專(zhuān)利名稱(chēng)：封閉效率提高的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及根據(jù)氨基酸序列信息篩選有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或新型部分序列的候選蛋白質(zhì)的方法，本發(fā)明還涉及通過(guò)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列從而提高了封閉效率的蛋白質(zhì)。此外，還涉及含有該蛋白質(zhì)的封閉試劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、折疊輔助劑、重折疊輔助劑、醫(yī)用敷料。本發(fā)明能夠增進(jìn)可以在大腸桿菌中大量表達(dá)的蛋白質(zhì)的封閉效率，對(duì)于通過(guò)重組方法大量生產(chǎn)封閉效率優(yōu)越的蛋白質(zhì)是有用的。
背景技術(shù)：
以往在免疫測(cè)定等技術(shù)中使用的封閉劑，大多一直采用從生物體成分中直接提取的蛋白質(zhì)。特別是長(zhǎng)期廣泛使用來(lái)自牛的清蛋白和酪蛋白等。但是，由于近年來(lái)瘋牛病等問(wèn)題，這些蛋白的使用受到了諸多限制。另一方面，利用重組體制備該類(lèi)物質(zhì)的方法，其優(yōu)點(diǎn)是可以排除病原體(物質(zhì))，但由于大量生產(chǎn)性方面等存在問(wèn)題而很少達(dá)到實(shí)用技術(shù)水平。
因此，試探采用來(lái)自大腸桿菌等的蛋白質(zhì)作為替代蛋白質(zhì)使用，從大量生產(chǎn)性方面來(lái)看可以認(rèn)為是合適的。然而，可以大量表達(dá)的蛋白質(zhì)不一定就有很好的封閉效果，所以必須找到能夠用重組體生產(chǎn)的封閉效果好的蛋白質(zhì)。
近年來(lái)，盡管已經(jīng)查明了各種生物的基因序列，但根據(jù)預(yù)測(cè)的氨基酸序列找到封閉效果好的蛋白質(zhì)的規(guī)律尚未掌握，看來(lái)要找到該類(lèi)蛋白質(zhì)需要付出大量的工作。
根據(jù)這樣的理由，需要有能夠用重組體大量生產(chǎn)的封閉效果好的替代蛋白質(zhì)。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示封閉效率測(cè)定概念的圖。
圖2表示蛋白質(zhì)的兩分法的圖。
圖3表示具有封閉能力的蛋白質(zhì)的封閉機(jī)制的圖。
圖4表示DnaK384-607的立體結(jié)構(gòu)的圖。β片部分相當(dāng)于N末端，α螺旋部分相當(dāng)于C末端。
圖5表示各種DnaK變異體顯示的封閉效率的圖。圖5中，空白無(wú)封閉效果384-638DnaK384-638384-607DnaK384-607384-578DnaK384-578；除去了α螺旋的一部分結(jié)構(gòu)的變異體384-561DnaK384-561；除去了α螺旋的大約一半結(jié)構(gòu)的變異體508-607DnaK508-607；除去了β片部分的結(jié)構(gòu)變異體(由α螺旋構(gòu)成)525-607DnaK525-607；除去了β片部分和α螺旋的一部分結(jié)構(gòu)的變異體(由α螺旋構(gòu)成)BSABSA級(jí)分V圖6表示大腸桿菌DnaK蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、以及制備成的變異體的結(jié)構(gòu)的圖。
圖7表示DnaK 381-553的立體結(jié)構(gòu)的圖。
圖8表示疏水域發(fā)生改變的蛋白質(zhì)的封閉機(jī)制的圖。
圖9表示各種DnaK變異體顯示的封閉效率的圖。
384-607DnaK384-607384-607(VAV)DnaK384-607(D479V，D481V)419-607DnaK 419-607
BSABSA級(jí)分V空白無(wú)封閉效果圖10表示DnaK變異體濃度和封閉效率相關(guān)性的圖。
圖11表示DnaK變異體的封閉速度的圖。
圖12表示DnaK變異體在酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)的封閉中的應(yīng)用的圖。
圖13表示頻繁封閉用蛋白質(zhì)和疏水性高的蛋白質(zhì)的親水性與疏水性氨基酸的含有率。
圖14表示BSA、α酪蛋白、脂肪酶、DnaK384-607的N末端側(cè)與C末端側(cè)含有的氨基酸的特征。 表示N末端側(cè)與C末端側(cè)的親水疏水率的差的絕對(duì)值。
圖15表示沒(méi)有組氨酸標(biāo)記(天然)的DnaK片段的封閉效果的比較。調(diào)整BSA(級(jí)分V)的濃度為10mg/ml，天然的DnaK419-607片段的濃度為0.5mg/ml，與其在高濃度下進(jìn)行比較。另外，調(diào)整BSA(級(jí)分V)濃度為2mg/ml，天然的DnaK419-607片段的濃度為0.1mg/ml，與其在低濃度下進(jìn)行比較。
圖16圖示圖15中高濃度的數(shù)據(jù)。
圖17圖示圖15中低濃度的數(shù)據(jù)。
發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的目的是提供根據(jù)氨基酸序列簡(jiǎn)便地找到有封閉能力的蛋白質(zhì)的方法，同時(shí)提供借助大腸桿菌等細(xì)菌能大量表達(dá)，而且由于改變了氨基酸序列而封閉效率提高的蛋白質(zhì)。
在上述背景下，通過(guò)精心研究，發(fā)現(xiàn)了與有封閉能力的蛋白質(zhì)的特征氨基酸序列相關(guān)的性質(zhì)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)改變這樣發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列能夠顯著增進(jìn)其封閉效率，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明由以下諸部分組成。
(1)根據(jù)氨基酸序列信息篩選有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列的候選蛋白質(zhì)的方法，篩選滿足以下條件的蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)A.將蛋白質(zhì)的氨基酸序列一分為二，根據(jù)各自的親水性氨基酸(D、E、K、H、R、Y)和疏水性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W、P)的含有率用下式計(jì)算出的一分為二的各部分中親水/疏水率之差的絕對(duì)值為0.1以上；(親水/疏水率)＝(親水性氨基酸含有率)/(疏水性氨基酸含有率)B.親水性部分(親水/疏水率高的一方的值)為0.5以上；C.由超過(guò)100個(gè)氨基酸殘基組成。
(2)用(1)所述方法篩選到的有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列的候選蛋白質(zhì)，其可以通過(guò)下述D的解析工序獲得，并滿足下述E的條件D.1.聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分別加入滿足上述1的條件的候選蛋白質(zhì)(0.5～1mg/ml用20mM Tris-HCl(pH7.0)稀釋)以及同樣制備的牛血清蛋白(級(jí)分V)，在2℃～10℃封閉4～5小時(shí)，將液體丟棄的工序；2.加入用PBS(-)稀釋25～100倍的正常人血清，在37℃放置1小時(shí)后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；3.使用經(jīng)酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，通過(guò)使用顯色法的比色法比較非特異吸附在板上的IgG量的工序；E.候選蛋白質(zhì)的顯色是牛血清蛋白顯色的2.5倍以下。
(3)用(1)所述方法篩選到的有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列的候選蛋白質(zhì)，其可以通過(guò)下述F的解析工序獲得，并滿足下述G的條件D.1.將來(lái)自西洋辣根的標(biāo)記用過(guò)氧化物酶溶解到候選蛋白質(zhì)溶液(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀釋)以及同樣制備的牛血清蛋白(級(jí)分V)中，使其濃度為0.05mg/ml的工序；2.將上述稀釋液分配到聚苯乙烯制96孔微型板中的工序；3.在25℃放置1小時(shí)后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；4.加入四甲基聯(lián)苯胺溶液，37℃保溫后，加入1N硫酸停止反應(yīng)并使其顯色的工序；5.通過(guò)微型板讀數(shù)器測(cè)定顯色的工序；G候選蛋白質(zhì)的測(cè)定值為牛血清蛋白顯色的2.5倍以下。
(4)用(1)所述方法篩選到的有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)，其可以通過(guò)下述H的解析工序獲得，并滿足下述I的條件H.1.在聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分別加入滿足上述1的條件的候選蛋白質(zhì)(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀釋)以及同樣制備的牛血清蛋白(級(jí)分V)，在2℃～10℃封閉4～5小時(shí)，將液體丟棄的工序；2.加入配制成濃度為0.05mg/ml的過(guò)氧化物酶溶液，37℃放置1小時(shí)后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；3.25℃放置1小時(shí)后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；4.加入四甲基聯(lián)苯胺溶液，37℃保溫后，加入1N硫酸停止反應(yīng)并使其顯色的工序；5.通過(guò)微型板讀數(shù)器測(cè)定顯色的工序；I.候選蛋白質(zhì)的測(cè)定值為牛血清蛋白顯色的2.5倍以下。
(5)通過(guò)滿足(1)所述條件A、B、C的蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列的改變而獲得的封閉效率提高的新型蛋白質(zhì)。
(6)上述(5)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，借助氨基酸置換、減除、插入改變了氨基酸序列。
(7)上述(5)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，來(lái)自原核生物或真核生物。
(8)封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，來(lái)自“HSP70家族蛋白質(zhì)”。
(9)上述(8)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，來(lái)自DnaK蛋白質(zhì)。
(10)上述(8)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，是除去了DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列而得到的蛋白質(zhì)。
(11)上述(8)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，是除去了DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列而得到的蛋白質(zhì)，并且從N末端至少到第387個(gè)，至多到第472個(gè)氨基酸序列被除去了。
(12)上述(8)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，是除去了DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列而得到的蛋白質(zhì)，并且從N末端至少到第387個(gè)，至多到第418個(gè)氨基酸序列被除去了。
(13)上述(8)所述的蛋白質(zhì)，由DnaK蛋白質(zhì)的第419～607個(gè)氨基酸序列組成。
(14)上述(8)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白質(zhì)的一部分親水性氨基酸被置換成疏水性氨基酸。
(15)上述(8)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其為ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列被除去的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置換成了纈氨酸。
(16)上述(8)所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其由DnaK蛋白質(zhì)的第384～607氨基酸序列組成，并且氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置換成了纈氨酸。
(17)具有一個(gè)以上親水域和一個(gè)以上疏水域的封閉用蛋白質(zhì)，其中疏水域可以吸附在器壁上，親水域可以覆蓋吸附在器壁上的疏水域。
(18)被改變了的蛋白質(zhì)，其特征在于，封閉速度比BSA提高。
(19)上述(18)所述的被改變了的蛋白質(zhì)，其特征在于，在3小時(shí)封閉中，在調(diào)整蛋白質(zhì)量使得顯示與BSA同等的封閉效率的條件下，小于10分鐘的封閉能力比BSA優(yōu)良。
(20)上述(2)～(19)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有標(biāo)記序列。
(21)上述(20)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，標(biāo)記序列從組氨酸標(biāo)記、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)記、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記、Flag標(biāo)記、Myc標(biāo)記、串連型親和純化標(biāo)記中選擇。
(22)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，用原核生物生產(chǎn)上述(2)～(21)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
(23)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，用大腸桿菌生產(chǎn)上述(2)～(21)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
(24)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法生產(chǎn)上述(2)～(21)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
(25)上述(2)～(21)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的提純方法，其特征在于，經(jīng)過(guò)加熱工序。
(26)將上述(2)～(21)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在封閉、穩(wěn)定、賦形、折疊輔助、重折疊輔助、包膜、醫(yī)療應(yīng)用中使用的方法。
(27)封閉試劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、折疊輔助劑、重折疊輔助劑、包膜劑或醫(yī)療用包膜劑，含有上述(2)～(21)任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本文所述的封閉過(guò)程，是指阻礙成分非特異地吸附到容器或載體上，特別是阻礙蛋白質(zhì)非特異地吸附到塑料等樹(shù)脂上。在各種測(cè)定中，由于測(cè)定的對(duì)照成分非特異地吸附到容器壁上，作為背景而阻礙測(cè)定，因而造成問(wèn)題。特別是在免疫學(xué)測(cè)定中，抗體在聚苯乙烯板上的吸附顯著，通常廣泛采用預(yù)先加入容易吸附在樹(shù)脂上的蛋白質(zhì)以阻礙抗體非特異吸附的操作，即封閉操作。在免疫測(cè)定中，由于必須使蛋白質(zhì)物理吸附到器壁上，所以廣泛采用容易吸附蛋白質(zhì)的聚苯乙烯等樹(shù)脂制成的板，但由于附加成分的吸附顯著，因而現(xiàn)實(shí)中常常需要有更好的封閉劑。此外，臨床上使用的診斷藥物中，也多發(fā)生診斷用酶非特異吸附在自動(dòng)分析儀的小池上的問(wèn)題。
本發(fā)明主要考慮到免疫學(xué)測(cè)定，通過(guò)測(cè)定已知作為最顯著的非特異吸附的例子的人血清中的IgG在聚苯乙烯板上的非特異吸附，測(cè)定封閉效果。即測(cè)定由以下工序組成。
(1)在聚苯乙烯制96孔板上加入要研究其封閉能力的蛋白質(zhì)溶液，靜置一定時(shí)間，封閉板。
(2)除去(1)中的液體，加入稀釋了的人血清，保溫。
(3)清洗板后，加入標(biāo)記的抗人IgG抗體，保溫。
(4)清洗板后，用比色法比較非特異結(jié)合的IgG量。
詳細(xì)方法見(jiàn)下述，在進(jìn)行本發(fā)明時(shí)該方法非常有效。本方法的概述如圖1所示。
以往廣泛使用牛血清蛋白(BSA)或牛乳中的酪蛋白等作為封閉試劑。但是，這種高封閉能力來(lái)自蛋白質(zhì)的何種性質(zhì)，還沒(méi)有從理論上作出解釋?zhuān)话阏J(rèn)為是由于其疏水性。
為此，首先以研究疏水性高的蛋白質(zhì)是否具備封閉能力為目的，采用了來(lái)自已知疏水性氨基酸含量高的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的脂肪酶作為封閉劑，考查其封閉能力。脂肪酶在臨床檢驗(yàn)中廣泛使用，但已知它們?cè)诰郾揭蚁┍砻嫖侥芰Ω叨跍y(cè)定時(shí)因吸附在小池上而會(huì)帶來(lái)問(wèn)題。不過(guò)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幾乎看不出有封閉效果。圖13表示了各種蛋白質(zhì)中親水性氨基酸和疏水性氨基酸的比率等，將它們加以比較，可知BSA和酪蛋白的疏水性比脂肪酶的疏水性要低。從這個(gè)事實(shí)可以研究的事項(xiàng)是，蛋白質(zhì)因其疏水性而發(fā)生吸附的現(xiàn)象與封閉能力有關(guān)系，然而并非完全如此。推測(cè)脂肪酶沒(méi)有表現(xiàn)封閉能力的原因，是由于吸附在器壁上的脂肪酶上蛋白質(zhì)非特異地吸附而造成的。
此處所謂親水性氨基酸、疏水性氨基酸，不同教科書(shū)有不同的定義，本發(fā)明中的定義是，親水性氨基酸指天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸。疏水性氨基酸則為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。
本發(fā)明中將天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸定義為親水性氨基酸。另外，將甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸定義為疏水性氨基酸，親水性氨基酸中，組氨酸和酪氨酸，特別是酪氨酸的親水性低；疏水性氨基酸中，甘氨酸和丙氨酸，特別是丙氨酸的疏水性低，為了更嚴(yán)密地進(jìn)行預(yù)測(cè)，將酪氨酸和甘氨酸排除進(jìn)行計(jì)算，更理想的是，將組氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸都排除，可以得到較好的計(jì)算結(jié)果。另外，在后述的封閉能力的改變中，想法中優(yōu)選用親水性、疏水性的強(qiáng)弱進(jìn)行改變。
然后，由各種片段計(jì)算各氨基酸的含有率。結(jié)果，證明了在通過(guò)將顯示封閉能力的BSA(沒(méi)有信號(hào)肽)和來(lái)源于牛的α酪蛋白(沒(méi)有信號(hào)肽)等的氨基酸序列一分為二而得到的各部分，例如N末端側(cè)和C末端側(cè)，親水性氨基酸含有率和疏水性氨基酸含有率的趨勢(shì)是不同的(14)。在本發(fā)明中，親水性氨基酸和疏水性氨基酸含有率的比值，方便地定義為“親水/疏水率”。已知BSA的N末端側(cè)的親水/疏水率是1.00，而C末端側(cè)為0.83，有0.17的差異。α酪蛋白N末端側(cè)親水/疏水率是0.88，而C末端側(cè)0.64，有0.24的差異。另一方面，不表現(xiàn)封閉能力的來(lái)自假單胞菌(Pseudomonas)的脂肪酶中N末端側(cè)是0.39，而C末端側(cè)為0.44，差異是0.05，也小于0.1。根據(jù)這些考查結(jié)果，推測(cè)為了表現(xiàn)封閉能力，在蛋白質(zhì)分子中除比較疏水的區(qū)域之外，親水性領(lǐng)域也是必要的。
在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，親水性部分、疏水性部分和全長(zhǎng)的親水/疏水率優(yōu)選以下范圍。
親水性部分的親水/疏水率是0.5～2.0，更優(yōu)選為0.7～1.7，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8～1.5。
疏水性部分的親水/疏水率是0.2～1.1，更優(yōu)選為0.3～1.0，進(jìn)一步優(yōu)選為0.4～0.9。
整個(gè)蛋白質(zhì)分子的親水/疏水率是0.4～2.0，更優(yōu)選為0.5～1.5，進(jìn)一步優(yōu)選為0.6～1.0。
親水性部分和疏水性部分的親水/疏水率之差(絕對(duì)值)優(yōu)選是0.1～0.6，更優(yōu)選為0.15～0.5，進(jìn)一步優(yōu)選為0.15～0.4。
親水性部分和疏水性部分也可以均是一分為二的各部分，例如C末端側(cè)(或C末端側(cè))。
在本發(fā)明中，假定親水性部分和疏水性部分存在于被一分為二的各部分，例如C末端側(cè)或N末端側(cè)，但是，在N末端側(cè)或C末端側(cè)添加既非親水性又非疏水性的序列后的蛋白質(zhì)，只要有親水性部分和疏水性部分，就包含在本發(fā)明中。
此外，本發(fā)明還包含圖2所示的親水性部分-疏水性部分-親水性部分、疏水性部分-親水性部分-疏水性部分、以及親水性部分-疏水性部分-親水性部分-疏水性部分等各種順序的部分。
根據(jù)以上事實(shí)，估計(jì)是一種疏水部分(疏水域)吸附在器壁上，而親水部分(親水域)覆蓋在它上面的形態(tài)，整體來(lái)看，則是通過(guò)用親水部分(親水域)覆蓋器壁，從而進(jìn)行了封閉。其模式如圖3所示。脂肪酶不表現(xiàn)封閉能力的原因考慮是，雖然被吸附，但因?yàn)槲降牡鞍踪|(zhì)過(guò)于疏水，所以進(jìn)一步發(fā)生向該蛋白質(zhì)的非特異吸附。
吸附在器壁上的疏水性部分和覆蓋疏水性部分的親水性部分的比率，基于疏水性部分為1，則親水部分是0.3～10，優(yōu)選是0.5～5，更優(yōu)選是0.7～2。如果疏水性部分過(guò)大，則不能被親水性部分覆蓋，吸附在器壁上的疏水性部分上會(huì)進(jìn)一步吸附其它蛋白質(zhì)。而如果親水性部分過(guò)大，吸附在器壁上的疏水性部分面積過(guò)小，不能牢固吸附，從而使封閉效率降低。
此外，在本發(fā)明中，所謂“一分為二”，并不意味著全部序列被分為50％和50％，而是指分為疏水性部分和親水性部分兩部分。親水性部分和疏水性部分二者之一或二者都有多個(gè)的情況下，則多個(gè)存在的親水性部分/疏水性部分的親水/疏水率便取平均值計(jì)算。再者，親水性部分和疏水性部分各自具有成群的部分，優(yōu)選有域結(jié)構(gòu)，各部分占全部序列的20％以上，優(yōu)選30％以上，更優(yōu)選40％以上。不過(guò)在不知道蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或者預(yù)測(cè)困難的情況下，優(yōu)選把氨基酸序列區(qū)分為N末端側(cè)和C末端側(cè)兩部分進(jìn)行解析，這樣是有效的。
就圖14所見(jiàn)，親水域和疏水域之間親水/疏水率的差異在不同蛋白質(zhì)間有所波動(dòng)，看來(lái)僅僅靠這個(gè)差異值的大小可能并不詳細(xì)地反映封閉能力?？烧J(rèn)為其中因子之一是分子量。在本發(fā)明中，所謂“由多于100個(gè)殘基的氨基酸構(gòu)成”，意指整個(gè)氨基酸序列的氨基酸總數(shù)為100個(gè)以上的殘基。優(yōu)選由多于150個(gè)殘基的氨基酸構(gòu)成，更優(yōu)選由多于200個(gè)殘基的氨基酸構(gòu)成。同時(shí)，其上限優(yōu)選是2000個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選上限是1500個(gè)氨基酸殘基，進(jìn)一步優(yōu)選上限是1000個(gè)氨基酸殘基。親水性部分或親水域的氨基酸數(shù)目，優(yōu)選為30個(gè)以上氨基酸殘基，更優(yōu)選50個(gè)以上氨基酸殘基，進(jìn)一步優(yōu)選60個(gè)以上氨基酸殘基，特別優(yōu)選80個(gè)以上氨基酸殘基，另外，優(yōu)選1000個(gè)以下氨基酸殘基，更優(yōu)選500個(gè)以下氨基酸殘基。
疏水性部分或疏水域的氨基酸數(shù)目，優(yōu)選是30個(gè)以上氨基酸殘基，更優(yōu)選是50個(gè)以上氨基酸殘基，進(jìn)一步優(yōu)選是60個(gè)以上氨基酸殘基，特別優(yōu)選是80個(gè)以上氨基酸殘基，另外，優(yōu)選1000個(gè)以下氨基酸殘基，更優(yōu)選500個(gè)以下氨基酸殘基。
本文所謂的域，是指具有分子結(jié)構(gòu)上或功能上一個(gè)集中的區(qū)域，在本發(fā)明中，主要指具有結(jié)構(gòu)上集中的單位。
然后，我們采用單純的蛋白質(zhì)來(lái)驗(yàn)證這種假設(shè)是否正確。該實(shí)驗(yàn)中，采用了作為一種大腸桿菌熱激蛋白的HSP70(DnaK)的底物結(jié)合域。該蛋白質(zhì)(DnaK384-607)已經(jīng)NMR解析查明了它的結(jié)構(gòu)(圖4)，已知它由兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域(域)，即N末端側(cè)的β片區(qū)域(域)和C末端側(cè)的α螺旋區(qū)域(域)組成。還通過(guò)計(jì)算知道序列的N末端側(cè)的親水/疏水率為0.5，C末端側(cè)為0.89，二者之差高達(dá)0.39。
為此，首先確認(rèn)了該蛋白質(zhì)(DnaK384-607)表現(xiàn)了封閉能力，然后確認(rèn)了雖然還沒(méi)有達(dá)到BSA那樣的程度，但它有封閉能力(圖5)，從而說(shuō)明了本發(fā)明的方法是有效的。
其次，制備了DnaK384-607的各種缺失突變體，研究DnaK的何種結(jié)構(gòu)對(duì)封閉起重要作用。本次研究的變異體如圖6所示。所研究的蛋白質(zhì)，有DnaK384-638、DnaK508-607、DnaK384-578、DnaK384-561、DnaK508-607和DnaK525-607等5種變異體。這些蛋白質(zhì)都可以以大腸桿菌為宿主大量表達(dá)，可以在各蛋白質(zhì)的N末端連接組氨酸標(biāo)記進(jìn)行表達(dá)，用鎳螯合柱簡(jiǎn)單純化，即能用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用增加了組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，但由于標(biāo)記很小，其影響可以忽略。當(dāng)然，已確認(rèn)沒(méi)有標(biāo)記時(shí)也能得到同樣的效果(實(shí)施例7)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，被認(rèn)為是除去了α螺旋結(jié)構(gòu)的一部分而得到的DnaK384-578、DnaK384-561和除去了β片部分而只有α螺旋結(jié)構(gòu)的DnaK508-607和DnaK525-607的封閉效率明顯降低(圖5)。關(guān)于DnaK384-561，已通過(guò)NMR解析查明了與其接近的DnaK381-553的立體結(jié)構(gòu)(圖7)，據(jù)此類(lèi)推，可預(yù)測(cè)α螺旋結(jié)構(gòu)已被破壞。根據(jù)這些結(jié)果，可以得出以下啟示。即(1)有封閉能力的蛋白質(zhì)的親水部分的縮小或結(jié)構(gòu)破壞就會(huì)損害封閉能力。(2)僅僅親水性部分并不表現(xiàn)封閉能力。這看來(lái)是因?yàn)?，要發(fā)揮封閉能力，除疏水性部分以外，親水性部分也是重要的，如圖3所示，表現(xiàn)封閉能力的蛋白質(zhì)以疏水性部分吸附在板上，以親水性部分覆蓋在板表面，從而表現(xiàn)出封閉效果。預(yù)測(cè)該DnaK正好對(duì)應(yīng)于圖3的左圖。
已知變性或突變等一般會(huì)造成二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，蛋白質(zhì)的親水性會(huì)喪失，根據(jù)上述DnaK的實(shí)例也可以預(yù)料通過(guò)破壞親水域，不適合制備部分序列蛋白質(zhì)。與此相反，如圖8所示，看起來(lái)通過(guò)破壞疏水域，可以提高疏水性。
同時(shí)，在本發(fā)明中，看來(lái)域是重要的，必須有至少多于一個(gè)的結(jié)構(gòu)域。構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)域所需的100個(gè)氨基酸是一個(gè)粗略的標(biāo)準(zhǔn)。因此，本發(fā)明需要具有由至少多于100個(gè)氨基酸殘基組成，即多于一個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)這些事實(shí)，本發(fā)明提供一種根據(jù)氨基酸序列信息篩選有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)的方法。更具體而言，即滿足以下條件的蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)的篩選方法。
A將蛋白質(zhì)的氨基酸序列一分為二，根據(jù)各自的親水性氨基酸(D、E、K、H、R、Y)和疏水性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W、P)含有率使用下式計(jì)算出的一分為二的各部分中親水/疏水率之差的絕對(duì)值為0.1以上；(親水/疏水率)＝(親水性氨基酸含有率)/(疏水性氨基酸含有率)B親水性部分(親水/疏水率高的一方的值)為0.5以上；C由超過(guò)100個(gè)氨基酸殘基組成。
上述條件中，D表示天冬氨酸、E表示谷氨酸、K表示賴氨酸、H表示組氨酸、R表示精氨酸、Y表示酪氨酸、G表示甘氨酸、A表示丙氨酸、V表示纈氨酸、L表示亮氨酸、I表示異亮氨酸、M表示蛋氨酸、F表示苯丙氨酸、W表示色氨酸、P表示表示脯氨酸。教科書(shū)上關(guān)于親水性氨基酸和疏水性氨基酸的定義有各家之說(shuō)，在本發(fā)明中，將天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸定義為親水性氨基酸。同時(shí)將甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸定義為疏水性氨基酸。
本發(fā)明中所謂部分序列蛋白質(zhì)，表示由野生型蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，優(yōu)選具有多于一個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。
例如，將氨基酸序列分成N末端側(cè)和C末端側(cè)兩部分時(shí)，并不必須精確地二分，但優(yōu)選將兩方氨基酸的數(shù)目分割得大體相等。當(dāng)從氨基酸序列預(yù)測(cè)信號(hào)肽時(shí)，最好將該部分排除后再計(jì)算。實(shí)際上在本發(fā)明中，在BSA、α酪蛋白、脂肪酶中，都是使用除去了信號(hào)肽的成熟型的氨基酸序列來(lái)計(jì)算的。
此外，如圖2所示，也優(yōu)選使用分成N末端側(cè)和C末端側(cè)的二分法以外的分割方法。此時(shí)，該方法可以優(yōu)選應(yīng)用于立體結(jié)構(gòu)不清楚的蛋白質(zhì)和預(yù)測(cè)立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。
要根據(jù)氨基酸一級(jí)序列計(jì)算各種氨基酸含量，采用基因氨基酸序列解析軟件是有效的。對(duì)解析軟件并沒(méi)有特別指定，但本發(fā)明采用的是GENETYX(軟件開(kāi)發(fā)公司)。
再者，利用軟件的疏水性計(jì)算功能，將蛋白質(zhì)的疏水性和親水性加以圖形化，對(duì)于提高篩選作業(yè)的效率也是有效的。優(yōu)選采用hopp&woods的計(jì)算式。
另外，本發(fā)明是用上述方法根據(jù)氨基酸序列篩選到的有封閉能力的蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)，通過(guò)下述D的所述解析工序得到，并滿足E所述條件。
D1.聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分別加入滿足上述1的條件的候選蛋白質(zhì)(0.5～1mg/ml，用20mM Tris-HCl稀釋?zhuān)琾H7.0)以及同樣制備的牛血清蛋白(級(jí)分V)，在2℃～10℃封閉4～5小時(shí)，將液體丟棄的工序；2.加入用PBS(-)稀釋25～50倍的正常人血清，在37℃放置1小時(shí)后，用0.05％Tween 20清洗板的工序；3.使用經(jīng)酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，通過(guò)使用顯色法的比色法比較非特異吸附在板上的IgG量的工序；E候選蛋白質(zhì)的顯色是牛血清蛋白顯色的2.5倍以下，優(yōu)選2倍以下，更優(yōu)選1.5倍以下，進(jìn)一步優(yōu)選1.2倍以下，特別是1倍以下。
在此，以已知在塑料板上的非特異吸附顯著的人血清中的IgG的非特異吸附作為大致標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定封閉能力。這里所說(shuō)的聚苯乙烯免疫滴定板(96孔型)是免疫測(cè)定中通常使用的聚苯乙烯制96孔型的免疫滴定板。采用經(jīng)適當(dāng)方法純化的候選蛋白質(zhì)，將其最終濃度用20m M Tris-HCl(pH 7.0)稀釋為50～100mg/ml。同時(shí)也同樣制備牛血清蛋白(BSA)。BSA可以用SIGMA公司等出品的級(jí)分V。另外只要性能相同，不特別采用級(jí)分V也可以。2℃～8℃封閉4～5小時(shí)后，完全棄去液體，清洗并進(jìn)入下一步操作。
此處采用的人血清只要是由正常人分離的血清，則沒(méi)有特別限制，原液是高濃度的，因此最好用PBS(-)稀釋25～50倍后使用。血清中的IgG含量存在個(gè)體差異，因此稀釋率可以稍作變更。對(duì)板的非特異吸附在37℃進(jìn)行30分鐘。為了準(zhǔn)確測(cè)定此時(shí)加入的血清量，優(yōu)選最初加入量少于封閉的液量。例如，用100μl封閉時(shí)，加入50μl稀釋血清溶液。最后，精確進(jìn)行1小時(shí)反應(yīng)后，棄去液體，用充分量的0.05％Tween/PBS(-)清洗。清洗操作優(yōu)選進(jìn)行3次以上，更優(yōu)選進(jìn)行4次。清洗操作可以使用專(zhuān)用的洗板機(jī)。
然后，用適當(dāng)?shù)娜芤簩⒚笜?biāo)記的抗人IgG抗體稀釋到合適濃度，加入上述孔中。反應(yīng)時(shí)間以37℃1小時(shí)為宜?？贵w的稀釋優(yōu)選是通常免疫學(xué)檢測(cè)所采用的程度，并且優(yōu)選使用含有對(duì)抗體的稀釋適合的封閉劑(BSA或酪蛋白)溶液，因?yàn)闆](méi)有變動(dòng)，更優(yōu)選用0.01M磷酸緩沖液(pH7.4)、0.15M NaCl、0.5％酪蛋白。標(biāo)記用的酶，優(yōu)選用過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酯酶，特別優(yōu)選使用過(guò)氧化物酶。過(guò)氧化物酶用的顯色試劑，優(yōu)選采用四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ，即3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)。堿性磷酸酯酶的顯色底物可以采用WT-1。顯色時(shí)間希望是目標(biāo)孔的吸光度沒(méi)有失去定量性的程度(0.5～1.5)。要注意，超過(guò)定量范圍時(shí)，得不到正確的數(shù)據(jù)。全部操作中如果板不干燥，則不能取得正確數(shù)據(jù)。
如上操作獲得的數(shù)值越低表示封閉效率越高，在本發(fā)明中，顯示BSA的數(shù)值的2.5倍以下的值時(shí)，判定為有封閉能力。所以，本發(fā)明的有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)滿足權(quán)利請(qǐng)求1所述條件，而且本次測(cè)定得到顯示BSA的數(shù)值的2.5倍以下的值，即有封閉能力的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例7所示方法可以作為本測(cè)定的替代方法。這種方法是將逐次稀釋的過(guò)氧化物酶溶解在候選蛋白質(zhì)溶液中，供給固相中，令其吸附一定時(shí)間后，測(cè)定過(guò)氧化物酶的非特異吸附。
確定被吸附的過(guò)氧化物酶的方法同上，優(yōu)選使用四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ，即3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)的顯色法。本次測(cè)定中，也以顯示BSA的值的2.5倍以下的值作為為有封閉能力的指標(biāo)。另外，同樣地，優(yōu)選在預(yù)先封閉的固相上加入稀釋了的過(guò)氧化物酶溶液，測(cè)定非特異吸附。此時(shí)也以顯示BSA的值的2.5倍以下的值作為有封閉能力的指標(biāo)。所用過(guò)氧化物酶溶液的濃度，優(yōu)選使用0.05mg/ml，但應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整后使用，以便可以在常規(guī)范圍內(nèi)測(cè)定，由此可以獲得更正確的評(píng)價(jià)。過(guò)氧化物酶的稀釋優(yōu)選用PBS(-)進(jìn)行，但并不特別限定。
因此，本發(fā)明優(yōu)選具有多于一個(gè)域結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，而象該例一樣，特別是疏水側(cè)的域中在兩個(gè)域中缺少一個(gè)域結(jié)構(gòu)的一部分也可以。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目為100個(gè)以上，優(yōu)選150個(gè)以上，更優(yōu)選180個(gè)以上。
另外，本發(fā)明是新型蛋白質(zhì)，它是通過(guò)改變符合上述1的條件的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進(jìn)一步提高了蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)的封閉效率的蛋白質(zhì)。所謂新型，是在氨基酸的改變水平上稱(chēng)為新型，也可以是已知蛋白質(zhì)。而對(duì)于部分序列蛋白質(zhì)，新型應(yīng)視為具有迄今未知的部分序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，氨基酸序列的改變是通過(guò)氨基酸置換、消除或插入的任一種進(jìn)行，或者也可以其組合進(jìn)行。作為變異的方向性，無(wú)論是進(jìn)一步增加疏水區(qū)域的疏水性的變異或進(jìn)一步增加親水區(qū)域的親水性的變異都是有效的，可以適合使用。另外，為了使蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，氨基酸序列的插入或消除等也是有效的，還可考慮采用使埋藏在親水區(qū)域的疏水區(qū)域暴露于蛋白質(zhì)分子表面等方法。另一方面，如上述實(shí)例所示，破壞親水域的結(jié)構(gòu)而改變氨基酸是不優(yōu)選的。
被改變的蛋白質(zhì)可來(lái)源于原核生物，也可來(lái)源于真核生物，考慮到用大腸桿菌等大量制備，優(yōu)選使用來(lái)源于原核生物的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選采用來(lái)源于大腸桿菌的蛋白質(zhì)。采用的蛋白質(zhì)也可以是域等的部分結(jié)構(gòu)體，寧愿優(yōu)選采用它。
特別是封閉劑經(jīng)常與酶等混合后用作穩(wěn)定劑或賦形劑，沒(méi)有特別酶活性功能的蛋白質(zhì)適合本發(fā)明。另外，除去了具有酶活性的域的蛋白質(zhì)等也優(yōu)選采用。
本發(fā)明優(yōu)選采用來(lái)源于HSP70家族蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌DnaK蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。另外，優(yōu)選地，優(yōu)選使用除去了ATPase域的HSP70家族的蛋白質(zhì)的底物結(jié)合域，更優(yōu)選采用除去了大腸桿菌的ATPase域的DnaK蛋白質(zhì)的底物結(jié)合域。DnaK蛋白質(zhì)的底物結(jié)合域，已經(jīng)作為例子在上面介紹過(guò)。
本發(fā)明采用的屬于HSP70家族的蛋白質(zhì)，并無(wú)特別指定，從大腸桿菌的DnaK、存在于酵母菌細(xì)胞質(zhì)中的Ssa1p、存在于酵母菌線粒體中的Ssc1p、存在于酵母菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Kar2p、存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中的HSP70、存在于哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Bip、存在于哺乳動(dòng)物線粒體中的mHsp70、以及與熱激的有關(guān)無(wú)關(guān)而正常表達(dá)的HSP70的同源物HSC70等中選擇。已知HSP70家族中有多種同源物，上述幾種只是其中一部分。當(dāng)然，可以容易地預(yù)計(jì)上述列舉的以外的同源物也可以有同樣的效果。
由于對(duì)大腸桿菌DnaK的研究進(jìn)行得特別好，所以比較容易預(yù)測(cè)氨基酸改變等的效果。這種蛋白質(zhì)由638個(gè)氨基酸構(gòu)成，由從第1個(gè)到第385個(gè)氨基酸構(gòu)成的“ATPase(ATPase結(jié)合)域”和從第386到第638個(gè)氨基酸構(gòu)成的“底物結(jié)合域”組成(圖6)。序列編號(hào)1中示出了DnaK蛋白質(zhì)的序列；序列編號(hào)2中示出了基因序列。已知HSP70與新生多肽或部分折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)不能自發(fā)折疊的蛋白質(zhì)的重折疊，而且已知它們?cè)诘鞍踪|(zhì)合成的較前期起作用，所以可識(shí)別豐富的底物。
另外，已知DnaK的底物結(jié)合的區(qū)域本身具有促進(jìn)變性后的蛋白質(zhì)重折疊的作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)99，15398-15403)，考慮通過(guò)應(yīng)用這種分子，可以開(kāi)發(fā)各種應(yīng)用。
為了完成本發(fā)明，我們著眼于DnaK的底物結(jié)合域進(jìn)行了多方面的研究，根據(jù)這些研究，可以得到與封閉作用表達(dá)的機(jī)制有關(guān)的多方面的知識(shí)，并且完成了本發(fā)明。
首先，我們嘗試了通過(guò)在β片結(jié)構(gòu)部分上添加變異來(lái)提高其疏水性，從而制作封閉效率好的蛋白質(zhì)。該嘗試是指(1)通過(guò)除去β片N末端的一部分，使β片的更疏水的部分暴露出來(lái)(破壞β片結(jié)構(gòu)提高疏水性)，和(2)將β片上的親水性氨基酸置換成疏水性氨基酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除去了β片結(jié)構(gòu)的N末端部分的DnaK 419-607和將親水性氨基酸置換成了疏水性氨基酸的DnaK 384-607(D479V，D481V)，封閉效率顯著提高(圖9)。這一次，特別是在DnaK 419-607中觀察到封閉效率的顯著提高?？雌饋?lái)這種蛋白質(zhì)以圖8所示的形態(tài)表現(xiàn)出封閉能力。即由于改變了疏水域結(jié)構(gòu)，疏水域的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提高了疏水域的疏水性，這與封閉能力的提高相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明所謂的封閉能力的提高，是指通過(guò)對(duì)候選蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸序列置換、缺失或插入等，使得相對(duì)于原來(lái)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分序列封閉能力提高。
封閉能力的提高，優(yōu)選用上述2所述方法測(cè)定。另外，封閉能力的提高，有長(zhǎng)時(shí)間的封閉能力和短時(shí)間的封閉能力，兩者或兩者之一中封閉能力可以提高。
進(jìn)一步詳細(xì)考查DnaK 419-607封閉能力顯著提高的原因，推測(cè)其原因是通過(guò)除去了與DnaK底物結(jié)合域的コ字型結(jié)構(gòu)的絞鏈部分相鄰的β片部分，用于捕獲作為陪伴蛋白的底物的肽的富于疏水性的コ字型結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的一部分暴露于外側(cè)。
即，本發(fā)明是封閉效率提高的DnaK蛋白質(zhì)，其特征在于，從N末端開(kāi)始，至少到第387個(gè)，至多到第472個(gè)氨基酸序列被除去了。另外，本發(fā)明是封閉效率提高的DnaK蛋白質(zhì)，其特征在于，從N末端開(kāi)始，至少到第387個(gè)，至多到第418個(gè)氨基酸序列被除去了。更優(yōu)選由DnaK蛋白質(zhì)的第419到第607個(gè)氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明是封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，將除去了ATPase域或它的一部分而得到的DnaK蛋白質(zhì)的一部分親水性氨基酸置換成了疏水性氨基酸。更詳細(xì)地說(shuō)，是將除去了ATPase域或它的一部分而得到的DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列除去的封閉效率提高蛋白質(zhì)，其第479個(gè)和第481個(gè)氨基酸由天冬氨酸置換成了纈氨酸。更優(yōu)選使用由DnaK蛋白質(zhì)的第384到第607個(gè)氨基酸序列組成，第479個(gè)和第481個(gè)氨基酸由天冬氨酸置換成了纈氨酸的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中所謂的改變，是指借助候選蛋白質(zhì)的氨基酸置換、缺失或插入而改變了氨基酸的序列。對(duì)于這種改變，優(yōu)選通過(guò)在選擇候選蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分序列后進(jìn)行上述的考查，通過(guò)以(1)不破壞親水域和(2)使疏水域更具有疏水性等為意圖改變蛋白質(zhì)。另外，雖然在本發(fā)明中沒(méi)有敘述，但當(dāng)然也應(yīng)該考慮使親水域更具親水性。
另外，在本發(fā)明中，進(jìn)行關(guān)于封閉速度的研究，顯示了本發(fā)明的有用性。即測(cè)定了在5分鐘、10分鐘、30分鐘和3小時(shí)封閉時(shí)的封閉效率。結(jié)果得知，本次實(shí)驗(yàn)效果最顯著的DnaK 419-607其在約5分鐘的封閉效率是87.5％，而DnaK 384-638是58.8％。該速度比在3小時(shí)后表現(xiàn)同等封閉效果的BSA快，預(yù)測(cè)在非常早的階段發(fā)揮向聚苯乙烯板吸附的封閉效果。因此，使用本發(fā)明，有可能開(kāi)發(fā)出性能與常規(guī)的BSA效果同等或更好的新型封閉劑。
另外，本發(fā)明是具有一個(gè)以上親水性域和一個(gè)以上疏水性域的封閉用蛋白質(zhì)，疏水性域可以吸附在器壁上，親水性域可以覆蓋吸附在器壁上的疏水性域。此處所說(shuō)的域，優(yōu)選是由50個(gè)以上氨基酸組成的結(jié)構(gòu)氨基酸的簇，即使是一部分氨基酸缺失或添加，也視作域。
另外，本發(fā)明對(duì)于封閉速度也作了規(guī)定。即，改變了的蛋白質(zhì)，其特征在于，封閉速度比BSA提高。詳細(xì)而言，是一種改變了的蛋白質(zhì)，其特征在于，在對(duì)蛋白質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整使得在3小時(shí)的封閉中顯示出與BSA同等封閉效率的條件下，在小于10分鐘的封閉能力比BSA優(yōu)。此處所謂的改變，表示編碼野生型蛋白質(zhì)的基因序列通過(guò)氨基酸置換、消除或插入等而被變換了。評(píng)價(jià)方法并沒(méi)有特別限定，優(yōu)選采用實(shí)施例5和實(shí)施例7中所提供的方法，以IgG或過(guò)氧化物酶在聚苯乙烯板上的非特異吸附為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。在采用IgG進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法中，在進(jìn)行1～10分鐘，優(yōu)選2～10分鐘封閉后，加入用PBS(-)稀釋的人血清，37℃保溫60分鐘后，進(jìn)行清洗，使最適濃度的抗人IgG抗體(過(guò)氧化物酶結(jié)合)反應(yīng)，清洗后，用TMBZ顯色，由此測(cè)定非特異吸附的IgG量。另外，在采用過(guò)氧化物酶進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法中，先用來(lái)自西洋辣根的標(biāo)記用過(guò)氧化物酶(東洋紡織(公司)制PEO-131)溶解在待測(cè)定封閉能力的蛋白質(zhì)溶液中，使其濃度為2mg/ml。然后由同一溶液制作過(guò)氧化物酶溶解液的40～320倍的系列稀釋液，將各稀釋液100μl分配到96孔板的各個(gè)孔中。室溫放置1小時(shí)后，除去溶液，用含0.02％Tween20的PBS(-)緩沖液清洗。清洗操作反復(fù)進(jìn)行6次，然后除去清洗液。加入四甲基聯(lián)苯胺，在37℃精確保溫10分鐘后，加入1N硫酸停止反應(yīng)并使其顯色。用微型板讀數(shù)器在主波長(zhǎng)450nm副波長(zhǎng)650nm下測(cè)定顯色。詳情記載在實(shí)施例7中。另外，同樣地，在預(yù)先封閉的固相上添加稀釋的過(guò)氧化物酶溶液測(cè)定其非特異吸附也可以。此處所用的過(guò)氧化物酶溶液的濃度，優(yōu)選采用0.05mg/ml，但如果進(jìn)行調(diào)整使得可以在常規(guī)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，能夠更正確地評(píng)價(jià)。過(guò)氧化物酶的稀釋可以用PBS(-)進(jìn)行，但并非特別限定。
另外，在這個(gè)實(shí)施例中，使用0.7mg/ml的DnaK 419-607和3小時(shí)后顯示同等封閉能力的濃度為2.4mg/ml的BSA(級(jí)分V，SIGMA公司制，(商品編號(hào)A-4503))(蛋白質(zhì)量用Bradford法測(cè)定)。待測(cè)蛋白質(zhì)的量可以在用于測(cè)定封閉能力的常規(guī)范圍內(nèi)，但優(yōu)選在0.5～1mg范圍內(nèi)。本測(cè)定中使用的BSA的濃度，使用顯示與待測(cè)蛋白質(zhì)的第3小時(shí)的封閉效率同等的封閉效率的量，這需要事先對(duì)濃度加以研究。作為用于溶解這些蛋白質(zhì)的緩沖液，優(yōu)選采用20mM Tris-HCl(pH 7.0)或PBS(-)，但無(wú)特別限定。
本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段也可以具有標(biāo)記，實(shí)際上在研究中采用在氨基末端加上了組氨酸的那些進(jìn)行研究。作為標(biāo)記，可以采用組氨酸標(biāo)記、GST(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)記、MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)記、Flag標(biāo)記、Myc標(biāo)記、TAP(串連型親和純化標(biāo)記)中的任一種均可采用，根據(jù)需要也可以將各種蛋白質(zhì)加以融合后應(yīng)用。而且還可以在已知標(biāo)記上加入任意的氨基酸序列等。
另外，當(dāng)然也可以添加一般未知的標(biāo)記或任意氨基酸序列。具體而言，當(dāng)使用N末端側(cè)被去除的蛋白質(zhì)的部分序列時(shí)，當(dāng)然需要在N末端導(dǎo)入蛋氨酸殘基。另外，根據(jù)表達(dá)增加或限制酶的位點(diǎn)的關(guān)系，也考慮幾個(gè)氨基酸的附加。例如在實(shí)施例7中的DnaK 419-607的N末端，加上了MRGS的4個(gè)氨基酸。當(dāng)然作為與任意蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)表達(dá)也可以。待添加的位置則既可以是N末端側(cè)也可以是C末端側(cè)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)方法并無(wú)特別限制，但優(yōu)選使用原核生物表達(dá)的方法，進(jìn)一步優(yōu)選用大腸桿菌表達(dá)的方法。另外，表達(dá)載體也沒(méi)有特別限制，可以使用一般用于表達(dá)的載體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的純化方法，除采用上述標(biāo)記的純化方法以外，將粗純化溶液加熱到適當(dāng)溫度，再將其離心上清液加以提純，有時(shí)是效率好的純化方法。加熱溫度優(yōu)選50℃以上，更優(yōu)選70℃以上。本實(shí)驗(yàn)采用的DnaK的底物結(jié)合域?qū)嵊锌剐裕?0℃30分鐘的條件下未發(fā)現(xiàn)凝集，并確認(rèn)蛋白質(zhì)仍保留在離心上清部分中。因此，在純化時(shí)，通過(guò)用柱色譜等方法對(duì)加熱的離心上清液進(jìn)行純化，可以簡(jiǎn)單地將蛋白質(zhì)純化，是非常經(jīng)濟(jì)的方法。此外，經(jīng)過(guò)加熱工序，也可以預(yù)料共存的酶類(lèi)已經(jīng)失活。
本發(fā)明的封閉效率提高的蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于封閉劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、重折疊輔助劑、包膜劑、醫(yī)用敷料等。特別地，對(duì)于其作為利用免疫反應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)中的封閉劑的期待很大，預(yù)計(jì)可以用于ELISA、免疫組織染色、蛋白質(zhì)印跡等。實(shí)際上，在完成本發(fā)明時(shí)，已經(jīng)考查了它在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè))中應(yīng)用的可能性，得到了良好的結(jié)果(圖12)。
本發(fā)明的實(shí)施形式之一是含有DnaK 419-607的封閉劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、重折疊輔助劑。
本發(fā)明的實(shí)施形式之一是含有DnaK 384-607(D479V、D481V)的封閉劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、重折疊輔助劑。
通過(guò)以下所示本發(fā)明的實(shí)施例，將更進(jìn)一步表明本發(fā)明的效果。
實(shí)施例1 候選蛋白質(zhì)的篩選為了從氨基酸序列篩選候選蛋白質(zhì)，主要使用核酸氨基酸序列解析軟件GENETYX(軟件開(kāi)發(fā)公司)進(jìn)行。此軟件有根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸一級(jí)序列計(jì)算出親水性氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基數(shù)目的功能，很方便。用GENETYX計(jì)算出已經(jīng)查明有各種封閉能力的蛋白質(zhì)，以及來(lái)自大腸桿菌的蛋白質(zhì)或部分序列的N末端側(cè)的一半和C末端側(cè)一半序列所含有的親水性氨基酸和疏水性氨基酸的數(shù)目，將親水性氨基酸含有率、疏水性氨基酸含有率、親水/疏水率，以及二分的各自的親水/疏水率之差的絕對(duì)值等匯總在圖13和圖14中。依從GENETYX的定義，親水性氨基酸指天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸。疏水性氨基酸則為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。
實(shí)施例2 DnaK片段的克隆和表達(dá)用從大腸桿菌K-12中提取出的基因組DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增目標(biāo)基因的片段，將DnaK片段克隆?；虻腜CR擴(kuò)增采用東洋紡織出品的KOD-Plus-。DnaK 384-638擴(kuò)增的具體過(guò)程是在50μl反應(yīng)液中，制備試樣以含有反應(yīng)用緩沖液、1mM MgSO4、序列編號(hào)3和4所表示的引物15p mole、1單位多聚酶和配制100ng大腸桿菌DNA，將在94℃2分鐘后，94℃15秒，55℃30秒、68℃1分鐘的循環(huán)進(jìn)行25次。另外，同樣地，DnaK 386-586的擴(kuò)增也用序列編號(hào)3和4所表示的引物。擴(kuò)增的DNA片段用限制酶BamHI消化，對(duì)pQE30的BamHI-Sma I位點(diǎn)進(jìn)行克隆(因?yàn)椴捎肒OS-Plus-擴(kuò)增的DNA片段平滑化了，擴(kuò)增片段的下游一側(cè)可以直接使用)?？寺〉幕虻男蛄型ㄟ^(guò)序列分析加以確認(rèn)。通過(guò)在該載體中克隆，可以在目的蛋白質(zhì)的N末端加上6X His序列(組氨酸標(biāo)記)。于是制備了表達(dá)質(zhì)粒pQE30-DnaK384-638。
蛋白質(zhì)的表達(dá)和提純，是使用通過(guò)將導(dǎo)入了基因的JM109在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，通過(guò)離心分離法回收菌體，懸浮在20mMTris-HCl(pH 7.0)中，進(jìn)行超聲破碎后，用微量高速離心機(jī)以15000rpm離心10分鐘而得到的上清液來(lái)進(jìn)行的。具體地，采用His-Select HCNickel Affinity Gel(SIGMA公司制)純化，最后對(duì)Tris-HCl(pH 7.0)透析一夜后用于實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定使用以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品的Bradford法測(cè)定(BIORAD Bio-Red protein Assay試劑盒；500-0006)。
實(shí)例3 除去C末端的DnaK克隆和點(diǎn)突變體的制備除去C末端的DnaK克隆，是以實(shí)施例1制備的pQE-DnaK 384-638為模板，采用Quickchange法在任意部位導(dǎo)入終止密碼來(lái)制備的。實(shí)驗(yàn)采用Quick change site directive mutagenesis kit(Stratage公司制)，根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各個(gè)制備的克隆和在克隆中利用的引物的序列的組合如下DnaK 384-638序列編號(hào)5和6、DnaK 384-578序列編號(hào)7和8、DnaK 384-561序列編號(hào)9和10。另外，DnaK 384-607(D479V、D481V)是以pQE30-DnaK 384-607為模板，使用序列編號(hào)11和12進(jìn)行變異的導(dǎo)入。制備的各個(gè)變異體用序列分析確認(rèn)序列后，依照實(shí)施例1所述方法制備蛋白質(zhì)。
實(shí)施例4 除去N末端的DnaK克隆的制備用實(shí)施例2制備的pQE-DnaK 384-607為模板，以下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)施例1的方法，導(dǎo)入pQE30載體的BamHI-Sma I位點(diǎn)。用作制備克隆的引物組如下DnaK 508-607序列編號(hào)13和2；DnaK 525-607序列編號(hào)14和2；DnaK 419-607序列編號(hào)15和2。所制備的各種變異體通過(guò)序列分析確認(rèn)序列后，按實(shí)施例1所述方法制備蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5 封閉效果封閉效果用以下方法測(cè)定。
以人血清IgG對(duì)聚苯乙烯板的非特異吸附為指標(biāo)進(jìn)行研究。
方法是，在20mM Tris-HCl(pH 7.0)中稀釋的BSA(SIGMA公司，級(jí)分V)和各種DnaK樣品，取100μl加入96孔聚苯乙烯板(Costar公司制，E.I.A./R.I.A 8Well Strip)上，在4℃靜置4小時(shí)(原則上靜置4小時(shí)，在研究封閉時(shí)間時(shí)任意設(shè)定封閉時(shí)間)。隨后從板上除去溶液，然后加入50μl用PBS(-)稀釋50倍的正常人血清，37℃保溫1小時(shí)。然后將各孔用200μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween20)清洗4次，在各孔中加入50μl用抗體稀釋液(0.01M PB(pH7.4)、0.15M NaCl、0.5％酪蛋白)稀釋至最適濃度的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體(JacksonImmuno Research公司制)，37℃保溫1小時(shí)。各孔再用200μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween20)清洗4次，加入100μl顯色劑(四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ，3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine)，在室溫下顯色5分鐘，用50μl 1N硫酸停止反應(yīng)。用讀數(shù)儀，以主波長(zhǎng)450nm，副波長(zhǎng)650nm測(cè)定顯色。蛋白質(zhì)的定量用Bradford法測(cè)定。
首先，對(duì)于制備成0.7mg/ml濃度的BSA、DnaK 384-638、DnaK384-607、DnaK 384-578、DnaK 508-607、DnaK 525-607測(cè)定4小時(shí)的封閉效率。結(jié)果如圖5所示，對(duì)于BSA、DnaK 384-638、DnaK 384-607以外的那些而言，封閉效果低。在封閉效果低的克隆中，DnaK 384-607、DnaK 384-578是α螺旋被消除的克隆，而DnaK 508-607和DnaK525-607則是消除了β片的克隆，推測(cè)在使用DnaK的底物結(jié)合域的封閉中α螺旋結(jié)構(gòu)和β片結(jié)構(gòu)二者都是必需的。
其次，使用同濃度的BSA和DnaK 384-607作為對(duì)照，在以提高β片部分的疏水性為目的制備的DnaK 384-607(D479V、D481V)和DnaK 419-607(濃度各為0.7mg/ml)中比較4小時(shí)的封閉效果。結(jié)果表明，DnaK 384-607(D479V、D481V)、和DnaK 419-607都有比同濃度的BSA高的封閉效果，特別是DnaK 419-607更為顯著。
進(jìn)一步，對(duì)于上述實(shí)驗(yàn)中封閉效果最高的DnaK 419-607和DnaK384-638、BSA，考查了封閉濃度和封閉第4小時(shí)的封閉效果。結(jié)果，0.15mg/ml的DnaK419-607比12mg/ml的BSA的封閉效果顯著，暗示著可以非常低濃度作為封閉劑使用(圖10)。
最后，進(jìn)一步對(duì)于上述實(shí)驗(yàn)中封閉效果最高的DnaK 419-607和DnaK 384-638、BSA，對(duì)于封閉時(shí)間和封閉效果進(jìn)行了研究。蛋白質(zhì)的濃度，對(duì)于DnaK 419-607和DnaK 384-638為0.7mg/ml，BSA濃度則為顯示與上述研究的0.7mg/ml的DnaK419-607同等的封閉效果的2.4mg/ml。結(jié)果表明，DnaK 419-607的封閉時(shí)間大為縮短到10分鐘而封閉效果充分，比在封閉3小時(shí)后才看到同等效果而濃度為2.4mg/ml的BSA的封閉速度更快(圖11)。
實(shí)施例6 封閉效果(ELISA)用人類(lèi)癌的胎兒性抗原(Carcinoembrionic antibodyhCEA)的ELISA系統(tǒng)，研究了DnaK的片段作為封閉劑的有用性。首先，用50mM的碳酸緩沖液(pH9.6)將hCEA MoAb稀釋到10μg/ml后，各取100μ1加入96孔聚苯乙烯板(Costar公司制，E.I.A./R.I.A 8Well Strip)孔中，然后在37℃靜置1小時(shí)。靜置后，用150μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween 20)清洗孔3次，然后加入200μl封閉液，4℃靜置4小時(shí)。封閉液用通常使用的濃度為2.4mg/ml的BSA(20mM Tris-HCl(pH 7.0))和溶解在同樣緩沖液的DnaK 419-607，空白用20mM Tris-HCl(pH 7.0)。棄去封閉液后，加入50μl稀釋成0、2.5、5ng/ml的hCEA溶液(Immunofluora東洋紡織制)，37℃保溫1小時(shí)，然后用150μl清洗液清洗4次。然后加入稀釋到最佳濃度的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗hCEA抗體(Immunofluora東洋紡織制)，37℃反應(yīng)1小時(shí)后，進(jìn)一步用150μl清洗液(PBS(-)，0.05％Tween 20)清洗孔3次，然后加入100μl底物溶液(四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ，3，3’5，5’-Tetramethylbenzidine))，37℃遮光，顯色20分鐘。最后，添加100μl反應(yīng)停止液(1N H2SO4)，在450nm/650nm波長(zhǎng)測(cè)定黃色的顯色。
結(jié)果表明，空白測(cè)定沒(méi)有直線性關(guān)系，與此相對(duì)，DnaK 419-607則和BSA一樣有良好的直線性關(guān)系，DnaK 419-607在免疫學(xué)測(cè)定中也可以充分應(yīng)用(圖12)。
實(shí)施例7 無(wú)組氨酸標(biāo)記(天然)的DnaK片段的封閉效果比較實(shí)施例2～4構(gòu)建的DnaK片段的每一個(gè)，在其N(xiāo)末端都有來(lái)自表達(dá)載體pQE30的組氨酸標(biāo)記，因此DnaK片段的等電點(diǎn)偏向中性pH。為此，構(gòu)建了組氨酸標(biāo)記被去除的DnaK片段，以維持固有的靜電相互作用帶來(lái)的封閉能力。
除去組氨酸標(biāo)記的DnaK克隆，以實(shí)施例5制備的pQE-DnaK419-607為模板，采用QuickChange法切除起始密碼子后到包含組氨酸標(biāo)記的DnaK區(qū)域?yàn)橹沟陌被?，由此進(jìn)行制作。實(shí)驗(yàn)采用Quickchangesite directive mutagenesis kit(Stratagene公司制)，在組氨酸標(biāo)記上游導(dǎo)入BamHI位點(diǎn)。操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。此時(shí)所使用的引物序列在序列編號(hào)16、17中表示。如實(shí)施例2所表明的，克隆的基因的上游側(cè)設(shè)置了BamHI位點(diǎn)。因此，將用BamHI所得到的載體消化，并再結(jié)合，由此可以得到除去了組氨酸標(biāo)記序列的克隆。
這個(gè)表達(dá)載體命名為pQE-DnaK419-607N。天然的pQE-DnaK419-607片段，是通過(guò)培養(yǎng)用此pQE-DnaK419-607N轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到的轉(zhuǎn)化體而取得的。
即，將大腸桿菌JM109(pQE-DnaK419-607N)接種在含100mg/L氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)肉湯(1.2％聚蛋白胨、2.4％酵母膏、0.5％甘油、17mM磷酸二氫鉀、72mM磷酸氫二鉀)中，在32℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。通過(guò)離心分離收集相對(duì)當(dāng)1L培養(yǎng)液的菌體，懸浮在200ml 100mM pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液中，用French壓力機(jī)破碎。在破碎液中加入聚乙撐亞胺使其終濃度為0.1％，然后在60℃保溫2小時(shí)，通過(guò)離心分離加收上清液。然后加入50％飽和度的硫酸銨，通過(guò)離心分離收集沉淀物，然后再溶解在100mM pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液中。進(jìn)而在64℃加溫處理14小時(shí)，通過(guò)離心分離回收上清液。將此粗酶液供給Superdex200(Amacia Bioscience公司制)凝膠過(guò)濾色譜，再加入50％飽和度的硫酸銨，回收沉淀后，再溶解在100mM pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液中。用經(jīng)同一緩沖液緩沖過(guò)的Sephadex G-25(Amacia Bioscience公司制)凝膠過(guò)濾色譜脫鹽。然后，將此DnaK片段供給用含有20％飽和度的硫酸銨的濃度為100mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液緩沖過(guò)的Phenyl Sepharose Fast Flow(Amacia Bioscience公司制)柱色譜，用20～0％飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫，得到純化的DnaK片段級(jí)分。這一純化片段級(jí)分經(jīng)超濾膜濃縮后，用蒸餾水脫鹽，最后得到純化的DnaK片段。
BSA和天然DnaK 419-607片段的封閉效率的比較用以下方法測(cè)定。
首先將來(lái)源于西洋辣根的標(biāo)記用過(guò)氧化物酶(東洋紡織公司制，PEO-131)溶解在含有BSA或天然DnaK 419-607片段的PBS緩沖液中使其濃度為2mg/ml。此時(shí)，將市售的BSA(級(jí)分V)的濃度調(diào)整為2mg/ml或10mg/ml，天然DnaK 419-607片段的濃度調(diào)整為0.1或0.5mg/ml。然后用相同溶液制備過(guò)氧化物酶溶解液的40～320倍系列稀釋液，各取稀釋液100μl分配到聚苯乙烯制96孔微型板上。室溫放置1小時(shí)后，棄去溶液，用含有0.02％Tween 20的PBS緩沖液200μl清洗。反復(fù)清洗6次后，充分除去清洗液。再加入100μl四甲基聯(lián)苯胺(Bio-Rad公司制)，37℃精確保溫10分鐘后，加入100μl 1N硫酸停止反應(yīng)并使其顯色。在微型板讀數(shù)器上以主波長(zhǎng)450nm、副波長(zhǎng)650nm測(cè)定顯色。
結(jié)果如圖15～圖17所示，可知天然DnaK 419-607片段在BSA濃度的1/20的濃度下顯示與BSA同等的非特異顯色抑制效果，表現(xiàn)出約為BSA 20倍的封閉能力。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以根據(jù)氨基酸序列信息篩選有封閉能力的新型蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)，另外，可以生產(chǎn)能夠在大腸桿菌中大量表達(dá)的封閉效率提高的蛋白質(zhì)。利用本發(fā)明所得到的蛋白質(zhì)封閉能力高，能得到比過(guò)去所用方法既簡(jiǎn)便又確切的結(jié)果。本發(fā)明對(duì)于應(yīng)用免疫學(xué)測(cè)定的臨床診斷或醫(yī)療領(lǐng)域有大的貢獻(xiàn)。
序列表<110>東洋紡織株式會(huì)社(Toyo Boseki Kabushiki Kaisya)<120>封閉效率提高的蛋白質(zhì)(ブロツキング効率の向上したタンパク質(zhì))<130>SCT055668-25<160>16<170>PatentIn version 2.1<210>1<211>638<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1Met Gly Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val1 5 10 15Ala Ile Met Asp Gly Thr Thr Pro Arg Val Leu Glu Asn Ala Glu Gly20 25 30Asp Arg Thr Thr Pro Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Gln Asp Gly Glu Thr35 40 45Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Gln Asn50 55 60Thr Leu Phe Ala Ile Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Gln Asp Glu65 70 75 80Glu Val Gln Arg Asp Val Ser Ile Met Pro Phe Lys Ile Ile Ala Ala85 90 95Asp Asn Gly Asp Ala Trp Val Glu Val Lys Gly Gln Lys Met Ala Pro100 105 110Pro Gln Ile Ser Ala Glu Val Leu Lys Lys Met Lys Lys Thr Ala Glu115 120 125
Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Val Thr Glu Ala Val Ile Thr Val Pro Ala130 135 140Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Arg Ile145 150 155 160Ala Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala165 170 175Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Arg Thr Ile Ala Val180 185 190Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Ile Glu Ile Asp195 200 205Glu Val Asp Gly Glu Lys Thr Phe Glu Val Leu Ala Thr Asn Gly Asp210 215 220Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Ser Arg Leu Ile Asn Tyr Leu225 230 235 240Val Glu Glu Phe Lys Lys Asp Gln Gly Ile Asp Leu Arg Asn Asp Pro245 250 255Leu Ala Met Gln Arg Leu Lys Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu260 265 270Leu Ser Ser Ala Gln Gln Thr Asp Val Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Ala275 280 285Asp Ala Thr Gly Pro Lys His Met Asn Ile Lys Val Thr Arg Ala Lys290 295 300Leu Glu Ser Leu Val Glu Asp Leu Val Asn Arg Ser Ile Glu Pro Leu305 310 315 320Lys Val Ala Leu Gln Asp Ala Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Asp Asp325 330 335Val Ile Leu Val Gly Gly Gln Thr Arg Met Pro Met Val Gln Lys Lys340 345 350Val Ala Glu Phe Phe Gly Lys Glu Pro Arg Lys Asp Val Asn Pro Asp
355 360 365Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Val Gln Gly Gly Val Leu Thr Gly370 375 380Asp Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly385 390 395 400Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Thr405 410 415Thr Ile Pro Thr Lys His Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Glu Asp Asn420 425 430Gln Ser Ala Val Thr Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Lys Arg Ala435 440 445Ala Asp Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe Asn Leu Asp Gly Ile Asn Pro450 455 460Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala465 470 475 480Asp Gly Ile Leu His Val Ser Ala Lys Asp Lys Asn Ser Gly Lys Glu485 490 495Gln Lys Ile Thr Ile Lys Ala Ser Ser Gly Leu Asn Glu Asp Glu Ile500 505 510Gln Lys Met Val Arg Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp Arg Lys515 520 525Phe Glu Glu Leu Val Gln Thr Arg Asn Gln Gly Asp His Leu Leu His530 535 540Ser Thr Arg Lys Gln Val Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Pro Ala Asp545 550 555 560Asp Lys Thr Ala Ile Glu Ser Ala Leu Thr Ala Leu Glu Thr Ala Leu565 570 575Lys Gly Glu Asp Lys Ala Ala Ile Glu Ala Lys Met Gln Glu Leu Ala580 585 590
Gln Val Ser Gln Lys Leu Met Glu Ile Ala Gln Gln Gln His Ala Gln595 600 605Gln Gln Thr Ala Gly Ala Asp Ala Ser Ala Asn Asn Ala Lys Asp Asp610 615 620Asp Val Val Asp Ala Glu Phe Glu Glu Val Lys Asp Lys Lys625 630 635<210>2<211>1917<212>DNA.
<213>大腸桿菌<400>2atgggtaaaa taattggtat cgacctgggt actaccaact cttgtgtagc gattatggat 60ggcaccactc ctcgcgtgct ggagaacgcc gaaggcgatc gcaccacgcc ttctatcatt 120gcctataccc aggatggtga aactctag ttggtcagccgg ctaaacgtca ggcagtgacg 180aacccgcaaa acactctgtt tgcgattaaa cgcctgattg gtcgccgctt ccaggacgaa 240gaagtacagc gtgatgtttc catcatgccg ttcaaaatta ttgctgctga taacggcgac 300gcatgggtcg aagttaaagg ccagaaaatg gcaccgccgc agatttctgc tgaagtgctg 360aaaaaaatga agaaaaccgc tgaagattac ctgggtgaac cggtaactga agctgttatc 420accgtaccgg catactttaa cgatgctcag cgtcaggcaa ccaaagacgc aggccgtatc 480gctggtctgg aagtaaaacg tatcatcaac gaaccgaccg cagctgcgct ggcttacggt 540ctggacaaag gcactggcaa ccgtactatc gcggtttatg acctgggtgg tggtactttc 600gatatttcta ttatcgaaat cgacgaagtt gacggcgaaa aaaccttcga agttctggca 660accaacggtg atacccacct ggggggtgaa gacttcgaca gccgtctgat caactatctg 720gttgaagaat tcaagaaaga tcagggcatt gacctgcgca acgatccgct ggcaatgcag 780cgcctgaaag aagcggcaga aaaagcgaaa atcgaactgt cttccgctca gcagaccgac 840gttaacctgc catacatcac tgcagacgcg accggtccga aacacatgaa catcaaagtg 900actcgtgcga aactggaaag cctggttgaa gatctggtaa accgttccat tgagccgctg 960aaagttgcac tgcaggacgc tggcctgtcc gtatctgata tcgacgacgt tatcctcgtt 1020
ggtggtcaga ctcgtatgcc aatggttcag aagaaagttg ctgagttctt tggtaaagag 1080ccgcgtaaag acgttaaccc ggacgaagct gtagcaatcg gtgctgctgt tcagggtggt 1140gttctgactg gtgacgtaaa agacgtactg ctgctggacg ttaccccgct gtctctgggt 1200atcgaaacca tgggcggtgt gatgacgacg ctgatcgcga aaaacaccac tatcccgacc 1260aagcacagcc aggtgttctc taccgctgaa gacaaccagt ctgcggtaac catccatgtg 1320ctgcagggtg aacgtaaacg tgcggctgat aacaaatctc tgggtcagtt caacctagat 1380ggtatcaacc cggcaccgcg cggcatgccg cagatcgaag ttaccttcga tatcgatgct 1440gacggtatcc tgcacgtttc cgcgaaagat aaaaacagcg gtaaagagca gaagatcacc 1500atcaaggctt cttctggtct gaacgaagat gaaatccaga aaatggtacg cgacgcagaa 1560gctaacgccg aagctgaccg taagtttgaa gagctggtac agactcgcaa ccagggcgac 1620catctgctgc acagcacccg taagcaggtt gaagaagcag gcgacaaac tgccggctgac 1680gacaaaactg ctatcgagtc tgcgctgact gcactggaaa ctgctctgaa aggtgaagac 1740aaagccgcta tcgaagcgaa aatgcaggaa ctggcacagg tttcccagaa actgatggaa 1800atcgcccagc agcaacatgc ccagcagcag actgccggtg ctgatgcttc tgcaaacaac 1860gcgaaagatg acgatgttgt cgacgctgaa tttgaagaag tcaaagacaa aaaataa1917<210>3<211>55<212>DNA<213>合成DNA<400>3gcggatccat cgagggtaga ggtgacgtaa aagacgtact gctgctggac gttac 55<210>4<211>27<212>DNA<213>合成DNA<400>4ttattttttg tctttgactt cttcaaattc agc 33
<210>5<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>5gccggctgac gactaaactg ctatcgagtc 30<210>6<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>6gactcgatag cagtttagtc gtcagccggc 30<210>7<211>27<212>DNA<213>合成DNA<400>7tgctctgaaa ggttaagaca aagccgctat 27<210>8<211>27<212>DNA<213>合成DNA<400>8atagcggctt tgtcttaacc tttcagagca 27<210>9
<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>9gcagcaacat gcctaacagc agactgccgg 30<210>10<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>10ccggcagtct gctgttaggc atgttgctgc 30<210>11<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>11ccttcgatat cgttgctgtc ggtatcctgc 30<210>12<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>12gcaggatacc gacagcaacg atatcgaagg 30<210>13<211>27
<212>DNA<213>合成DNA<400>13tctggatcca acgaagatga aatccag 27<210>14<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>14gcggatccgc tgaccgtaag tttgaagagc30<210>15<211>29<212>DNA<213>合成DNA<400>15ccggatcccc gaccaagcac agccaggtg 30<210>16<211>29<212>DNA<213>合成DNA<400>16attaactatg agaggatccc atcaccatc 29<210>17<211>29<212>DNA
<213>合成DNA<400>17gatggtgatg ggatcctctc atagttaat 29
權(quán)利要求
1.根據(jù)氨基酸序列信息篩選有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列的候選蛋白質(zhì)的方法，篩選滿足以下條件的蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)A.將蛋白質(zhì)的氨基酸序列一分為二，根據(jù)各自的親水性氨基酸(D、E、K、H、R、Y)和疏水性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W、P)的含有率用下式計(jì)算出的一分為二的各部分中親水/疏水率之差的絕對(duì)值為0.1以上；(親水/疏水率)＝(親水性氨基酸含有率)/(疏水性氨基酸含有率)B.親水性部分的親水/疏水率(親水/疏水率高的一方的值)為0.5以上C.由超過(guò)100個(gè)氨基酸殘基組成。
2.用權(quán)利要求1所述的方法篩選到的有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)，其可以通過(guò)下述D的解析工序獲得，并滿足下述E的條件D.(1)聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分別加入滿足權(quán)利要求1的條件的候選蛋白質(zhì)(0.5～1mg/ml用20mM Tris-HCl(pH7.0)稀釋)以及同樣制備的牛血清蛋白(級(jí)分V)，在2℃～10℃封閉4～5小時(shí)，將液體丟棄的工序；(2)加入用PBS(-)稀釋25～100倍的正常人血清，在37℃放置1小時(shí)后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；(3)使用經(jīng)酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，通過(guò)使用顯色法的比色法比較非特異吸附在板上的IgG量的工序；E.候選蛋白質(zhì)的顯色是牛血清蛋白顯色的2.5倍以下。
3.用權(quán)利要求1所述方法篩選到的有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列的候選蛋白質(zhì)，其可以通過(guò)下述F的解析工序獲得，并滿足下述G的條件D.(1)將來(lái)自西洋辣根的標(biāo)記用過(guò)氧化物酶溶解到候選蛋白質(zhì)溶液(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀釋)以及同樣制備的牛血清蛋白(級(jí)分V)中，使其濃度為0.05mg/ml的工序；(2)將上述稀釋液分配到聚苯乙烯制96孔微型板中的工序；(3)在25℃放置1小時(shí)后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；(4)加入四甲基聯(lián)苯胺溶液，37℃保溫后，加入1N硫酸停止反應(yīng)并使其顯色的工序；(5)通過(guò)微型板讀數(shù)器測(cè)定顯色的工序；G.候選蛋白質(zhì)的測(cè)定值為牛血清蛋白顯色的2.5倍以下。
4.用權(quán)利要求1所述方法篩選到的有封閉能力的新型封閉用蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)，其可以通過(guò)下述H的解析工序獲得，并滿足下述I的條件H.(1)在聚苯乙烯制免疫滴定板上的各孔中分別加入滿足權(quán)利要求1的條件的候選蛋白質(zhì)(0.5～1mg/ml用PBS(-)稀釋)以及同樣制備的牛血清蛋白(級(jí)分V)，在2℃～10℃封閉4～5小時(shí)，將液體丟棄的工序；(2)加入配制成濃度為0.05mg/ml的過(guò)氧化物酶溶液，37℃放置1小時(shí)后，用PBS(-)(0.05％Tween 20)清洗板的工序；(3)25℃放置1小時(shí)后，除去溶液，用含0.02％Tween 20的PBS(-)清洗的工序；(4)加入四甲基聯(lián)苯胺溶液，37℃保溫后，加入1N硫酸停止反應(yīng)并使其顯色的工序；(5)通過(guò)微型板讀數(shù)器測(cè)定顯色的工序；I.候選蛋白質(zhì)的測(cè)定值為牛血清蛋白顯色的2.5倍以下。
5.通過(guò)滿足權(quán)利要求1所述條件A、B、C的蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列的改變而獲得的封閉效率提高的新型蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，借助氨基酸置換、減除、插入改變了氨基酸序列。
7.權(quán)利要求5所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，來(lái)自原核生物或真核生物。
8.封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，來(lái)自“HSP70家族蛋白質(zhì)”。
9.權(quán)利要求8所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，來(lái)自DnaK蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求8所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，是除去了DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列而得到的蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求8所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，是除去了DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列而得到的蛋白質(zhì)，并且從N末端至少到第387個(gè)，至多到第472個(gè)氨基酸序列被除去了。
12.權(quán)利要求8所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，是除去了DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列而得到的蛋白質(zhì)，并且從N末端至少到第387個(gè)，至多到第418個(gè)氨基酸序列被除去了。
13.權(quán)利要求8所述的蛋白質(zhì)，由DnaK蛋白質(zhì)的第419～607個(gè)氨基酸序列組成。
14.權(quán)利要求8所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其特征在于，ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白質(zhì)的一部分親水性氨基酸被置換成疏水性氨基酸。
15.權(quán)利要求8所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其為ATPase域或其一部分被除去的DnaK蛋白質(zhì)的一部分氨基酸序列被除去的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置換成了纈氨酸。
16.權(quán)利要求8所述的封閉效率提高的蛋白質(zhì)，其由DnaK蛋白質(zhì)的第384～607氨基酸序列組成，并且氨基酸序列中第479和第481的天冬氨酸被置換成了纈氨酸。
17.具有一個(gè)以上親水域和一個(gè)以上疏水域的封閉用蛋白質(zhì)，其中疏水域可以吸附在器壁上，親水域可以覆蓋吸附在器壁上的疏水域。
18.被改變了的蛋白質(zhì)，其特征在于，封閉速度比BSA提高。
19.權(quán)利要求18所述的被改變了的蛋白質(zhì)，其特征在于，在3小時(shí)封閉中，在調(diào)整蛋白質(zhì)量使得顯示與BSA同等的封閉效率的條件下，小于10分鐘的封閉能力比BSA優(yōu)良。
20.權(quán)利要求2～19任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有標(biāo)記序列。
21.權(quán)利要求20所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，標(biāo)記序列從組氨酸標(biāo)記、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)記、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記、Flag標(biāo)記、Myc標(biāo)記、串連型親和純化標(biāo)記中選擇。
22.權(quán)利要求2～19任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，添加了任意的氨基酸序列。
23.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用原核生物生產(chǎn)權(quán)利要求2～22任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
24.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用大腸桿菌生產(chǎn)權(quán)利要求2～22任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
25.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于，使用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法生產(chǎn)權(quán)利要求2～22任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
26.權(quán)利要求2～22任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的提純方法，其特征在于，經(jīng)過(guò)加熱工序。
27.將權(quán)利要求2～22任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在封閉、穩(wěn)定、賦形、折疊輔助、重折疊輔助、包膜、醫(yī)療應(yīng)用中使用的方法。
28.封閉試劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、折疊輔助劑、重折疊輔助劑、包膜劑或醫(yī)療用包膜劑，含有權(quán)利要求2～22任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供根據(jù)氨基酸序列信息簡(jiǎn)便篩選有封閉能力的新型蛋白質(zhì)或具有部分新序列的蛋白質(zhì)的方法，并提供可以在大腸桿菌中大量表達(dá)的封閉效率提高的蛋白質(zhì)。根據(jù)氨基酸序列信息篩選有封閉能力的新型蛋白質(zhì)或部分序列蛋白質(zhì)的方法；和通過(guò)改變氨基酸序列而封閉效率提高的蛋白質(zhì)，以及該蛋白質(zhì)的應(yīng)用方法。
文檔編號(hào)C07K1/14GK1816562SQ200480019080
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2004年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月3日
發(fā)明者黑板敏弘, 曾我部敦, 寶田裕, 田中直毅 申請(qǐng)人:東洋紡織株式會(huì)社