專利名稱：有機(jī)酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于使用細(xì)菌來(lái)制造有機(jī)酸的方法。
背景技術(shù)：
以發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)琥珀酸等時(shí)，通常使用厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)屬、放線桿菌(Actinobacillus)屬等的厭氧細(xì)菌(美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,143,834、美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)5,504,004以及International Journal of Systematic Bacteriology(1999)，49，207-216)。使用厭氧細(xì)菌的時(shí)候，產(chǎn)物的收率高，但另一方面，由于為了增殖而需要很多的營(yíng)養(yǎng)素，在培養(yǎng)基中添加大量的CSL等有機(jī)氮源是必要的。這些有機(jī)氮源的大量添加不僅會(huì)帶來(lái)培養(yǎng)基成本的增加，還涉及到在取出產(chǎn)物時(shí)精制成本的增加，不經(jīng)濟(jì)。
另外，下述方法也是已知的在好氧性條件下一度培養(yǎng)好氧細(xì)菌使菌體增殖之后，收集細(xì)菌、洗凈、不通氧氣以靜止菌體生產(chǎn)有機(jī)酸(特開(kāi)平11-113588號(hào)公報(bào))。在這種情況下，在使菌體增殖時(shí)，有機(jī)氮的添加量少比較好，由于用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基就能夠充分地增殖而比較經(jīng)濟(jì)，但目的有機(jī)酸的生成量或每個(gè)菌體的生產(chǎn)速度還不足夠，希望建立更優(yōu)良的方法。
此外，通過(guò)將細(xì)菌重復(fù)培養(yǎng)的連續(xù)培養(yǎng)來(lái)制備L-谷氨酸或L-天冬氨酸的方法也是已知的(特開(kāi)昭62-48394號(hào)公報(bào)、以及特開(kāi)平5-260985號(hào)公報(bào))。然而，使用棒狀桿型細(xì)菌(コリネ型細(xì)菌)、桿菌屬細(xì)菌、或根瘤菌屬細(xì)菌等的細(xì)菌，尤其是通過(guò)在厭氧條件下將細(xì)菌重復(fù)培養(yǎng)來(lái)制備琥珀酸的方法，到目前為止沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以提供發(fā)酵效率很高的有機(jī)酸的制造方法為所要解決的課題。
本發(fā)明者為解決上述課題進(jìn)行銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)將在生產(chǎn)上使用過(guò)一次或一次以上的菌體進(jìn)行再利用來(lái)提高有機(jī)酸的生產(chǎn)速度和收率。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的。
也就是說(shuō)根據(jù)本發(fā)明提供如下發(fā)明。
(1)通過(guò)在含有有機(jī)原料的水性反應(yīng)液中使細(xì)菌菌體或其處理物作用而由該有機(jī)原料制備有機(jī)酸的方法，其特征在于，回收反應(yīng)后的水性反應(yīng)液，從回收的水性反應(yīng)液中分離菌體或其處理物，通過(guò)使分離的菌體或其處理物在新的水性反應(yīng)液中作用，重復(fù)使用菌體或其處理物。
(2)(1)中所述的方法，其中細(xì)菌選自棒狀桿型細(xì)菌、桿菌屬細(xì)菌或根瘤菌屬細(xì)菌中的任意一種。
(3)(1)或(2)中所述的方法，其中細(xì)菌是與該細(xì)菌的野生型相比乳酸生產(chǎn)能力降低至10％或10％以下的變異株。
(4)(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用缺乏乳酸脫氫酶(LDH)的細(xì)菌。
(5)(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中反應(yīng)液含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w。
(6)(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的方法，其中在含有有機(jī)原料的水性反應(yīng)液中，在厭氧氛圍氣下，使細(xì)菌菌體或其處理物作用。
(7)(1)～(6)中任一項(xiàng)所述的方法，其中有機(jī)原料是葡萄糖。
(8)(1)～(7)中任一項(xiàng)所述的方法，其中菌體或其處理物的重復(fù)使用次數(shù)是3次或3次以上。
(9)(1)～(8)中任一項(xiàng)所述的方法，其中有機(jī)酸是琥珀酸、蘋果酸或富馬酸。
(10)(1)～(9)中任一項(xiàng)所述的方法，其中將反應(yīng)結(jié)束后的水性反應(yīng)液的全部量直接用于下一次的反應(yīng)。
(11)(1)～(10)中任一項(xiàng)所述的方法，其中有機(jī)酸的第2次以后的生產(chǎn)量是第一次生產(chǎn)量的80％或80％以上。
(12)(1)～(11)中任一項(xiàng)所述的方法，其中琥珀酸的第2次以后的生產(chǎn)量是第一次生產(chǎn)量的80％或80％以上。
(13)含有有機(jī)酸的組合物，其是根據(jù)(1)～(12)中任一項(xiàng)方法制備的。
(14)權(quán)利要求13中所述的含有有機(jī)酸的組合物，其中有機(jī)酸是琥珀酸。
(15)制備含有有機(jī)酸的聚合物的方法，其包括根據(jù)(1)～(12)中任一項(xiàng)方法來(lái)制備有機(jī)酸的工序以及以所得的有機(jī)酸作為原料來(lái)進(jìn)行聚合反應(yīng)的工序。
(16)(15)中所述的制備含有有機(jī)酸的聚合物的方法，其中有機(jī)酸是琥珀酸。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下就本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明在于有機(jī)酸的制備方法，其特征是是通過(guò)使用細(xì)菌菌體的反應(yīng)來(lái)制備有機(jī)酸，并將在制備中使用一次以上的菌體的50％或50％以上再利用。想要以使用棒狀桿型細(xì)菌進(jìn)行的厭氧發(fā)酵來(lái)制備乳酸時(shí)，乳酸的生產(chǎn)量由于重復(fù)使用菌體而顯著下降。與此相對(duì)比，在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了即使重復(fù)使用菌體也不會(huì)特別地使琥珀酸的生產(chǎn)量下降。
在本發(fā)明方法中，通過(guò)使細(xì)菌的菌體或其處理物在含有有機(jī)原料的水性反應(yīng)液中作用而由該有機(jī)原料制備有機(jī)酸時(shí)，回收反應(yīng)結(jié)束的水性反應(yīng)液，從回收的水性反應(yīng)液中分離菌體或其處理物，通過(guò)使分離的菌體或其處理物在新的水性反應(yīng)液中作用而再次進(jìn)行有機(jī)酸的制備。同上所述，本發(fā)明的方法是以重復(fù)使用菌體或其處理物為特征的。
在本發(fā)明中使用的細(xì)菌，只要是具有生產(chǎn)有機(jī)酸的能力即可沒(méi)有特別限定，但其中優(yōu)選芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rizobium)或棒狀桿型細(xì)菌等好氧細(xì)菌。
上述好氧細(xì)菌中優(yōu)選的是棒狀桿型細(xì)菌，作為棒狀桿型細(xì)菌而優(yōu)選的可以列舉出屬于棒桿菌屬的微生物、屬于短桿菌屬的微生物或?qū)儆诠?jié)桿菌屬屬的微生物。其中優(yōu)選的可以列舉出屬于棒桿菌屬或短桿菌屬的微生物，更優(yōu)選的是屬于谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)或乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)的微生物。
上述微生物的特別優(yōu)選的具體例子，可以列舉出黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)MJ-233(FERM BP-1497)、黃色短桿菌MJ-233AB-41(FERM BP-1498)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)ATCC6872、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC31831、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869。
在本發(fā)明方法中使用的上述微生物，不僅是野生株，通過(guò)UV照射或NTG處理等通常變異處理而得到的變異株、通過(guò)細(xì)胞融合或者是基因重組法等遺傳學(xué)手法誘導(dǎo)的重組株等的任何株都可以。還有，作為上述基因重組株的宿主，只要是可以轉(zhuǎn)化的微生物，與親株是同屬的可以，不同屬的也可以，以上述的好氧細(xì)菌作為宿主是優(yōu)選的。
這其中，在本反應(yīng)中，使用缺乏乳酸脫氫酶的變異株是非常有效的。作為棒狀桿型細(xì)菌的乳酸脫氫酶缺乏變異株的具體制備方法，可以列舉出特開(kāi)平11-205385號(hào)公報(bào)中所述的方法，按照該方法可以簡(jiǎn)單地制備。
在本發(fā)明中也可以使用菌體的處理物。作為菌體的處理物是指例如用丙烯酰胺、角叉菜膠等將菌體固定化的固定化菌體，將菌體破碎后的破碎物，其離心分離的上清液，或者用硫酸銨處理等將其上清液部分精制得的級(jí)分等。還有，為了在本發(fā)明的方法中使用好氧性棒狀桿型細(xì)菌，優(yōu)選首先將菌體在通常的好氧條件下培養(yǎng)然后再使用。培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基，可以使用通常微生物培養(yǎng)能夠使用的培養(yǎng)基。例如可以使用硫酸銨、磷酸鉀、硫酸鎂等無(wú)機(jī)鹽組成上添加了肉膏、酵母提取物、蛋白胨等天然營(yíng)養(yǎng)源的一般培養(yǎng)基。培養(yǎng)后的菌體通過(guò)離心分離、膜分離等進(jìn)行回收，用于如下所示的反應(yīng)中。
在本反應(yīng)中使用上述細(xì)菌時(shí)，可以將在瓊脂培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基中斜面培養(yǎng)的細(xì)菌直接用于反應(yīng)，但優(yōu)選使用將上述細(xì)菌在預(yù)先的液體培養(yǎng)基(種培養(yǎng))中培養(yǎng)了的細(xì)菌。
作為為了對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)以及反應(yīng)而使用的培養(yǎng)基的有機(jī)原料，只要是該微生物能夠利用的碳源就沒(méi)有特別的限定，通常使用半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、砂糖、蔗糖、淀粉、纖維素等碳水化合物，甘油、甘露醇、木糖醇、核糖醇等多元醇類發(fā)酵性糖質(zhì)，其中優(yōu)選葡萄糖、果糖、甘油，特別優(yōu)選葡萄糖。
此外，也可以使用含有上述發(fā)酵性糖質(zhì)的淀粉糖化液、糖蜜等。這些發(fā)酵性糖類可以單獨(dú)使用也可以組合使用。
上述碳源的使用濃度沒(méi)有特別的限定，但在不阻礙有機(jī)酸生成的范圍內(nèi)，盡可能的高是有利的，通常在5～30％(w/V)優(yōu)選在10～20％(W/V)范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。
此外，根據(jù)與反應(yīng)進(jìn)行相伴隨的上述碳源的減少，也可以追加添加碳源。
作為氮源，只要是該微生物能夠利用的氮源就沒(méi)有特別的限定，但具體地可以列舉出銨鹽、硝酸鹽、尿素、大豆水解物、酪蛋白分解物、蛋白胨、酵母提取物、肉膏、玉米漿等的各種有機(jī)、無(wú)機(jī)的氮化合物。
作為無(wú)機(jī)鹽，可以使用各種磷酸鹽，硫酸鹽，鎂、鉀、錳、鐵、鋅等金屬鹽。
此外，根據(jù)必要添加生物素、泛酸、肌醇、煙酸等維生素類，核苷酸、氨基酸等促進(jìn)生育因子。
此外，為了抑制反應(yīng)時(shí)的起泡，可以在培養(yǎng)液中預(yù)先添加適量的市售消泡劑。
作為本發(fā)明中使用的反應(yīng)液，可以使用水、緩沖液、培養(yǎng)基，但優(yōu)選使用培養(yǎng)基。可以使培養(yǎng)基中含有例如上述的有機(jī)原料和碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w，在厭氧條件下反應(yīng)。碳酸根離子或碳酸氫根離子由碳酸或重碳酸或者它們的鹽或二氧化碳?xì)怏w來(lái)提供。作為碳酸鹽或碳酸氫鹽的具體例子可以列舉出碳酸銨、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫銨、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等。這樣添加碳酸根、碳酸氫根離子的濃度為1～500mM，優(yōu)選2～300mM，更優(yōu)選3～200mM。在使含有二氧化碳?xì)怏w的情況下，每1L溶液中含有50mg～25g二氧化碳?xì)怏w，優(yōu)選100mg～15g，更優(yōu)選150mg～10g。
培養(yǎng)液和反應(yīng)液的pH，通常調(diào)整到pH5～10，優(yōu)選pH6～9.5，也可在反應(yīng)中根據(jù)必要以堿性物質(zhì)、碳酸鹽、尿素等調(diào)節(jié)到上述范圍內(nèi)。
本反應(yīng)中使用的微生物的繁育最適溫度通常是25℃～35℃。反應(yīng)時(shí)的溫度通常是25℃～40℃，優(yōu)選30℃～37℃。
反應(yīng)通常進(jìn)行5小時(shí)至120小時(shí)。反應(yīng)所用的菌體的量沒(méi)有特別的規(guī)定，可以用1～700g/l，優(yōu)選10～500g/l，更優(yōu)選20～400g/l。
在培養(yǎng)時(shí)，通氣、攪拌和供給氧是必要的。在反應(yīng)時(shí)，可以通氣、攪拌，但可以不通氣、不供給氧。本發(fā)明中所述的厭氧條件是指降低溶液中溶解氧的濃度來(lái)反應(yīng)。在這種情況下，作為溶解的氧的濃度，希望是以0～2ppm，優(yōu)選0～1ppm，更優(yōu)選0～0.5ppm來(lái)反應(yīng)。作為為了達(dá)到此目的的方法，可以采用例如將容器密閉不通氣來(lái)反應(yīng)、供給氮?dú)獾炔换钚詺怏w來(lái)反應(yīng)、通含有二氧化碳?xì)怏w的不活性氣體等。
有機(jī)酸的合成反應(yīng)通常可以以培養(yǎng)液中葡萄糖等有機(jī)原料被消耗掉的時(shí)間點(diǎn)作為反應(yīng)結(jié)束。此時(shí)，在反應(yīng)液中生成了琥珀酸、蘋果酸或富馬酸等有機(jī)酸。其中，琥珀酸因是蓄積度最高的產(chǎn)物而優(yōu)選。
在本發(fā)明中，回收反應(yīng)后的水性反應(yīng)液，但這里所說(shuō)的“反應(yīng)后”是指殘留的有機(jī)原料(例如葡萄糖等)在初期添加量的50％或50％以下，優(yōu)選在20％或20％以下，更優(yōu)選在5％或5％以下，或者是殘留原料的濃度在5重量％或5重量％以下，優(yōu)選在2重量％或2重量％以下，更優(yōu)選在0.5重量％或0.5重量％以下。
在本發(fā)明中，如上所述，回收有機(jī)酸合成反應(yīng)結(jié)束后的水性反應(yīng)液，從回收的水性反應(yīng)液中分離菌體或其處理物，通過(guò)使分離的菌體或其處理物在新的水性反應(yīng)液中作用來(lái)再次進(jìn)行有機(jī)酸的制備。從回收的水性反應(yīng)液中對(duì)菌體或其處理物的分離，可以以離心分離等本領(lǐng)域人員公知的方法來(lái)進(jìn)行。
此外，可以使用回收的水性反應(yīng)液的全部量或其一部分來(lái)分離菌體或其處理物，但優(yōu)選使用回收的水性反應(yīng)液的全部量。使分離的菌體或其處理物在新的水性反應(yīng)液中作用，但這里所說(shuō)的新的水性反應(yīng)液是指含有葡萄糖等有機(jī)原料的水性反應(yīng)液。
在重復(fù)使用上述菌體或其處理物的情況下，有機(jī)酸的第2次以后的生產(chǎn)量?jī)?yōu)選是第一次生產(chǎn)量的80％或80％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，特別優(yōu)選95％或95％以上。特別優(yōu)選的例子中，琥珀酸的第2次以后的產(chǎn)量是第一次產(chǎn)量的80％或80％以上，更優(yōu)選90％或90％以上，特別優(yōu)選95％或95％以上。
在本發(fā)明中，可以將菌體或其處理物重復(fù)使用2次或2次以上。重復(fù)的次數(shù)優(yōu)選3次或3次以上，其上限是在能生產(chǎn)有機(jī)酸的限度內(nèi)沒(méi)有特別限定，可以重復(fù)例如10次、20次、30次或在其之上的任意次數(shù)。
在根據(jù)上述本發(fā)明的方法所得的反應(yīng)液中，生成了琥珀酸、蘋果酸或富馬酸等有機(jī)酸。含有該有機(jī)酸的組合物本身也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為含有有機(jī)酸的組合物，琥珀酸蓄積度高的是特別優(yōu)選的。
此外，在反應(yīng)液(培養(yǎng)液)中蓄積的有機(jī)酸可以按照通常的方法從反應(yīng)液中分離、精制。具體地是，可以通過(guò)離心分離、過(guò)濾等將菌體等固形物除去之后，以離子交換樹(shù)脂等脫鹽，通過(guò)從溶液中結(jié)晶化或者柱色譜法將有機(jī)酸進(jìn)行分離、精制。
還有，在本發(fā)明中，可以在根據(jù)上述本發(fā)明方法制備了有機(jī)酸后，通過(guò)以所得的有機(jī)酸作為原料進(jìn)行聚合反應(yīng)制備含有有機(jī)酸的聚合物。
近年來(lái)，顧及環(huán)境的工業(yè)制品數(shù)量正在增加，對(duì)采用來(lái)源于植物的原料的聚合物的越來(lái)越受到關(guān)注，本發(fā)明中制備的有機(jī)酸可以用來(lái)加工成叫做聚酯或聚酰胺的聚合物。此外，這樣的有機(jī)酸可以用作食品添加物或者醫(yī)藥品、化妝品中的直接或中間體。
以下舉出實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例(實(shí)施例1)按照特開(kāi)平11-206385號(hào)公報(bào)，由黃色短桿菌MJ233AB-41(FERMBP-1498)制備缺乏乳酸脫氫酶(LDH)的株MJ233AB-41LDH(-)株。即，以根據(jù)通常的方法由MJ-233株提取的全DNA作為模板，使用特開(kāi)平11-206385號(hào)公報(bào)中所述的兩個(gè)引物(CARAARCCNG GNGARAC(序列號(hào)1)、以及TCNCCRTGYT CNCCNAT)(序列號(hào)2)進(jìn)行PCR反應(yīng)(但是，R是指A或G，Y是指C或T，N是指A、G、C或T)。將所得的反應(yīng)液3μl和PCR產(chǎn)物克隆用載體pGEM-T(由PROMEGA可商業(yè)獲得)1μl混合，添加50mM tris緩沖液(pH7.6)、10mM二硫蘇糖醇、1mM ATP、10mM MgCl2以及T4DNA連接酶1個(gè)單位的各成分，在4℃反應(yīng)15小時(shí)，使結(jié)合。用得到的質(zhì)粒混合液，通過(guò)氯化鈣法將大腸桿菌JM109(寶酒造制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布到含有氨芐青霉素50mg的培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g以及瓊脂16g溶解于1L蒸餾水中)上。
將該培養(yǎng)基上的生育株按照通常的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液制備質(zhì)粒DNA。向20μl的該質(zhì)粒DNA中添加50mM tris緩沖液(pH7.5)、1mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2、100mM NaCl、限制酶SphI以及SalI 1個(gè)單位的各成分，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。使用Gene Clean II(フナコシ社制)從得到的DNA溶液中進(jìn)行300bp片斷的回收，將該DNA溶液10μl與耐氯霉素的克隆用載體pHSG396(寶酒造制)1μl的SphI以及SalI分解物混合，添加50mMtris緩沖液(pH7.6)、10mM二硫蘇糖醇、1mM ATP、10mM MgCl以及T4DNA連接酶1個(gè)單位的各成分，在4℃反應(yīng)15小時(shí)，使結(jié)合。用得到的質(zhì)?；旌弦?，通過(guò)氯化鈣法將大腸桿菌JM109(寶酒造制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布到含有氨芐青霉素50mg的培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g以及瓊脂16g溶解于1L蒸餾水中)上。
將該培養(yǎng)基上的生育株按照通常的方法進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液制備質(zhì)粒DNA。通過(guò)電脈沖法將該質(zhì)粒導(dǎo)入到黃色短桿菌MJ-233中，涂布到含有氯霉素5mg的培養(yǎng)基(尿素2g，硫酸銨7g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸一氫鉀0.5g，硫酸鎂·7水合物0.5g，硫酸亞鐵·7水合物20mg，硫酸錳·水合物20mg，D-生物素200μg，鹽酸硫胺素200μg，酵母提取物1g，水解酪蛋白氨基酸1g，以及瓊脂16g溶解于1L蒸餾水中)上。在該培養(yǎng)基上生育的菌株中，選擇LDH活性為十分之一或十分之一以下的株作為MJ233AB-41LDH(-)株。
培養(yǎng)基尿素4g，硫酸銨14g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸一氫鉀0.5g，硫酸鎂·7水合物0.5g，硫酸亞鐵·7水合物20mg，硫酸錳·水合物20mg，D-生物素200μg，鹽酸硫胺素200μg，酵母提取物1g，水解酪蛋白氨基酸1g，以及蒸餾水1000ml，將100mL的該培養(yǎng)基放入到500mL的三角燒瓶中，于120℃加熱20分鐘滅菌。將其冷卻至室溫，添加預(yù)先滅菌了的50％葡萄糖水溶液4ml、無(wú)菌過(guò)濾過(guò)的0.1％氯霉素水溶液5ml，接種前述的MJ233AB-41LDH(-)株，于30℃進(jìn)行種培養(yǎng)24小時(shí)。
培養(yǎng)基尿素1.6g，硫酸銨5.6g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸一氫鉀0.2g，硫酸鎂·7水合物0.2g，硫酸亞鐵·7水合物8mg，硫酸錳·水合物8mg，D-生物素80μg，鹽酸硫胺素80μg，酵母提取物0.4g，水解酪蛋白氨基酸0.4g，消泡劑(アデカノ-ルLG294旭電化制)0.4ml以及蒸餾水200ml，將該培養(yǎng)基放入到1L的發(fā)酵槽中，于120℃加熱20分鐘滅菌。將其冷卻至室溫后，添加預(yù)先滅菌了的20％葡萄糖水溶液200ml，向其中加入前述的種培養(yǎng)液的全部量，在30℃保溫。用2M的碳酸鈉將pH保持在8.0，在通氣(在反應(yīng)中使反應(yīng)液中的溶解氧保持在2ppm以下)每分鐘100mL、攪拌每分鐘400轉(zhuǎn)下進(jìn)行反應(yīng)。31小時(shí)之后，葡萄糖幾乎已都被消耗掉，琥珀酸蓄積為31g/L。
(實(shí)施例2)
通過(guò)將實(shí)施例1中得到的全部培養(yǎng)液以10000rpm離心分離10分鐘來(lái)收集細(xì)菌，添加與實(shí)施例1相同的培養(yǎng)基，在30℃保溫。用2M碳酸鈉將pH保持在8.0，在通氣(在反應(yīng)中使反應(yīng)液中的溶解氧保持在2ppm以下)每分鐘100mL、攪拌每分鐘400轉(zhuǎn)下進(jìn)行反應(yīng)。21小時(shí)之后，葡萄糖幾乎已都被消耗掉，各種有機(jī)酸蓄積為琥珀酸42g/L、富馬酸2.2g/L、醋酸3.7g/L、蘋果酸0.8g/L、丙酮酸1.9g/L、草酰醋酸0.1g/L。
(實(shí)施例3)通過(guò)將實(shí)施例2中得到的全部培養(yǎng)液以10000rpm離心分離10分鐘來(lái)收集細(xì)菌，添加與實(shí)施例1相同的培養(yǎng)基，在30℃保溫。用2M碳酸鈉將pH保持在8.0，在通氣(在反應(yīng)中使反應(yīng)液中的溶解氧保持在2ppm以下)每分鐘100mL、攪拌每分鐘400轉(zhuǎn)下進(jìn)行反應(yīng)。20小時(shí)之后，葡萄糖幾乎已都被消耗掉，各種有機(jī)酸蓄積為琥珀酸47g/L、富馬酸1.3g/L、醋酸12g/L、蘋果酸0.6g/L、丙酮酸2.0g/L、草酰醋酸0.1g/L。
(實(shí)施例4～11)在與實(shí)施例3相同的條件下反應(yīng)。22小時(shí)后，終止反應(yīng)，重復(fù)使用。各種有機(jī)酸的產(chǎn)量在下表1中表示。
表1

產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用的可能性根據(jù)本發(fā)明的方法，基于使用細(xì)菌制備有機(jī)酸，可以高反應(yīng)速度和高收率的得到目的物。
本申請(qǐng)是要求基于2003年7月9日提出的日本專利申請(qǐng)(特愿2003-194240)的優(yōu)先權(quán)的申請(qǐng)，其內(nèi)容在本說(shuō)明書中引入作為參考。此外，本說(shuō)明書中引用的文獻(xiàn)內(nèi)容也在本說(shuō)明書中引入作為參考。
序列表<110>三菱化學(xué)株式會(huì)社(Mitsubishi Chemical Corporation)Ajinomoto Co.，Inc.
<120>有機(jī)酸的制造方法<130>A41540A<160>2<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<220>
<221>misc_feature<222>(9)<223>n代表任意堿基<220>
<221>misc_feature<222>(12)<223>n代表任意堿基<400>1caraarccng gngarac 17<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的<220>
<221>misc_feature<222>(3)<223>n代表任意堿基<220>
<221>misc_feature<222>(12)<223>n代表任意堿基<220>
<221>misc_feature<222>(15)<223>n代表任意堿基<400>2tcnccrtgyt cnccnat 1權(quán)利要求
1.通過(guò)在含有有機(jī)原料的水性反應(yīng)液中使細(xì)菌菌體或其處理物作用而由該有機(jī)原料制備有機(jī)酸的方法，其特征在于，回收反應(yīng)后的水性反應(yīng)液，從回收的水性反應(yīng)液中分離菌體或其處理物，通過(guò)使分離的菌體或其處理物在新的水性反應(yīng)液中作用，重復(fù)使用菌體或其處理物。
2.權(quán)利要求1中所述的方法，其中細(xì)菌選自棒狀桿型細(xì)菌、桿菌屬細(xì)菌或根瘤菌屬細(xì)菌中的任意一種。
3.權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中細(xì)菌是與該細(xì)菌的野生型相比乳酸生產(chǎn)能力降低至10％或10％以下的變異株。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用缺乏乳酸脫氫酶(LDH)的細(xì)菌。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其中反應(yīng)液含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w。
6.權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其中在含有有機(jī)原料的水性反應(yīng)液中，在厭氧氛圍氣下，使細(xì)菌菌體或其處理物作用。
7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的方法，其中有機(jī)原料是葡萄糖。
8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中菌體或其處理物的重復(fù)使用次數(shù)是3次或3次以上。
9.權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的方法，其中有機(jī)酸是琥珀酸、蘋果酸或富馬酸。
10.權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中將反應(yīng)結(jié)束后的水性反應(yīng)液的全部量直接用于下一次的反應(yīng)。
11.權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的方法，其中有機(jī)酸的第2次以后的生產(chǎn)量是第一次生產(chǎn)量的80％或80％以上。
12.權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的方法，其中琥珀酸的第2次以后的生產(chǎn)量是第一次生產(chǎn)量的80％或80％以上。
13.含有有機(jī)酸的組合物，其是根據(jù)權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)方法制備的。
14.權(quán)利要求13中所述的含有有機(jī)酸的組合物，其中有機(jī)酸是琥珀酸。
15.制備含有有機(jī)酸的聚合物的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)方法來(lái)制備有機(jī)酸的工序以及以所得的有機(jī)酸作為原料來(lái)進(jìn)行聚合反應(yīng)的工序。
16.權(quán)利要求15中所述的制備含有有機(jī)酸的聚合物的方法，其中有機(jī)酸是琥珀酸。
全文摘要
本發(fā)明以提供發(fā)酵效率很高的有機(jī)酸的制造方法為所要解決的課題。根據(jù)本發(fā)明通過(guò)在含有有機(jī)原料的水性反應(yīng)液中使細(xì)菌菌體或其處理物作用而由該有機(jī)原料制備有機(jī)酸的方法，其特征在于，回收反應(yīng)后的水性反應(yīng)液，從回收的水性反應(yīng)液中分離菌體或其處理物，通過(guò)使分離的菌體或其處理物在新的水性反應(yīng)液中作用，重復(fù)使用菌體或其處理物。
文檔編號(hào)C07C57/15GK1820076SQ20048001949
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者山岸兼治 申請(qǐng)人:三菱化學(xué)株式會(huì)社, 味之素株式會(huì)社