法和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于設(shè)定在人體中使用的預(yù)防性或治療性試劑的劑量范圍。這些試劑的劑量?jī)?yōu)選處于包括具有少許毒性或沒有毒性的ED50在內(nèi)的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可以根據(jù)所采用的劑量形式和施用路徑在該范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明方法中所使用的任何試劑，最初可以由細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定法估算治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中設(shè)定一個(gè)劑量以達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的IC50(即達(dá)到最大癥狀抑制效果一半的測(cè)試化合物濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍。這些信息可用于更精確的確定在人體中的有用劑量?？梢酝ㄟ^例如高效液相層析(HPLC)和放射免疫測(cè)定法(RIA)來測(cè)量血漿水平?？梢酝ㄟ^例如測(cè)量諸如峰值血漿水平(Cmax)、曲線下的面積(AUC，通過繪制試劑的血漿濃度對(duì)時(shí)間的曲線來測(cè)量，反映生物利用度)、化合物半衰期(t1/2)、和達(dá)到最大濃度的時(shí)間等參數(shù)來測(cè)定預(yù)防性或治療性試劑的藥動(dòng)學(xué)。
另外，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的任何測(cè)定法都可用于評(píng)估本發(fā)明療法對(duì)于針對(duì)本文公開的病毒感染(例如SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的預(yù)防性和/或治療性效用。
5.7.施用方法本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療、處理、和改善病毒感染(例如SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物包含甘草皂苷或其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含甘草皂苷或其衍生物以及一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防性或治療性試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含甘草皂苷或其衍生物以及一種或多種抗病毒試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含甘草皂苷或其衍生物以及利巴韋林。依照這些實(shí)施方案，組合物還可以包含載體。
本發(fā)明的組合物包括但不限于可用于制造藥用組合物的散裝藥物組合物(例如不純的或未滅菌的組合物)和可用于制備單位劑量形式的藥用組合物(即適于施用于受試者或患者的組合物)。這些組合物包含預(yù)防或治療有效量的本文公開的預(yù)防性和/或治療性試劑或是那些試劑與藥用可接受載體的組合。優(yōu)選的是，本發(fā)明的組合物是藥用組合物，且包含有效量的甘草皂苷或其衍生物、藥用可接受載體、以及任選的有效量的另一種預(yù)防性或治療性試劑。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，術(shù)語“藥用可接受的”意味著得到聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)或是在美國(guó)藥典、歐洲藥典、或其它公認(rèn)藥典中列出可用于動(dòng)物，更特別的是可用于人。術(shù)語“載體”指稀釋劑、佐劑(例如(完全或不完全)弗氏佐劑)、賦形劑、或用于容納或施用治療劑的介質(zhì)。這些藥用載體可以是無菌液體，諸如水和油，包括源自石油、動(dòng)物、植物、或合成的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、諸如此類。靜脈內(nèi)施用藥用組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液態(tài)載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、諸如此類。如果需要，組合物還可以包含較少數(shù)量的潤(rùn)濕或乳化劑或是pH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊粉劑、緩釋配方、諸如此類的形式。
一般而言，或是分開或是在單位劑量形式中混合在一起供應(yīng)本發(fā)明組合物的成分，例如諸如指示活性劑數(shù)量的安瓿或sachette等密封容器中的凍干粉或無水濃縮物。在通過輸液施用組合物時(shí)，可以將它與裝有無菌藥用級(jí)水或鹽水的輸液瓶一起發(fā)放。在通過注射施用組合物時(shí)，可以提供一安瓿無菌注射用水或鹽水，從而可以在施用前混合成分。
本發(fā)明的組合物可以配制成中性或鹽形式。藥用可接受鹽包括與由氫氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、丁酸、等衍生的陰離子形成的鹽和與由氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨乙醇、組氨酸、葡魯卡因、等衍生的陽離子形成的鹽。
已知多種投遞系統(tǒng)，可用于施用甘草皂苷或其衍生物或是甘草皂苷或其衍生物與甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑的組合，用于預(yù)防、處理、治療、或改善呼吸狀況(優(yōu)選病毒呼吸狀況且最優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀，例如包裝成脂質(zhì)體、微粒、微囊、能夠表達(dá)抗體或抗體片段的重組細(xì)胞、由受體介導(dǎo)的胞吞作用(參閱例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.2624429-4432，1987年)、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體一部分的核酸的構(gòu)建、等。施用部分預(yù)防性或治療性試劑的方法包括但不限于腸胃外施用(例如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、和皮下)、硬膜外施用、腫瘤內(nèi)施用、和粘膜施用(例如鼻內(nèi)和口腔路徑)。另外，可以采用肺部施用，例如通過使用吸入器或噴霧器以及用霧化劑配制。參閱例如美國(guó)專利號(hào)6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT發(fā)布號(hào)WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，將它們完整收入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用Alkermes AIRTM肺部藥物投遞技術(shù)(Alkermes公司，劍橋，馬薩諸塞)施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物、聯(lián)合療法、和組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、口腔、鼻內(nèi)、肺部、或皮下施用本發(fā)明的預(yù)防性或治療性試劑?？梢酝ㄟ^任何方便的路徑施用預(yù)防性或治療性試劑，例如通過輸液或推注、通過經(jīng)由上皮或粘膜和皮膚層的吸收(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜、等)，而且可以與其它生物學(xué)活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可能希望將本發(fā)明的預(yù)防性或治療性試劑局部施用至需要治療的部位；這可以通過例如但不限于局部輸液、注射、或植入來實(shí)現(xiàn)，所述植入物指多孔或非多孔材料，包括膜和基體，諸如硅膠膜、聚合物、纖維基體(例如Tissuel)、或膠原基體。在一個(gè)實(shí)施方案中，將有效量的甘草皂苷或其衍生物局部施用至受試者的患病部位以預(yù)防、治療、處理、和/或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其癥狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將有效量的甘草皂苷或其衍生物連同有效量的一種或多種甘草皂苷或其衍生物以外的療法(例如一種或多種預(yù)防性或治療性試劑)局部施用至受試者的患病部位以預(yù)防、治療、處理、和/或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀。
可以在受控釋放或緩釋系統(tǒng)中施用預(yù)防性或治療性試劑。受控釋放藥物產(chǎn)品的目的是在將藥物用量和治療或控制狀況的時(shí)間最小化的同時(shí)將藥物療法的益處最大化。受控釋放配方的優(yōu)點(diǎn)包括延長(zhǎng)藥物活性、降低用藥頻率、和改善接受治療的受試者的順從性。另外，受控釋放配方影響發(fā)起作用所需要的時(shí)間和其它特征，諸如藥物的血液水平，由此提供對(duì)發(fā)生副作用的一些控制。
大多數(shù)受控釋放配方的設(shè)計(jì)是為了最初以迅速產(chǎn)生期望效果的數(shù)量釋放藥劑，然后以在較長(zhǎng)時(shí)間里足以延續(xù)期望效果的數(shù)量逐漸且持續(xù)釋放其它成分。為了維持持續(xù)的治療性和預(yù)防性效果，必須以能夠補(bǔ)償由身體代謝和排泄的數(shù)量的速率由劑量形式釋放藥物。藥劑的受控釋放可能受到多種條件的激發(fā)，包括但不限于pH、溫度、酶、水、或其它生理學(xué)條件或化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵來實(shí)現(xiàn)受控或持續(xù)釋放(參閱Langer，見上文；Sefton，1987年，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.1420；Buchwald等，1980年，Surgery 88507；Saudek等，1989年，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用聚合材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明療法的受控或持續(xù)釋放(參閱例如《受控釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise編，CRC出版社，伯克萊屯，佛羅里達(dá)，1974年；《受控藥物生物利用度、藥物產(chǎn)品設(shè)計(jì)、和性能》Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball編，Wiley出版社，紐約，1984；Ranger和Peppas，1983年，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；還可參閱Levy等，1985年，Science 228190；During等，1989年，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989年，J.Neurosurg.71105；美國(guó)專利號(hào)5,679,377、美國(guó)專利號(hào)5,916,597、美國(guó)專利號(hào)5,912,015、美國(guó)專利號(hào)5,989,463、美國(guó)專利號(hào)5,128,326、PCT發(fā)布號(hào)WO 99/15154、和PCT發(fā)布號(hào)WO 99/20253)?？捎糜诰忈屌浞降木酆衔锏膶?shí)例包括但不限于聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯共乙烯乙酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)、和聚原酸酯。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，緩釋配方中所使用的聚合物是惰性、不含可濾去雜質(zhì)、貯存穩(wěn)定、無菌、且生物可降解的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將受控或緩釋系統(tǒng)置于預(yù)防或治療目標(biāo)附近，由此只需要全身劑量的一部分(參閱例如Goodson，《受控釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》Medical Applications of ControlledRelease，見上文，第2卷，第115-138頁，1984頁)。
Langer(1990年，Science 2491527-1533)在綜述中討論了受控釋放系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何技術(shù)都可用于生成包含一種或多種本發(fā)明治療劑的緩釋配方。參閱例如美國(guó)專利號(hào)4,526,938、PCT發(fā)布號(hào)WO 91/05548、PCT發(fā)布號(hào)WO 96/20698。Ning等人，1996年，“使用緩釋凝膠的人結(jié)腸癌異種移植物的腫瘤內(nèi)放射免疫療法”，Radiotherapy & Oncology 39179-189；Song等，1995年，“由抗體介導(dǎo)的肺循環(huán)乳液的肺靶向”，PDA Journal of PharmaceuticalScience & Technology 50372-397；Cleek等，1997年，“用于心血管應(yīng)用的bFGF抗體的生物可降解聚合載體”，Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854；和Lam等，1997年，“用于局部投遞的重組人源化單克隆抗體的微囊化”Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24759-760，將它們完整收入本文作為參考。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的組合物是編碼預(yù)防性或治療性試劑的核酸時(shí)，通過將核酸構(gòu)建成合適核酸表達(dá)載體的一部分，并例如通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參閱美國(guó)專利號(hào)4,980,286)、或通過直接注射、或通過使用微粒轟擊(例如基因槍，Biolistic，Dupont)、或用脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被、或?qū)⑺c已知進(jìn)入細(xì)胞核的同源框樣肽連鎖施用(參閱例如Joliot等，1991年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)進(jìn)行施用使之進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可以在體內(nèi)施用核酸以促進(jìn)由它編碼的預(yù)防性或治療性試劑的表達(dá)?；蛘撸梢詫⒑怂釋?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并通過同源重組摻入宿主細(xì)胞DNA以進(jìn)行表達(dá)。
將本發(fā)明的藥用組合物配制成與其意向施用路徑相容。施用路徑的實(shí)例包括但不限于腸胃外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔、鼻內(nèi)(例如吸入)、經(jīng)皮(例如局部)、經(jīng)粘膜、和直腸施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，依照常規(guī)流程將組合物配制成適合靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口腔、鼻內(nèi)、或局部施用于人類的藥用組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無菌等滲水性緩沖液中的溶液。如果需要，組合物還可以包含增溶劑和局部麻醉劑諸如麥角胺以減輕注射部位的疼痛。
若要局部施用本發(fā)明的組合物，則可以將組合物配制成軟膏、乳膏、皮膚貼、洗劑、凝膠、洗發(fā)劑、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳液的形式或是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它形式。參閱例如《雷明頓氏藥物科學(xué)和藥物劑量形式導(dǎo)論》Remington′s PharmaceuticalSciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞，1995年。對(duì)于非可噴霧局部劑量形式，通常采用包含與局部應(yīng)用相容的載體或一種或多種賦形劑且具有優(yōu)選大于水的動(dòng)態(tài)粘滯度的粘性至半固體或固體形式。合適的配方包括但不限于溶液、懸浮液、乳狀液、乳膏、軟膏、粉劑、搽劑、藥膏、諸如此類，如果需要，是無菌的或與輔助試劑(例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑緩沖劑、或鹽)混和以改變各種特性，諸如例如滲透壓。其它合適的局部劑量形式包括可噴霧氣霧劑制劑，其中優(yōu)選聯(lián)合固相或液相惰性載體的活性成分包裝在含有增壓揮發(fā)物(例如壓縮氣體，諸如氟利昂)的混合物或是擠瓶中。如果需要，還可以向藥物組合物和劑量形式中添加增濕劑或濕潤(rùn)劑。這些額外成分的實(shí)例在本領(lǐng)域是眾所周知的。
若本發(fā)明的方法包括組合物的鼻內(nèi)施用，則組合物可以配制成氣霧劑、噴霧劑、輕霧劑、或滴劑的形式。具體而言，依照本發(fā)明使用的預(yù)防性或治療性試劑可以使用合適的推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲烷、三氯單氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合適其它)以氣霧劑噴霧呈現(xiàn)的形式由增壓包裝或噴霧器進(jìn)行方便的投遞。在增壓氣霧劑的情況中，可以通過提供閥門來確定劑量單位，以投遞計(jì)量數(shù)量。吸入器或吹入器中所使用的膠囊和藥筒(由例如明膠構(gòu)成)可以配制成含有化合物及合適粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
若本發(fā)明的方法包括口服施用，則組合物可以配制成片劑、膠囊、藥包、軟膠囊、溶液、懸浮液、諸如此類的形式。可以通過常規(guī)手段用藥用可接受賦形劑諸如粘合劑(例如預(yù)膠凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如乳糖、微晶纖維素、或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、或硅石)；分解質(zhì)(例如馬鈴薯淀粉或淀粉乙醇酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如月桂醇硫酸鈉)片劑或膠囊?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的方法包被片劑。用于口腔施用的液體制劑可以采取但不限于溶液、糖漿、或懸浮液的形式，或者它們可以以干燥產(chǎn)品的形式存在，使用前用水或其它合適介質(zhì)溶解?？梢酝ㄟ^常規(guī)手段用藥用可接受添加劑，諸如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物、或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性介質(zhì)(例如杏仁油、油性酯、乙醇、或分餾植物油)；以及防腐劑(例如甲基或丙基-對(duì)-羥基苯甲酸酯或山梨酸)制備這些液體制劑。制劑還可以適當(dāng)包含緩沖鹽、芳香劑、著色劑、和甜味劑?？梢赃m當(dāng)配制用于口腔施用的制劑以緩慢釋放、受控釋放、或持續(xù)釋放預(yù)防性或治療性試劑。
本發(fā)明的方法可以包括用霧化劑配制的組合物的肺部施用，例如通過使用吸入器或噴霧器。參閱例如美國(guó)專利號(hào)6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT發(fā)布號(hào)WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，將它們完整收入本文作為參考。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用Alkermes AIRTM肺部藥物投遞技術(shù)(Alkermes公司，劍橋，馬薩諸塞)施用本發(fā)明的甘草皂苷或其衍生物、聯(lián)合療法、和/或組合物。
本發(fā)明的方法還包括配制用于通過注射(例如通過推注或連續(xù)輸液)腸胃外施用的組合物的施用。用于注射的配方可以以含有額外防腐劑的單位劑量形式(例如在安瓿中或在多劑量容器中)存在。組合物可以采取諸如油性或水性介質(zhì)中的懸浮液、溶液、或乳狀液等形式，而且可以含有配制劑，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑、和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合適介質(zhì)(例如無菌、無熱原水)溶解。
可用于提供本發(fā)明腸胃外劑量形式的合適介質(zhì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。在某些實(shí)施方案中，適于腸胃外劑量形式的介質(zhì)包括但不限于注射用水USP；水性介質(zhì)包括但不限于氯化鈉注射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、以及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介質(zhì)包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及非水性介質(zhì)包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、和苯甲酸苯甲酯。
在其它實(shí)施方案中，將增加預(yù)防性或治療性試劑溶解度的化合物摻入腸胃外劑量形式。例如，可以使用環(huán)糊精及其衍生物來增加撒利多胺類似物及其衍生物的溶解度。參閱例如美國(guó)專利號(hào)5,134,127，將其收入本文作為參考。本發(fā)明的方法還額外包含配制成倉(cāng)儲(chǔ)制劑的組合物的施用?？梢酝ㄟ^植入(例如皮下或肌肉內(nèi))或通過肌肉內(nèi)注射來施用這些長(zhǎng)期作用配方。由此，例如，可以與合適的聚合或疏水材料(例如在可接受油中配制成乳狀液)或離子交換樹脂一起配制組合物，或是配制成少量可溶衍生物(例如少量可溶鹽)。
本發(fā)明的方法涵蓋配制成中性或鹽形式的組合物的施用。藥用可接受鹽包括與由氫氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、丁酸、等衍生的陰離子形成的鹽和與由氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨乙醇、組氨酸、普魯卡因、等衍生的陽離子形成的鹽。
一般而言，或是分開或是在單位劑量形式中混合在一起供應(yīng)組合物的成分，例如諸如指示活性劑數(shù)量的安瓿或小瓶(sachette)等密封容器中的凍干粉或無水濃縮物。施用模式是輸液時(shí)，可以將組合物與裝有無菌藥用級(jí)水或鹽水的輸液瓶一起發(fā)放。施用模式是注射時(shí)，可以提供一安瓿無菌注射用水或鹽水，從而可以在施用前混合成分。
具體而言，本發(fā)明還提供將本發(fā)明的一種或多種預(yù)防性或治療性試劑或是藥物組合物包裝在密封容器中，諸如指示試劑數(shù)量的安瓿或小瓶中。在一個(gè)實(shí)施方案中，作為密封容器中的凍干粉或無水濃縮物供應(yīng)本發(fā)明的一種或多種預(yù)防性或治療性試劑或是藥用組合物，并且可以還原(例如用水或鹽水)至合適濃度以施用于受試者。
如果需要，組合物可以存在于包裝或分發(fā)裝置中，它可以裝有一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑量形式。包裝可以包括例如金屬或塑料薄片，諸如透明塑料浮泡包裝。包裝或分發(fā)裝置可以附有施用說明。
一般而言，本發(fā)明組合物的成分衍生自與這些組合物的受眾具有相同物種起源或物種反應(yīng)性的受試者。由此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，出于治療或預(yù)防目的對(duì)人類患者施用人源或人源化抗體。
5.8.施用劑量和頻率可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)測(cè)定在預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染(例如SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀中將是有效的甘草皂苷或其衍生物的預(yù)防或治療有效量。劑量、服藥頻率、或二者將取決于患者的年齡、患者的體重、患者的響應(yīng)、患者狀況的嚴(yán)重程度、患者過去的醫(yī)學(xué)病歷、以及預(yù)防性或治療性試劑的施用路徑、藥動(dòng)學(xué)、和藥效學(xué)效果，而且應(yīng)當(dāng)根據(jù)從業(yè)人員的判斷和每名患者的情況做出決定。可以由衍生自體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)(見上文5.6節(jié))的劑量-響應(yīng)曲線來推斷有效劑量。
甘草皂苷或其衍生物的例示劑量包括每千克受試者或樣品體重的甘草皂苷或其衍生物的毫克或微克量(例如大約1微克每千克-大約500毫克每千克、大約100微克每千克-大約5毫克每千克、或大約1微克每千克-大約50微克每千克)。在具體實(shí)施方案中，甘草皂苷或其衍生物的日常劑量是至少50mg、75mg、100mg、150mg、250mg、500mg、750mg、或至少1g。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的組合物的劑量是0.01-5000mM、1-300mM、10-100mM、和10mM-1M的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的組合物的劑量是至少5μM、至少10μM、至少50μM、至少100μM、至少500μM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少50mM、至少100mM、或至少500mM的濃度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的組合物的劑量是0.01-5000mM、1-300mM、10-100mM、和10mM-1M的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的組合物的劑量是至少5μM、至少10μM、至少50μM、至少100μM、至少500μM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少50mM、至少100mM、或至少500mM的濃度。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療、處理、或改善患者中的SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的組合物的劑量是0.25μg/kg或更多、優(yōu)選0.5μg/kg或更多、1μg/kg或更多、2μg/kg或更多、3μg/kg或更多、4μg/kg或更多、5μg/kg或更多、6μg/kg或更多、7μg/kg或更多、8μg/kg或更多、9μg/kg或更多、10μg/kg、25μg/kg或更多、優(yōu)選50μg/kg或更多、100μg/kg或更多、250μg/kg或更多、500μg/kg或更多、1mg/kg或更多、5mg/kg或更多、6mg/kg或更多、7mg/kg或更多、8mg/kg或更多、9mg/kg或更多、或10mg/kg或更多患者體重。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療、處理、或改善患者中的SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的組合物的劑量是5mg、優(yōu)選10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg或更多的單位劑量。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于預(yù)防、治療、處理、或改善患者中的SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物或是包含甘草皂苷或其衍生物的組合物的劑量是范圍為大約5mg-大約100mg、優(yōu)選大約100mg-200mg、大約150mg-大約300mg、大約150mg-大約400mg、大約250mg-大約500mg、大約500mg-大約800mg、大約500mg-大約1000mg、或大約5mg-大約1000mg的劑量單位。
可以使用臨床醫(yī)生能夠得到的參考文獻(xiàn)諸如例如《醫(yī)生的案頭參考資料》Physicians′Desk Reference，第55版，2001年來測(cè)定曾經(jīng)或目前用于預(yù)防、治療、或改善病毒感染(優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其癥狀的甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防性或治療性試劑的劑量。優(yōu)選的是，聯(lián)合甘草皂苷或其衍生物使用低于曾經(jīng)或目前用于預(yù)防、治療、或改善病毒感染(優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)的劑量的劑量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用一個(gè)或多個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中每次服用的預(yù)防或治療有效量并非相同的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用一個(gè)或多個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中對(duì)所述受試者施用的甘草皂苷或其衍生物的預(yù)防或治療有效量的劑量增加了例如0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、或50μg/kg作為治療進(jìn)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用一個(gè)或多個(gè)劑量的預(yù)防或治療有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中對(duì)所述受試者施用的甘草皂苷或其衍生物的預(yù)防或治療有效量的劑量減少了例如0.01μg/kg、0.02μg/kg、0.04μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.08μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg、0.75μg/kg、1μg/kg、1.5μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、或50μg/kg作為治療進(jìn)度。
在某些實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用一個(gè)或多個(gè)劑量的有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中所述甘草皂苷或其衍生物的有效量的一個(gè)劑量將SARS相關(guān)冠狀病毒的復(fù)制抑制或降低了至少20％-25％、優(yōu)選至少25％-30％、至少30％-35％、至少35％-40％、至少40％-45％、至少45％-50％、至少50％-55％、至少55％-60％、至少60％-65％、至少65％-70％、至少70％-75％、至少75％-80％、或可高達(dá)至少85％。在其它實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用一個(gè)或多個(gè)劑量的有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中所述甘草皂苷或其衍生物的有效量的一個(gè)劑量將SARS相關(guān)冠狀病毒顆粒的生成抑制或減少了至少20％-25％、優(yōu)選至少25％-30％、至少30％-35％、至少35％-40％、至少40％-45％、至少45％-50％、至少50％-55％、至少55％-60％、至少60％-65％、至少65％-70％、至少70％-75％、至少75％-80％、或可高達(dá)至少85％。在其它實(shí)施方案中，對(duì)受試者施用一個(gè)或多個(gè)劑量的有效量的甘草皂苷或其衍生物，其中所述甘草皂苷或其衍生物的有效量的一個(gè)劑量將SARS相關(guān)冠狀病毒顆粒的釋放抑制或減少了至少20％-25％、優(yōu)選至少25％-30％、至少30％-35％、至少35％-40％、至少40％-45％、至少45％-50％、至少50％-55％、至少55％-60％、至少60％-65％、至少65％-70％、至少70％-75％、至少75％-80％、或可高達(dá)至少35％。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括在一段時(shí)間內(nèi)每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每7天一次、每8天一次、每10天一次、每2周一次、或每3周一次對(duì)有所需要的受試者施用至少5mg、優(yōu)選10mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、或更多甘草皂苷或其衍生物的一個(gè)劑量。
提供上文所述施用方案僅是處于例示目的而不應(yīng)答理解為限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解，甘草皂苷或其衍生物的所有劑量屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可以依照本發(fā)明的方法聯(lián)合甘草皂苷或其衍生物施用曾經(jīng)或目前用于預(yù)防、治療、處理、或改善狀況(優(yōu)選病毒狀況)或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物以外的療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)以治療、處理、預(yù)防、或改善病毒感染或其一種或多種癥狀。
可以依照本發(fā)明的方法聯(lián)合甘草皂苷或其衍生物施用曾經(jīng)或目前用于預(yù)防、治療、處理、或改善呼吸狀況(優(yōu)選病毒性呼吸狀況且最優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的甘草皂苷或其衍生物以外的療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)以治療、處理、預(yù)防、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀。優(yōu)選的是，本發(fā)明聯(lián)合療法中所使用的預(yù)防性或治療性試劑的劑量低于曾經(jīng)或目前用于預(yù)防、治療、處理、或改善呼吸狀況(優(yōu)選病毒性呼吸狀況且最優(yōu)選SARS相關(guān)冠狀病毒感染)或其一種或多種癥狀的劑量。可以由本領(lǐng)域的任何參考文獻(xiàn)獲得目前用于預(yù)防、治療、處理、或改善呼吸狀況(優(yōu)選病毒性呼吸狀況)或其一種或多種癥狀的試劑的推薦劑量，包括但不限于Hardman等編，2001年，Goodman & Gilman′s ThePharmacological Basis Of Therapeutics，第10版，Mc-Graw-Hill，紐約；Physician′s Desk Reference(PDR)，第57版，2003年，MedicalEconomics Co.，Inc.，Montvale，NJ，將其完整收入本文作為參考。
在多個(gè)實(shí)施方案中，相距少于5分鐘、相距少于30分鐘、相距少于1小時(shí)、相距少于大約1小時(shí)、相距少于大約1-大約2小時(shí)、相距少于大約2小時(shí)-大約3小時(shí)、相距大約3小時(shí)-大約4小時(shí)、相距大約4小時(shí)-大約5小時(shí)、相距大約5小時(shí)-大約6小時(shí)、相距大約6小時(shí)-大約7小時(shí)、相距大約7小時(shí)-大約8小時(shí)、相距大約8小時(shí)-大約9小時(shí)、相距大約9小時(shí)-大約10小時(shí)、相距大約10小時(shí)-大約11小時(shí)、相距大約11小時(shí)-大約12小時(shí)、相距大約12小時(shí)-18小時(shí)小時(shí)、相距大約18小時(shí)-24小時(shí)、相距大約24小時(shí)-36小時(shí)、相距大約36小時(shí)-48小時(shí)、相距大約48小時(shí)-52小時(shí)、相距大約52小時(shí)-60小時(shí)、相距大約60小時(shí)-72小時(shí)、相距大約72小時(shí)-84小時(shí)、相距大約84小時(shí)-96小時(shí)、或相距大約96小時(shí)-120小時(shí)施用療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在同一次患者就診時(shí)施用兩個(gè)或多個(gè)療法。
在某些實(shí)施方案中，循環(huán)施用甘草皂苷或其衍生物和一種或多種其它療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)。循環(huán)療法包括施用第一種療法(例如第一種預(yù)防性或治療性試劑)一段時(shí)間，然后施用第二種療法(例如第二種預(yù)防性或治療性試劑)一段時(shí)間，任選隨后施用第三種療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)一段時(shí)間等等，并且順序重復(fù)該順序施用即循環(huán)，從而降低針對(duì)某一種療法的抗性的發(fā)展以避免或降低某一種療法的副作用，和/或改善療法的功效。
在某些實(shí)施方案中，可以反復(fù)施用相同的甘草皂苷衍生物，而且每次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、或30天。在其它實(shí)施方案中，可以反復(fù)施用甘草皂苷或其衍生物以外的相同療法(例如預(yù)防性或治療性試劑)，而且每次施用可以相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、或30天。
5.9.商品本發(fā)明還涵蓋完成包裝和標(biāo)記的藥品。所述商品包括在諸如玻璃瓶或其它密封容器等適當(dāng)器皿或容器中的合適單位劑量。在劑量形式適于腸胃外施用的情況中，例如甘草皂苷或其衍生物等活性成分是無菌的且適于作為不含微粒溶液施用。換言之，本發(fā)明包括腸胃外溶液和凍干粉，它們都是無菌的，且后者適于在注射前重溶?；蛘?，單位劑量形式可以是適于口服、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、肺部、或局部投遞的固體。
在某些實(shí)施方案中，單位劑量形式適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、局部、肺部、或皮下投遞。因此，本發(fā)明涵蓋溶液，優(yōu)選無菌的、適于各種投遞路徑的溶液。
對(duì)于任一種藥品而言，包裝材料和容器都設(shè)計(jì)成在貯存和運(yùn)輸期間保持產(chǎn)品的穩(wěn)定性。此外，本發(fā)明的產(chǎn)品包括使用說明書或建議醫(yī)師、技術(shù)人員、或患者如何正確預(yù)防或治療所述呼吸疾病的其它信息資料。換言之，商品包括指示或建議劑量攝生法以及監(jiān)測(cè)信息的說明書，包括但不限于實(shí)際劑量、監(jiān)測(cè)步驟、總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)、肥大細(xì)胞脫粒、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、T細(xì)胞計(jì)數(shù)、IgE抗體產(chǎn)量、以及其它監(jiān)測(cè)信息。
具體而言，本發(fā)明提供了這樣的商品，它包括包裝材料，諸如盒子、瓶子、管、小瓶、罐、噴霧器、吹藥器、靜脈內(nèi)(i.v.)包、封套、等等；而且，在所述包裝材料中包含至少一個(gè)單位劑量形式的藥劑，其中所述藥劑包含甘草皂苷或其衍生物且其中所述包裝材料包括指明所述甘草皂苷或其衍生物通過施用特定劑量且使用本文所述特定劑量攝生法可用于治療、預(yù)防、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的說明書。
本發(fā)明還提供了這樣的商品，它包括包裝材料，諸如盒子、瓶子、管、小瓶、罐、噴霧器、吹藥器、靜脈內(nèi)(i.v.)包、封套、等等；而且，在所述包裝材料中包含至少各一個(gè)單位劑量形式的藥劑，其中第一種藥劑包含甘草皂苷或其衍生物而第二種藥劑包含甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防性或治療性試劑，且其中所述包裝材料包括指明所述甘草皂苷或其衍生物通過施用特定劑量且使用本文特定劑量攝生法可用于治療、預(yù)防、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的說明書。
本發(fā)明還提供了這樣的商品，它包括包裝材料，諸如盒子、瓶子、管、小瓶、罐、噴霧器、吹藥器、靜脈內(nèi)(i.v.)包、封套、等等；而且，在所述包裝材料中包含至少一個(gè)單位劑量形式的藥劑，其中一種藥劑包含甘草皂苷或其衍生物以及甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防性或治療性試劑，且其中所述包裝材料包括指明所述甘草皂苷或其衍生物通過施用特定劑量且使用本文所述特定劑量攝生法可用于治療、預(yù)防、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的說明書。
本發(fā)明規(guī)定，在商品所含的信息資料中指出了用于預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的本發(fā)明方法可以減少或避免的副作用?？梢酝ㄟ^本發(fā)明方法減少或避免的副作用包括但不限于重大癥狀異常(發(fā)熱、心動(dòng)過速、心動(dòng)過緩、高血壓、低血壓)、血液病(貧血、淋巴細(xì)胞減少癥、白血球減少癥、血小板減少癥)、頭痛、寒戰(zhàn)、頭暈、惡心、衰弱、背痛、胸痛(胸壓)、腹瀉、肌痛、疼痛、搔癢、牛皮癬、鼻炎、發(fā)汗、注射部位反應(yīng)、和血管舒張。
6.1.實(shí)施例1甘草皂苷(甘草根的活性成分)和SARS相關(guān)冠狀病毒的復(fù)制SARS的爆發(fā)需要研究用于治療疾病的抗病毒化合物。目前，尚未鑒定針對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒感染的特效治療。評(píng)估了利巴韋林、6-氮尿苷、吡唑呋喃菌素、霉酚酸、和甘草皂苷針對(duì)來自收入德國(guó)法蘭克福大學(xué)臨床中心的SARS患者的兩種冠狀病毒臨床分離物(FFM-1和FFM-2)的抗病毒能力。所有化合物都可以通過商業(yè)途徑獲得，而且已經(jīng)由于它們的抗病毒、抗腫瘤、和免疫抑制活性而用于患者。在所有化合物中，甘草皂苷在抑制SARS相關(guān)冠狀病毒復(fù)制方面是最有活性的。這些結(jié)果指示甘草皂苷的預(yù)防性和治療性功效。
對(duì)在96孔板中感染72-96小時(shí)后由病毒誘導(dǎo)的對(duì)Vero細(xì)胞匯合層的細(xì)胞病原性進(jìn)行視覺評(píng)分。選擇性指數(shù)確定為使細(xì)胞生存力降低50％(CC50)的某化合物濃度與抑制細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)對(duì)照值的50％(EC50)所需的該化合物濃度的比例。用MMT細(xì)胞增殖試劑盒I(Roche，曼海姆，德國(guó))測(cè)定藥物的細(xì)胞毒性。
利巴韋林和霉酚酸，作為肌苷單磷酸鹽脫氫酶的抑制劑，不會(huì)影響SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-CV)的復(fù)制(見表2)。乳清酸核苷單磷酸鹽脫羧酶的抑制劑，6-氮尿苷和吡唑呋喃菌素，分別以選擇性指數(shù)5和12將SARS-CV的復(fù)制抑制在非毒性劑量。在Vero細(xì)胞中SARS-CV復(fù)制的最強(qiáng)抑制劑是甘草皂苷，它的選擇性指數(shù)為67。
表2化合物在Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中針對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒的活性
EC50＝抑制細(xì)胞致病效應(yīng)達(dá)對(duì)照值50％所需的化合物有效濃度。
CC50＝使細(xì)胞生存力降低50％的化合物的細(xì)胞毒性濃度。
NC＝不可計(jì)算。
*8次試驗(yàn)的平均值(SD)。
在所使用的最大濃度(200，mg/L)處記錄到細(xì)胞生存力降低了20-30％。
除了抑制病毒復(fù)制以外，甘草皂苷還抑制病毒復(fù)制周期的早期步驟-病毒的吸附和侵入。甘草皂苷在吸附期間加入比在病毒吸附后加入效率要低(分別為EC50600對(duì)2400mg/L)。甘草皂苷在吸附過程中以及吸附之后加入都是最有效的的(EC50300mg/L)。
圖1顯示了甘草皂苷對(duì)Vero細(xì)胞中SARS-CV復(fù)制的影響。利用SARS患者的血清樣品測(cè)定了SARS-CV的復(fù)制。在用1000mg/L甘草皂苷處理的培養(yǎng)基中病毒抗原的表達(dá)比任何其它培養(yǎng)基中的都要低得多；高濃度甘草皂苷(4000mg/L)完全阻斷了病毒的復(fù)制(圖1)。
甘草皂苷影響諸如蛋白酶C、酪蛋白激酶II等細(xì)胞信號(hào)途徑以及諸如激活劑蛋白1和核因子кB等轉(zhuǎn)錄因子。此外，甘草皂苷及其糖苷配基代謝物18β-甘草酸上調(diào)可誘導(dǎo)性一氧化二氮合酶的表達(dá)以及一氧化二氮在最大值相位(macrophases)中的產(chǎn)量(Jeong HG，Kim JY.最大值相位中18(3-甘草酸對(duì)可誘導(dǎo)性一氧化氮合酶表達(dá)的誘導(dǎo)。FEBSLett 2002；513208-12)。一氧化二氮抑制若干種病毒的復(fù)制，例如日本腦炎病毒(Flavivirate家族的成員)，它也可被甘草皂苷所抑制。不受理論限制，甘草皂苷誘導(dǎo)一氧化氮合酶且該一氧化氮合酶抑制SARS相關(guān)冠狀病毒的復(fù)制。在此處未出示的結(jié)果中，甘草皂苷在Vero細(xì)胞中誘導(dǎo)一氧化氮合酶且當(dāng)培養(yǎng)基中加入一氧化氮供體(DETANONOate)時(shí)SARS相關(guān)冠狀病毒復(fù)制受到抑制。
6.2實(shí)施例2甘草皂苷衍生物的抗SARS活性甘草皂苷衍生物的合成甘草皂苷的氨基酸衍生物(例如化合物6和化合物3)如文獻(xiàn)所報(bào)導(dǎo)通過利用活化的N-羥琥珀酰亞胺酯來合成L.A.Baltina等，甘草酸的轉(zhuǎn)換。VIII.用氨基酸的叔丁基醚合成免疫調(diào)控糖肽；Russian J.Bioorg.Chem.，1994年，20(12)，778-784；Baltina L.A.等，甘草酸的轉(zhuǎn)換。VII.含L型氨基酸烷基醚的三萜糖肽的合成，Khim.Prir.Soedin.，1994年，(20)，261-268；和R.M.Kondratenko等，含半胱氨酸的甘草酸衍生物的合成及免疫調(diào)控活性，Russian J.Bioorg.Chem.，2004，年，30(1)，61-67。
通過利用Gly-L-Val的叔丁基醚氫氧化物作為四氫呋喃的氨基組分在0℃在存在N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)-N-羥琥珀酰亞胺且堿(三乙胺)稍微過量(1mmol)的條件下進(jìn)行化合物3的選擇性合成。用CF3COOH解離叔丁基醚基團(tuán)并用柱層析(CC)以50-53％的產(chǎn)量分離具有游離30-COOH功能的目的產(chǎn)物。
在R1和R2處含S-苯甲基-L-半胱氨酸的甘草皂苷氨基酸衍生物的選擇性合成是通過利用L-Cys的叔丁基醚(SBn)氫氧化物作為四氫呋喃的氨基組分在0℃在存在N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)-N-羥琥珀酰亞胺且堿(三乙胺)稍微過量(1mmol)的條件下進(jìn)行的。用CF3COOH解離叔丁基醚基團(tuán)并用柱層析(CC)以50-53％的產(chǎn)量分離具有游離30-COOH功能的目的產(chǎn)物。
化合物7是通過甘草皂苷三甲基醚(L.A.Baltina等，甘草酸的轉(zhuǎn)換。X.新的酯的合成，Zh.Org.Khim.，1994年，30(11)，1622-1626)與肼水合物在沸騰狀態(tài)甲醇中的反應(yīng)產(chǎn)生的，產(chǎn)量77％。
雜環(huán)酰胺化合物2和化合物4是通過甘草皂苷與5-氨基尿嘧啶(aminouracyl)和6-氨基-2-硫-尿嘧啶(uracyl)在存在DCC時(shí)反應(yīng)而制備的。
β-甘草亭酸甲酯的β-D-吡喃基葡糖-(1→2)-β-D-吡喃葡糖苷是通過在文獻(xiàn)所述的溫和條件下在含NaBH4的甲醇中還原甘草皂苷三甲基醚而合成的Baltina L.A.等，甘草酸的轉(zhuǎn)換3-O-[β-6′-脫氫-6′-氨基-D-吡喃基葡糖(1-2)-β-6″脫氫-6″-氨基-D-吡喃葡糖苷]-(3β，20β)-11-氧代-20-甲基羰基-18β-齊墩果-12-烯-3-醇的合成，Mendeleev Comm.，1995年，(5)，178-179。
化合物5是通過在溫和條件下以DCC方式在DMF-吡啶混合物中偶聯(lián)甘草皂苷和N-乙酰-β-D-吡喃糖胺而合成的。產(chǎn)物化合物5是通過產(chǎn)量為42％柱層析以均一(TLC)狀態(tài)獲得的。當(dāng)將DCC和N-羥苯并三唑用于偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)化合物5的產(chǎn)量較高(R.M.Kondratenko等，Russian J.Bioorg.Chem.，2004年，30(3)，1-8)。
所合成化合物的結(jié)構(gòu)通過IR，UV，NMR1H和13C光譜證實(shí)。
如上文實(shí)施例1所述檢測(cè)不同甘草皂苷衍生物在Vero細(xì)胞中抗SARS相關(guān)冠狀病毒的活性。不同甘草皂苷衍生物的活性如下表3中所示。
表3化合物在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中抗SARS相關(guān)冠狀病毒的活性。
6.3實(shí)施例3甘草皂苷和利巴韋林的聯(lián)合對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒的協(xié)同作用為了檢測(cè)甘草皂苷和利巴韋林的聯(lián)合對(duì)SARS相關(guān)冠狀病毒的作用，用SARS相關(guān)冠狀病毒B感染Vero細(xì)胞并分別用甘草皂苷、利巴韋林、以及甘草皂苷和利巴韋林的聯(lián)合進(jìn)行處理。如文獻(xiàn)所述從感染了SARS相關(guān)冠狀病毒的患者樣品中獲取SARS相關(guān)冠狀病毒Drosten等，2003年，New England Journal of Medicine 348(20)1967-1976，將其完整收入本文作為參考。未處理的細(xì)胞用作對(duì)照。隨后，在感染72小時(shí)后用60份甲醇和40份丙酮固定細(xì)胞。用過氧化物酶染色探測(cè)SARS患者血清中的病毒。結(jié)果如圖2所示。圖2(A)顯示未處理的受感染細(xì)胞；圖2(B)顯示用50mg/L利巴韋林處理的受感染細(xì)胞；圖2(C)顯示用100mg/L甘草皂苷處理的受感染細(xì)胞；而圖2(D)顯示用50mg/L利巴韋林和100mg/L甘草皂苷處理的受感染細(xì)胞。
利巴韋林和甘草皂苷之間的協(xié)同作用使得所使用的兩種化合物的濃度均較低。使用較低濃度的利巴韋林尤其有利，因?yàn)橐阎晚f林在較高濃度時(shí)是有毒的。
6.4實(shí)施例4甘草皂苷衍生物的抗貓傳染性腹膜炎病毒和抗可傳染腸胃炎病毒活性介紹冠狀病毒和動(dòng)脈炎病毒感染包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的多個(gè)種屬，所引起的疾病范圍包括從腦炎到腸炎(Perlman S.，冠狀病毒所誘發(fā)傳染病的發(fā)病機(jī)理。病理學(xué)和免疫學(xué)綜述。Adv Exp Med Biol.1998；440503-13)。這些病毒中有些感染家畜并造成明顯的發(fā)病率和死亡率，導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失。諸如可傳染腸胃炎病毒(TGEV)、豬呼吸道和生殖道病毒、以及傳染性支氣管炎病毒等病原體都包括在此范圍內(nèi)。貓冠狀病毒(FECV)通常不會(huì)引起高死亡率的感染，但在個(gè)別情況下，病毒突變成毒性更高的狀態(tài)。貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)在年輕的貓中引起嚴(yán)重疾病。此疾病大多屬于免疫病理學(xué)且被認(rèn)為是冠狀病毒研究的主要目標(biāo)。
材料和方法所有冠狀病毒和貓腎細(xì)胞系均由維也納獸醫(yī)大學(xué)的Unger博士惠贈(zèng)。將1×106個(gè)CRFK細(xì)胞(ATCC CCL-94)接種于裝有MEM(+10％FCS，+1％非基本AS，+AB)的96孔板中。24小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)用無FCS的MEM中的50ul FipV(貓傳染性腹膜炎病毒)和TGEV(可傳染胃腸炎病毒)感染細(xì)胞。在施加甘草皂苷衍生物之前將細(xì)胞于室溫放置30分鐘。
加入未感染的細(xì)胞以及用對(duì)照物質(zhì)處理的細(xì)胞作為參照。將所述物質(zhì)以1000uM起始的不同濃度稀釋于96孔板中并將50ul轉(zhuǎn)移至檢測(cè)平板中。將細(xì)胞于37℃保溫過夜。48小時(shí)后通過顯微鏡觀察確定CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))。用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，例如細(xì)胞滴定96Aqueous增殖測(cè)定法(Promega)。
結(jié)果甘草皂苷單銨鹽和甘草皂苷衍生化合物5的FipV和TFEV EC50值分別如表4中所示。在低于指定濃度的濃度觀察到部分抑制。此外，用標(biāo)準(zhǔn)的TCID50測(cè)定法滴定用GA或GA+M-21-1(met)處理的受感染細(xì)胞的上清液。對(duì)于FipV和TGEV而言，化合物5在100μM至500μM范圍內(nèi)的所有檢測(cè)濃度均觀察到將病毒復(fù)制顯著減少了超過一個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)于FipV和TGEV而言，當(dāng)甘草皂苷濃度500μM時(shí)病毒復(fù)制均顯著減少。
表4
結(jié)論甘草皂苷單銨鹽和甘草皂苷衍生化合物5不僅以劑量依賴的形式保護(hù)細(xì)胞免于病毒誘發(fā)的死亡，還抑制了FipV和TGEV在CRFK細(xì)胞中的病毒復(fù)制。因此，甘草皂苷單銨基鹽和甘草皂苷衍生化合物5對(duì)于生產(chǎn)針對(duì)由所述冠狀病毒引起的疾病的獸醫(yī)用藥是有用的。
等同物本發(fā)明并不限于實(shí)施例中所公布的具體實(shí)施方案的范圍，這些實(shí)施例只是用于說明本發(fā)明的一些方面，而且任何實(shí)施方案在本發(fā)明范圍內(nèi)所起的作用都是同等的。確實(shí)，除了本文的顯示和描述以外，還有多種有關(guān)本發(fā)明的修改方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并且也認(rèn)為屬于所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文引用了一些參考文獻(xiàn)，將它們完整公開書全文收入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.治療SARS相關(guān)冠狀病毒感染或改善其一種或多種癥狀的方法，所述方法包括對(duì)感染了SARS相關(guān)冠狀病毒的人施用治療有效量的甘草皂苷或其衍生物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中甘草皂苷的衍生物是通式I的化合物 其中R1、R2、和R3獨(dú)立地是-OH、5，6或7元雜環(huán)、-甘氨酸-亮氨酸、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中R1、R2、和R3各自是
4.抑制或減少SARS相關(guān)冠狀病毒復(fù)制的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸有效量的甘草皂苷或其衍生物。
5.抑制或減少SARS相關(guān)冠狀病毒粒子產(chǎn)生的方法，所述方法包括使細(xì)胞接觸有效量的甘草皂苷或其衍生物。
6.權(quán)利要求1、2、3、4、或5的方法，其中甘草皂苷或其衍生物是純化的。
7.權(quán)利要求1、4、或5的方法，其中甘草皂苷衍生物是18β-甘草酸。
8.權(quán)利要求1的方法，其中感染了SARS相關(guān)冠狀病毒的人是老年人、嬰幼兒、或無免疫應(yīng)答的人。
9.權(quán)利要求1的方法，還包括施用治療有效量的不同于甘草皂苷或其衍生物的抗病毒劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中不同于甘草皂苷的抗病毒劑是利巴韋林。
11.預(yù)防SARS相關(guān)冠狀病毒感染的方法，所述方法包括對(duì)有需要的人施用預(yù)防有效量的甘草皂苷或其衍生物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中甘草皂苷或其衍生物是純化的。
13.權(quán)利要求11的方法，其中受試者曾經(jīng)暴露于SARS相關(guān)冠狀病毒感染。
14.權(quán)利要求11的方法，其中甘草皂苷衍生物是18β-甘草酸。
15.通式I的化合物 或其藥用可接受鹽，其中R1、R2、和R3是N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R4不是噻唑、尿嘧啶或
16.通式I的化合物 或其藥用可接受鹽，其中R1和R2中的一個(gè)是 而R3及R1和R2中的另一個(gè)獨(dú)立地是-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、氨基酸、肽、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
17.通式I的化合物 或其藥用可接受鹽，其中R1、R2、和R3中的一個(gè)是氨基酸或肽，而R1、R2、和R3中的另兩個(gè)獨(dú)立地是-OH、-OCH3、-NH-NH2、-NHCH(COOH)CH2SCH2C6H5、5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)、-N(H)R4，其中R4是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)。
18.通式I的化合物 或其藥用可接受鹽，其中R1、R2和R3是
19.通式I的化合物 或其藥用可接受鹽，其中R1、R2、和R3獨(dú)立地是5，6或7元雜環(huán)(取代或未取代的)，附帶條件是R1、R2和R3不全是脯氨酸。
20.治療SARS相關(guān)冠狀病毒感染或改善其一種或多種癥狀的方法，所述方法包括對(duì)感染了SARS相關(guān)冠狀病毒的人施用治療有效量的權(quán)利要求15-19任一項(xiàng)的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于預(yù)防、治療、處理、或改善病毒感染特別是嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的方法。更具體的說，本發(fā)明提供了通過施用甘草皂苷和/或其衍生物來預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法。本發(fā)明還提供了通過施用甘草皂苷和/或其衍生物并聯(lián)合甘草皂苷或其衍生物以外的預(yù)防劑或治療劑來預(yù)防、治療、處理、或改善SARS相關(guān)冠狀病毒感染或其一種或多種癥狀的方法。
文檔編號(hào)C07D309/10GK1838947SQ200480019031
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2004年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者J·希納特爾, H·W·德爾, G·胡佛, M·米歇埃里斯 申請(qǐng)人:約翰沃爾夫?qū)璧麓髮W(xué)