專利名稱：雌三烯衍生物的制作方法
技術領域：
本申請涉及用于調節(jié)間充質細胞功能例如平滑肌和成纖維細胞增殖或細胞因子表達和用于治療與間充質細胞功能相關的病癥例如與哮喘相關的氣道高反應性的化合物和方法。本申請的化合物是一類雌三烯衍生物。
背景技術：
哮喘是一種以不同程度的氣道阻塞、慢性炎癥、稱為氣道壁重塑(AWR)的氣道壁結構改變和氣道高反應性(AHR)為特征的疾病。AHR通常通過用乙酰甲基膽堿或組胺或其它刺激性刺激物如冷空氣或緩激肽人工誘導氣道阻塞來測定。AHR的特征是對氣道刺激物誘導的阻塞的濃度-反應曲線的左移和對這些非特異性刺激物反應的平臺期的消失。
氣道阻塞，例如在哮喘或慢性阻塞性肺病中發(fā)生的氣道阻塞可以本身自發(fā)地或者因活性劑治療而消退。目前用于治療哮喘的三大類活性劑是預防藥(抗炎藥)、緩解藥和癥狀控制劑。所有這些藥物的目標是減少氣道阻塞和/或炎癥。預防藥通過抗炎作用使氣道阻塞的可能性和/或強度減小。緩解藥產生平滑肌縮短的快速逆轉，從而緩解支氣管痙攣性氣道阻塞。癥狀控制劑產生持久的支氣管擴張劑反應，其減少達到需要使用緩解藥物治療的水平的氣道阻塞的可能性。
這些已知的療法各自都具有顯著的副作用。以上治療劑的組合在很多，但不是所有的患者中成功地控制哮喘的癥狀。盡管患有嚴重哮喘的患者占總哮喘人群的不到10％，但認為他們占有大于70％的哮喘的健康預算成本，并且是最有住院治療和哮喘致死風險的一組人。因此，明顯需要新的治療劑用于控制和預防這種疾病的癥狀。
現有的這三類活性劑并不特異性地針對氣道壁重塑(AWR)的原因；不過，已確定AWR為一種可能的治療哮喘的新目標。有大量的證據支持氣道壁重塑是AHR形成的主要因素這一假說。認為被平滑肌、成纖維細胞和細胞外基質占據的氣道體積的增加促進AWR中氣道壁的增厚。該體積增加的至少一個原因是氣道平滑肌細胞的過度增殖。這種增厚的后果是對于給定量的平滑肌收縮而言增加的氣道變窄。此外，AWR降低氣道平滑肌細胞的負荷，使得對于該收縮性器官的給定程度的激活而言有更大量的平滑肌細胞縮短。因此AWR中的結構變化能夠解釋AHR的非特異性。由此可見，能夠防止或逆轉該重塑的抗哮喘活性劑具有降低AHR，從而降低作為平滑肌收縮的結果發(fā)生的氣道阻塞水平的潛能。
本申請的一個目的是提供能夠調節(jié)平滑肌細胞或成纖維細胞的功能，從而提供用于治療與平滑肌細胞或成纖維細胞功能相關的病癥例如哮喘的潛在活性劑的活性劑和方法。

發(fā)明內容
本申請涉及新的雌三烯衍生物以及它們的合成方法和應用。該新的雌三烯衍生物可以用于調節(jié)平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能，例如細胞增殖、細胞外基質沉積、細胞因子表達和收縮性，并可以用于涉及平滑肌細胞和/或成纖維細胞的病癥。這些化合物在調節(jié)平滑肌細胞和/或成纖維細胞的增殖和細胞因子表達方面表現出令人驚奇的選擇性。
本發(fā)明的一個實施方案提供式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?br> n為0或1；
條件是該化合物包含至少一個基團A，且當R1和R4為H，R2為ORa，R3為OH，R6為-H，而Z″為OH或NH2時，則在Z′位的A不為＞C＝N-NH-SO2-X。
根據一個實施方案，至少Z′和Z″之一為A。換句話說，根據此實施方案，A在6和17位之一或二者。
根據另一個實施方案，雖然“取代基”Y組中包括H，但當芳族基為苯基時，則可能的取代基Y組中適宜地不包括H。
在一個實施方案中，所公開的化合物具有調節(jié)成纖維細胞和/或平滑肌細胞功能的活性。該化合物可以通過抑制增殖來調節(jié)細胞功能。在其它實施方案中，該化合物可以通過影響細胞的細胞外基質沉積、細胞遷移、細胞因子表達或細胞收縮性中的一種或多種來調節(jié)細胞功能。
在一個實施方案中，該化合物能夠抑制氣道高反應性，例如在哮喘中表現出的氣道高反應性。
在另一個實施方案中，該化合物抑制纖維變性，例如肺纖維變性或肺炎癥。
根據一個實施方案，該化合物具有調節(jié)間充質細胞功能的特異性活性。
本說明書還提供一種合成如以上定義的式I的化合物的方法，所述方法包括使式II、III或IV的酮或醛前體與其中X如式I中所定義的式H2N-O-X、H2N-O-Rc-X、H2N-NH-Rc-X、H2N-NH-X或H2N-酯-X的胺反應以形成式I的化合物的步驟
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、Rb、Rc、n、Z′和Z″如式I中所定義。
本申請還提供一種包含以上定義的式I的化合物和藥學可接受的載體的藥物組合物。
本申請還提供以上定義的式I的化合物作為用于調節(jié)平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能的活性劑的應用。在一個實施方案中，該應用是作為抗增殖或抗炎活性劑。本申請還提供式I的化合物作為氣道高反應性抑制劑或抗哮喘活性劑的應用。
在另一個實施方案中，該化合物用作抑制纖維變性，例如肺纖維變性的活性劑。在另一個實施方案中，式I的化合物用作抑制肺炎癥的活性劑。
在一個實施方案中，該化合物用作具有調節(jié)間充質細胞功能的特異性活性的活性劑。本申請?zhí)峁┮环N用于治療與平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能相關的病癥的方法，所述方法包括給予需要其的個體治療有效量的式I的化合物。在某些特定的實施方案中，該癥狀與氣道平滑肌細胞或肺成纖維細胞功能有關。該細胞功能可以選自細胞增殖、細胞的細胞因子表達、細胞的細胞外基質沉積、細胞遷移或細胞收縮性。
本申請還提供式I的化合物在治療氣道高反應性中的應用。在一個優(yōu)選的實施方案中，該化合物用于治療哮喘。
本申請還提供式I的化合物在抑制纖維變性如肺纖維變性中的應用。
本申請還提供式I的化合物在抑制肺炎癥中的應用。
本申請?zhí)峁┦絀的化合物在制備用于治療與平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能相關的病癥的藥物中的應用。
本領域技術人員應理解，本申請中確定的活性劑的活性包括但不限于抑制平滑肌增殖、遷移和細胞因子合成以及抑制成纖維細胞增殖和抑制炎癥。根據這些活性，預期這些活性劑在過敏性和炎性疾病例如類風濕性關節(jié)炎、過敏性皮炎、過敏性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、成人呼吸窘迫綜合征、慢性感染和膿毒病的治療中具有活性。成纖維細胞增殖的減少還表明預期該活性劑在纖維變性性疾病包括不同類型的肺纖維變性、瘢痕和內臟粘連/纖維化(fibroid)的治療中具有活性。
優(yōu)選的式I的化合物是應用以下之一或多項的化合物
i.Y優(yōu)選為選自如下的鈍化基團-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑和咪唑，更優(yōu)選選自-NO2、-CN、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑或咪唑；
ii.X優(yōu)選為苯基、萘基或吡啶基，最優(yōu)選為苯基；
iii.X優(yōu)選包括1個或2個取代基Y，更優(yōu)選1個，最優(yōu)選為當X為苯基時，單一取代基Y在4-位；
iv.A中的基團Rc如果存在的話，優(yōu)選為亞烷基，更優(yōu)選為C1-C6亞烷基，最優(yōu)選為-CH2-或-CH2CH2-；
v.A優(yōu)選為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X或＞C＝N-NH-Rc-X，更優(yōu)選為＞C＝N-O-X或＞C＝N-O-Rc-X；
vi.當Z″為A時，Z′優(yōu)選為＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH或＞C＝N-ORb；
vii.當Z′為A時，Z″優(yōu)選為＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH或＞C＝N-ORb，更優(yōu)選為＞C＝O、＞C(H)OH或＞C＝N-OH；
viii.R2優(yōu)選為-ORb、-ARb、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb或-CN，更優(yōu)選為-ORb，最優(yōu)選為-OMe；
ix.R3優(yōu)選為-OH、-ORa或-RcORb，最優(yōu)選為-OH；
x.R1和R4優(yōu)選為H；和
xi.R6優(yōu)選為H。
以上優(yōu)選特征的組各自可以彼此組合。特別優(yōu)選某些組合，例如組iv和組i和/或組iii。
本申請還包括以下化合物
式(V)的化合物
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6、Z″和X如關于式I所定義，且
Rf為直接鍵或亞烷基；
式(VI)的化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、Z′和X如關于式I所定義，且Re為直接鍵或亞烷基；
式(VII)的化合物
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6和Z″如式I中所定義；
Rf為直接鍵或亞烷基，且
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1u選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
式(VIII)的化合物
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6和Z′如式I中所定義；
Rf為直接鍵或亞烷基，且
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
式(IX)的化合物
其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6如式I中所定義，
Rf為直接鍵或亞烷基，
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd，其中Y 選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素-、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRcCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；且
Z為＞C＝O、＞C(H)OH或＞C＝N-OH；
式(X)的化合物
其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6如式I中所定義，
Rf為直接鍵或亞烷基，
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；且
ZIV為＞CH2、＞C＝O或＞C＝N-OH；
式(XI)的化合物
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6、Z′、Z″、Rb和X如式I中所定義，且
Rf為直接鍵或亞烷基。
本申請的申請人發(fā)現以上定義的包含取代基A的雌三烯衍生物具有調節(jié)平滑肌和/或成纖維細胞功能，特別是細胞增殖、細胞的細胞外基質沉積、細胞遷移和細胞因子表達。因此，本申請廣義地包括所有包含以上定義的取代基A的雌二醇衍生物，條件是該化合物不是2-乙氧基-6-甲苯磺酰腙-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇。
附圖簡述


圖1比較2-甲氧基雌二醇(2MEO)和兩種化合物4NO(CP-DM-2-11-7)和4NOM(CP-DM-3-91)抑制培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞的凝血酶介導的細胞分裂的效力和效能。
圖2比較2MEO、4NO(CP-DM-2-11-7)和4NOM(CP-DM-3-91)抑制II型氣道上皮細胞系A549對5％胎牛血清反應的增殖的效力和效能。
圖3比較2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制表達雌激素受體的乳房腫瘤細胞系MCF7對5％胎牛血清或300pM表皮生長因子反應的增殖的效力和效能。
圖4比較2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制培養(yǎng)的牛主動脈內皮細胞對5％胎牛血清反應的增殖的效力和效能。
圖5比較4NO(CP-DM-2-11-7)和地塞米松抑制組織培養(yǎng)塑料上培養(yǎng)的堿性成纖維細胞生長因子介導的人氣道平滑肌細胞的增殖的效力和效能。
圖6比較4NO(CP-DM-2-11-7)和地塞米松抑制涂布膠原的硅橡膠上培養(yǎng)的堿性成纖維細胞生長因子介導的人氣道平滑肌細胞的增殖的效力和效能。
圖7比較2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制來自培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞的白細胞介素-1介導的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的釋放的效力和效能。
圖8比較腹膜內給予的2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制卵清蛋白致敏的小鼠對支氣管收縮劑乙酰甲基膽堿的靜脈內激發(fā)的氣道高反應性的效力和效能。
圖9比較口服2MEO和4NO(CP-DM-2-11-7)抑制卵清蛋白致敏的小鼠對靜脈內支氣管收縮劑乙酰甲基膽堿激發(fā)的氣道高反應性的效力和效能。
圖10比較4NO(CP-DM-2-11-7)和4NOM(″4NO-menox″)(CP-DM-3-91)抑制肺成纖維細胞對堿性成纖維細胞生長因子刺激反應的增殖的效力和效能。
圖11顯示與4NOM(CP-DM-3-91)一起預培養(yǎng)對人氣道平滑肌細胞的凝血酶介導的細胞周期蛋白D1蛋白表達的影響。
圖12比較2MEO或4NO(CP-DM-2-11-7)抑制血小板衍生生長因子(BB)誘導的人氣道平滑肌細胞遷移的效力。
具體實施例方式
為說明本申請的目的，應清楚地理解詞語“包含(comprising)”意指“包括但不限于”，而詞語“包含(comprises)”具有相應的含義。
所公開的化合物是一組2-甲氧基雌二醇(2MEO)的衍生物。先前已研究過2MEO和此化合物的其它衍生物以及它們治療癌癥的活性。
單獨或者在復合詞如“芳烷基”中使用的術語“烷基”指具有1-10個碳原子，優(yōu)選1-6個碳原子，更優(yōu)選1-4個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴基。這些烷基的例子為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。
單獨或者在復合詞中使用的術語“烯基”指2-20個碳原子，優(yōu)選2-14個碳原子，更優(yōu)選2-6個碳原子的具有至少一個碳碳雙鍵的直鏈、支鏈或者單環(huán)或多環(huán)基團。烯基的實例包括烯丙基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、異丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、環(huán)戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、環(huán)己烯基、1-壬烯基、1，3-丁二烯基等。術語“炔基”具有相應的含義。
單獨或者在復合詞中使用的“酰基”指具有1-20個碳原子，優(yōu)選1-14個碳原子的氨基甲?；?、脂族酰基、稱為芳族酰基的含芳環(huán)的?；蛘叻Q為雜環(huán)?；暮s環(huán)的?；?。?；膶嵗ò被柞；?；直鏈或支鏈烷酰基，例如甲?；?、乙?；?、丙?；?、丁?；?、2-甲基丙?；?、辛?；煌檠豸驶?，例如甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基；環(huán)烷基羰基，例如環(huán)己基羰基；烷基磺?；?，例如甲基磺?；蛞一酋；?；烷氧基磺?；缂籽趸酋；蛞已趸酋；?；芳?；?，例如苯甲酰基、甲苯?；蜉刘；?；芳烷酰基，例如苯烷酰基如苯乙?；虮奖；蛘咻镣轷；巛炼□；环枷；绫较；绫奖；虮郊谆；蜉料；巛帘；?；芳烷氧羰基，例如苯基烷氧羰基如芐氧羰基；芳氧羰基，例如苯氧羰基；芳氧基烷?；绫窖趸；?；芳基氨基甲酰基，例如苯基氨基甲酰基；芳硫基氨基甲酰基，例如苯硫基氨基甲?；环蓟胰；?，例如苯基乙醛酰基；芳基磺酰基，例如苯基磺?；?；雜環(huán)羰基；雜環(huán)烷?；玎绶砸阴；?、噻二唑乙?；蛩倪蛞阴；?；雜環(huán)烯?；珉s環(huán)丙烯?；?；或雜環(huán)乙醛酰基，例如噻唑乙醛?；?。
單獨或者在復合詞中使用的術語“雜環(huán)基”指含有至少一個選自氮、硫和氧的雜原子的單環(huán)或多環(huán)雜環(huán)基。例示此術語范圍內的大量雜環(huán)的一些實例如下吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三唑基、四唑基、吡咯烷基、吲哚基、苯并咪唑基、吡喃基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、嗎啉基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑烷基、苯并噻唑基和苯并噻二唑基。
優(yōu)選雜環(huán)基作為5或6元芳族雜單環(huán)基。
單獨或者在復合詞如“芳烷基”或“芳基?；敝惺褂玫男g語“芳基”指含有一、二或三個環(huán)的碳環(huán)芳族系統，其中這些環(huán)可以以懸掛(pendent)的方式連接在一起或者可以是稠合的。
術語“芳基”包括芳族基，例如苯基、萘基、四氫萘基、茚滿和聯苯。優(yōu)選該芳基為苯基。
術語“芳族基”指芳基和芳族雜環(huán)基(即雜芳)基團，并包括以上例舉的具體雜環(huán)。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
術語“烷氧基”指直鏈或支鏈含氧基團，優(yōu)選各基團具有1至大約6個碳原子的烷基部分。烷氧基的實例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。
術語“任選取代的”指可以進一步被一個或多個選自以下的基團取代或可以不被取代的基團烷基、烯基、炔基、芳基、醛、鹵素、鹵代烷基、鹵代烯基、鹵代炔基、鹵代芳基、羥基、烷氧基、烯氧基、芳氧基、芐氧基、鹵代烷氧基、鹵代烯氧基、鹵代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基雜環(huán)基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、芐基氨基、二芐基氨基、?；⑾┗；⑷不；⒎蓟；?、?；被?、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、芳基亞磺酰氧基、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、雜環(huán)氨基、鹵代雜環(huán)基、烷基亞磺酰基、芳基亞磺酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、巰基、烷硫基、芐硫基、酰硫基、含磷基團等。
術語“酯”最廣義地用于本文，指含有至少一個碳、硫或磷與氧成的雙鍵和該碳、硫或磷原子與另一個氧或硫原子成的單鍵的二價基團。有機酯基團的實例包括磺酰酯(sulfonylate)、磺酸酯、膦酸酯、硫代膦酸酯、羧酸酯和硫醇酯(RCOS)。此外，該酯基團內可以含有其它官能團。這些官能團包括硫代、硫烷基、亞硫?；?、磺?；?、磺酸酯基、氧膦基、膦?；⒘柞；?、氨基或它們的混合物。含有這些官能團的酯的實例包括衍生自硫代膦酸、硫代磷酸、亞硫?；姿帷⒘蛩狨セ被?、磺酸酯基次膦酸和氨基磷酸的酯。
與氣道平滑肌細胞增殖相關的病癥包括哮喘及相關的病癥如氣道壁重塑和氣道高反應性，還包括與哮喘無關但特征是平滑肌細胞增殖的癥狀，例如慢性阻塞性肺病或導致贅生物、腫瘤或癌癥的平滑肌細胞的異常生長。
對氣道平滑肌細胞增殖的抑制包括減緩或停止平滑肌細胞分裂周期。在一個實施方案中，對增殖的抑制優(yōu)選不伴有平滑肌細胞死亡的增加或其它正常平滑肌細胞功能如收縮性的喪失。
術語“選擇性”在本文中用于描述化合物影響組織的一種或多種細胞類型的程度大于與該組織有關的其它細胞類型的能力。
例如，對氣道平滑肌細胞或成纖維細胞增殖的抑制的選擇性意指這些細胞的細胞分裂速率與氣道和其它組織有關的其它細胞例如內皮細胞、肺泡細胞、上皮細胞、肥大細胞和乳房腫瘤上皮細胞相比被更大比例地降低。
合成方法
本文公開的在選擇的一個或多個位置含有基團A的化合物可以通過使適宜的具有代替A的羧基的雌三烯基前體與適宜的胺在縮合反應中反應來制備。下面我們建立了取代芳基胺(H2N-O-X、H2N-O-Rc-X、HN2-NH-Rc-X、H2N-NH-X或H2N-酯-X)合成的標準方法，其后我們將描述使雌三烯前體多樣化的多種方法。
取代芳基胺(H2N-O-X、H2N-O-Rc-X、H2N-NH-Rc-X、H2N-NH-X或H2N-酯-X)
取代芳基羥胺(例如H2N-O-X和H2N-O-Rc-X)可以容易地通過一些方法合成。優(yōu)選的合成方法為經過芳基取代羥胺的關鍵的苯二甲酰亞氨基中間體。在此情況下，N-羥基鄰苯二甲酰亞胺通過對取代芳基和芳基烷基鹵進行親核攻擊起作用。[1]可以使用許多其它離去基團替代該鹵化物。然后用肼處理去除鄰苯二甲酰亞胺基得到取代芳基羥胺，其經常以鹽酸鹽的形式被分離。
路線1
得到這些中間體的另一種途徑是通過銅介導的取代苯基硼酸與N-羥基鄰苯二甲酰亞胺進行偶聯。[2]然后再用肼去除鄰苯二甲酰亞胺基得到期望的芳氧基胺。
路線2
取代芳基羥胺的另一種合成方法是用去質子化的乙酸基異羥肟酸乙酯對取代氟苯進行親核攻擊，然后用高氯酸水解。[3]
路線3
這些實例用于苯環(huán)的情況，但也存在一些用于生產萘基和吡啶基取代羥胺的方法。[4-6]
一旦合成這些取代羥胺，可以將它們容易地用于與基本雌-1，3，5(10)-三烯甾族化合物結構內包含的酮和醛進行縮合反應以形成取代芳基肟。
許多取代芳基肼可商購獲得(例如2，4-二硝基苯肼)。許多取代芳基磺?；?H2N-NH-SO2-X)和取代芳基磺?；u胺也可商購獲得。或者，一種產生取代芳基肼的簡單方法包括使用已確立的如Malachowski等人[28]例示的還原氨基化化學?？梢詫θ〈蓟┻M行來自肼的親核攻擊，并將產物還原得到所需要的取代芳基肼。
然后使這些肼與適宜的前體化合物II、III或IV反應得到相應的酰肼、磺酸酰肼或磺?；?。這三種基團中的后二種是本申請的含酯化合物的實例。
使雌-1，3，5(10)-三烯多樣化以形成前體化合物II、III和IV
現在我們使用多種可以用來獲得含有代替A的羧基的前體雌三烯的方法，且表明這些取代基中的任一個可以在R1、R2、R3、R4、R6、Z′和Z″位。
(A)R1、R2、R3和R4的多樣化
許多可商購獲得的雌-1，3，5(10)-三烯化合物可以通過在該分子的芳族A環(huán)上進行多種取代而容易地得到。這些商購化合物中的許多還具有存在于Z″的酮官能團，可以與取代芳基胺縮合形成式I的化合物?；蛘撸梢栽谂c取代芳基胺縮合之前使用以下所示的技術對這些化合物進行進一步多樣化。
作為實例，以下的化合物可以從Steraloids Inc.商購獲得
17-OH化合物
1-甲基雌二醇
2，4-二溴雌二醇
2，4-二硝基雌二醇
2-溴雌二醇
2-乙氧基雌二醇
2-氟雌二醇
2-羥基雌二醇
2-羥基雌二醇-3-甲基醚
2-碘雌二醇
2-甲氧基雌二醇-3-甲基醚
2-硝基雌二醇
4-溴雌二醇
4-氟雌二醇
4-甲氧基雌二醇
4-甲基雌二醇
雌二醇-3-乙酸酯
雌二醇-3-苯甲酸酯
雌二醇-3-芐基醚
雌二醇-3-羧甲基醚
雌二醇-3-丙酸酯
雌二醇-3-硫酸酯
17-酮化合物
1-甲基雌酮
2-氟雌酮
2-羥基雌酮
2-羥基雌酮-3-甲基醚
2-甲氧基雌酮-3-甲基醚
3-脫氧雌酮
4-羥基雌酮
4-硝基雌酮
雌酮-3-乙酸酯
雌酮-3-苯甲酸酯
雌酮-3-芐基醚
雌酮-3-乙基醚
雌酮-3-甲基醚
雌酮-3-硫酸酯
16-變體
16-羥基雌二醇-3-甲基醚
16-溴雌酮
16-溴雌二醇-3-甲基醚
16-羥基雌二醇-3-乙酸酯
16-溴雌二醇
16-羥基雌二醇
2，16-二羥基雌二醇
16-羥基-2-甲氧基雌二醇
16-羥基-4-甲氧基雌二醇
16-羥基雌二醇-3-硫酸酯
以下化合物可從Research Plus商購獲得
17-OH化合物
16-溴雌二醇
雌二醇-3-甲基醚
雌二醇-3-磷酸酯
2，4-二甲氧基雌二醇
3，4-二溴-2-甲氧基雌二醇
17-酮化合物
2，4-二硝基雌酮
雌酮-3-磷酸酯
除了可商購獲得的含有適宜的R1、R2、R3和R4基團的化合物之外，其它化合物可以容易地通過現有方法，在基本雌-1，3，5(10)-三烯結構上進行多樣化而合成。這些在1-位的不同取代基(R1)的實例包括胺、羥基、醚和烷基鏈，它們可以通過參考文獻7-10中所示的方法制備。這些在2-位的不同取代基(R2)的一些實例包括硝基、鹵素、胺、羥基、硫醇、醚、烷基鏈和亞烷基，它們可以通過參考文獻11-17所示的方法制備。
3-位的取代基(R3)的一些實例包括羥基、醚和酯，例如烷基磷酸酯和氨基磺酸酯，它們可以通過參考文獻14和18-22所示的方法制備。
4-位取代基(R4)的進一步實例包括鹵素、羥基、醚、烷基、烯、氰基和硝基，它們可以通過參考文獻17和23-26所示的方法制備。
(B)Z′的多樣化
6-位的芐基氧化可以使用多種鉻基氧化劑，但最優(yōu)選使用于酸性介質中的三氧化鉻來進行。在2-位為吸電子取代基的情況下(例如R2＝氰基)，可能需要在2-取代基的引入之前進行這一種類的氧化?？赡苄枰赯′和可能的Z″處的酮的保護，優(yōu)選為乙縮醛或乙縮醛衍生物，以使得在這種情況下能夠進行R2處的取代。一旦該酮官能團適當地在Z′位，這些取代胺中的任一個可以與該基團縮合，或者用適宜的氫化物試劑還原將得到6-羥基衍生物。如果已引入肟，則它的還原將產生胺，其本身可以通過還原氨基化過程被進一步烷基化。所有這些反應在本領域已進行了充分地研究[34]。上述的各種反應在以下路線4中作了例示。
路線4
(C)Z″的多樣化
許多在6-和/或17-位已存在酮官能團并且在芳族A環(huán)(R1-R4)上具有變化的取代雌-1，3，5(10)-三烯甾族化合物可商購獲得。它們通過與適宜的取代芳基羥胺縮合直接適用于形成芳基肟。許多可商購獲得的雌-1，3，5(10)-三烯甾族化合物還具有存在的17-羥基官能團，并可以容易地轉化成酮以用于進一步的根據要求的Z″的多樣化。存在許多用于這一類型氧化的方法[14，27]。一個重要的因素是使用適宜的保護基(例如乙?；?、甲氧基、芐基)阻斷其它潛在的可氧化基團的氧化，這些潛在的可氧化基團可以作為在該分子的芳環(huán)或其它部位上的取代基存在。
如果在Z″處需要羥基，則再用氫化物試劑將該酮簡單還原得到此官能團。類似地，肟的還原氨基化或還原將允許在此點引入胺官能團。通過還原氨基化將可以將此胺再烷基化。
路線5
在Z′為酮、肟或芳基肟且Z″也為酮、肟或芳基肟的情況下，應該首先將Z″轉化成適宜的肟或芳基肟，然后將芐基位Z′氧化。這種情況在2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟的合成中作了例示。
(D)2-位(R2)的多樣化以引入A。
路線6
2-甲?；贫伎梢酝ㄟ^Pert和Ridley的方法制備[23]，然后分別與芐基羥胺和4-硝基芐基羥胺縮合得到2-芐氧基亞氨基甲基雌二醇和2-(4-硝基芐氧基)亞氨基甲基雌二醇。為得到產生其它化合物的變體，可以將醛轉化成酮，或者可以進一步沿烴鏈(-Rc-)將醛定位在R2處。
取代芳基胺與式II、III和IV的化合物縮合
一旦合成或得到所需的取代芳基胺(其可以是肼)和式II、III或IV的前體，可以通過本領域已知的和在實施例中所示的技術對它們進行縮合，得到式I的目標化合物。
式II、III或IV的化合物與取代胺的縮合反應不限于與取代芳基胺衍生物的反應，而是可以形成以上定義的許多其它的“酯”。與取代芳基磺酰基肼(其中許多可以商購獲得)反應將得到取代芳基磺酸酰肼，而同樣地與取代芳基磺?；u胺反應將得到相應的取代芳基磺?；?。這些反應以如下關于芳基為苯基的情況所圖示?？梢杂没鶊FX即不同的取代芳基來替代以下所示的具有一個(或多個)取代基的苯基。
路線7
另外，與在17-位具有酮的前體化合物的縮合反應不限于與取代芳基羥胺衍生物的反應，而是可以形成以上定義的許多其它的“酯”。與取代芳基磺?；?其中許多可商購獲得)反應將得到取代芳基磺酸酰肼，而同樣地與取代芳基磺?；u胺反應將得到相應的取代芳基磺酰基肟。
路線8
式I的化合物的鹽優(yōu)選是藥學可接受的，但應理解非藥學可接受的鹽也在本申請的范圍內，因為它們用作制備藥學可接受的鹽的中間體。藥學可接受的鹽的實例包括藥學可接受的陽離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、銨和烷基銨的鹽；藥學可接受的無機酸如鹽酸、正磷酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氫溴酸的酸加成鹽；或者藥學可接受的有機酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來酸、羥基馬來酸、富馬酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、三鹵代甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、對氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗壞血酸和戊酸的鹽。
此外，本申請的某些化合物可以與水或常用的有機溶劑形成溶劑合物。這些溶劑合物包含在本申請的范圍內。
“藥學可接受的衍生物”意指任何藥學可接受的鹽、水合物或任何其它化合物，其在給予個體時能夠(直接或間接地)得到式I的化合物或者其活性代謝產物或殘基。
術語“前藥”最廣義地用于本文，包括在體內轉化成式I的化合物的那些化合物，例如有機酸酯或醚。
術語“互變異構體”最廣義地用于本文，包括能夠以兩種異構形式之間的平衡狀態(tài)存在的式I的化合物。這些化合物在連接兩個原子或基團的鍵和這些原子或基團在該化合物中的位置方面可以不同。
術語“異構體”最廣義地用于本文，包括結構、幾何和立體異構體。由于式I的化合物可以具有一個或多個手性中心，因此它能夠以對映異構形式存在。式I所示的波狀線表示該取代基可以在α或β位，或者可以是它們的異構體混合物。
本申請的組合物包含至少一種式I的化合物和一種或多種藥學可接受的載體和任選的其它治療活性劑。載體、稀釋劑、助劑和/或賦形劑各自必須是藥學“可接受的”，其含義是可以與該組合物的其它成分相容且對個體無害。組合物包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括口含、氣道和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內和皮內)給藥的組合物。該組合物可以方便地以單元劑量的形式存在，并可以由藥學領域中熟知的方法制備。這些方法包括使活性成分與構成一種或多種輔助成分的載體結合的步驟。一般地，該組合物通過以下方法制備使活性成分與液體載體、稀釋劑、助劑和/或賦形劑或者微細固體載體或二者均勻而緊密地結合，然后如果需要的話制成產品。
本文所用的術語“個體”指患有需要用藥學活性劑治療的疾病或病癥的任何動物。該個體可以是哺乳動物，優(yōu)選人，或者可以是家養(yǎng)或伴侶動物。雖然特別考慮到本申請的化合物適用于人的醫(yī)學治療，但它還可以應用于獸醫(yī)治療，包括治療伴侶動物如狗和貓和家養(yǎng)動物如馬、小型馬、驢、騾、美洲駝、羊駝、豬、牛和羊，或者動物園動物如靈長類、貓科動物、犬科動物、?？苿游锖陀刑泐悇游?。應理解，控制氣道平滑肌細胞增殖的機制主要通過哺乳動物保存，因此認為本申請的化合物廣泛應用于治療與許多物種的氣道平滑肌細胞增殖增加相關的病癥。
本文所用的術語“治療有效量”意指本申請的化合物有效地實現所期望的治療反應，例如預防或治療與氣道平滑肌細胞過度增殖相關的病癥如哮喘的量。
顯然，特定的“治療有效量”將隨諸如以下的因素而變化被治療的具體病癥、個體的身體狀況、被治療的個體的類型、治療的持續(xù)時間、同時治療(如果有的話)的性質以及所用的特定制劑和該化合物或其衍生物的結構。
可以將本申請的化合物另外地與其它藥物組合得到一種可操作的組合。本申請意在包括藥學活性劑的任何化學相容的組合，只要這種組合不消除式I或II的化合物的活性。應理解，本申請的化合物和其它藥物可以單獨、序慣或同時給藥。
當病癥為哮喘時，其它藥物可以包括，例如抗炎藥、預防劑、緩解劑和癥狀控制劑現有療法中的一種或多種。
用于制備藥物組合物的方法和藥學載體在本領域中是熟知的，如諸如以下的教科書所述Remington′s Pharmaceutical Sciences，20thEdition，Williams & Wilkins，Pennsylvania，USA。
本文所用的“藥學載體”是用于將式I的化合物遞送至個體的藥學可接受的溶劑、助懸劑或賦形劑。該載體可以是液體或固體，并根據計劃的給藥方式來選擇。各種載體必須是藥學“可接受的”，其含義是與該組合物的其它成分相容，并對個體無害。
式I的化合物可以口服、局部或腸胃外以包含常規(guī)無毒的藥學可接受的載體、助劑和賦形劑的劑量單元制劑給予。本文所用的術語腸胃外包括皮下注射、用于肺或鼻腔給藥的氣霧劑形式、靜脈內注射、肌內注射、鞘內注射、顱內注射或者輸注技術。
本申請還提供用于本申請的新治療方法的適宜的局部、口服和腸胃外藥物制劑。本申請的化合物可以作為片劑、水或油混懸劑、糖錠、錠劑、散劑、顆粒劑、乳劑、膠囊劑、糖漿劑或酏劑經口服給藥?？诜褂玫慕M合物可以包含一種或多種選自甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以產生藥學上精致美味的制劑。適宜的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬甜素或糖精。適宜的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原酸膠、膨潤土、海藻酸或瓊脂。適宜的調味劑包括薄荷油、冬綠油、櫻桃、橙或覆盆子調味劑。適宜的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。適宜的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。適宜的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。該片劑包含與適于制備片劑的無毒的藥學可接受的賦形劑混合的活性成分。
這些賦形劑可以是例如(1)惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；(2)成粒劑或崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；(3)粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和(4)潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。這些片劑可以是未包衣的，或者可以由已知的技術包衣以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而提供在較長時間內的持續(xù)作用。例如，可以使用延時材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。還可以使用美國專利4,256,108、4,160,452和4,265,874中所述的技術進行包衣，以形成用于控釋的滲透性治療片劑。
為進行體內施用，用于該方法的式I的化合物和藥學活性劑可以單獨或一起通過注射或者通過一段時間內緩慢輸注而腸胃外給藥。給藥可以是靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、腔內、經皮給藥或者通過例如滲透泵進行輸注。為進行體外研究，可以將這些活性劑加入或溶解于適宜的生物學可接受的緩沖液中，并加入細胞或組織中。腸胃外給藥制劑包括無菌含水或非水溶液、懸浮液和乳液。
一般地，術語“治療(treating)”、“治療(treatment)”等在本文中意指影響個體、組織或細胞以獲得期望的藥理學和/或生理學效果。該效果在完全或部分預防疾病或者其征候或癥狀方面而言可以是預防性的和/或在部分或完全治愈疾病方面而言可以是治療性的。本文所用的“治療(treating)”涵蓋脊椎動物、哺乳動物特別是人的疾病的任何治療或預防，包括(a)預防可能有患病傾向但尚未診斷為患病的個體發(fā)生疾病；(b)抑制疾病，即阻止它的發(fā)展；或者(c)緩解或改善該疾病的影響，即導致該疾病的影響消退。
該組合物包括用于改善疾病的多種藥物組合物。根據本申請的一個實施方案，該藥物組合物通過以下方法制備使用載體、賦形劑和添加劑或助劑將式I的化合物、其類似物、衍生物或鹽，或者式I的化合物和一種或多種藥學活性劑的組合變成適于給予個體的形式。經常使用的載體或助劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露糖醇和其它糖、滑石、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素和其衍生物、動物和植物油、聚乙二醇和溶劑如無菌水、醇、甘油和多羥基醇。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其它藥學可接受的載體包括水溶液、無毒賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩沖劑等，如例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams and Wilkins(2000)和The British National Formulary 43rd ed.(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain，2002；http://bnf.rhn.net)中所述，這些文獻的內容在此被引入作為參考。根據本領域技術常識調節(jié)該藥物組合物的不同組分的pH和精確濃度。參見See Goodman and Gilman的The Pharmacological Basis forTherapeutics(7th ed.，1985)和Remington的Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams和Wilkins(2000)。
該藥物組合物優(yōu)選制備成劑量單元并以此給藥。固體劑量單元可以是片劑、膠囊劑和栓劑。可以通過單次給予單個劑量單元或多個較小劑量單元的形式來進行日劑量的給予，還可以通過以特定的時間間隔多次給予細分的劑量來進行日劑量的給予。
該藥物組合物可以以治療有效劑量局部或全身給藥。當然此應用的有效量取決于疾病的嚴重程度和個體的體重與一般狀況。通常體外使用的劑量可以為用于藥物組合物原位給予的量提供有用的指導，并可以用動物模型確定治療細胞毒性副作用的有效劑量。各種考慮事項在例如Langer，Science，2491527，(1990)中有描述。
式I的化合物的優(yōu)選的劑量水平的數量級為大約0.1mg至大約150mg/千克體重，更優(yōu)選數量級為50-100mg/千克體重，特別優(yōu)選劑量為大約50mg/千克體重/日?？梢耘c載體材料組合以產生單一劑量的活性成分的量將隨被治療的宿主和特定的給藥方式而變化。例如，欲用于口服給予人的制劑可以包含大約5mg-1g活性化合物和適宜、方便量的載體材料，該載體材料可以占總成分的大約5-95％。劑量單元形式一般包含大約5mg-500mg的活性成分。
供口服使用的制劑可以是硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合。它們還可以是軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油介質如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
含水懸浮液一般包含與適于制備含水懸浮液的賦形劑混合的活性材料。這些賦形劑可以是(1)助懸劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；(2)分散劑或潤濕劑，其可以是(a)天然存在的磷脂，例如卵磷脂；(b)環(huán)氧烷和脂肪酸的縮合產物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產物，例如十七烷乙烯氧基十六醇；(d)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或者(e)環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。
式I的化合物還可以以脂質體遞送系統，例如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡的形式給藥。脂質體可以由多種磷脂，例如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿形成。
實施例
現在將通過僅參考以下非限制性實施例的方式詳細描述本發(fā)明。
制備式I的侯選化合物
實施例1
合成2-甲氧基-6-(4′-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇(″4NO″)
實施例1a
通過用在吡啶中的乙酸酐處理將2-甲氧基雌二醇(1)二乙酰基化，收率為95％。用在乙酸/水混合物中的三氧化鉻進行該雙保護物質(species)的芐基氧化，收率為45％。通過用在甲醇水溶液中的碳酸鉀處理新形成的酮化合物(3)除去二種乙酸酯，收率98％。然后用在甲醇中的O-(4-硝基芐基)羥胺進行該酮的縮合，得到2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇(5)，收率99％。
路線9
實施例1b
3，17-雙-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯(2)
在氮氣氛下將2-甲氧基雌二醇(127.5mg，0.426mmol)溶于無水吡啶(6.0mL)中，并冷卻至0℃。滴加乙酸酐(3.0mL)，并使反應物暖至室溫。攪拌過夜后，將反應混合物冷卻至0℃，此時加入50.0mL 1M鹽酸水溶液，并使反應物暖至室溫。用乙酸乙酯(3×50mL)進行萃取，并依次用3M鹽酸水溶液(50mL)、水(50mL)和鹽水(50mL)洗滌合并的有機萃取液。用硫酸鈉干燥有機層，然后過濾，并將溶劑真空濃縮，得到白色固體(154mg)。當用TLC分析時產物是均勻的，因此認為沒有必要純化，但使用1∶5乙酸乙酯/石油溶劑油作為洗脫液在硅膠柱上純化分析樣品。
Rf 0.88[乙酸乙酯-石油溶劑油(1∶1)，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ6.86(s，1H)，6.71(s，1H)，4.67(t，J＝8.3Hz，1H)，3.78(s，3H)，2.77-2.74(m，2H)，2.28(s，3H)，2.04(s，3H)，2.26-1.23(m，13H)，0.81(s，3H)。
實施例1c
3，17-雙-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯(3)
在90分鐘的時間內通過攪拌將三氧化鉻(79.8mg，0.798mmol)溶于2.0mL 90％(v/v)乙酸水溶液中。在10℃下將該氧化混合物滴加入3，17-雙-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯(2)(72.5mg，0.188mmol)的攪拌溶液中。將該混合物于10℃下攪拌30分鐘，此時將反應物傾倒在冰/水混合物(30mL)上，用乙酸乙酯(3×15mL)進行萃取。用水(20mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(20mL)、水(20mL)和鹽水(20mL)洗滌合并的萃取液，然后用硫酸鈉干燥，并過濾。蒸發(fā)有機溶劑得到黃色固體殘余物。通過閃蒸硅膠色譜法純化此殘余物，使用1∶3乙酸乙酯/石油溶劑油混合物作為洗脫液，得到白色固體(34mg，45％)。
Rf 0.36[乙酸乙酯-石油溶劑油(1∶3)，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ7.73(s，1H)，6.92(s，1H)，4.71(t，J＝8.5Hz，1H)，3.90(s，3H)，2.69(dd，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.53(dt，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.31(s，3H)，2.06(s，3H)，2.40-1.34(m，13H)，0.83(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ195.81，171.10，168.92，155.40，146.95，138.42，126.06，121.79，108.36，82.09，55.97，49.74，43.49，43.26，42.63，39.57，36.38，27.36，25.35，22.92，21.12，20.52，11.84。
實施例1d
2-甲氧基-6-氧代-雌二醇(4)
在氮氣氛下將無水碳酸鉀(20mg，0.145mmol)加入在8.0mL甲醇中的3，17-雙-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯(3)(7)(34mg，0.085mmol)的攪拌溶液中。加入水(3.0mL)，并將反應物在室溫下攪拌16小時。通過滴加1M鹽酸水溶液將反應物的pH調節(jié)至pH4。用乙酸乙酯(3×10mL)進行萃取，然后用水(10mL)和鹽水溶液(10mL)洗滌合并的層，然后用硫酸鈉干燥，并過濾。真空蒸發(fā)溶劑得到米色固體，通過閃蒸硅膠色譜法(3∶2乙酸乙酯∶石油溶劑油)純化得到26.4mg(98％)目標化合物，為白色結晶固體。
熔點189-190℃(分解)；Rf 0.34[乙酸乙酯-石油溶劑油(3∶2)，硅膠]；1H NMR(CD3OD)δ7.36(s，1H)，6.91(s，1H)，3.92(s，3H)，3.66(t，J＝8.5Hz，1H)，2.52(dd，J＝16.8，3.5Hz，1H)，2.43-1.26(m，12H)，0.76(s，3H)。
實施例1e
2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇(″4NO″)(5)
在氮氣氛下向在甲醇(25.0mL)中的2-甲氧基-6-氧代-雌二醇(4)(176.0mg，0.556mmol)的攪拌溶液中加入4-硝基芐基羥胺鹽酸鹽(266mg，1.574mmol)。向此溶液中加入4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，1.033g)，并將反應混合物加熱回流。17小時后，將反應物冷卻至室溫，并在真空下除去溶劑。將粗產物溶于無水四氫呋喃中，并用PS-異氰酸酯(裝載1.25mmol/g，2.522g)樹脂處理15.5小時。通過硅藻土濾墊(celite pad)過濾混合物，并再用四氫呋喃(4×50mL)洗脫得到淺黃色溶液，將其真空蒸發(fā)得到無定形固體(257mg，99％)。
Rf 0.60[乙酸乙酯-石油溶劑油(2∶1)，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ8.21(d，8.8Hz，2H)，7.53(d，8.8Hz，2H)，7.46(s，1H)，6.78(s，1H)，5.49(s，1H)，5.27(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.6Hz，1H)3.14(dd，J＝18.1，4.4Hz，1H)，2.19-1.22(m，12H)，0.77(s，3H)；ESIMS-[M+H]+m/z＝467；HRESI-MS[M+H]+ 467.2185(467.2182計算值)。
實施例2
合成2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(″4NOM″)(10)
實施例2a
在回流下將2-甲氧基雌酮與過量的在甲醇中的羥胺縮合得到2-甲氧基雌酮-17-肟(6)，為一種單一幾何異構體。此化合物沒有進行純化，而用在吡啶中的乙酸酐處理得到3，17-二乙?；垦苌?7)，兩步收率為90％。用在乙酸/水混合物中的三氧化鉻將乙?；Ｗo的物質芐基氧化，得到6-氧代衍生物，將其立即脫保護得到2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(9)，該兩步收率為71％。用在甲醇中的4-硝基芐基羥胺處理該酮得到2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(10)，收率為33％。
路線10
實施例2b
2-甲氧基雌酮-17-肟(6)
在氮氣氛下向在無水甲醇(160.0mL)中的2-甲氧基雌酮(1.698g，5.651mmol)的懸浮液中加入羥胺鹽酸鹽(1.110g，15.97mmol)，通過緩慢加熱該混合物至35℃達到完全溶解。加入4-聚乙烯基吡啶(8.00g，25％交聯)，并使反應物回流。14.5小時后，將反應冷卻至室溫，并在真空下除去溶劑。將殘余物懸浮在無水四氫呋喃(60.0mL)中，并通過燒結玻璃漏斗過濾。進一步用四氫呋喃(40.0mL，50.0mL)洗滌樹脂，并將濾液真空蒸發(fā)得到粗產物，為白色泡沫狀物(1.942g)。
Rf 0.28[乙酸乙酯-石油溶劑油(1∶2)，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ6.79(s，1H)，6.65(s，1H)，5.50(s，1H)，3.86(s，3H)，2.90-2.70(m，2H)，2.60-1.32(m，13H)，0.96(s，3H)；ESIMS-[M+H]+m/z＝316。
實施例2c
3-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(7)
在氮氣氛下將粗2-甲氧基雌酮-17-肟(6)(1.937g)溶于吡啶(12.0mL，148.8mmol)中。攪拌下滴加乙酸酐(6.0mL，63.6mmol)。在室溫下繼續(xù)攪拌16小時，此時通過小心加入1M氯化銨水溶液(50.0mL，50.0mmol)來終止反應物反應。然后用乙酸乙酯(100mL，然后2×50mL)萃取反應混合物，并用1M氯化銨溶液(3×50mL)、1M鹽酸水溶液(50mL)、水(50mL)和鹽水(50mL)洗滌合并的有機層。用無水硫酸鈉干燥有機相，過濾，并真空蒸發(fā)，然后高真空干燥得到灰白色固體(2.099g)，兩步收率為90％。
Rf 0.38[乙酸乙酯-石油溶劑油(1∶2)，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ6.89(s，1H)，6.75(s，1H)，3.81(s，3H)，2.84-2.72(m，2H)，2.60-1.32(m，13H)，2.31(s，3H)，2.16(s，3H)1.02(s，3H)。
實施例2d
3-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(8)
在60分鐘的時間內在振搖下將三氧化鉻(2.26g，22.6mmol)溶于50.0mL 90％(v/v)乙酸水溶液中。5-8℃下將此氧化混合物滴加入3-乙酰氧基-2-甲氧基雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(7)(2.099g，5.07mmol)的攪拌溶液中。將該混合物于5-8℃下攪拌42分鐘，此時通過加入水(150mL)來終止反應物反應。然后用乙酸乙酯(2×150mL，然后100mL)萃取反應混合物，并用飽和碳酸氫鈉水溶液(3×100mL)、水(100mL)和鹽水(100mL)洗滌合并的萃取液。然后用硫酸鈉干燥有機相，并通過硅藻土濾墊過濾，進一步用乙酸乙酯(2×20mL)洗滌。蒸發(fā)溶劑得到淺黃色固體。當用TLC分析時產物是均勻的，因此認為沒有必要純化，但是用1∶1乙酸乙酯/石油溶劑油作為洗脫液在硅膠柱上純化分析樣品。
Rf 0.28[乙酸乙酯-石油溶劑油(1∶1)，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ7.77(s，1H)，6.95(s，1H)，3.93(s，3H)，2.69(dd，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.53(dt，J＝16.9，3.4Hz，1H)，2.31(s，3H)，2.06(s，3H)，2.40-1.34(m，13H)，1.05(s，3H)；ESIMS-[M+H]+m/z＝414。
實施例2e
2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(9)
在氮氣氛下將無水碳酸鉀(12.56g，90.87mmol)加入在甲醇(150mL)中的粗3-乙酰氧基-2-甲氧基-6-氧代雌-1，3，5(10)三烯-17-酮乙酰肟(8)的攪拌溶液中。13.5小時后，加入水并將反應物于40℃下攪拌12小時。然后用水(150mL)稀釋反應混合物，并通過滴加1M鹽酸水溶液將溶液的pH調節(jié)至pH7。用乙酸乙酯(3×150mL)進行萃取，然后用水(150mL)和鹽水(150mL)洗滌合并的層，之后用硫酸鈉干燥，并過濾。真空蒸發(fā)溶劑得到米色固體，通過閃蒸硅膠色譜法(2∶1乙酸乙酯∶石油溶劑油)純化，得到1.233g(71％，兩步)灰白色固體。
Rf 0.46[乙酸乙酯-石油溶劑油(2∶1)，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ7.61(s，1H)，6.85(s，1H)，5.57(s，1H)，3.97(s，3H)，2.77(dd，J＝16.6，3.4Hz，1H)，2.61-1.41(m，12H)，0.97(s，3H)；ESIMS-[M+H]+m/z＝330。
實施例2f
2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(″4NOM″)(10)
在氮氣氛下向在無水甲醇(10.0mL)中的2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(9)(22.8mg，0.069mmol)的攪拌溶液中加入4-硝基芐基羥胺鹽酸鹽(42.5mg，0.208mmol)和4-聚乙烯基吡啶(185.0mg，25％交聯)。將反應物于室溫下攪拌24小時，此時真空蒸發(fā)溶劑。在室溫下，將該淺黃色殘余物懸浮在無水四氫呋喃(15.0mL)和用PS-苯甲醛樹脂(177.0mg)凈化的過量的親核試劑中24小時。在固相萃取柱(SupelcoLC-CN)上過濾該固體，并進一步用四氫呋喃(4×5.0mL)洗滌，然后在氮氣流下除去溶劑得到淺黃色油狀物，進一步通過閃蒸硅膠色譜法(2∶1乙酸乙酯∶石油溶劑油)進行純化，得到11.2mg(33％)所需的產物，為淺黃色固體。
Rf 0.33[乙酸乙酯-石油溶劑油(3∶2)，硅膠]；ESIMS-[M+H]+m/z＝480
1H NMR(CDCl3)δ8.21(d，J＝8.7Hz，2H)，7.54(d，J＝8.7Hz，2H)，7.48(s，1H)，6.78(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.27(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝18.1，4.4Hz，1H)，2.65-1.21(m，12H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ170.63，154.16，148.08，147.41，146.09，143.97，135.09，128.34，123.58，123.27，109.89，106.83，74.67，55.87，53.20，43.97，41.84，36.50，33.56，29.43，25.55，25.07，22.91，17.01；ESI-MS(20v)m/z 480(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+480.2125(480.2135計算值)。
實施例3
合成2-芐氧基亞氨基甲基雌二醇和2-(4-硝基芐氧基)亞氨基甲基雌二醇
路線11
通過Pert和Ridley的方法[23]制備2-甲?；贫?，然后分別與芐基羥胺和4-硝基芐基羥胺縮合得到2-芐氧基亞氨基甲基雌二醇(Y＝H；12a)和2-(4-硝基芐氧基)亞氨基甲基雌二醇(Y＝NO2；12b)。
將兩份在5mL無水THF中的2-甲酰基雌二醇(7.2mg，0.190mmol)溶液在氮氣氛下攪拌，并將如下所示的O-芳基羥胺(以它們的鹽酸鹽)加到每一份中。
表1
在加入各羥胺時，將一定量的25％交聯的聚(4-乙烯基吡啶)(200-220mg)加入每一個反應管中，將每管加熱回流，并攪拌16小時。使反應物冷卻至室溫，并將PS-苯甲醛凈化劑樹脂(32-42mg，裝載1.31mmol/g)加入每管中。將反應物攪拌2小時，此時通過聚乙烯玻璃料過濾除去所有的殘余物。用THF(3×5mL)洗滌殘余物，并在氮氣流下除去剩余的溶劑。
通過薄層色譜法(SiO2，1∶1；乙酸乙酯∶石油溶劑油)、高效液相色譜法；22分鐘內梯度洗脫70％CH3CN/H2O-98％ CH3CN/H2O(Phenomenex C18 column spherex 5，(250×4.6mm))以及電霧化質譜法分析得到的產物。結果見下表。
表2
實施例4
制備6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-36)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例4a
制備N-(3，5-二氟芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
在氮氣氛下向在25mL無水四氫呋喃中的N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(試劑A)(592.3mg，3.631mmol)溶液中加入3，5-二氟芐基溴(試劑B)(516.7μL，3.994mmol)。然后攪拌下滴加N，N-二異丙基乙胺(試劑C)(1.367mL，7.988mmol)立即引起顏色變化。將反應物加熱回流并在此溫度下保持20小時，之后冷卻至室溫，形成稠厚的白色沉淀。然后將反應混合物用25mL水稀釋，之后用5×25mL乙酸乙酯萃取。用水(25mL)和鹽水(25mL)洗滌合并的有機部分，之后用無水硫酸鈉干燥。真空蒸發(fā)得到936.1mg產物(D)(89％)，為白色固體。
Rf 0.375[二氯甲烷，硅膠]；1H NMR(CDCl3)δ7.86-7.75(m，4H)，7.11-7.09(m，2H)，6.85-6.79(m，1H)，5.17(s，2H)。ESI-MS(40V)m/z 312(100)[M+Na]+，601(34)[2M+Na]+。
實施例4b
制備O-(3，5-二氟芐基)羥胺鹽酸鹽
在氮氣氛和攪拌下將N-(3，5-二氟芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺(D)(143.0mg，0.494mmol)溶于5mL冰乙酸中，并滴加37％鹽酸(1.00mL，31.8mmol)。將反應物加熱回流并在此溫度下保持3小時，之后冷卻至室溫。將反應混合物在氮氣流下蒸發(fā)，之后懸浮于0.2M氫氧化鈉水溶液中。通過滴加6M氫氧化鈉水溶液將混合物的pH調節(jié)至pH8＜10。用3×15mL乙酸乙酯萃取，將合并的有機萃取液用無水硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)得到淺黃色油狀物，將其溶于乙醇(1mL)中，之后滴加在乙醚(3mL)中的1M鹽酸，立即產生白色沉淀。加入另外的乙醚(25mL)，離心，傾析，進一步用乙醚(25mL)洗滌，進一步離心和傾析，之后風干，得到白色固體(E)(78.6mg，82％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.92(br s，3H)，7.24(tt，J＝9.6，2.4Hz，1H)，7.17-7.09(m，2H)，4.96(s，2H)；ESI-MS(20V)m/z 160(100)[M+H]+，143(43)[M+H-NH2]+。
實施例4c
制備6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-36)
在氮氣氛下將2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟(F)(15.0mg，0.0455mol)、O-(3，5-二氟芐基)羥胺鹽酸鹽(E)(11.6mg，0.059mmol)和4-聚乙烯基吡啶(G)(25％交聯，200mg)都加入反應器中，并在室溫和攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在室溫下進行64小時，此時將反應混合物真空蒸發(fā)。將得到的殘余物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，并用PS-苯甲醛樹脂(H)(46mg，1.20mmolg-1)處理。將懸浮液通過LC-C18固相萃取柱過濾，進一步用3×5mL THF處理。蒸發(fā)，之后通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(1∶1)]純化，得到白色無定形固體。(20.2mg，94％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.50(s，1H)，6.89-6.82(m，2H)，6.78(s，1H)，6.76-6.64(m，1H)，5.15(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H，2.62-1.20(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z471(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 471.2086(471.2095計算值)。
實施例5
制備6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-35)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為15.1mg(0.048mmol)，作為試劑E，O-(3，5-二氟芐基)羥胺鹽酸鹽的使用量為12.1mg(0.062mmol)，樹脂G的使用量為210mg，而樹脂H的使用量為43.0mg。反應進行64小時。獲得產物2-甲氧基-6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌二醇，收率為88％。
1H NMR(CDCl3)δ7.49(s，1H)，6.89-6.87(m，2H)，6.78(s，1H)，6.74-6.68(m，1H)，5.50(br s，1H)，5.15(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.5Hz，1H)，3.14(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.62-1.22(m，12H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ164.04(dd，J＝248.0，13.0Hz)，155.41，149.02，144.93(t，J＝9.9Hz)，136.51，124.55，111.32(dd，J＝18.7，6.5Hz)，110.95，107.92，107.90，103.86(t，J＝25.2Hz)，82.69，75.71，56.90，51.53，44.09，42.88，38.30，37.26，31.63，30.61，26.76，24.14，12.00；ESI-MS(20v)m/z 458(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 458.2131(458.2143計算值)。
實施例6
制備6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-66)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例6a
制備N-(3-甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，3-甲氧基芐基溴使用486.1μL(3.47mmol)，試劑A的使用量為514.8mg(3.16mmol)，而試劑C使用1.20mL(7.01mmol)。反應在回流下進行15小時。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷進行萃取。獲得產物D，N-(3-甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率為95％。
1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.70(m，4H)，7.26(m，1H)，7.10-7.06(m，2H)，6.89(dd，J＝8.3，2.8Hz，1H)，5.17(s，2H)，3.80(s，3H)。
實施例6b
制備O-(3-甲氧基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(3-甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用211.5mg(0.791mmol)，冰乙酸的使用量為10mL，而37％鹽酸的使用量為2.00mL(63.6mmol)。反應在回流下進行4.5小時。獲得產物E，O-(3-甲氧基芐基)羥胺鹽酸鹽，收率為92％。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.15(br s，3H)，7.32(t，J＝7.5Hz，1H)，6.97-6.92(m，3H)，4.88(s，2H)，3.76(s，3H)。
實施例6c
制備6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-66)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為13.0mg(0.040mmol)，來自實施例6b的試劑E的使用量為9.7mg(0.051mmol)，樹脂G的使用量為103.9mg，而樹脂H的使用量為35.0mg。反應進行64小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率45％。
1H NMR(CDCl3)δ7.55(s，1H)，7.26(m，1H)，7.15(br s，1H)，7.01-6.97(m，2H)，6.84(dd，J＝8.1，2.6Hz，1H)6.77(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.17(s，2H)，3.91(s，3H)，3.82(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.63-1.24(m，12H)，0.76(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 465(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 465.2385(465.2389計算值)。
實施例7
制備6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-62)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為11.2mg(0.035mmol)，來自實施例6b的試劑E的使用量為8.7mg(0.046mmol)，樹脂G的使用量為120.2mg，而樹脂H的使用量為35mg。反應進行64小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率70％。
1H NMR(CDCl3)δ7.54(s，1H)，7.26(m，1H)，6.97(m，2H)，6.84(dd，J＝8.4，2.6Hz，1H)6.77(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.11(s，2H)，3.90(s，3H)，3.81(s，3H)，3.73(t，J＝8.5Hz，1H)，3.13(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.33-1.15(m，12H)，0.76(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ159.59，153.86，147.88，143.88，139.94，135.37，129.32，123.76，120.41，113.60，113.22，109.99，106.84，81.64，76.06，55.82，55.21，50.50，43.02，41.83，37.27，36.22，30.57，29.58，25.71，23.08，10.94；ESI-MS(20v)m/z 452(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+452.2432(452.2437計算值)。
實施例8
制備6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-67)
該化合物通過兩種中間體來制備，各階段相應于實施例4中所述。
實施例8a
制備N-(3-三氟甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，3-三氟甲氧基芐基溴使用546.0μL(3.37mmol)，試劑A的使用量為499.1mg(3.16mmol)，而試劑C使用1.20mL(7.01mmol)。反應在回流下進行15小時。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷進行萃取。獲得產物D，N-(3-三氟甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率94％。
1H NMR(CDCl3)δ7.82-7.71(m，4H)，7.47(d，J＝7.7Hz，1H)，7.42-7.38(m，2H)，7.22-7.20(m，1H)，5.19(s，2H)。
實施例8b
制備O-(3-三氟甲氧基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(3-三氟甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用202.8mg(0.631mmol)，冰乙酸的使用量為10mL，而37％鹽酸的使用量為2.00mL(63.6mmol)。反應在回流下進行4.5小時。獲得產物(E)O-(3-三氟甲氧基芐基)羥胺鹽酸鹽，收率90％。
1H NMR(DMSO-d6)δ9.79(br s，3H)，7.54(dd，J＝8.6，7.9Hz1H)，7.43-7.36(m，3H)，4.90(s，2H)。
實施例8c
制備6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-67)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，(2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟)的使用量為14.1mg(0.043mmol)，來自實施例8b的試劑E的使用量為13.6mg(0.056mmol)，樹脂G的使用量為124mg，而樹脂H的使用量為35.0mg。反應進行64小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率34％。
1H NMR(CDCl3)δ7.52(s，1H)，7.40-7.26(m，3H)，7.14(d，7.9Hz，1H)，6.78(s，1H)，5.50(br s，1H)，5.20(s，2H)，3.91(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.67-1.24(m，12H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ170.93，153.79，149.25，147.91，143.91，140.79，135.01，129.65，123.51，120.46(q，J＝257.1Hz)，120.34，119.97，109.88，106.74，75.14，55.83，53.17，43.94，41.83，36.48，33.57，29.42，25.58，25.02，22.85，17.00；ESI-MS(20v)m/z 519(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 519.2102(519.2107計算值)。
實施例9
制備6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-63)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為11.0mg(0.035mmol)，來自實施例8b的試劑E的使用量為11.0mg(0.045mmol)，樹脂G的使用量為141.3mg，而樹脂H的使用量為35mg。反應進行64小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率25％。
1H NMR(CDCl3)δ7.49(s，1H)，7.37-7.23(m，3H)，7.12-7.11(m，1H)，6.76(s，1H)，5.43(br s，1H)，5.17(s，2H)，3.89(s，3H)，3.72(t，J＝8.5Hz，1H)，3.12(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H，2.32-1.17(m，12H)，0.75(s，3H)；ESI-MS(60v)m/z 506(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 506.2155(506.2154計算值)。
實施例10
制備6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-68)
該化合物通過兩種中間體來制備，各階段相應于實施例4中所述。
實施例10a
制備N-(4-三氟甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，4-三氟甲氧基芐基溴使用490.9μL(3.07mmol)，試劑A的使用量為455.0mg(2.79mmol)，而試劑C使用1.20mL(7.01mmol)。反應在回流下進行15小時。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷進行萃取。獲得產物D，N-(4-三氟甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率91％。+；HRESI-MS[M+H]+ 519.2101(519.2107計算值)。
實施例11
制備6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-64)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為11.4mg(0.036mmol)，來自實施例10b的試劑E的使用量為11.4mg(0.047mmol)，樹脂G的使用量為133.1mg，而樹脂H的使用量為35mg。反應進行64小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率29％。
1H NMR(CDCl3)δ7.52(s，1H)，7.43(d，J＝8.7Hz，2H)，7.19(d，J＝7.9Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.47(br s，1H)，5.17(s，2H)，3.91(s，3H)，3.74(t，J＝8.5Hz，1H)，3.12(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.34-1.17(m，12H)，0.76(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 506(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 506.2149(506.2154計算值)。
實施例12
制備6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-69)
該化合物通過兩種中間體來制備，各階段相應于實施例4中所述。
實施例12a
制備N-(4-三氟甲硫基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，4-三氟甲硫基芐基溴使用747.8mg(2.77mmol)，試劑A的使用量為475.5mg(2.91mmol)，而試劑C使用1.20mL(7.01mmol)。反應在回流下進行15小時。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷進行萃取。獲得產物D，N-(4-三氟甲硫基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率95％。
1H NMR(CDCl3)δ7.86-7.73(m，4H)，7.68(d，J＝8.2Hz，2H)，7.61(d，J＝8.2Hz，2H)，5.25(s，2H)。
實施例12b
制備O-(4-三氟甲硫基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(4-三氟甲硫基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用203.1mg(0.602mmol)，冰乙酸的使用量為10mL，而37％鹽酸的使用量為2.00mL (63.6mmol)。反應在回流下進行4.5小時。獲得產物E，O-(4-三氟甲硫基芐基)羥胺鹽酸鹽，收率84％。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.36(br s，3H)，7.76(d，J＝8.1Hz，2H)，7.54(d，J＝8.3Hz，2H)，4.99(s，2H)。
實施例12c
制備6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-69)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為15.5mg(0.047mmol)，來自實施例12b的試劑E的使用量為15.9mg(0.061mmol)，樹脂G的使用量為116.9mg，而樹脂H的使用量為35.0mg。反應進行64小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率68％。
1H NMR(CDCl3)δ7.90(br s，1H)7.64(d，J＝8.1Hz，2H)7.52(s，1H)，7.45(d，J＝8.1Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.22(s，2H)，3.91(s，3H)，3.21(dd，J＝17.9，4.6Hz，1H)，2.64-1.39(m，12H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ170.70，153.76，147.94，143.93，141.63，136.30，135.00，129.57(q，J＝308Hz)，128.84，123.46，109.90，106.77，75.15，53.17，43.97，41.80，36.45，33.54，29.42，25.52，25.08，22.90，16.99；ESI-MS(20v)m/z 535(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 535.1873(535.1878計算值)。
實施例13
制備6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-65)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為11.2mg(0.035mmol)，來自實施例12b的試劑E的使用量為11.9mg(0.046mmol)，樹脂G的使用量為133.8mg，而樹脂H的使用量為35mg。反應進行64小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率87％。
1H NMR(CDCl3)δ7.63(d，J＝8.2Hz，2H)7.51(s，1H)，7.44(d，J＝8.3Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.21(s，2H)，3.90(s，3H)，3.16(dd，J＝18.1，4.6Hz，1H)，2.34-1.18(m，12H)，0.77(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 522(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+522.1922(522.1926計算值)。
實施例14
制備6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-15)
該化合物通過兩種中間體來制備，各階段相應于實施例4中所述。
實施例14a
制備N-(4-吡啶基甲氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，(4-溴甲基)吡啶氫溴酸鹽使用2.048g(8.098mmol)，試劑A的使用量為1.201g(7.362mmol)，而試劑C使用3.665mL(22.08mmol)。反應在室溫下于50.0mL四氫呋喃中進行136小時。用3×50mL乙酸乙酯萃取。將合并的萃取液用水(50mL)、50％飽和鹽水(100mL)和鹽水(50mL)洗滌。甲苯中重結晶，獲得產物D，N-(4-吡啶基甲氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率34％。
1H NMR(CDCl3)δ8.66(d，J＝5.4Hz，2H)，7.85-7.74(m，4H)，7.48(d，J＝5.6Hz，2H)，5.24(s，2H)。
實施例14b
制備O-(4-吡啶基甲基)羥胺二鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(4-吡啶基甲氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用103.3mg(0.602mmol)，37％鹽酸的使用量為2.00mL(63.6mmol)。反應在回流下進行2.5小時。獲得產物O-(4-吡啶基甲基)羥胺二鹽酸鹽(E)，收率50％。
1H NMR(CD3OD)δ8.90(d，J＝6.1Hz，2H)，8.03(d，J＝6.1Hz，2H)，5.26(s，2H)。
實施例14c
制備6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-15)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為16.5mg(0.050mmol)，來自實施例14b的試劑E的使用量為12.8mg(0.065mmol)，樹脂G的使用量為172.4mg，而樹脂H的使用量為37.1mg。反應進行90小時。通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(3∶1)]純化。獲得產物2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基雌酮-17肟，收率46％。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.13(br s，1H)，8.54(d，J＝4.7Hz，2H)，7.35(d，J＝4.8Hz，2H)，7.22(s，1H)，6.81(s，1H)，5.19(s，2H)，3.77(s，3H)，3.14(dd，J＝17.6，4.5Hz，1H)，2.56-1.20(m，12H)，0.83(s，3H)；13C NMR(CDCl3+DMSO-d6)δ154.85，149.67，149.29，149.12，144.98，134.98，122.38，110.53，110.49，108.64，80.29，73.56，55.78，50.17，43.02，41.75，37.51，36.45，30.26，29.52，25.68，23.08，11.48；ESI-MS(20v)m/z 436(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 436.2225(436.2236計算值)。
實施例15
制備6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-16)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為13.7mg(0.043mmol)，來自實施例14b的試劑E的使用量為11.1mg(0.056mmol)，樹脂G的使用量為140.2mg，而樹脂H的使用量為32.5mg。反應進行90小時。通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(3∶1)]純化。獲得產物2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基雌二醇，收率52％。
1H NMR(CDCl3)δ8.58(d，J＝4.9Hz，1H)，7.47(s，2H)，7.33(d，J＝4.9Hz，2H)，6.78(s，1H)，5.21(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.4Hz)，3.16(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.37-1.20(m，12H)，0.78(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 423(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 423.2271(423.2283計算值)。
實施例16
制備6-(4-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-38)
該化合物通過兩種中間體來制備，各階段相應于實施例4中所述。
實施例16a
制備N-(4-氰基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，4-氰基芐基溴使用773.4mg(3.95mmol)，試劑A的使用量為585.0mg(3.59mmol)，而試劑C使用1.35mL(7.89mmol)。反應在回流下進行20小時。用3×50mL二氯甲烷進行萃取。將合并的萃取液用水(50mL)、50mL鹽水洗滌。獲得產物D，N-(4-氰基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率73％。
1H NMR(DMSO-d6)δ7.89(d，J＝8.2Hz，2H)，7.85(m，4H)，7.73(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27(s，2H)。
實施例16b
制備O-(4-氰基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(4-氰基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用143.1mg(0.514mmol)。反應在回流下進行3小時。獲得產物O-(4-氰基芐基)羥胺鹽酸鹽(E)，收率70％。
1H NMR(DMSO-d6)δ7.89(d，J＝8.1Hz，2H)，7.59(d，J＝7.9Hz，2H)，5.02(s，2H)。
實施例16c
制備6-(4-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-38)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為14.0mg(0.043mmol)，來自實施例16b的試劑E的使用量為10.2mg(0.055mmol)，樹脂G的使用量為200mg，而樹脂H的使用量為48.0mg。反應進行64小時。獲得產物2-甲氧基-6-(4-氰基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率74％。
1H NMR(CDCl3)δ7.64(d，J＝8.2Hz，2H)，7.49(d，J＝8.4Hz，2H)，7.48(s，1H)，6.77(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.22(s，2H)，3.91(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.60-1.25(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 460(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+460.2235(460.2236計算值)。
實施例17
制備6-(4-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-37)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為11.7mg(0.037mmol)，來自實施例16b的試劑E的使用量為8.9mg(0.046mmol)，樹脂G的使用量為200mg，而樹脂H的使用量為49mg。反應進行64小時，獲得產物2-甲氧基-6-(4-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率77％。
1H NMR(CDCl3)δ7.64(d，J＝8.0Hz，2H)，7.48(d，J＝8.6Hz，2H)，7.47(s，1H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.22(s，2H)，3.90(s，3H)，3.73(t，J＝9.0Hz，1H)，3.13(dd，J＝18.0，4.5Hz，1H)，2.18-1.22(m，12H)，0.77(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ154.41，147.95，144.14，143.82，135.46，132.15，128.24，123.36，118.92，111.26，109.78，106.80，81.58，74.87，55.82，50.43，43.00，41.77，37.20，36.16，30.52，29.52，25.67，23.07，10.94；ESI-MS(60v)m/z 447(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 447.2275(447.2284計算值)。
實施例18
制備6-(3-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-51)
該化合物通過兩種中間體來制備，各階段相應于實施例4中所述。
實施例18a
制備N-(3-氰基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，3-氰基芐基溴使用773.4mg(3.95mmol)，試劑A的使用量為585.0mg(3.59mmol)，而試劑C使用1.35mL(7.89mmol)。反應在回流下進行20小時。用3×50mL二氯甲烷進行萃取。將合并的萃取液用水(50mL)、50mL鹽水洗滌。獲得產物D，N-(3-氰基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率73％。
1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.75(m，6H)，7.68(d，J＝7.9Hz，1H)，7.53(dd，J＝8.1，7.8Hz，1H)，5.23(s，2H)。
實施例18b
制備O-(3-氰基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(3-氰基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用143.1mg(0.514mmol)。反應在回流下進行3小時。獲得產物O-(3-氰基芐基)羥胺鹽酸鹽(E)，收率70％。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.75(br s，3H)，7.88-7.85(m，2H)，7.75(d，J＝7.9Hz，1H)，7.64(dd，J＝7.9，7.8Hz，1H)，5.05(s，2H)。
實施例18c(CP-DM-4-51)
制備6-(3-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為14.0mg(0.043mmol)，來自實施例18b的試劑E的使用量為10.2mg(0.055mmol)，樹脂G的使用量為200mg，而樹脂H的使用量為48.0mg。反應進行64小時。通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(2∶3)]純化。獲得產物2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率74％。
1H NMR(CDCl3)δ7.78(br，s1H)，7.68(s，1H)，7.62(d，J＝7.8Hz，1H)，7.59(d，J＝7.7Hz，1H)，7.48-7.44(m，2H)，6.78(s，1H)，5.55(br s，1H)，5.20(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝17.9，4.4Hz，1H)，2.65-1.25(m，12H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ171.19，154.00，148.02，143.94，140.11，135.02，132.26，131.38，131.27，129.10，123.32，118.89，112.44，109.85，106.77，74.73，55.85，53.19，44.07，41.77，36.45，33.51，29.40，25.54，25.27，22.88，16.97；ESI-MS(20v)m/z 460(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+460.2231(460.2236計算值)。
實施例19
制備6-(3-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-52)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為11.7mg(0.037mmol)，來自實施例18b的試劑E的使用量為8.9mg(0.046mmol)，樹脂G的使用量為200mg，而樹脂H的使用量為49mg。反應進行64小時。獲得產物2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率77％。
1H NMR(CDCl3)δ7.67(s，1H)，7.61(d，J＝7.7Hz，1H)，7.57(d，J＝7.7Hz，1H)，7.53-7.43(m，2H)，6.78(s，1H)，5.54(brs，1H)，5.19(s，2H)，3.90(s，3H)，3.74(t，J＝8.5Hz，1H)3.12(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.34-1.22(m，12H)，0.77(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ154.43，147.95，143.82，140.23，135.48，132.20，131.31，131.22，129.07，123.39，118.89，112.41，109.80，106.83，81.59，74.64，55.82，50.43，43.00，41.76，37.20，36.17，30.53，29.53，25.67，23.07，10.93；ESI-MS(20v)m/z 447(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+447.2283(447.2284計算值)。
實施例20
制備6-(4-甲基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-76)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例20a
制備N-(4-甲基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，4-甲基芐基溴使用590.3μL(2.90mmol)，試劑A的使用量為590.3mg(3.19mmol)，而試劑C使用1.20mL(7.01mmol)。反應在回流下進行15小時。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷進行萃取。獲得產物D，N-(4-甲基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率90％。
1H NMR(CDCl3)δ7.82-7.72(m，4H)，7.42(d，J＝8.1Hz，1H)，7.18(d，J＝7.9Hz，2H)，5.17(s，2H)，2.35(s，3H)。
實施例20b
制備O-(4-甲基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(4-甲基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用214.8mg(0.855mmol)，冰乙酸的使用量為10mL，而37％鹽酸的使用量為2.00mL(63.6mmol)。反應在回流下進行4.5小時。獲得產物O-(4-甲基芐基)羥胺鹽酸鹽(E)，收率21％。
1H NMR(DMSO-d6)δ9.77(br s，3H)，7.26(d，J＝8.0Hz，2H)，7.20(d，J＝7.9Hz，2H)，4.81(s，2H)，2.30(s，3H)。
實施例20c
制備6-(4-甲基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-76)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為8.8mg(0.027mmol)，來自實施例20b的試劑E的使用量為6.0mg(0.035mmol)，樹脂G的使用量為107.1mg，而樹脂H的使用量為40.3mg。反應進行90小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(4-甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率43％。
1H NMR(CDCl3)δ7.56(s，1H)，7.32(d，J＝7.8Hz，2H)，7.17(d，J＝7.9Hz，2H)，6.77(s，1H)，5.50(br s，1H)，5.15(s，2H)，3.91(s，3H)，3.22(dd，J＝18.1，4.4Hz，1H)，2.63-1.24(m，12H)，2.35(s，3H)，0.92(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 449(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 449.2435(449.2440計算值)。
實施例21
制備6-(4-甲基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇(CP-DM-4-78)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為6.2mg(0.020mmol)，來自實施例20b的試劑E的使用量為4.4mg(0.025mmol)，樹脂G的使用量為120.4mg，而樹脂H的使用量為22.3mg。反應進行90小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(4-甲基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率25％。
1H NMR(CDCl3)δ7.54(s，1H)，7.31(d，J＝7.7Hz，2H)，7.16(d，J＝7.7Hz，2H)，6.76(s，1H)，5.45(br s，1H)，5.14(s，2H)，3.90(s，3H)，3.10(dd，J＝18.1，4.6Hz，1H)，2.34(s，3H)，2.33-1.17(m，12H)，0.75(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 436(100)[M+H]+。
實施例22
制備6-(4-異丙基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-77)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例22a
制備N-(4-異丙基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例4中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，4-異丙基芐基溴使用563.0μL(2.99mmol)，試劑A的使用量為488.5mg(3.29mmol)，而試劑C使用1.20mL(7.01mmol)。反應在回流下進行15小時。用1×15mL乙酸乙酯和2×25mL二氯甲烷進行萃取。獲得產物D，N-(4-異丙基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率98％。
1H NMR(CDCl3)δ7.86-7.71(m，4H)，7.47(d，J＝8.0Hz，2H)，7.24(d，J＝8.1Hz，2H)，5.18(s，2H)，2.91(七重峰，J＝6.9Hz，1H)，1.24(s，3H)，1.23(s，3H)。
實施例22b
制備O-(4-異丙基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例4b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(4-異丙基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用208.6mg(0.747mmol)，冰乙酸的使用量為10mL，而37％鹽酸的使用量為2.00mL(63.6mmol)。反應在回流下進行4.5小時。獲得產物O-(4-異丙基芐基)羥胺鹽酸鹽(E)，收率24％。
1H NMR(DMSO-d6)δ7.33-7.20(m，4H)，4.80(s，2H)，2.89(七重峰，J＝7.0Hz，1H)，1.20(s，3H)，1.18(s，3H)。
實施例22c
制備6-(4-異丙基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-4-77)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為6.3mg(0.019mmol)，來自實施例22b的試劑E的使用量為4.1mg(0.025mmol)，樹脂G的使用量為106.4mg，而樹脂H的使用量為35.1mg。反應在回流下進行90小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(4-異丙基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率21％。
1H NMR(CDCl3)δ7.57(s，1H)，7.35(d，J＝8.1Hz，2H)，7.22(d，J＝8.1Hz，2H)，6.77(s，1H)，5.47(br s，1H)，5.16(s，2H)，3.91(s，3H)，3.19(dd，J＝17.9，4.6Hz，1H)，2.91(七重峰，J＝7.0Hz，1H)2.63-1.20(m，12H)，1.44(s，3H)，1.43(s，3H)，0.92(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 477(100)[M+H]+。
實施例23
制備6-(3-硝基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟(CP-DM-3-105)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例23a
制備N-(3-硝基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
在氮氣氛下向在25mL無水四氫呋喃中的N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(試劑A)(1.059g，6.418mmol)中加入3-硝基芐基溴(試劑B)(1.543mL，7.141mmol)。然后攪拌下滴加N，N-二異丙基乙胺(試劑C)(2.155mL，12.98mmol)，立即產生顏色變化。反應物在室溫下保持19小時。然后將反應混合物用25mL四氫呋喃和100mL水稀釋，之后用3×100mL乙酸乙酯萃取。將合并的有機部分用水(100mL)和鹽水(100mL)洗滌，之后用無水硫酸鈉干燥。通過閃蒸硅膠色譜法[二氯甲烷]純化。真空蒸發(fā)得到877.6mg白色固體(D)(45％)。
1H NMR(CDCl3)δ8.39(dd，J＝1.9，1.9Hz，1H)，8.25(dd，J＝8.2，2.3Hz，1H)，7.95(d，J＝7.7Hz，1H)，7.60(dd，J＝8.0，7.9Hz，1H)，7.84-7.75(m，4H)，5.30(s，2H)。
實施例23b
制備O-(3-硝基芐基)羥胺鹽酸鹽
將N-(3-硝基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺(D，來自實施例23b)(166.2mg，0.557mmol)加入15mL乙醇中，并加入一定量的二氯甲烷(7.5mL)。在氮氣氛和攪拌下將肼水合物(試劑1)(29.8μL，0.613mmol)加入反應物中。將反應物加熱回流，在此溫度下保持18小時，之后冷卻至室溫。將反應物真空蒸發(fā)，并懸浮于5mL乙醇中，將懸浮液在室溫下攪拌2小時，之后通過過濾除去固體。將殘余物用另外的3mL乙醇洗滌。將濾液和洗液合并，蒸發(fā)，并通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(2∶3)]純化。將得到的油狀物溶解在乙醇(2mL)中，之后加入鹽酸(1M，在乙醚中)和乙醚20mL，得到白色沉淀。過濾固體，進一步用乙醚洗滌，得到產物(E)，收率94％。
1H NMR(CD3OD)δ8.39-8.20(m，2H)，7.84(d，J＝7.6Hz，1H)，7.70(dd，J＝8.1，7.9Hz，1H)，5.11(s，2H)。
實施例23c
制備2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基-雌酮-17-肟(CP-DM-3-105)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為14.7mg(0.045mmol)，來自實施例23b的試劑E的使用量為11.9mg(0.058mmol)，樹脂G的使用量為72.1mg，而樹脂H的使用量為33.5mg。反應物進行28小時。通過聚乙烯玻璃料濾過。獲得產物2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率為68％。
1H NMR(CDCl3)δ8.26(s，1H)，8.16(d，J＝8.1Hz，1H)，7.73(d，J＝7.6Hz，1H)，7.51(dd，J＝8.0，7.9Hz，1H)，7.49(s，1H)，7.41(br s，1H)，6.78(s，1H)，5.52(br s，1H)，5.27(s，2H)，3.91(s，3H)，3.23(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.63-1.22(m，12H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ170.81，154.22，148.31，148.02，143.91，140.78，135.12，133.96，129.25，123.29，122.80，122.63，109.85，106.77，74.64，55.84，53.15，43.95，41.83，36.48，33.55，29.44，25.55，25.05，22.88，17.01；ESI-MS(20v)m/z 480(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 480.2135(480.2135計算值)。
實施例24
制備2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇(CP-DM-3-106)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為16.3mg(0.052mmol)，來自實施例23b的試劑E的使用量為26.3mg(0.129mmol)，樹脂G的使用量為60mg，而樹脂H的使用量為193mg。反應進行60小時。通過聚乙烯玻璃料過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率為92％。
1H NMR(CDCl3)δ8.25(d，J＝1.6Hz，1H)，8.15(dd，J＝8.1Hz，2.1Hz，1H)，7.72(d，J＝7.7Hz，1H)，7.52(dd，J＝8.1，7.9Hz，1H)，7.48(s，1H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.26(s，2H)，3.90(s，3H)，3.75(t，J＝8.6Hz，1H)，3.15(dd，J＝18.0，4.6Hz，1H)，2.36-1.20(m，12H)，0.77(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ154.60，148.30，147.96，143.80，140.80，135.52，133.90，129.23，123.36，122.74，122.57，109.80，106.82，81.60，74.55，55.81，50.41，43.00，41.77，37.21，36.15，30.53，29.56，25.67，23.05，10.93；ESI-MS(20v)m/z467(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 467.2179(467.2182計算值)。
實施例25
制備2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(CP-DM-3-117)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例25a
制備N-(2-硝基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例23a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，2-硝基芐基溴使用1.6306g(7.548mmol)，來自實施例23a的試劑A的使用量為1.1193g(6.861mmol)，而試劑C使用2.277mL(13.72mmol)。反應在室溫下進行41小時。將另外量的試劑B[2-硝基芐基溴](313.5mg，1.45mmol)加入反應混合物中，反應在室溫下持續(xù)另外48小時。將反應物用水(50mL)稀釋。氯仿重結晶獲得產物D，N-(2-硝基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率為51％。
1H NMR(CDCl3)δ8.14(d，J＝8.3Hz，1H)，8.01(d，J＝7.8Hz)，7.90-7.68(m，5H)，7.54(dd，J＝8.3，7.8Hz，1H)，5.65(s，2H)。
實施例25b
制備O-(2-硝基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例23b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(2-硝基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用188.4mg(0.632mmol)，試劑I的使用量為33.8μL(0.695mmol)。反應在15mL乙醇中回流下進行20小時。加入另外量的試劑I(5μL，0.103mmol)，反應在回流下持續(xù)另外24小時。獲得產物O-(2-硝基芐基)羥胺鹽酸鹽(E)，收率為23％。
1H NMR(CD3OD)δ8.17(d，J＝8.3Hz，1H)，7.51-7.83(m 3H)，5.44(s，2H)。
實施例25c
制備2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(CP-DM-3-117)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為13.5mg(0.041mmol)，來自實施例25b的試劑E的使用量為10.5mg(0.051mmol)，樹脂G的使用量為80mg，而樹脂H的使用量為35mg。反應進行66小時。獲得產物2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率為88％。
1H NMR(CDCl3)δ8.05(d，J＝8.1Hz，1H)，7.61(m，2H)，7.46-7.40m，2H)，6.77(s，1H)，5.59(s，2H)，3.91(s，3H)，3.25(dd，J＝18.1，4.6Hz，1H)，2.71-1.24(m，12H)，1.00(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 480(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 480.2136(480.2135計算值)。
實施例26
制備2-甲氧基6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇(CP-DM-3-124)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為16.3mg(0.052mmol)，來自實施例25b的試劑E的使用量為15.8mg(0.077mmol)，樹脂G的使用量為98.3mg，而樹脂H的使用量為52mg。反應進行48小時。通過將產物溶于甲醇(8mL)中并用C18柱(裝載300mg)過濾來純化。獲得產物2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率為99％。
1H NMR(CDCl3)δ8.06(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63-7.57(m，2H)，7.46-7.38，m，2H)，7.49(s，1H)，6.78(s，1H)，5.59(s，2H)，3.90(s，3H)，3.76(t，J＝8.6Hz，1H)，3.19(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.34-1.20(m，12H)，0.77(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 467(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 467.2179(467.2182計算值)。
實施例27
制備2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(CP-DM-4-6)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例27a
制備N-(4-甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例23a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，4-甲氧基芐基溴使用0.9777g(7.204mmol)，來自實施例23a試劑A的使用量為1.0684g(6.549mmol)，而來自實施例23a的試劑C使用2.173mL(13.10mmol)。反應在室溫下進行41小時。將另外量的試劑B[4-甲氧基芐基氯](250.0μL，1.835mmol)加入反應混合物中，反應在室溫下持續(xù)另外40小時。用水(50mL)稀釋反應物。獲得產物D，N-(4-甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，粗收率為72％。
1H NMR(CDCl3)inter alia δ7.83-7.77(m，2H)，7.76-7.70(m，2H)，7.45(d，J＝8.4Hz，2H)，7.29(d，J＝8.4Hz，2H)，5.15(s，2H)，3.81(s，3H)。
實施例27b
制備O-(4-甲氧基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例23b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為粗試劑D，N-(4-甲氧基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用291.9mg(1.030mmol)，而試劑I的使用量為101.3μL(2.084mmol)。反應在6mL乙醇和3mL二氯甲烷中回流下進行21小時。獲得產物O-(4-甲氧基芐基)羥胺鹽酸鹽(E)，收率為23％。
1H NMR(CD3OD)δ7.36(d，J＝8.7Hz，2H)，6.97(d，J＝8.7Hz，2H)，4.92(s，2H)，3.81(s，3H)。
實施例27c
制備2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(CP-DM-4-6)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，(2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟)的使用量為19.7mg(0.060mmol)，來自實施例27b的試劑E的使用量為11.5mg(0.075mmol)，樹脂G的使用量為100.4mg，而樹脂H的使用量為117.6mg。反應進行24小時。將來自實施例27b的另外量的試劑E加入反應混合物(4.9mg，0.032mmol)中，反應持續(xù)另外44小時。獲得產物2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率為70％。
1H NMR(CDCl3)δ7.57(s，1H)，7.37(d，J＝8.5Hz，2H)，6.90(d，J＝8.5Hz，2H)，6.76(s，1H)，5.54(br s，1H)，5.12(s，2H)，3.91(s，3H)，3.81(s，3H)，3.16(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.62-1.39(m，12H)，0.92(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ170.82，159.26，153.05，147.74，143.89，134.82，130.31，130.05，123.88，113.69，109.91，106.72，75.94，55.84，55.24，53.19，43.96，41.80，36.46，33.55，29.41，25.55，25.05，22.90，16.98；ESI-MS(20v)m/z 465(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 465.2382(465.2390計算值)。
實施例28
制備2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇(CP-DM-4-5)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌二醇的使用量為17.3mg(0.055mmol)，來自實施例27b的試劑E的使用量為10.5mg(0.068mmol)，樹脂G的使用量為86.6mg，而樹脂H的使用量為91.3mg。反應進行24小時。將另外量的試劑E加入反應混合物(3.5mg，0.022mmol)中，反應持續(xù)另外40小時。通過將產物溶于甲醇(8mL)中并用C18柱(裝載300mg)過濾來純化。獲得產物2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇，收率為80％。
1H NMR(CDCl3)δ7.56(s，1H)，7.36(d，J＝8.5Hz，2H)，6.89(d，J＝8.7Hz，2H)，6.77(s，1H)，5.51(br s，1H)，5.11(s，2H)，3.90(s，3H)，3.81(s，3H)，3.72(t，J＝8.3Hz，1H)，3.16(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.35-1.14(m，12H)，0.75(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 452(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 452.2435(452.2437計算值)。
實施例29
制備2-甲氧基-6-(3-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(CP-DM-3-118)
該化合物通過如下所述的兩種中間體來制備。
實施例29a
制備N-(3-三氟甲基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺
使用與以上實施例23a中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑B，3-三氟甲基芐基溴使用1.1019g(7.214mmol)，試劑A的使用量為1.070g(6.559mmol)，而試劑C使用2.246mL(13.18mmol)。反應在室溫下進行41小時。將另外量的試劑B[3-三氟甲基芐基溴](250.0mg，1.63mmol)加入反應混合物中，反應在室溫下持續(xù)另外48小時。將反應物用水(50mL)稀釋。通過閃蒸硅膠色譜法[甲苯，然后二氯甲烷]純化。獲得產物D，N-(3-三氟甲基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺，收率為39％。
1H NMR(CDCl3)δ7.89-7.72(m，6H)，7.64(d，J＝7.8Hz，1H)，7.53(dd，J＝8.0，7.6Hz，1H)，5.26(s，2H)。
實施例29b
制備O-(3-三氟甲基芐基)羥胺鹽酸鹽
使用與以上實施例23b中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑D，N-(3-三氟甲基芐氧基)鄰苯二甲酰亞胺使用588.0mg(1.737mmol)，而試劑I的使用量為101.3μL(2.084mmol)。反應在乙醇(6mL)和二氯甲烷(3mL)中回流下進行16小時。加入另外量的乙醇(5mL)和二氯甲烷(2.5mL)，反應在回流下持續(xù)另外5小時。獲得產物O-(3-三氟甲基芐基)羥胺鹽酸鹽(E)，收率為13％。
1H NMR(CD3OD)δ7.78-7.60(m，4H)，5.10(s，2H)。
實施例29c
制備2-甲氧基-6-(3-三氟甲基芐氧基)亞氨基-雌酮-17-肟(CP-DM-3-118)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，(2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟)的使用量為7.5mg(0.023mmol)，來自實施例29b的試劑E的使用量為6.5mg(0.029mmol)，樹脂G的使用量為80mg，而樹脂H的使用量為30mg。反應進行66小時。通過LC-CN固相萃取柱過濾。獲得產物2-甲氧基-6-(3-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟，收率為95％。
1H NMR(CDCl3)δ7.66(br s，1H)，7.62-7.44(m，4H)，6.78(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.23(s，2H)，3.91(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.4Hz，1H)，2.62-1.16(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 503(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 503.2155(503.2158計算值)。
實施例30
制備6-(2，4-二硝基苯基亞肼基)-2-甲氧基-雌酮-17-肟(CP-DM-3-119)
使用與以上實施例4c中所描述的相同的方法，具有如下的變化。
作為試劑F，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-肟的使用量為11.6mg(0.035mmol)，試劑E(2，4-二硝基苯肼)的使用量為8.7mg(0.044mmol)，樹脂G的使用量為80mg，而樹脂H的使用量為35mg。將一定量的鹽酸(37％，100.0μL)加入反應物中。反應在室溫下進行16小時。通過將產物溶于甲醇(8mL)中并用C18柱(裝載300mg)過濾來純化。獲得產物6-(2，4-二硝基苯基亞肼基)-2-甲氧基-雌酮-17-肟，收率為24％。
1H NMR(CDCl3)δ9.16(d，J＝2.1Hz，1H)，8.38(dd，J＝9.7，2.1Hz，1H)，8.15(d，J＝9.7Hz，1H)，7.79(s，1H)，6.84(s，1H)，3.97(s，3H)，2.99(dd，J＝16.7，4.9Hz)，2.66-1.11(m，12H)，0.98(s，1H)；ESI-MS(20v)m/z 508(100)[M-H]-；HRESI-MS[M-H]-508.1825(508.1832計算值)。
實施例31
制備雌酮-17-(4-硝基芐基)肟(CP-DM-3-101)
在氮氣氛下將雌酮(16.0mg，0.059mmol)、O-(4-硝基芐基)羥胺(30.3mg，0.148mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，81.3mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在室溫下進行24小時，之后回流24小時。將反應物真空蒸發(fā)，并將PS-苯甲醛樹脂(222mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌60小時，之后通過聚乙烯玻璃料過濾，進一步用2×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到淺黃色固體，將其懸浮于甲醇(5mL)中。將該懸浮液通過C18柱(裝載300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到產物雌酮-17-(4-硝基芐基)肟，收率86％。
1H NMR(CDCl3)δ8.20(d，J＝8.6Hz，2H)，7.49(d，J＝8.8Hz，2H)，7.14(d，J＝8.4Hz，1H)，6.62(dd，J＝8.4，2.7Hz，1H)，6.56(d，J＝2.6Hz，1H)，5.17(s，2H)，4.93(br s，1H)，2.92-1.22(m，15H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ171.89，153.45，147.26，146.32，138.01，132.24，127.99，126.45，123.48，115.24，112.74，73.89，52.92，44.51，43.91，38.11，34.09，29.47，27.17，26.15，22.97，17.30；ESI-MS(20v)m/z 421(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+421.2122(421.2127計算值)。
實施例32
制備2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基芐基)肟(CP-DM-3-103)
在氮氣氛下將2-甲氧基雌酮(9.8mg，0.033mmol)、O-(4-硝基芐基)羥胺[可商購獲得](16.7mg，0.082mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，72.9mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。將反應在室溫下進行24小時，之后回流16小時。將反應物真空蒸發(fā)，并將PS-苯甲醛樹脂(122mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌60小時，之后通過聚乙烯玻璃料過濾，進一步用2×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到淺黃色固體，將其懸浮于甲醇(5mL)中。將該懸浮液通過C18柱(裝載300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到產物2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基芐基)肟，收率73％。
1H NMR(CDCl3)δ8.18(d，J＝8.7Hz，2H)，7.48(d，J＝8.6Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.63(s，1H)，5.47(br s，1H)，5.16(s，1H)，3.84(s，3H)，2.88-1.22(m，15H)，0.93(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ171.79，147.23，146.35，144.60，131.31，129.26，127.96，123.47，114.58，107.94，73.88，56.03，52.91，44.46，44.20，38.09，34.12，28.84，27.29，26.44，26.14，22.94，17.31；ESI-MS(20v)m/z 451(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 451.2222(451.2233計算值)。
實施例33
制備雌酮-17-(3-硝基芐基)肟(CP-DM-3-102)
試劑O-(3-硝基芐基)羥胺通過上述實施例23a和23b的方法制備。
在氮氣氛下將雌酮(14.9mg，0.055mmol)、O-(3-硝基芐基)羥胺[來自實施例23b](28.2mg，0.138mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，91.5mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在室溫下進行24小時，之后回流24小時。將反應物真空蒸發(fā)，將PS-苯甲醛樹脂(207mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌60小時，之后通過聚乙烯玻璃料過濾，進一步用2×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到淺黃色固體，將其懸浮于甲醇(5mL)中。將該懸浮液通過C18柱(裝載300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到產物雌酮-17-(3-硝基芐基)肟，收率77％。
1H NMR(CDCl3)δ8.23(br s，1H)，8.14(dd，J＝8.3，2.0Hz，1H)，7.66(d，J＝7.5Hz，1H)，7.51(dd，J＝7.9，7.8Hz，1H)，7.14(d，8.5Hz，1H)，6.63(dd，J＝8.4，2.8Hz，1H)，6.57(d，J＝2.7Hz，1H)，5.16(s，2H)，4.78(br s，1H)，2.92-1.22(m，15H)，0.94(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ172.18，153.61，148.46，141.10，138.27，133.86，132.53，129.34，126.71，122.84，122.66，115.44，112.94，74.07，53.11，44.74，44.13，38.32，34.32，29.71，27.39，26.40，23.20，17.51；ESI-MS(20v)m/z 421(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+421.2122(421.2127計算值)。
實施例34
制備2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基芐基)肟(CP-DM-3-104)
試劑O-(3-硝基芐基)羥胺通過上述實施例23a和23b的方法制備。
在氮氣氛下將2-甲氧基雌酮(9.7mg，0.032mmol)、O-(3-硝基芐基)羥胺[來自實施例23b](16.5mg，0.081mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，63.3mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在室溫下進行24小時，之后回流16小時。將反應物真空蒸發(fā)，并將PS-苯甲醛樹脂(121mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌60小時，之后通過聚乙烯玻璃料過濾，進一步用2×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到淺黃色固體，將其懸浮于甲醇(5mL)中。將該懸浮液通過C18柱(裝載300mg)，用另外量的甲醇(2mL)洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到產物2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基芐基)肟，收率76％。
1H NMR(CDCl3)δ8.24(s，1H)，8.15(dd，J＝8.8，2.1Hz，1H)，7.66(d，J＝7.6Hz，1H)，7.51(dd，J＝8.0，7.8Hz，1H)，7.14(d，8.5Hz，1H)，6.78(s，1H)，6.65(s，1H)，5.45(br s，1H)，5.16(s，2H)，3.86(s，3H)，2.94-1.24(m，15H)，0.95(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 451(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 451.2214(451.2233計算值)。
實施例35
制備雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟(CP-DM-4-33)
試劑O-(4-甲氧基芐基)羥胺通過上述實施例27a和27b的方法制備。
在氮氣氛下將雌酮(4.2mg，0.016mmol)、O-(4-甲氧基芐基)羥胺[來自實施例27b](4.4mg，0.023mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，101.9mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在回流下進行48小時。將反應物真空蒸發(fā)，并將PS-苯甲醛樹脂(44mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌70小時，之后通過LC-C18固相萃取柱過濾，進一步用4×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟，收率為94％。
1H NMR(DMSO-d6)δ9.00(s，1H)，7.26(d，J＝8.5Hz，2H)，7.03(d，J＝8.6Hz，1H)，6.89(d，J＝8.6Hz，2H)，6.49(d，J＝8.4Hz，1H)，6.42(s，1H)，4.90(s，2H)，3.73(s，3H)，2.77-1.16(m，15H)，0.86(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 406(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 406.2377(406.2382計算值)。
實施例36
制備2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟(CP-DM-4-34)
試劑O-(4-甲氧基芐基)羥胺通過上述實施例27a和27b的方法制備。
在氮氣氛下將2-甲氧基雌酮(4.6mg，0.015mmol)、O-(4-甲氧基芐基)羥胺[來自實施例27b](4.4mg，0.023mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，98.6mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在回流下進行48小時。將反應物真空蒸發(fā)，將PS-苯甲醛樹脂(50mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌70小時，之后通過LC-C18固相萃取柱過濾，進一步用4×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟，收率88％。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.56(br s，1H)，7.26(d，J＝8.2Hz，2H)，6.89(d，J＝8.4Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.44(s，1H)，4.91(s，2H)，3.74(s，3H)，3.71(s，3H)2.72-1.13(m，15H)，0.87(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 436(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 436.2491(436.2488計算值)。
實施例37
制備6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌三醇(CP-DM-4-88)
試劑O-(3，5-二氟芐基)羥胺通過上述實施例4a和4b的方法制備。
在氮氣氛下將6-氧代-雌三醇(8.4mg，0.028mmol)、O-(3，5-二氟芐基)羥胺[來自實施例4b](10.9mg，0.056mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，150mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在回流下進行48小時。將反應物真空蒸發(fā)，并將PS-苯甲醛樹脂(69.7mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌2.5小時，之后通過LC-CN固相萃取柱過濾，進一步用3×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到白色固體，通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(2∶1)]純化，得到產物6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌三醇，收率86％。
1H NMR(CD3OD/CDCl3)δ7.31(d，J＝2.7Hz，1H)，7.13(d，J＝8.6Hz，1H)，6.92-6.86(m，2H)，6.77(dd，J＝8.4，2.7Hz，1H)，6.73(tt，J＝6.8，2.2Hz，1H)，5.14(s，2H)，4.08-4.02(m，1H)，3.46(d，J＝5.9Hz，1H)，3.08(dd，J＝18.2，4.3Hz，1H)，2.30-1.23(m，10H)，0.73(s，3H)；ESIMS(20v)m/z 444(100)[M+H]+。
實施例38
制備2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇-17-乙酸酯(CP-DM-4-91)
在氮氣氛下將2-甲氧基雌二醇-17-乙酸酯(16.3mg，0.045mmol)、O-(4-硝基芐基)羥胺(18.6mg，0.091mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，150mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在回流下進行48小時。將反應物真空蒸發(fā)，并將PS-苯甲醛樹脂(113.6mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，室溫下攪拌2.5小時，之后通過LC-CN固相萃取柱過濾，進一步用3×5mL四氫呋喃洗滌。蒸發(fā)合并的濾液和洗液，得到產物2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇-17-乙酸酯，收率92％。
1H NMR(CDCl3)δ8.21(d，J＝8.4Hz，2H)，7.53(d，J＝8.6Hz，2H)，7.46(s，1H)，6.76(s，1H)，5.49(br s，1H)，5.26(s，2H)，4.69(t，J＝8.5Hz，1H)，3.90(s，3H)，3.15(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.28-1.31(m，12H)，2.07(s，3H)，0.81(s，3H)；ESIMS(20v)m/z 509(100)[M+H]+。
實施例39
制備2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基-雌酮-17-甲基肟(CP-DM-4-75)
該化合物通過如下所述的四種中間體來制備。
實施例39a
制備2-甲氧基雌酮-17-甲基肟
在氮氣氛和攪拌下將2-甲氧基雌酮(98.3mg，0.327mmol)溶于甲醇(12mL)中，并加入甲氧胺鹽酸鹽(82.0mg，0.981mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，207.0mg)。反應在回流下進行21小時，之后真空蒸發(fā)。將混合的固體懸浮于二氯甲烷(10mL)中，通過LC-CN固相萃取柱過濾，用另外的5mL二氯甲烷洗滌。真空蒸發(fā)得到無定形白色固體，收率為99％。
1H NMR(CDCl3)δ6.90(s，1H)，6.74(s，1H)，3.84(s，3H)，3.81(s，3H)，2.81-1.37(m，15H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 330(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 330.2082(330.2069計算值)。
實施例39b
制備2-甲氧基雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯
在室溫和氮氣氛下將2-甲氧基雌酮-17-甲基肟(106.5mg，0.323mmol)溶于吡啶(2.0mL，24.80mmol)中，攪拌下滴加乙酸酐(1.0mL，10.58mmol)。15.5小時后，將反應物用1M鹽酸水溶液稀釋，之后用3×10mL乙酸乙酯萃取。將合并的萃取液用水(10mL)和鹽水(10mL)洗滌，之后用無水硫酸鈉干燥。過濾并真空蒸發(fā)得到灰白色固體，收率90％。
1H NMR(CDCl3)δ6.89(s，1H)，6.74(s，1H)，3.85(s，3H)，3.81(s，3H)，2.81-1.33(m，15H)，2.29(s，3H)，0.93(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 372(100)[M+H]+。
實施例39c
制備2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯
將三氧化鉻(119.5mg，1.195mmol)溶于乙酸(1.80mL)和水(0.20mL)的混合物中。加入于乙酸(2.00mL)中的2-甲氧基雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯(104.5mg，0.281mmol)溶液，之后加入另外量的乙酸(1.80mL)和水(0.20mL)，并將反應物在5-8℃下保持50分鐘。將反應物用水(25mL)稀釋，之后用3×20mL乙酸乙酯萃取。將合并的萃取液用飽和碳酸氫鈉溶液(2×20mL)、水(20mL)和鹽水(20mL)洗滌，之后用無水硫酸鈉干燥。過濾并真空蒸發(fā)得到白色固體，收率87％。
1H NMR(CDCl3)δ7.75(s，1H)，6.95(s，1H)，3.91(br s，3H)，3.85(s，3H)，2.77(dd，J＝16.8，3.4Hz，1H)，2.62-1.25(m，12H)，2.32(s，3H)，0.96(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 386(100)[M+H]+。
實施例39d
制備2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟
在氮氣氛和攪拌下將2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟-3-乙酸酯(84.4mg，0.219mmol)溶于乙醇(10.0mL)中，并加入碳酸鉀(934mg，6.758mmol)。室溫下持續(xù)攪拌18小時，之后加入1M氯化銨溶液(25.0mL)。通過滴加6M鹽酸溶液將反應物pH進一步調節(jié)至pH＝7。用二氯甲烷(3×20mL)萃取。將合并的萃取液用水(20mL)和鹽水(20mL)洗滌，之后用無水硫酸鈉干燥。過濾并真空蒸發(fā)，得到粗產物。通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(1∶2)]純化。獲得產物，為白色固體，收率78％。
1H NMR(CDCl3)δ7.59(s，1H)，6.83(s，1H)，5.52(br s，1H)，3.96(s，3H)，3.83(s，3H)，2.73(dd，J＝16.8，3.5Hz，1H)，2.56-1.37(m，12H)，0.94(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 344(100)[M+H]+，366(64)[M+Na]+；HRESI-MS[M+H]+344.1851(344.1826計算值)。。
實施例39e
制備2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-甲基肟(CP-DM-4-75)
在氮氣氛和攪拌下將2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟(16.4mg，0.048mmol)和O-(4-硝基芐基)羥胺鹽酸鹽(12.7mg，0.062mmol)溶于甲醇(10mL)中。加入一定量的4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，217.4mg)，反應在室溫下進行66小時。將混合物真空蒸發(fā)，之后加入PS-苯甲醛樹脂(39mg，1.20mmolg-1)，并用四氫呋喃(10mL)溶劑化。將反應混合物攪拌另外的48小時，之后通過LC-CN固相萃取柱過濾，用另外的3×5mL四氫呋喃洗滌。將合并的萃取液和洗液蒸發(fā)得到黃色油狀殘余物，通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(3∶7)]純化，得到產物，收率66％。
1H NMR(CDCl3)δ8.21(d，J＝8.7Hz，2H)，7.54(d，J＝8.6Hz，2H)，7.47(s，1H)，6.78(s，1H)，5.50(br s，1H)，5.27(s，2H)，3.91(s，3H)，3.84(s，3H)，3.22(dd，J＝18.1，4.5Hz，1H)，2.58-1.25(m，12H)，0.93(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ169.65，154.22，148.03，147.36，146.11，143.89，135.20，128.34，127.83，123.58，123.22，109.79，106.77，74.65，55.85，53.19，43.85，41.82，36.49，33.68，29.46，25.60，22.97，17.10；ESI-MS(20v)m/z 494(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 494.2288(494.2291計算值)。
實施例40
制備2-甲氧基-6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌酮-17-甲基肟(CP-DM-4-74)
本實施例中使用的兩種試劑，2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟和O-(3，5-二氟芐基)羥胺鹽酸鹽分別由實施例39a-39d和4a-4b的方法制備。
在氮氣氛和攪拌下將2-甲氧基-6-氧代-雌酮-17-甲基肟[來自實施例39b](14.5mg，0.042mmol)和O-(3，5-二氟芐基)羥胺鹽酸鹽[來自實施例4b](10.7mg，0.055mmol)溶于甲醇(10mL)。加入一定量的4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，227.8mg)，反應在室溫下進行66小時。將混合物真空蒸發(fā)，之后加入PS-苯甲醛樹脂(39mg，1.20mmolg-1)，并用四氫呋喃(10mL)溶劑化。將反應混合物攪拌另外48小時，之后通過LC-CN固相萃取柱過濾，用另外的3×5mL四氫呋喃洗滌。將合并的萃取液和洗液蒸發(fā)得到黃色油狀殘余物，通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(2∶7)]純化得到產物，收率52％。
1H NMR(CDCl3)δ7.50(s，1H)，6.93-6.87(m，2H)，6.78(s，1H)，6.72(tt，J＝9.0，2.4Hz，1H)，5.48(br s，1H)，5.15(s，2H)，3.92(s，3H)，3.85(s，3H)，3.20(dd，J＝18.0，4.6Hz，1H)，2.60-1.25(m，12H)，0.93(s，3H)；ESI-MS(20v)m/z 485(100)[M+H]+；HRESI-MS[M+H]+ 485.2246(485.2252計算值)。
實施例40A
制備6-(4-硝基芐氧基)亞氨基-17-乙炔基-雌二醇(CP-DM-4-89)
在氮氣氛下將17-乙炔基-6-氧代-雌二醇(8.9mg，0.029mmol)、O-(3，5-4-硝基芐基)羥胺(11.7mg，0.057mmol)和4-聚乙烯基吡啶(25％交聯，150mg)都加入反應器中，并在攪拌下用甲醇(10mL)溶劑化。反應在回流下進行48小時。將反應物真空蒸發(fā)，將PS-苯甲醛樹脂(71.7mg，1.20mmolg-1)加入反應器中。將反應混合物懸浮于無水四氫呋喃(10mL)中，并在室溫下攪拌2.5小時，之后通過LC-CN固相萃取柱過濾，進一步用3×5mL四氫呋喃洗滌。將合并的濾液和洗液蒸發(fā)得到白色固體，通過閃蒸硅膠色譜法[乙酸乙酯-石油溶劑油(40-60℃)(1∶2)]純化，獲得產物6-(4-硝基芐氧基)亞氨基-17-乙炔基-雌二醇，收率43％。
1H NMR(CDCl3)δ8.22(d，J＝8.6Hz，2H)，7.53(d，J＝8.6Hz，2H)，7.35(d，J＝2.9Hz，1H)，7.21(d J＝8.5Hz，1H)，6.84(dd J＝8.5，2.9Hz，1H)，5.29(s，2H)，4.84(br s，1H)，2.62(s，1H)，3.14(dd，J＝18.3，4.6Hz，1H)，2.40-1.24(m，12H)，0.86(s，3H)；ESIMS(20v)m/z 461(100)[M+H]+。
實施例4-40A的化合物
實施例4-40A的化合物如下所示。
其他化合物的合成
下述化合物已經由或可以由上述類似的方法合成
2-甲氧基-6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(2-氰基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-氰基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(2-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(2-硝基苯氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-硝基苯氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(2-硝基苯氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-硝基苯氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(2-吡啶氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-吡啶氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-吡啶氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(2-吡啶氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-吡啶氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-吡啶氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基芐基)肟
2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基芐基)肟
6-(4-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇
6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-羧基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(2-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(2-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌二醇
實施例41
本發(fā)明化合物效力的研究
測試化合物對人氣道平滑肌細胞增殖的作用
(a)人氣道平滑肌的培養(yǎng)
根據以前詳細發(fā)表的方法(Fernandes等，1999)，培養(yǎng)人氣道平滑肌(HASM)細胞，其來自由Alfred Hospital(Melbourne)提供的肺切除或心-肺移植標本的肉眼檢查正常的支氣管(直徑0.5-2cm)。
對于每次細胞培養(yǎng)，從支氣管壁上剝離大約0.1g平滑肌。將切碎的組織浸于Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(FlowLaboratories，Scotland)中，補加100U/ml青霉素G(CSL，Australia)和100μg/ml鏈霉素(CSL，Australia)。在磷酸緩沖鹽水(PBS；oxoid，英國)中漂洗組織，并將氣道平滑肌切成2mm3的小塊，于37℃和攪拌下在含彈性蛋白酶(0.5mg/mLWorthington Biochemical，USA)的DMEM中消化2小時，之后在含膠原酶(1mg/ml)(WorthingtonBiochemical，USA)的DMEM中溫育12小時。
將得到的細胞懸液離心，并在磷酸緩沖鹽水(PBS)中洗滌三次。在最后的離心步驟之后，將細胞重懸于25mL補加有如下物質的DMEM中L-谷氨酸(2mMSigma，USA)、青霉素G(100U/ml)、鏈霉素(100μg/mL)、兩性霉素B(2μg/mLWellcome，UK)和熱滅活的FCS(1％v/vCLS，Australia)，并接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。將原代分離群培養(yǎng)7-14天達到匯合。
每周通過與胰蛋白酶(0.5％CLS，Australia)和EDTA(1mM，在PBS中BDH，Australia)接觸10分鐘來收集細胞，以1∶3的比例傳代接種于75cm2培養(yǎng)瓶中。
通過測定這些化合物對促分裂原誘導的細胞數目增加的作用確定了它們在細胞培養(yǎng)物中的活性。我們研究了2MEO及其類似物4NO和4NOM對HASM細胞對凝血酶或堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)增殖刺激物反應的增殖的作用。將細胞接種于6-孔板中，密度為1.5×104個細胞/cm2，通過去除含血清培養(yǎng)基24小時使細胞處于靜止狀態(tài)。然后用凝血酶(0.3U/mL)或bFGF(300pM)刺激48小時。將測試化合物與HASM細胞一起預培養(yǎng)30分鐘，之后加入凝血酶。在培養(yǎng)48小時結束時，通過胰蛋白酶(0.5％w/v，在含1mM EDTA的PBS中)將細胞從培養(yǎng)板上分離下來，室溫下在含0.5％(w/v)錐蟲藍的PBS中溫育5分鐘，洗滌兩次(2％FCS，在PBS中)，離心分離(12000×g，5分鐘)，并重懸于200μl 2％在PBS中的FCS中，在血細胞計數器小室中計數。
這些試驗的結果提供在圖1和表3中。數據以載體處理的孔中的細胞數的百分比表示，并以均值和平均標準誤表示。
表3.2MEO類似物對用凝血酶或bFGF刺激的人氣道平滑肌細胞增殖反應的作用
2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇(4NO)類似物顯示在寬的濃度范圍(10nM至10μM)對HASM細胞增殖的抑制活性(圖1)。令人驚奇地，2MEO的相關類似物2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(4NOM)比2MEO或4NO都更有效的多(圖1)。4NO的抑制活性對于用凝血酶或堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)作為促分裂原是相似的(表3)。對這兩個不同的促分裂原缺乏選擇性表明它和相關類似物不可能在對特定促分裂原的受體水平上起作用，而是影響有益于這些反應的細胞內信號途徑。
還使用了該測定法測試了其他公開的化合物對凝血酶誘導的人氣道平滑肌細胞增殖的抑制的作用，結果總結在表4的A欄至C欄中。
評價了這些化合物在上述培養(yǎng)物中保持的細胞中對調節(jié)凝血酶誘導的人氣道平滑肌(HASM)增殖的效能。效能以pIC50值表示(表4的A欄)，pIC50指使增殖反應降低50％的濃度的負對數。此外，因為一些化合物的抑制作用是雙相的，所以數據也用″二位″模型擬合，其中確定了化合物對于第一相相當于抑制達到50％和第二相抑制達到100％的效能，并以pIC25和pIC75值(分別為B欄和C欄)表示。當確定單相模型更合適時，則pIC25和pIC75的值不被計算或顯示在表中。
數據顯示與B環(huán)的C6連接的芐基羥亞氨基環(huán)上的取代產生這樣的化合物，其通常顯示出比2-甲氧基雌二醇具有更顯著高的調節(jié)增殖的效能。一組在17位上具有相似的芐基羥亞氨基取代基的化合物顯示出比相應的6-位類似物具有更低的效能。這類活性劑的調節(jié)平滑肌增殖的效能支持它們在治療以平滑肌增殖為特征的疾病中的應用。
還進行了更有限的化合物組對牛主動脈血管平滑肌的實驗。3μM的2-甲氧基雌二醇、CP-DM-2-11-7和CP-DM-3-91分別將bFGF(300pM)誘導的增殖減少了87±6％、75±14％和93±4％，這些觀測表明所公開的化合物可能對于包括心血管系統的血管平滑肌功能失調的疾病具有治療作用。
應理解這些測定法可以容易地用于測定所公開的化合物抑制凝血酶或bFGF誘導的人氣道平滑肌細胞增殖的能力。這些測定法也可以用于測試這些化合物抑制凝血酶或bFGF誘導的來自其他組織的平滑肌細胞例如血管平滑肌細胞的增殖的能力。
ND＝未測量
確定pIC50為4.00的化合物沒有活性
(b)流式細胞術分析細胞周期狀態(tài)
將細胞接種于6-孔板中，密度為1.5×104細胞/cm2，用前述方法使之處于靜止狀態(tài)，然后用凝血酶(0.3U/mL)刺激48小時。在加入促分裂原時將Monomed A加入所有細胞(包括對照細胞)中。
通過用胰蛋白酶(0.5％w/v)在37℃下溫育30分鐘來將細胞從培養(yǎng)板上分離下來。將得到的懸液用PBS洗滌兩次，之后重懸于1mL70％乙醇中，-20℃下貯存達3周。在染色之前，將細胞洗滌兩次(2％FCS，在PBS中)以除去乙醇。將固定的細胞用于含有RNA酶II(180mU/mL)的Triton X-100中的二碘化丙錠(50μg/mL)(0.1％v/v)染色。將細胞懸液通過18口徑的針以促進細胞團的分開。將細胞貯存24小時，然后分析。
使用Becton-Dickinson FACScan儀器(Becton Dickinson，NJ，USA)分析細胞周期狀態(tài)。對于每一樣本計數1萬個事件(event)，并用ModFitLT V2.0分析包(Verity Software House，ME，USA)進行分析。
沒有證據表明濃度低于3μM具有細胞毒性，細胞毒性通過細胞不能從培養(yǎng)板上脫離和細胞不能被錐蟲藍染色(少于5％)來證明。FACs特征(profile)表明凋亡不是類似物的作用特點，因為沒有亞G0/G1DNA含量的累積。因此，這些類似物看起來提供了特定的抗氣道平滑肌細胞增殖的作用。不希望被任何特定的提議的作用方式所束縛，這些結果表明本申請的化合物通過調節(jié)細胞內信號途徑起作用。
研究2MEO和4NOM在凝血酶(0.3U/mL)存在下對HASM形狀的影響。將類似物和HASM一起預培養(yǎng)30分鐘，之后加入凝血酶。培養(yǎng)持續(xù)48小時，之后捕獲HASM的圖像。
重要地，觀察到在等效的增殖抑制濃度下沒有檢測到4NO(1μM)對HASM細胞的形狀有影響，但是2MEO(10μM)導致大量細胞變圓。
可以使用相同的測定體系研究其他化合物對細胞周期和細胞死亡的作用。
實施例42
測試化合物對非平滑肌細胞增殖的作用
評價4NO對一些非平滑肌細胞類型包括II型氣道上皮細胞系A549(ATCC保藏號ATCC CCL-185人肺癌)(圖2)；人乳腺腫瘤細胞系MCF7(ATTC保藏號ATCC HTB-22人乳腺癌)，其表達雌激素受體體(圖3)；以及牛主動脈內皮細胞(BAEC)(圖4)。
檢測了測試化合物對A549細胞對5％胎牛血清(FCS)反應的增殖的作用。
將類似物與A549細胞一起預培養(yǎng)30分鐘，之后加入FCS。培養(yǎng)持續(xù)48小時，之后細胞計數。數據以載體處理孔中的細胞數的百分比表示，并且以均值和平均標準誤表示。類似地檢測了2MEO和4NO對MCF7對5％FCS或表皮生長因子(EGF，300pM)反應的增殖的作用，以及2MEO和4NO對BAEC對5％FCS反應的增殖的作用。培養(yǎng)參數同上述相同，結果以均值和平均標準誤表示。
令人驚奇地，在低于3μM的濃度下，沒有檢測到4NO對這些細胞類型中的任一類型細胞的增殖具有作用，表明該化合物對平滑肌細胞和成纖維細胞的特異性，而且對氣道中存在的各種其他細胞也沒有檢測到作用。相比之下，2MEO是每種細胞類型增殖的抑制劑。
該測定法也用于評價其他化合物抑制非平滑肌細胞MCF7和A549(如上所述)對5％FCS反應的增殖的抑制能力。測定結果顯示在表4(分別為G欄和H欄)中?；衔镆种七@些細胞系增殖的效能比對HASM低的多。這些觀測支持這些化合物的作用具有細胞類型特異性靶向的觀點。這些測定法也適合檢測其他公開的化合物對這些細胞或對其他感興趣的非平滑肌細胞的作用。
實施例43
比較測試化合物和地塞米松對HASM增殖的抑制
我們檢測了4NO(1μM)和糖皮質激素地塞米松(Dex，100nM)對HASM細胞對bFGF(300pM)反應的增殖的作用。地塞米松為常用的抗炎糖皮質激素。在標準的塑料組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)細胞。測試化合物和HASM一起預培養(yǎng)30分鐘，之后加入bFGF。培養(yǎng)持續(xù)7天，之后細胞計數(圖5)。數據以載體處理孔中的細胞數的百分比表示，并且以均值和平均標準誤表示。
塑料培養(yǎng)板上的HASM細胞的增殖減弱，但并沒有完全被地塞米松阻斷。相比而言，有利的是4NO使HASM細胞數顯著減少到低于地塞米松減少的水平。檢測了細胞外膠原基質上生長的HASM細胞對糖皮質激素和測試化合物的反應。將細胞在膠原包被的硅橡膠基底上培養(yǎng)。將測試化合物和HASM細胞一起預培養(yǎng)30分鐘，之后加入bFGF(300pM)。持續(xù)培養(yǎng)7天，之后細胞計數(圖6)。數據以載體處理孔中的細胞數的百分比表示，并且以均值和平均標準誤表示。
令人驚奇地，膠原ECM上的HASM細胞的增殖對地塞米松的調節(jié)具有抵抗性，表明在含膠原基質存在下該化合物的作用減弱。但是，4NO保持了它對在膠原ECM上的細胞的作為抗增殖活性劑的效能。這些觀測顯示，本發(fā)明公開的化合物與糖皮質激素相比更好地控制HASM細胞增殖。
實施例44
測試化合物對雌激素受體和微管蛋白的親和力
雌激素受體結合測定
如Hughes等，2002中所詳細描述，使用大鼠子宮細胞溶膠作為ER的來源(Markaverich等，1979)檢測雌二醇(E2)、2MEO和類似物的雌激素受體(ER)親和力。子宮(每批6-10個)分離自Brown Norway大鼠(250-350g)，用鹽水洗除血液，并在10mM Tris緩沖液(pH7.4，1.5mMEDTA、10％w/v甘油、1mM苯基甲基磺酰氟)中使用Ultra Turrax勻漿器冰上間隔1分鐘15秒脈沖勻漿3次。
通過4℃下750×g(Sorvall RT7)離心10分鐘去除核物質和細胞碎片；在Beckman JM1離心中4℃下30000×g離心120分鐘制備細胞溶膠成分。使用Bradford方法(Biorad)測定，將細胞溶膠稀釋至大約1mg/mL蛋白質(大鼠子宮提取物)。
通過在300μL上述緩沖液中4℃下溫育過夜來進行結合測定，所述緩沖液包含200μL細胞溶膠、50μL置換劑(displacer)(10μM雌二醇或緩沖液)和50μL 0.2nM[3H]-E2(150Ci/mmol)。加入500μL葡聚糖包被的活性炭(400mg臨床等級C的葡聚糖和2g活性炭Norit A，在100mL Tris緩沖液中)并在Sorval RT7中4℃下2000×g離心10分鐘來實現將結合的放射性配體與游離的分離。
在0.01-50nM[3H]-雌二醇范圍內進行飽和分析，得到Kd為0.18nM，而Bmax為112fmol/mg蛋白(n＝3，使用Graph Pad PrismTM進行分析)，顯示0.2nM濃度適合于置換(displacement)研究。在0.1nM-10μM范圍內以0.5至1.0對數級增加進行2MEO和類似物的分析，在確定適合的范圍后，使用每十進制3-4個濃度來測定對雌二醇的置換。
數據用Cheng和Prussof方程擬合，使用Kd為0.18nM(如飽和分析所測定)，數據以pIC50(產生放射標記最大置換的50％的濃度的負對數)表示。
結果顯示在表5中。
用于秋水仙堿結合測定的微管蛋白純化
檢測了2MEO及其類似物將3H-秋水仙堿從部分純化的微管蛋白上的它的結合位點上替換的能力。對于該結合測定，部分純化的微管蛋白由Williams和Lee的聚合-解聚方法(Williams等，1982)得到。宰殺后大約15分鐘得到3個羊腦(大約共計150g)。將每批100g羊腦在50mL冷PM4M緩沖液(100mM哌嗪-N，N′-雙[2-乙烷磺酸](PIPES)、1mMMgSO4、2mM乙二醇四乙酸酯(EGTA)、2mM DTT、4M甘油，pH 6.9)使用家用型(domestic)攪拌器(Power Blender，Ronson)以最高設定勻漿30秒。將粗勻漿物離心15分鐘(9000rpm(6500×g)，4℃)并去除沉淀物(細胞碎片、細胞外基質和粗核部分)。然后將6500×g上清液離心75分鐘(28000rpm(96000×g)，4℃)并去除沉淀物(主要由細胞膜組成)。
通過添加適宜量的新配制的于蒸餾水中的50mM GTP溶液將96000×g上清液的GTP(鳥苷三磷酸)濃度調至1mM。通過在37℃水浴中加熱45分鐘進行微管蛋白的聚合。然后將粗微管蛋白離心60分鐘(28000rpm(96000×g)，27℃)來沉淀。然后使用手提式組織勻漿器將富含微管蛋白的沉淀物輕輕地重懸于15mL緩沖液(1M谷氨酸鈉、1mM MgCl2，pH6.6)中。然后將部分純化的微管蛋白冰育30-60分鐘，-80℃下凍存。
根據Williams和Lee(1982)，30-60分鐘冰育可使微管蛋白解聚(Williams等，1982)。但是在該冰育后澄清60分鐘(28000rpm，4℃，60分鐘)的部分顯示對秋水仙堿沒有特異性結合，表明微管蛋白仍是聚合的并以懸浮形式存在。因此，30-60分鐘冰育后得到的部分沒有進一步純化而使用。
秋水仙堿置換測定
通過置換3H秋水仙堿來進行微管蛋白對秋水仙堿-結合位點的親和力的測定。反應成分由D′Amato及其同事(D′Amato等，1994)的方法得到，同時采用Penefsky的方法(Penefsky，1977)在1mL尺寸排阻柱上將結合的放射性配體與游離的分開。這些微型柱由Hamel及其同事(Hamel等，1996)成功地用于研究3H 2-甲氧基雌二醇與微管蛋白的結合特性。每個微型柱由1mL一次性注射器中裝填大約0.95mLSephadex G-50(二級精度)的柱組成。雙份的反應混合物(總量0.48mL)于緩沖液(1M谷氨酸鈉、1mM MgCl2、0.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，pH6.6)中含有大約0.5mg/mL部分純化的微管蛋白、1μM3H秋水仙堿和置換劑化合物。飽和研究顯示此測定法中秋水仙堿的KD為1.4μM，提示1μM是合適的放射性配體濃度。采用置換劑的半-十進制增加方式(范圍從10-7.5至10-4M)。
將反應混合物在37℃下水浴中溫育30分鐘，之后在冰上冷固定1至1.5小時。對每一反應混合物，然后將三個0.14mL等分試樣加入分開的、預冷的微型柱中。通過離心2分鐘(1100rpm(100×g)，4℃)完成分離。將5mL“Emulsifier Safe”閃爍液(Packard)加入每一試管中，并將樣本在Packard 1600TR液體閃爍分析器中計數。數據用Cheng和Prusoff方程擬合，并且計算Ki和pIC50值(GraphPad Prism)。
表5 2MEO及類似物對微管蛋白上的雌激素受體和秋水仙堿結合位點的親和力。
NA＝沒有得到
2MEO的pIC50值為6.8(表5)，然而在達到10μM的濃度下2MEO類似物4NO和4NOM幾乎沒有或沒有檢測到對3H-雌二醇的置換。4NO和4NOM在該濃度下都沒置換E2結合的50％，因此它們的親和常數不能被測定(表5)。
秋水仙堿置換試驗的結果證明，在達到100μM的濃度下，2MEO對微管蛋白的pIC50為4.8，然而測試化合物都沒有顯示出顯著地秋水仙堿置換。鑒于測試化合物對微管蛋白相對弱的親和力，這些測試化合物的抗增殖活性看起來不可能是通過一般的對微管動力學的破壞所介導。
之后，檢測了一些公開的化合物置換來自如上所述的大鼠子宮細胞溶膠制備物的3H-雌二醇的能力。這些測定結果總結在表4的F欄中。無例外的，表4中例示的化合物對細胞溶膠雌激素受體具有比2-甲氧基雌二醇更低的親和力。
鑒于這些測試化合物對于ER的低親和力，看起來這些化合物的作用模式不是通過該受體。
實施例45
測試化合物對人氣道平滑肌細胞的白細胞介素-1α-介導的GM-CSF產生的作用
粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是由多種不同細胞類型在多種前炎癥刺激物如白細胞介素-1、脂多糖和柴油機廢氣(Ritz等，2002)的刺激下產生的細胞因子。GM-CSF涉及不同范圍的炎性病癥包括類風濕性關節(jié)炎、哮喘、膿毒癥和過敏性鼻炎。很可能GM-CSF不同程度地參與所有組織炎癥(Hamilton，2002)。
已經證實間充質細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞對于炎性疾病中細胞因子的過多具有重要貢獻。特別地，大量的證據表明氣道平滑肌細胞具有產生炎性細胞因子的能力(Panettieri，2002)。這些環(huán)節(jié)提示4NO對GM-CSF的抑制作用可能構成潛在的重要抗炎作用。為研究4NO的潛在抗炎活性，檢測了其對白細胞介素-1α(1ng/mL)介導的HASM的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的產生的作用。
測量GM-CSF水平
使用ELISA定量測定GM-CSF水平。將ELISA板用大鼠抗人GM-CSF單克隆包被抗體(1μg/mL，Endogen，MA，USA；在0.1M碳酸鈉緩沖液中，pH9.4-9.8)包被，然后室溫下溫育過夜。
用緩沖液(含0.1％Tween-20的PBS，PBS-T)漂洗板三次，然后用封閉緩沖液(含4％FCS的PBS)溫育1小時。在PBS中稀釋的生物素標記的鼠抗人GM-CSF抗體(0.25μg/mL，Endogen)與樣本或人重組GM-CSF標準品(范圍在0-1000pg/mL，Endogen)在室溫下溫育2小時，然后大量沖洗。根據廠商(Endogen)提供的方法，與聚合HRP-鏈霉抗生物素溶液(Endogen)和底物3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(BD PharMingen，San Diego，CA)一起溫育，在30分鐘內產生信號并在450nm處測定吸光度(Victor 1420Multilabel Counter，Wallac)。
試驗結果顯示在圖7中。數據以測試化合物預處理的IL-lα-刺激細胞的培養(yǎng)物上清液中檢測到的GM-CSF水平的百分數表示，并以均值和平均標準誤表示。4NO比2MEO更大程度地減少GM-CSF的生成。
隨后在上述測定系統中測試了其他公開的化合物抑制GM-CSF產生的能力。這些結果見總結在表4的D欄中。盡管測試的三種化合物CP-DM-3-119、CP-DM-3-103和CP-DM-4-35與2-甲氧基雌二醇相比對HASM細胞的GM-CSF產生都沒有抑制或產生很小抑制，不過一種化合物CP-DM-3-102卻具有更顯著性的效果。對抑制活性變異的原因到目前還不清楚，且每一點上測試的樣本數目相對較少；進一步增加測試樣本數目的試驗可能有助于確認這些結果。還應該使用該測定系統測試其他公開的化合物。
平滑肌中GM-CSF產生的減少可能對炎癥反應的強度和持續(xù)時間都有重要的影響。此外，很可能4NO對GM-CSF產生的抑制將在許多其他產生GM-CSF的細胞類型中發(fā)生，因為其它活性劑例如糖皮質激素看來作用于所有產生GM-CSF的細胞類型以抑制其產生。
實施例46
測試化合物在氣道高反應性動物模型中的作用。
小鼠已廣泛用來闡述氣道內過敏反應的病理學基礎的特征，并用于研究現有和新的抗哮喘活性劑的作用。小鼠模型被許多研究者認為是獲得新抗哮喘活性劑具有潛在功效的證據的關鍵性模型(Gleich &Kita，1997)，并因此在制藥工業(yè)中廣泛應用。證明最重要的一類預防藥糖皮質激素(見例如，Walter等，2002)的功效的小鼠模型支持了這一應用。
致敏和抗原激發(fā)
6-8周齡的意識清醒的雌性小鼠(C57BL/6)通過在第0天和第12天腹膜內注射0.2mL 50μg卵清蛋白(在10mg/mL氫氧化鋁中)致敏，之后在第20-28天用OVA(1％w/v)/FCS(5％v/v)氣霧劑霧化30分鐘來激發(fā)。通過將這些動物放置在全身體積描記器中，然后經位于室頂部的孔將藥物噴灑入室中來實現氣霧劑接觸。通過偏流進入一個小收集器(particle trap)中將氣霧劑排出該室?？乖ぐl(fā)沒有導致可檢測到的氣道阻抗的增加，也沒有不適的跡象。
給予藥物治療以評價藥物對氣道高反應性發(fā)生的作用。藥物治療在首次接觸OVA(第20天)之前(第19天)的那天開始，并持續(xù)貫穿OVA激發(fā)小鼠的整個期間。藥物治療包括4NO或2MEO，各自以于體積為100μL的10％DMSO/90％花生油載體中的50mg/kg通過腹膜內或口服在OVA接觸之前2小時每日一次給予。
26-28天致敏和激發(fā)步驟后，測量對支氣管收縮劑乙酰甲基膽堿反應的氣道阻塞情況。用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。行氣管造口術，頸靜脈內放置導管以由靜脈內給予乙酰甲基膽堿。然后將小鼠置于全身體積描記器中，機械通氣(150呼吸次/分鐘，潮氣量10ml/kg)。用一個孔連于體積描記器內部而另一個孔連于氣管內套管的差壓傳感器測量跨肺壓。用呼吸速率計測量氣流速率。
使用Buxco肺機械分析器聯機計算氣道對靜脈內乙酰甲基膽堿(1-1000μg/kg，給定間隔4分鐘)反應的阻力的改變。
這些實驗結果顯示在圖8和9中。
2MEO或4NO以50mg/kg/日腹膜內給藥處理卵清蛋白-激發(fā)小鼠(veh-OVA)對氣道對靜脈內給予乙酰甲基膽堿的反應性的作用顯示在圖8中。用測試化合物50mg/kg/日口服給藥處理的作用顯示在圖9中。數據以基線水平的呼吸阻力的改變表示，并且以均值和平均標準誤表示。
與在非激發(fā)小鼠(veh-SAL)中檢測到的相比，OVA激發(fā)(veh-OVA)增加了氣道對乙酰甲基膽堿的反應性。
4NO和/或2MEO，當口服或靜脈內給藥時，能夠降低攻擊后表現的呼吸阻力的增加。
實施例47
測試化合物對人肺成纖維細胞增殖的作用
來自人肺移植物受者的實質樣本從胸膜上切離，切成小于1mm2的碎片，使之附著于最小體積的含有血清(10％)和抗生素(同用于HASM培養(yǎng)所用)的DMEM的塑料培養(yǎng)皿上。組織碎片附著于培養(yǎng)皿的底部之后，加入另外的培養(yǎng)基。每周換液兩次，直到外植體培養(yǎng)物形成，此時除去組織碎片，并通過每周接觸胰蛋白酶以1∶3的分流比例傳代，產生肺成纖維細胞培養(yǎng)物。
在有或無測試化合物存在下，將肺成纖維細胞在不含血清的DMEM中培養(yǎng)24小時，然后用300pM bFGF刺激48小時，之后收集細胞并計算有活力的細胞。這些實驗結果顯示在圖11中。4NOM在1至1000nM的濃度范圍內抑制肺成纖維細胞數目的增加。在相同濃度范圍內4NO顯著降低肺成纖維細胞對bFGF的增殖反應。
之后使用上述測定系統檢測了一系列所公開的化合物，結果總結在表4的E欄中。數據以來自至少3個供者的細胞系的3個單獨實驗的最小的對bFGF(300pM)誘導的增殖的抑制的均值和平均標準誤表示。在1μM時，4NOM和幾個其他化合物顯示具有顯著性的抑制活性。實質成纖維細胞的增殖在肺纖維變性的形成中起重要作用。因此，這些現在的觀測表明所公開的化合物在氣道和肺的纖維變性病癥的治療中具有治療潛能。
氣道成纖維細胞還從來自氣道活檢的外植體培養(yǎng)物獲得。更有限的實驗組顯示3μM的4NO和4NOM分別將bFGF(300pM)誘導的增殖降低55±20％和50±24％。因此，看起來這些化合物具有對抗不同組織來源的成纖維細胞的活性，表明其在成纖維細胞功能紊亂相關的病癥中的治療潛能。這進一步被4NO和4NOM對凝血酶誘導的成纖維細胞源的NIH3T3細胞的增殖的分別為26±12％和68±10％的抑制效果所支持，表明可以合理地預測這些化合物對機體的其它部位具有抗纖維變性活性。
這些測定法也可以用于測定其他所公開的化合物對這些或其他組織來源的成纖維細胞的抗增殖活性。
實施例48
測試化合物對細胞周期蛋白D1表達的作用
在增殖實驗中如上所述培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞。將細胞去除血清24小時，并用凝血酶(0.3U/mL)刺激8小時，之后收集細胞用于細胞周期蛋白D1的蛋白質印跡。將4NO(0.01μM-1μM)和HASM一起預溫育產生細胞周期蛋白D1濃度依賴性減少。這些結果如圖10中所例示。細胞周期蛋白D1的減少表明細胞進入S-期延遲和/或減少，因此它可以部分地解釋在增殖測定中48小時時間點觀測到的細胞數目的減少。
實施例49
測試化合物對人氣道平滑肌細胞遷移的作用
開始該測定(改良的Boyden小室法)之前，將直徑6.5mm和孔徑8mm的Costar transwell culture insert(Corning Inc，USA)在4℃下用0.1％明膠(牛皮；Sigma，USA)包被過夜。開始該測定之前，將HASM細胞去除血清24小時。將細胞加到用這些測試化合物之一預處理30分鐘或沒有處理的transwell insert的上面。將血小板衍生生長因子(BB)(1ng/mL)加到下室以刺激細胞遷移，將小室和細胞保持5小時。這一時間后，用PBS沖洗具有粘附細胞的膜，用DiffQuick(Lab Aids，Aus)固定劑固定2分鐘，然后用DiffQuick染色。然后將膜用PBS沖洗兩次，剝除insert并置于載玻片上。將膜用光鏡觀察。計數5個視野(×400)內的細胞數目，重復三次。該實驗結果顯示在圖12中。
計數出現在多孔膜的下面的HASM的數，將反應以在沒有預處理情況下對PDGF反應遷移的細胞數的百分比表示。顯示用2MEO或4NO預處理的HASM具有顯著性降低的對PDGF反應的遷移水平。
實施例50
體外評價平滑肌和成纖維細胞相關病理學
血管平滑肌
評價藥物對血管平滑肌增殖的作用是對用于預防血管重塑的藥物的活性的完善篩選。血管重塑在全身性和肺性高血壓、動脈粥樣硬化和動脈(冠狀動脈等)血管成形術后再狹窄中發(fā)生。
血管平滑肌增殖
根據以前詳細描述的方法(Campbell and Campbell 1993)培養(yǎng)血管平滑肌。血管平滑肌從大鼠主動脈、牛主動脈或從牛肺動脈獲得。通過磨擦去除內皮，并將中層與外膜切離。然后將中層切碎成小的(2mm3)片段，并用膠原酶和彈性蛋白酶消化直到產生單個或少許細胞懸液。然后將細胞懸液在磷酸緩沖鹽水(PBS)(含2％胎牛血清)(FCS)中洗兩次，將細胞接種于一個75cm2的裝有含抗微生物劑和10％胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)瓶中。細胞每周用胰蛋白酶(0.5％w/v，在含有0.1％w/v EDTA的無Ca2+PBS中)(Tomlinson，Croft等，1994)接觸來傳代。
通過將細胞以亞匯合密度104個細胞/cm2接種到6孔組織培養(yǎng)板中來評價VASM增殖。72小時后將培養(yǎng)基更換成缺乏胎牛血清的培養(yǎng)基。另外的24小時后，用一定濃度范圍的特異性促分裂原和含有胰島素、硒和運鐵蛋白的無血清培養(yǎng)基補充物一起刺激細胞。當欲評價本申請的化合物時，將它們在加入濃度范圍為1pM-10μM的促分裂原之前30分鐘加入。細胞和促分裂原一起培養(yǎng)48小時之后，通過與胰蛋白酶接觸來將細胞從組織培養(yǎng)板上去除。將細胞懸液用離心機1000g(室溫)分離，將細胞重懸于含2％FCS的PBS中，之后用血細胞計數器計數。另外將等分試樣細胞與二碘化丙錠在含RNA酶的滲透性固定劑緩沖液存在或不存在下培養(yǎng)，以使得能夠計數無活力的細胞并為前面研究(Berk，Elder等，1990；Fernandes，Guida等，1999)中所描述的DNA含量的流式細胞計數評價準備細胞。
前述評價在體外在培養(yǎng)的細胞中調節(jié)平滑肌增殖的研究顯示了用于治療平滑肌相關病癥例如動脈粥樣硬化(Hupfeld and Weiss2001；Mattingly，Gibbs等，2002)的活性劑的抗增殖作用，因此這些測定法可以用于預測公開的化合物的功效。
平滑肌肥大
平滑肌的肥大反應在很多病癥包括高血壓、氣管壁重塑和前列腺肥大中是重要的。培養(yǎng)的平滑肌的肥大反應可以通過測量未固定的細胞懸液中的前向光散射的量來評估(Uhal，Ramos等，1998))。將細胞接種在6孔組織培養(yǎng)板中，并在48-72小時后將培養(yǎng)基用缺乏胎牛血清的培養(yǎng)基替換24小時。將潛在的肥大因子和胰島素、運鐵蛋白和硒的混合物一起加入，持續(xù)最多7天的不同時間，此時通過短暫的胰蛋白酶接觸來收集粘附細胞。將細胞在含2％胎牛血清和二碘化丙錠的PBS中培養(yǎng)，以使得能夠將無活力的細胞從分析中排除。前向光散射的增加表明細胞大小的增加。此外，可以通過測定每個細胞的蛋白量(Isaeff，Goya等，1993；Blennerhassett，Bovell等，1999)或通過測定蛋白合成率，其以培養(yǎng)物的DNA含量來標準化(McKay，de Jongste等，1998)來間接地測量肥大。
平滑肌收縮功能
將血管、氣道、子宮、膀胱和胃腸平滑肌制備物安裝在保持37℃、含有標準生理鹽溶液(例如Krebs溶液)的加套玻璃器官浴槽中。將組織制備成環(huán)狀或條狀，然后將其懸掛在金屬鉤之間，該金屬鉤一端固定到夾子上，另一端連于預先校準的力傳感器。通過將它們以1pM至10μM的遞增濃度直接添加到器官浴槽中來研究2MEO類似物的作用。通過檢測類似物對制備物對該特定組織相關的刺激物的收縮或舒張反應的影響來評價間接作用。這些方法是常規(guī)的方法，在下面的引文(Armour，Lazar等，1984；Arthur，Yin等，1997；Andersen，Weis等，1999)中已舉例說明。
平滑肌細胞因子產生
有證據表明，不同組織來源的平滑肌當受到適當的刺激時具有產生多種不同細胞因子的能力(John，Au等，1998)。細胞因子的產生通過收集保持在培養(yǎng)物中并與2MEO類似物和細胞因子產生的刺激物一起培養(yǎng)的細胞的上清液很容易測定，所述刺激物包括脂多糖、白細胞介素-1α、腫瘤壞死因子-α等。平滑肌產生的細胞因子包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-8、嗜酸細胞活化趨化因子和RANTES。這些細胞因子通過酶聯免疫吸附法(ELISA)測定以測定分泌性蛋白水平。此外，各個細胞因子特定的信使RNA可用實時PCR或通過RNA印跡定量測定。
成纖維細胞功能
許多在培養(yǎng)的不同組織來源的成纖維細胞中可測量的成纖維細胞功能被認為是在病癥中具有活性的預示，在該病癥中成纖維細胞促進了發(fā)病。這些病癥包括但并不限于肺纖維變性、氣道纖維變性包括閉塞性細支氣管炎、心肌纖維變性和其他組織發(fā)生的纖維變性。這些功能包括增殖、細胞因子產生、細胞外基質產生、細胞遷移和收縮，并容易地在來源于該病理相關的器官的成纖維細胞細胞培養(yǎng)物中測定(Bishop，Mitchell等，1993；Butt，Laurent等，1995；Dube，Chakir等，1998)。
成纖維細胞培養(yǎng)
成纖維細胞可以從多種組織活檢物包括皮膚、肺實質、氣道活檢物、心臟組織和包皮來培養(yǎng)。來自氣道活檢物的成纖維細胞通過外植體培養(yǎng)生長，Dube，Chakir等，1998。此外，因為成纖維細胞的生長特征可因疾病過程而改變，所以成纖維細胞還從纖維變性器官如外周肺的活檢組織獲得(Ramos，Montano等，2001)。
實施例51
評價平滑肌和成纖維細胞相關病理的臨床前動物模型
動脈粥樣硬化/再狹窄
許多動脈粥樣硬化/再狹窄動物模型通常用于評價藥物對內膜損傷形成的影響(Karas 2002(Hodgin和Maeda 2002)。近期的出版物討論了這些模型的價值(Van Put，Van Hove等，1995；Hickey，Makdissi等，1996)。顯示不同程度的ApoE缺乏的鼠模型證明動脈粥樣硬化損傷的形成能被飲食改變加速。另外，對兔采用非閉塞套囊包繞頸動脈的模型在7-10天內誘導新內膜損傷且具有最小的直接內皮損傷。這些動脈粥樣硬化模型通常用于篩選新的抗動脈粥樣硬化活性劑，并表明許多對人疾病有活性的化合物在模型中也有活性(Arthur，Yin等，1997；Karas 2002)。在該模型中，內皮功能障礙在內膜損傷發(fā)生前就可探測到。斑塊破裂在各種動脈粥樣硬化復合模型中均可以被誘導，也被報道見于ApoE缺乏的鼠模型(Rekhter 2002))中。再狹窄可以通過大鼠頸動脈內皮的氣囊導管剝離來更特異地模擬(Nili，Zhang等，2002)。
前列腺增生
前列腺增生用擬交感神經藥如苯腎上腺素皮下注射長期處理的大鼠或小鼠進行研究(Marinese等，2003)。
肺動脈高壓
實驗動物中肺動脈高壓的形成可以通過長期低氧接觸或通過注射野百合堿來誘導(Jeffery和Wanstall 2001；Wanstall，Gambino等，2002)。小鼠或大鼠的低氧導致右心室肥大和肺動脈增厚，這些可以通過將動物在含10％氧的環(huán)境中飼養(yǎng)4周之后用組織學方法來檢測。
系統性高血壓
有大量模型用于評價本發(fā)明所要求保護的化合物的抗高血壓活性。參考電子數據庫如PubMed應能夠使本領域技術研究人員選擇多種不同種類的模型。應理解，這些活性劑在具有遺傳因素的模型(例如自發(fā)性高血壓大鼠，SHR)中、在具有明顯腎因素的模型中和在具有肥胖和/或糖尿病并發(fā)的模型(參見例如，(Haff，Page等，1977；Dominiczak，Devlin等，1997；Sechi 1999；Gerin，Pickering等，2000；Stoll and Jacob 2001；Sugiyama，Yagami等，2001)中被評價。而且，除了測量對系統血壓的影響，還測定了相關病理如左心室肥大(以左心室總重量的比例來確定)。
纖維變性疾病
盡管有許多纖維變性疾病的實驗動物模型，但博來霉素誘導看起來是單獨使用最常用的疾病誘導方法。例如，在14天的時間對小鼠局部皮下注射誘導皮膚硬化，具有容易測量的皮膚厚度和皮膠原含量的增加(Murota，Hamasaki等，2003)。與評價所公開的化合物特別相關的是由氣管內注射博來霉素誘導的良好表征的肺纖維變性的模型(Chang，Nakao等，1980；Evans，McAnulty等，1990；Tani，Yasuoka等，1991)。
使用博來霉素肺纖維變性模型來研究CP-DM-2-11-7的活性(Underwood等，2000)。從博來霉素攻擊的當天開始每天在小鼠接受博來霉素前2小時給予4NO。然后在14天的時間內給予4NO(50mg/kg/日，經腹膜內注射)。小鼠還每天接受溴脫氧尿苷(BrdU，經腹膜內注射)注射。另外兩組小鼠對照組和博來霉素處理組每天接受腹膜內注射的含BrdU的載體。載體包含于花生油中的10％二甲基亞砜。
博來霉素在第一天以單次35pl滴鼻劑給予，該滴鼻劑含有溶于生理鹽水中的125mU。先將小鼠用甲氧氟烷吸入淺麻醉。在將藥滴施用到小鼠鼻孔中并向鼻內吹入后，將小鼠以45℃角保持以利于博來霉素在肺內的分布。
整個實驗期間測量體重。在給予博來霉素后的12至14天實驗結束時，用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，準備用全身體積描記器(Buxco Inc.)記錄呼吸阻力和順應性。將小鼠進行機械通氣，每分鐘150次呼吸，潮氣量為150pL。5分鐘的穩(wěn)定期后，記錄阻力和順應性的值，用致死量的戊巴比妥處死動物。
然后將每組的半數動物進行支氣管肺泡灌洗(BAL)來產生BAL液(BALF)，用血細胞計數法計數其中的浸潤細胞數。一組中半數動物的肺被快速冷凍。該組中另一半小鼠的肺用緩沖福爾馬林鹽水以25cmH2O壓力注入固定20分鐘，之后轉移到含有相同固定劑的燒杯中。然后將這些樣本用石蠟處理用于之后的切片(5微米切片)以及形態(tài)分析，對于形態(tài)分析由工作者使用標準方法用蘇木精和伊紅染色來進行，工作者對處理組得到的樣本保持盲態(tài)。另外，切片還用Masson三色染色法進行膠原染色。另外的切片用于進行BrdU陽性核檢測的制備。這一染色的存在表明在給予BrDU期間，細胞經歷過DNA合成，因此它可以作為細胞增殖的指標。
表6中報告的組織面積通過在100倍放大率下捕獲肺切片的圖像并將這些圖像輸入powerpoint文件中來測定。用覆蓋整個捕獲圖像的具有至少10個交叉點的覆蓋網格來確定面積，然后在600×放大率下觀察并通過Image pro軟件進行捕獲。
然后將36點的覆蓋用于捕獲的圖像，確定10個選擇的區(qū)域中每個中與組織交叉的網格點的數。表6中的數據代表落在組織上的網格點的百分比。
纖維變性評分通過追蹤在低倍(10×放大率)圖像上以形態(tài)學確定的纖維變性的面積來確定并將其以切面總面積的百分比來表示，該切面包括整個肺的橫切面。在纖維變性區(qū)中使用6點標度進行纖維變性損傷的嚴重程度的評估，在6點標度中0表示正常肺組織結構，而6代表由成纖維細胞和炎性浸潤導致空間的完全實變。表6的數據代表受影響的面積百分比乘以它的嚴重程度的均值。
在兩肺葉的每一個的主實質氣管內測定細胞增殖，通過測量主氣管中BrdU陽性核的數來進行，以核總數的百分比表示。氣道壁的細胞根據形態(tài)和部位確定為上皮細胞或間充質細胞(平滑肌或成纖維細胞)。數據顯示4NO處理選擇性減弱了間充質細胞的增殖。
表6 4NO(50mg/kg/日，i.p.)處理對C57BL6雌鼠博來霉素誘導的纖維變性的作用。
*P＜0.05，與對照相比
＝P＜0.05，與沒有改變(即0)相比。
數據區(qū)表示為均值±平均標準誤，
§數據表示在600倍放大率下每106象素的陽性細胞數。
三組間小鼠的初始體重無差異。12-14天的處理期后，對照組小鼠體重增加，博來霉素/載體組小鼠體重減輕，而用博來霉素/4NO處理組沒有顯著性改變。載體/博來霉素處理組小鼠的氣道阻力顯著增加，而博來霉素/4NO處理組無顯著性改變。不考慮4NO處理，博來霉素處理的小鼠順應性顯著降低。載體/博來霉素處理組小鼠的BALF中的炎性淋巴細胞/白細胞數顯著增加，而博來霉素/4NO處理組無顯著改變。博來霉素/載體組小鼠的纖維變性評分和組織面積均增加，而博來霉素/4NO處理組無這些改變。
可以獲得其它的纖維變性動物模型，例如給予羰基鐵和四氯化碳來誘導小鼠肝臟纖維變性(Arezzini，Lunghi等，2003)。小鼠氣道纖維變性可以通過重復給予先前經腹膜內注射卵清蛋白致敏的小鼠卵清蛋白來誘導(Blyth，Wharton等，2000；Kuhn，Homer等，2000；Wills-Karp2001)。
肺炎癥
給予脂多糖(LPS)得到的肺炎癥模型(Bozinvski等，Innate immuneresponses to LPS in mouse lung are suppressed and reversed byneutralization of GM-CSF via repression of TLR-4.Am J Physiol LCMP(2004)286L877-L885)用于研究某些公開的化合物抑制肺炎癥的能力。
為確定對肺炎癥的作用，將載體(如上在博來霉素實驗中所述)、CP-DM-4-35或4NO各自以150mg/kg腹膜內注射，2小時后如前述鼻內給予35μL LPS(LPS總量為1μg)對雌性balb/c小鼠進行預處理。給予LPS后24小時，用過量戊巴比妥鈉處死小鼠，氣管插管使得能夠獲得BAL用于炎性淋巴細胞和白細胞計數并使用BioRad蛋白測定試劑盒測定蛋白水平。另外，BALF中的活性MMP-9的量通過采用完善的方法學(參見例如Johnson S，Knox A.Autocrine production of matrixmetalloproteinase-2 is required for human airway smooth muscleproliferation Am J Physiol.1999 Dec；277(6 Pt 1)L1109-17)經酶譜法測定。
LPS(1μg)明顯增加每組中的BALF細胞數，不過4NO和CP-DM-4-35具有使細胞數降低的趨勢(表7)。LPS/載體小鼠的BALF中的蛋白水平增高，但在用LPS激發(fā)前用4NO或CP-DM-4-35預處理的小鼠無此改變。LPS/載體處理的動物的活性MMP-9水平顯著增加，但在用LPS激發(fā)前用4NO或CP-DM-4-35預處理的動物無此改變。
根據已知的糖皮質激素化合物在肺炎癥中的抗炎活性以及這些化合物也抑制其它組織中的炎癥，因此合理地預測本申請公開的化合物在機體的其它部位也具有抗炎活性。
表7.4NO(150mg/kg，i.p.)或CP-DM-4-35(150mg/kg，i.p.)處理對LPS誘導的雌性Balb/c小鼠炎癥的作用。
*P＜0.05，與對照相比
數據區(qū)為表示為均值±平均標準誤
實施例52
平滑肌和成纖維細胞相關病理的臨床評價
哮喘的臨床評價在近期文獻中有很好的描述。評價新的抗哮喘活性劑，與對所考慮的特別嚴重的哮喘目前最好的實際治療進行對比。對于中度哮喘，許多臨床終點(endpoint)可用于評價新的治療劑，包括搶救(短效β-激動劑)治療劑的使用率；哮喘惡化的次數，該惡化定義為需要短期口服糖皮質激素或收住院；FEV1；基于日志卡的癥狀評分；生活質量；不損失哮喘控制的情況下糖皮質激素節(jié)制的水平(Lemanske，Sorkness等，2001；Lemanske，Nayak等，2002)。許多研究特別檢測了試驗治療開始和結束時所取氣道活檢物的哮喘病理的重塑成分(Sont，Willems等，1999)。在這些活檢物中，測定平滑肌和結締組織的量、顯示細胞增值標記的細胞部分和上皮損傷程度是可行的(Druilhe，Wallaert等，1998；Benayoun，Druilhe等，2003)。
再狹窄
再狹窄可以通過許多終點在臨床試驗中評價。間接的結果包括心肌梗死的發(fā)生和心絞痛的發(fā)生。另外，可以通過使用基于射線照相或超聲的方法的血管造影直接測定新內膜(Topol，Califf等，1994；Brack，Ray等，1995；Leon，Baim等，1998；Serruys，Foley等，2001)。
肺纖維變性
臨床研究中肺纖維變性情況通過臨床檢測如杵狀指(clubbing)、射線照相異常和肺功能檢測(talmadge king)來確定。這些疾病特征與疾病進展的相關性和它們在評價新治療劑中的重要性基于現有文獻的系統綜述被一致認可地確立(Lipinski，Black等，1975；King 2000；King，Tooze等，2001；Selman，King等，2001))。
涉及平滑肌和成纖維細胞的其它病癥
可獲得多種完善的臨床方案用于新的活性劑在成纖維細胞和平滑肌功能改變的其它病癥中的評價。本領域技術研究人員通過檢索公用數據庫如PubMed將能夠得到和應用這些方案。
本發(fā)明所屬領域的技術人員應理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可以對發(fā)明進行多種修改。
為方便參考，下表列出了本申請中所使用的化合物ID號以及它們相關的化學名稱。
表8
化合物ID化學名稱
2-甲氧基雌二醇(2MEO)
CP-DM-2-11-72-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇(4NO)
CP-DM-3-91 2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟(4NOM)
CP-DM-3-106 2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-3-105 2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-3-124 2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-3-117 2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-3-119 2-甲氧基-6-(2，4-二硝基苯基亞肼基)雌酮-17-肟
CP-DM-3-118 2-甲氧基-6-(3-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-15 2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基))亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-16 2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-4-36 6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟
CP-DM-4-35 6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇
CP-DM-4-37 6-(4-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇
CP-DM-4-51 2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-52 2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-4-38 6-(4-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟
CP-DM-3-101 雌酮-17-(4-硝基芐基)肟
CP-DM-3-102 雌酮-17-(3-硝基芐基)肟
CP-DM-3-103 2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基芐基)肟
CP-DM-3-104 2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基芐基)肟
CP-DM-4-5 2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)-亞胺基雌二醇
CP-DM-4-6 2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)-亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-33 雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟
CP-DM-4-34 2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟
CP-DM-4-65 2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-4-66 2-甲氧基-6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-68 2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-62 2-甲氧基-6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-4-63 2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-4-64 2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-4-67 2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-69 2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-74 6-(3，5二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟
CP-DM-4-75 6-(4-硝基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟
CP-DM-4-76 2-甲氧基-6-(4-甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-77 2-甲氧基-6-(4-異丙基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
CP-DM-4-78 2-甲氧基-6-(4-甲基芐氧基)亞氨基雌二醇
CP-DM-4-88 6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌三醇
CP-DM-4-91 2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇-17-乙酸酯
CP-DM-4-89 6-(4-硝基芐氧基)亞氨基-17-乙炔基-雌二醇
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權利要求
1.式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；磺?br> n為0或1；
條件是所述化合物包含至少一個基團A。
2.權利要求1的化合物，其中Z′和Z″中至少一個為A。
3.權利要求1的化合物，其中X選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd。
4.權利要求1的化合物，所述化合物具有調節(jié)平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能的活性。
5.根據權利要求4的化合物，所述化合物具有調節(jié)平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能的特異性活性。
6.根據權利要求4或權利要求5的化合物，其中所述調節(jié)細胞功能為抑制細胞增殖。
7.根據權利要求4或權利要求5的化合物，其中所述調節(jié)細胞功能為調節(jié)細胞的細胞外基質沉積。
8.根據權利要求4或權利要求5的化合物，其中所述調節(jié)細胞功能為調節(jié)細胞的細胞因子表達。
9.權利要求8的化合物，其中所述調節(jié)細胞的細胞因子表達為抑制GM-CSF表達。
10.根據權利要求4或權利要求5的化合物，其中所述調節(jié)細胞功能為調節(jié)細胞收縮性。
11.根據權利要求4或權利要求5的化合物，其中所述調節(jié)細胞功能為調節(jié)細胞遷移。
12.根據權利要求4或權利要求5的化合物，其中所述平滑肌細胞為氣道平滑肌細胞。
13.根據權利要求4或權利要求5的化合物，其中所述成纖維細胞為氣道成纖維細胞。
14.根據權利要求1的化合物，所述化合物具有抑制氣道高反應性的活性。
15.根據權利要求14的化合物，其中所述氣道高反應性與哮喘有關。
16.根據權利要求1的化合物，所述化合物具有抑制纖維變性的活性。
17.根據權利要求1的化合物，所述化合物具有抑制肺纖維變性的活性。
18.根據權利要求1的化合物，所述化合物具有抑制炎癥的活性。
19.權利要求1的化合物，其中Y優(yōu)選為選自基團-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑和咪唑的鈍化基團。
20.權利要求19的化合物，其中Y選自基團-NO2、-CN、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑和咪唑。
21.權利要求1的化合物，其中X選自基團苯基、萘基或吡啶基。
22.權利要求1的化合物，其中A中的基團Rc為亞烷基。
23.權利要求1的化合物，其中A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X或＞C＝N-NH-Rc-X。
24.權利要求1的化合物，其中Z″為A，而Z′選自基團＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH和＞C＝N-ORb。
25.權利要求1的化合物，其中Z′為A，而Z″選自基團＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH和＞C＝N-ORb。
26.權利要求1的化合物，其中R2選自基團-ORb、-ARb、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb和-CN。
27.權利要求25的化合物，其中R2為-OMe。
28.權利要求1的化合物，其中R3選自基團-OH、-ORa和-RcORb。
29.權利要求1的化合物，其中R1和R4各自為H。
30.權利要求1的化合物，其中R6為H。
31.式(V)的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為酰基；且
Rf為直接鍵或亞烷基。
32.式(VI)的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；且
Rf為直接鍵或亞烷基。
33.式(VII)的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?br> Re為直接鍵或亞烷基；且
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd。
34.式(VIII)的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；
Rf為直接鍵或亞烷基，且
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd。
35.式(IX)的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Z為＞C＝O、＞C(H)OH或＞C＝N-OH；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；且
Rf為直接鍵或亞烷基。
36.式(X)的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
X1選自被一個或多個取代基Y1取代的芳基和被一個或多個取代基Y取代的雜芳基，其中Y1選自-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
ZIV為＞CH2、＞C＝O或＞C＝N-OH；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；且
Rf為直接鍵或亞烷基。
37.式(XI)的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NR2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；磺?br> Rf為直接鍵或亞烷基。
38.根據權利要求1的化合物，所述化合物選自
2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(2-硝基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(2，4-二硝基苯基亞肼基)雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-三氟甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-吡啶基甲氧基)亞氨基雌二醇
6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟
6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇
6-(4-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-氰基芐氧基)亞氨基雌二醇
6-(4-氰基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-肟
雌酮-17-(4-硝基芐基)肟
雌酮-17-(3-硝基芐基)肟
2-甲氧基雌酮-17-(4-硝基芐基)肟
2-甲氧基雌酮-17-(3-硝基芐基)肟
2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)-亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-甲氧基芐氧基)-亞氨基雌酮-17-肟
雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟
2-甲氧基雌酮-17-(4-甲氧基芐基)肟
2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(3-甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(3-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌二醇
2-甲氧基-6-(4-三氟甲氧基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-三氟甲硫基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟
6-(4-硝基芐氧基)亞氨基-2-甲氧基雌酮-17-甲基肟
2-甲氧基-6-(4-甲基芐氧基)亞氨基雌酮-17-甲基肟
2-甲氧基-6-(4-異丙基芐氧基)亞氨基雌酮-17-肟
2-甲氧基-6-(4-甲基芐氧基)亞氨基雌二醇
6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基雌三醇
2-甲氧基-6-(4-硝基芐氧基)亞氨基雌二醇-17-乙酸酯
6-(3，5-二氟芐氧基)亞氨基-17-乙炔基-雌二醇。
39.一種合成以上定義的式I的化合物的方法，所述方法包括使式II、III或IV的酮或醛前體或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物與式H2N-O-X、H2N-O-Rc-X、H2N-NH-Rc-X、H2N-NH-X或H2N-酯-X的胺反應以形成式I的化合物的步驟
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?br> 在式H2N-O-X、H2N-O-Rc-X、H2N-NH-Rc-X、H2N-NH-X或H2N-酯-X中X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd。
40.包含式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物和藥學可接受的載體的藥物組合物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；
條件是所述化合物包含至少一個基團A。
41.一種治療與平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能相關的病癥的方法，所述方法包括給予需要其的個體治療有效量的式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-RcNRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?br> 條件是所述化合物包含至少一個基團A。
42.根據權利要求41的方法，其中所述平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能為細胞增殖。
43.根據權利要求41的方法，其中所述平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能為細胞的細胞因子表達。
44.根據權利要求43的方法，其中所述細胞的細胞因子表達為GM-CSF表達。
45.根據權利要求41的方法，其中所述平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能為細胞的細胞外基質沉積。
46.根據權利要求41的方法，其中所述平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能為細胞收縮性。
47.根據權利要求41的方法，其中所述平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能為細胞遷移。
48.根據權利要求41的方法，其中所述平滑肌細胞為氣道平滑肌細胞。
49.根據權利要求41的方法，其中所述成纖維細胞為氣道成纖維細胞。
50.根據權利要求41的方法，其中所述病癥為氣道高反應性。
51.根據權利要求50的方法，其中所述氣道高反應性與哮喘有關。
52.根據權利要求41的方法，其中所述病癥為纖維變性。
53.根據權利要求41的方法，其中所述病癥為肺纖維變性。
54.一種治療炎癥的方法，所述方法包括給予需要其的個體治療有效量的式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；
條件是所述化合物包含至少一個基團A。
55.式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物在制備用于治療與平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能相關的病癥的藥物中的應用
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；
條件是所述化合物包含至少一個基團A。
56.式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物在制備用于治療炎癥的藥物中的應用
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?br> 條件是所述化合物包含至少一個基團A。
57.式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物作為用于調節(jié)平滑肌細胞和/或成纖維細胞功能的活性劑的應用
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；
條件是所述化合物包含至少一個基團A。
58.式I的化合物或其鹽、水合物、前藥、異構體、互變異構體和/或衍生物作為用于治療炎癥的活性劑的應用
其中
R1和R4各自選自H、Ra、-RcRd、-CN、-NO2、-鹵素、OH、-ORa、-OC(O)Ra；
R2選自-ORb、-(Rc)n-ARb、-H、-Re、-RcRe、-CH＝NOH、-CH＝NORb、-CH＝NNRb2、-OH、-SRb、-Rb、-CN、-RcRd和-鹵素，其中n為0或1；
R3選自-OH、-ORa、-RcORb、-H、-酯-Rb；
R5為甲基；
R6為-H、-OH、-ORb或-鹵素；
Z′為A或＞CH2、＞C＝O、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-OH、＞C(Rb)-CN；＞C(Rb)-NRb2、＞CRb2、＞C＝N-NH2、＞C＝N-NRb2、-O-、＞N-Rb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞CRbRe、＞CRb-NRbRe、＞C＝N-酯-Ra；
Z″為A或＞C＝O、＞C(H)OH、＞C＝N-OH、＞C＝N-ORb、＞C(Rb)-ORb、＞C(Rb)-Rc-ORb、＞C(H)-NRb2、＞C(H)-鹵素、＞CRb2、＞C＝N-酯-Ra；
A為＞C＝N-O-X、＞C＝N-O-Rc-X、＞C＝N-NH-Rc-X、＞C＝N-NH-X、＞C＝N-酯-X；
X為被一個或多個取代基Y取代的芳族基，其中Y選自-H、-NO2、-CN、-SO3H、-SO3Ra、-CO-Rb、-+NRb3、-CO2Rb、-鹵素、-CF3、-CCl3、四唑、咪唑、-芳基、-取代芳基、-Ra、-NH2、-NRa2、-OH、-ORa、-Rc-CN、-Rc-鹵素、-NRbCORb、-Rc-NRb2、-RcRd；
Ra為直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rb為H或直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳烯基或芳炔基；
Rc為直鏈或支鏈C1-C10亞烷基、亞烯基或亞炔基；
Rd代表一個或多個選自以下的取代基-OH、-NH2、-鹵素、-CF3、-CN、-COORa、-SRb；
Re為?；?；
條件是所述化合物包含至少一個基團A。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于調節(jié)間充質細胞功能例如平滑肌和成纖維細胞增殖或細胞因子表達和用于治療與間充質細胞功能相關的病癥例如與哮喘相關的氣道高反應性的化合物和方法。該化合物還抑制炎癥。該化合物是一類雌三烯衍生物，包括包含基團A的2－甲氧基雌二醇的多種衍生物，所述衍生物在2－、6－和17－位包含取代的芳族取代基。
文檔編號C07J43/00GK1867577SQ20048002017
公開日2006年11月22日 申請日期2004年5月13日 優(yōu)先權日2003年5月13日
發(fā)明者阿拉斯泰爾·喬治·斯圖爾特, 戴維·詹姆斯·麥卡利斯特, 約翰·尼古拉斯·蘭伯特 申請人:克里普托法瑪有限公司