專利名稱：鹽孢菌酰胺及其使用方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求基于2004年4月30日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)10/838,157和2003年6月20日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)10/600,854的優(yōu)先權(quán)，這兩個(gè)申請(qǐng)的名稱均為“鹽孢菌酰胺(salinosporamide)及其使用方法”。
資助信息本發(fā)明中部分是在政府支持下進(jìn)行的，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院國(guó)家癌癥研究所授予的批準(zhǔn)號(hào)為CA44848。美國(guó)政府享有本發(fā)明的一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及抗腫瘤劑，特別是涉及鹽孢菌酰胺及其作為抗腫瘤劑的應(yīng)用。
背景信息特征是細(xì)胞增生不受細(xì)胞生長(zhǎng)正常控制的腫瘤類疾病，是人類死亡的一個(gè)主要原因。化療的臨床經(jīng)驗(yàn)表明，希望有新的更有效的細(xì)胞毒素類藥物來(lái)治療這些疾病。的確，由于對(duì)轉(zhuǎn)移到不同部位的新的腫瘤和癌細(xì)胞類型的識(shí)別，以及由于抗腫瘤治療方案作為一種主要的和附加的癌癥醫(yī)學(xué)療法的有效性，抗腫瘤劑的使用已經(jīng)增加。由于抗腫瘤劑是細(xì)胞毒素(對(duì)細(xì)胞有毒)，因此它們不僅會(huì)干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且也會(huì)干擾正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。抗腫瘤劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用要大于對(duì)正常細(xì)胞的作用，原因是腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)很快。因此，抗腫瘤劑所作用的正常組織細(xì)胞是快速分裂的細(xì)胞，如骨髓(在低血細(xì)胞計(jì)數(shù)中見到)，毛囊(以脫發(fā)方式見到)以及GI粘膜上皮(引起惡心，嘔吐，喪失食欲，腹瀉)。通常，抗腫瘤劑具有任何種類的人類用藥的最低治療指數(shù)，從而產(chǎn)生了對(duì)生命造成威脅的重大潛在毒性。某些通常使用的抗腫瘤劑對(duì)特異性組織具有獨(dú)特而急性的毒性。例如，長(zhǎng)春花屬生物堿對(duì)神經(jīng)組織有重大毒性，而阿霉素對(duì)心臟組織有特異性毒性，博來(lái)霉素對(duì)肺部組織具有毒性。因此，對(duì)于有效抑制高增生性細(xì)胞的增生，同時(shí)具有低于現(xiàn)有抗腫瘤劑的IC50值，從而導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重副作用顯著下降的抗腫瘤劑，仍存在繼續(xù)的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明基于海洋放線菌菌株CNB392和CNB476的某些發(fā)酵產(chǎn)物是高增生性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的有效抑制劑這一發(fā)現(xiàn)。CNB392和CNB476菌株存在于小單孢菌科中，而且鹽孢菌(Salinospora)這一屬名(generic epithet)已經(jīng)被提議用于這種專性海洋族群。由這種菌株產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物被歸為鹽孢菌酰胺，在治療腫瘤疾病方面特別有效，這是由于其具有低分子量、低IC50值、高藥效，以及癌細(xì)胞對(duì)真菌的選擇性。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物 其中
R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基(thioalkyl)，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基(oxyacyl)，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基；且x為0到8。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(II)的化合物 其中R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧?；被姿狨?，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；
E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5，或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基；以及x為0到8。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(III)的化合物 其中R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，?；貂；?，氨基甲酸酯，磺?；被酋?，或砜基，每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5，或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基，以及x為0到8。在本發(fā)明的又一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(IV)的化合物
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(V)的化合物 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(VI)的化合物
在另一種實(shí)施方式中，提供了一種藥物組合物，其包括存在于藥學(xué)上可接受的載體中的至少一種結(jié)構(gòu)I-VI的化合物。在另一種實(shí)施方式中，提供了制品，其包括包裝材料和裝在包裝材料內(nèi)的藥物組合物，其中該包裝材料包括指明該藥物組合物可用于治療細(xì)胞增生性疾病的標(biāo)簽，以及其中該藥物組合物包括至少一種結(jié)構(gòu)I-VI的化合物。在又一種實(shí)施方式中，提供了一種治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生性疾病的方法。這樣的方法可通過(guò)例如將治療有效量的結(jié)構(gòu)I-VI的化合物向所需的患者給藥的方式進(jìn)行。在另外的實(shí)施方式中，提供了制備結(jié)構(gòu)I-VI的化合物的方法，該化合物具有抑制高增生性哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生的能力。這樣的方法可通過(guò)例如對(duì)鹽孢菌種的菌株CNB392(ATCC#＿＿＿)或CNB476(ATCC PTA-5275)培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)物中分離出結(jié)構(gòu)I的至少一種化合物的方式進(jìn)行。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1示出了本發(fā)明示例性化合物鹽孢菌酰胺A的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有相對(duì)的立體化學(xué)。圖2示出了說(shuō)明“鹽孢菌”系統(tǒng)發(fā)育的系統(tǒng)樹。圖3示出了用于治療幾種人類癌癥的抗腫瘤劑，足葉乙甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖4比較了鹽孢菌酰胺A和足葉乙甙的細(xì)胞毒素活性和劑量響應(yīng)曲線。圖5是描繪用于分離鹽孢菌酰胺A的示例性分離方案的方塊圖。圖6-14是用于闡明鹽孢菌酰胺A結(jié)構(gòu)的NMR，IR和UV光譜數(shù)據(jù)。圖15是菌株CNB392和CNB476在其16S rDNA內(nèi)具有的標(biāo)記核苷酸，該標(biāo)記核苷酸使這些菌株與小單孢菌科中的其它成員在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上區(qū)分開來(lái)。圖16示出了本發(fā)明示例性化合物鹽孢菌酰胺A(結(jié)構(gòu)V)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其具有絕對(duì)的立體化學(xué)。圖17繪出了鹽孢菌酰胺A的最終X-射線結(jié)構(gòu)的ORTEP圖(熱橢圓形點(diǎn)圖)，描述了其絕對(duì)立體化學(xué)。
發(fā)明詳述在一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物
其中R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧?；?，氨基甲酸酯，磺?；?，氨磺酰，或砜基；每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5，或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基；以及x為0到8。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(II)的化合物 其中R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，?；?，氧?；?，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；
E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5，或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基；以及x為0到8。在一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(III)的化合物 其中R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，?；貂；?，氨基甲酸酯，磺?；被酋?，或砜基，每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5，或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基，以及x為0到8。在本發(fā)明的又一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(IV)的化合物
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(V)的化合物 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，提供了具有結(jié)構(gòu)(VI)的化合物
此處所用的術(shù)語(yǔ)″烷基″是指具有1至約12個(gè)碳原子的單價(jià)直鏈或支鏈烴基，包括甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，叔丁基，正己基，和類似基團(tuán)。此處所用的術(shù)語(yǔ)″取代烷基″是指帶有一個(gè)或多個(gè)取代基的烷基，這些取代基選自羥基，烷氧基，氫硫基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，芳氧基，取代芳氧基，鹵素，氰基，硝基，氨基，酰胺基，-C(O)H，酰基，氧?；然?，磺酰基，氨磺酰，砜基，和類似基團(tuán)。此處所用的術(shù)語(yǔ)″低級(jí)烷基″是指具有1至約6個(gè)碳原子的烷基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″鏈烯基″是指具有一個(gè)或多個(gè)碳碳雙鍵以及約2至12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基，以及″取代鏈烯基″是指進(jìn)一步帶有一個(gè)或多個(gè)上述取代基的鏈烯基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″炔基″是指具有至少一個(gè)碳碳叁鍵以及約2至約12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烴基，而″取代炔基″是指進(jìn)一步帶有上述一個(gè)或多個(gè)取代基的炔基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″芳基″是指具有6至14個(gè)碳原子的芳香基團(tuán)，而″取代芳基″是指進(jìn)一步帶有一個(gè)或多個(gè)上述取代基的芳基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″雜芳基″是指含有一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如N，O，S或類似原子)作為環(huán)結(jié)構(gòu)一部分，以及具有3至14個(gè)碳原子的芳香基團(tuán)，而″取代雜芳基″是指進(jìn)一步帶有一個(gè)或多個(gè)上述取代基的雜芳基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″烷氧基″是指-O-烷基-部分，其中烷基如上定義，而″取代烷氧基″是指進(jìn)一步帶有一個(gè)或多個(gè)上述取代基的烷氧基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″硫烷基″是指-S-烷基-部分，其中烷基如上定義，而″取代硫烷基″是指進(jìn)一步帶有一個(gè)或多個(gè)上述取代基的硫烷基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″環(huán)烷基″是指具有約3至約8個(gè)碳原子的含環(huán)烷基，而″取代環(huán)烷基″是指進(jìn)一步帶有一個(gè)或多個(gè)上述取代基的環(huán)烷基。此處所用的術(shù)語(yǔ)″雜環(huán)基″是指具有一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如N，O，S或類似原子)作為環(huán)結(jié)構(gòu)一部分以及具有3至14個(gè)碳原子的環(huán)狀(即含環(huán))基團(tuán)，而″取代雜環(huán)基″是指進(jìn)一步帶有一個(gè)或多個(gè)上述取代基的雜環(huán)基。在一些實(shí)施方式中，提供了結(jié)構(gòu)I-III的化合物，其中E1，E3和E4為-O，而E2為-NH。在一些實(shí)施方式中，提供了結(jié)構(gòu)I-III的化合物，其中R1和R2為-H，烷基或取代烷基，而R3為羥基或烷氧基。在一些實(shí)施方式中，R1為取代烷基。預(yù)期使用的示例性取代烷基包括鹵化烷基，例如諸如氯化烷基。本發(fā)明的化合物可被配制成天然形式或鹽形式的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的非毒性鹽包括堿加成鹽(base addition salt)(采用自由羧基或其它陰離子基團(tuán)形成)，其可來(lái)源于無(wú)機(jī)堿，例如鈉，鉀，銨，鈣，或鐵的氫氧化物，以及有機(jī)堿，例如異丙基胺，三乙基胺，2-乙基氨基-乙醇，組氨酸，普魯卡因，和類似物。這類鹽也可以用任何的自由陽(yáng)離子基團(tuán)形成為酸加成鹽，通常是用無(wú)機(jī)酸如鹽酸，硫酸或磷酸，或有機(jī)酸如乙酸，對(duì)甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，酒石酸，苦杏仁酸，和類似酸。本發(fā)明的鹽包括采用無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸和類似酸對(duì)氨基基團(tuán)進(jìn)行質(zhì)子化而形成的胺鹽。本發(fā)明的鹽也包括采用合適的有機(jī)酸如對(duì)甲苯磺酸、乙酸和類似酸對(duì)氨基基團(tuán)進(jìn)行質(zhì)子化而形成的胺鹽。本發(fā)明實(shí)踐中預(yù)期采用的其它賦形劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲知的那些賦形劑，如在United States Pharmacopeia Vol.XXII和National Formulary Vol.XVII，U.S.Pharmacopeia Convention，Inc.，Rockville，MD(1989)中可見到的那些賦形劑，這里將這些文獻(xiàn)的相關(guān)內(nèi)容引入作為參考。根據(jù)本發(fā)明的化合物可包含一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此可存在為外消旋物或外消旋混合物、單個(gè)的對(duì)映體、非對(duì)映異構(gòu)混合物和單獨(dú)的非對(duì)映異構(gòu)體。術(shù)語(yǔ)″立體異構(gòu)體″是指分子中不同基團(tuán)僅在空間取向上互不相同的化合物。立體異構(gòu)體具有相同的分子量，化學(xué)組成，以及結(jié)構(gòu)，但原子的組合方式不同。也就是說(shuō)，某些相同的化學(xué)部分在空間取向上有所不同，因此，當(dāng)為純化合物時(shí)，該化合物具有旋轉(zhuǎn)偏振光平面的能力。然而，一些純立體異構(gòu)體的旋光度很小，以至于采用目前的儀器探測(cè)不到。這些化合物的所有這類異構(gòu)體形式都清楚地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。每個(gè)立體型的碳可以具有R或S構(gòu)型。盡管本申請(qǐng)中舉例的具體化合物被以特定的構(gòu)型描繪，但也想象得出在任何給定的手性中心處具有相反立體化學(xué)的化合物或它們的混合物。當(dāng)在本發(fā)明的衍生物中發(fā)現(xiàn)手性中心時(shí)，應(yīng)該理解，本發(fā)明涵蓋了所有可能的立體異構(gòu)體。術(shù)語(yǔ)″光學(xué)純的化合物″或″光學(xué)純的異構(gòu)體″是指手性化合物的單一立體異構(gòu)體，而不管化合物的構(gòu)型如何。本發(fā)明示例性的結(jié)構(gòu)I化合物如下所示
鹽孢菌酰胺A的分子結(jié)構(gòu)中具有可被化學(xué)修飾以制造合成衍生物的各種官能團(tuán)(內(nèi)酯，鹵代烷，酰胺，羥化物)。因此，示例性的本發(fā)明化合物鹽孢菌酰胺A具有優(yōu)異的形成合成和半合成衍生物的引導(dǎo)性結(jié)構(gòu)。確實(shí)，可對(duì)鹽孢菌酰胺A進(jìn)行衍生以改進(jìn)藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，這使得衍生物易于給藥并增加了其作為抗腫瘤劑的利用度。對(duì)本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物進(jìn)行化學(xué)修飾而制得本發(fā)明范圍內(nèi)的其它化合物的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的。在HTC-116細(xì)胞分析試驗(yàn)中，鹽孢菌酰胺A顯示出對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞具有強(qiáng)的細(xì)胞毒素活性。IC50值為11ng/mL，這幾乎超過(guò)足葉乙甙(參見圖3，IC50值為828ng/mL)的活性達(dá)2個(gè)數(shù)量級(jí)(參見圖4)，足葉乙甙是一種用于治療多種癌癥的抗癌藥物。這種高活性使本發(fā)明的鹽孢菌酰胺成為用于治療各種人類癌癥的優(yōu)異候選物，尤其是減慢了目前尚無(wú)治療方案的頑固癌(refractile cancers)的生長(zhǎng)。鹽孢菌酰胺A對(duì)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有特效，對(duì)白念珠菌(Candida albicans)的抗真菌活性很小(IC50 250μg/mL)，且不具有抗細(xì)菌活性(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，尿腸球菌(Enterococcus faecium))。鹽孢菌酰胺A的IC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前已在使用或處于臨床試驗(yàn)中的最強(qiáng)化療劑。鹽孢菌酰胺A是海洋放線菌菌株CNB392和CNB476的發(fā)酵產(chǎn)物。這些菌株是放線菌目的成員，其為高G+C革蘭氏陽(yáng)性菌。CNB392和CNB476的新穎性在于屬這一級(jí)別上。這里所述的發(fā)明化合物由某些″鹽孢菌″種產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物由″鹽孢菌″種的菌株CNB392和CNB476產(chǎn)生。為此，根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約，于2003年6月20日將″鹽孢菌″種的CNB392和CNB476菌株保藏在位于12301Parklawn Drive，Rockville，Md.20852U.S.A.的美國(guó)模式菌種收集中心的專利菌種存放處，ATCC保藏號(hào)分別為＿＿＿和PTA-5275。如同其它生物體的情況，″鹽孢菌″種的特征易于變化。例如，可采用各種已知的物理和化學(xué)誘變劑，如紫外線、X-射線、γ-射線和N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍，進(jìn)行處理，可得到特定菌株的重組體、變異體或突變體。保留了產(chǎn)生本發(fā)明化合物這個(gè)特性的特定菌株的所有天然的和誘發(fā)的變異體、突變體和重組體都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的化合物可例如通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵而制備，其產(chǎn)生的化合物的量足以用于開發(fā)藥物和用于臨床試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物是通過(guò)在AlBfe+C或CKA-液體介質(zhì)中對(duì)放線菌菌株CNB392和CNB476進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)生的。培養(yǎng)介質(zhì)中還應(yīng)該包括培養(yǎng)物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的基本痕量元素。這類痕量元素在介質(zhì)的其它組分中作為雜質(zhì)存在，其存在量足以滿足生物體的生長(zhǎng)要求。如果發(fā)泡變成問(wèn)題，需要向大規(guī)模的培養(yǎng)介質(zhì)中加入少量的(即0.2mL/L)消泡劑如聚丙二醇(M.W.約為2000)。通過(guò)將有機(jī)代謝物吸附到安珀萊特(amberlite)XAD-16樹脂上，使有機(jī)代謝物分離。例如，采用甲醇∶二氯甲烷1∶1洗脫XAD-16樹脂而分離出鹽孢菌酰胺A，每升培養(yǎng)物中得到的粗提取物為約105mg。然后采用反相快速色譜法，接著采用反相HPLC和正相HPLC，從初提取物中分離鹽孢菌酰胺A，獲得6.7mg鹽孢菌酰胺A。圖5給出了本發(fā)明化合物分離和分開方案的方塊圖。采用各種NMR技術(shù)、質(zhì)譜、IR和UV光譜對(duì)鹽孢菌酰胺A的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，如圖6-14所示。鹽孢菌酰胺A的絕對(duì)結(jié)構(gòu)，以及對(duì)鹽孢菌酰胺A的整體結(jié)構(gòu)的確認(rèn)是采用單晶體X-射線衍射分析獲得的(參見實(shí)施例3)。本發(fā)明還提供了包括包裝材料和裝在包裝材料內(nèi)的藥物組合物的制品，其中所述的包裝材料包括說(shuō)明藥物組合物可用于治療癌癥的標(biāo)簽，及其中所述的藥物組合物包括本發(fā)明的化合物。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明化合物的藥物組合物，其中所述的化合物的濃度為有效治療細(xì)胞增生性疾病的濃度。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)治療方案或采用動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)確定該濃度。用作本發(fā)明制品的構(gòu)成部分的藥物組合物可以以固體、溶液、乳液、分散系、膠束、脂質(zhì)體的形式和類似形式使用，其中最終的組合物含有一種或多種作為活性成分的本發(fā)明化合物，與適于經(jīng)腸或腸胃外應(yīng)用的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體或賦形劑相混合。用作本發(fā)明制品的構(gòu)成部分的化合物可以例如與常規(guī)的無(wú)毒性藥學(xué)可接受載體結(jié)合，形成片劑、顆粒劑、膠囊、栓劑、溶劑、乳液、懸浮液，以及其它適用的劑型?？梢圆捎玫妮d體包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯膠、白明膠、甘露糖醇、淀粉糊、三硅酸鎂、滑石、玉米淀粉、角蛋白、硅膠、馬鈴薯淀粉、脲、中等鏈長(zhǎng)的甘油三酯、右旋糖酐以及其它適于制備固體、半固體或液體形式制劑的載體。此外也可采用輔劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和著色劑以及香味劑。本發(fā)明的組合物可包含下述的其它治療劑，并且例如，可采用常規(guī)的固體或液體載體或稀釋劑，以及適于所需給藥方式的藥物添加劑類型(例如，賦形劑，粘結(jié)劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，調(diào)味劑等)，根據(jù)藥物配制領(lǐng)域公知的技術(shù)，進(jìn)行配制。本發(fā)明的藥物組合物可以采用任何合適的方式給藥，如口服給藥，諸如以片劑、膠囊、顆?；蚍勰┬问?；舌下給藥；口腔給藥；腸胃外給藥，諸如通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、肌肉或腦池內(nèi)的注射或輸注技術(shù)(如作為無(wú)菌注射性水性或非水性溶液或懸浮液)；鼻腔給藥，諸如通過(guò)吸入噴劑；局部給藥，諸如采用乳膏或藥膏形式；或者直腸給藥，諸如以栓劑形式；以含有無(wú)毒性藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的單位劑量制劑的形式。本發(fā)明的化合物可以例如以適于立即釋放或延遲釋放的形式進(jìn)行給藥?？刹捎冒ū景l(fā)明化合物的適當(dāng)藥物組合物，或者，特別在延遲釋放的情況下，可采用裝置，如皮下輸注裝置或滲透泵，實(shí)現(xiàn)立即釋放或延遲釋放。本發(fā)明的化合物也可以脂質(zhì)體方式進(jìn)行給藥。本發(fā)明還提供了采用發(fā)明的結(jié)構(gòu)(I)-(VI)的鹽孢菌酰胺化合物來(lái)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生的方法，該方法是通過(guò)使這些細(xì)胞與其量足以抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生的本發(fā)明鹽孢菌酰胺化合物相接觸而實(shí)現(xiàn)的。一種實(shí)施方式是抑制高增生性哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生的方法。在本發(fā)明中，″高增生性哺乳動(dòng)物細(xì)胞″是指不受生長(zhǎng)的特性限制，如編程性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。另一種優(yōu)選實(shí)施方式是哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類細(xì)胞時(shí)。本發(fā)明還提供了使哺乳動(dòng)物細(xì)胞和至少一種本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物以及至少一種其它的抗腫瘤劑相接觸的方法。在另一種實(shí)施方式中，提供了治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生性疾病的方法，該方法包括給予患者所需的治療有效量的結(jié)構(gòu)(I)-(VI)的化合物?？刹捎帽景l(fā)明的方法有效治療的細(xì)胞增生性疾病包括以腫瘤的形成為特征的疾病。如此，本發(fā)明的化合物就是抗腫瘤劑。此處所用的術(shù)語(yǔ)″腫瘤的″涉及異常生長(zhǎng)的腫瘤，這類生長(zhǎng)的發(fā)生是由于細(xì)胞增生不受到生長(zhǎng)的通常限制。此處所用的術(shù)語(yǔ)″抗腫瘤劑″是抑制、消除、阻礙、或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的腫瘤表型的任何化合物、組合物、混合物、共混物或摻和物。在一些實(shí)施方式中，腫瘤選自乳腺腫瘤，小細(xì)胞肺部腫瘤，非小細(xì)胞肺部腫瘤，結(jié)直腸腫瘤，白血病，黑素瘤，胰腺癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤，卵巢腫瘤，前列腺腫瘤，軟組織或骨肉瘤，頭頸部腫瘤，包括甲狀腺和非何杰金氏病的胃癌，胃部腫瘤，骨髓瘤，膀胱腫瘤，腎部腫瘤，包括甲狀腺和非何杰金氏和何杰金氏病的神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤。在一種實(shí)施方式中，腫瘤是結(jié)直腸腫瘤。目前癌癥治療中使用化療，外科手術(shù)，放療，采用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的治療，以及免疫療法。每種治療方式都有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的特異性適應(yīng)癥，可采用一種療法或所有療法實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的全部毀滅。本發(fā)明提供了利用一種或多種本發(fā)明鹽孢菌酰胺的化療法。而且，本發(fā)明也提供了聯(lián)合利用本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物和其它抗腫瘤劑的聯(lián)合化療法，該聯(lián)合化療法一般比采用單獨(dú)一種抗腫瘤劑更有效。因此，本發(fā)明的再一方面提供了組合物，其包括治療有效量的至少一種本發(fā)明鹽孢菌酰胺化合物與至少一種抗腫瘤劑。這類組合物也可與生理學(xué)容許的液體，凝膠或固體載體，稀釋劑，輔劑和賦形劑一起提供。這類載體，稀釋劑，輔劑和賦形劑可在United StatesPharmacopeia Vol.XXII和National Formulary Vol.XVII，U.S.Pharmacopeia Convention，Inc.，Rockville，Md.(1989)中找到，這里將其內(nèi)容引入作為參考。其它的治療方法可參見AHFS DrugInformation，1993版，美國(guó)醫(yī)院處方服務(wù)機(jī)構(gòu)(American HospitalFormulary Service)編輯，第522-660頁(yè)，在此將其內(nèi)容引入作為參考。可與本發(fā)明的鹽孢菌酰胺化合物聯(lián)合使用的抗腫瘤劑包括TheMerck Index，11th ed.Merck & Co.，Inc.(1989)pp.Ther 16-17中提供的那些抗腫瘤劑，在此將其內(nèi)容引入作為參考。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，抗腫瘤劑可以是抗代謝物，其包括但不限于氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-氫硫基嘌呤，阿糖胞苷，羥基脲，以及2-氯脫氧腺苷。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑是烷基化試劑，其可包括但不限于環(huán)磷酰胺，美法侖，白消安，伯爾定(Paraplatin)，苯丁酸氮芥，以及氮芥。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，抗腫瘤劑是植物生物堿，其包括但不限于長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春花堿，紫杉醇，以及足葉乙甙。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑是抗生素，其包括但不限于亞德里亞霉素(阿霉素)，道諾霉素，絲裂霉素c，以及博來(lái)霉素。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑是激素，其包括但不限于卡普睪酮，diomostavolone，丙酸酯，環(huán)硫雄醇，美雄烷，睪內(nèi)脂，三苯氧胺，聚磷酸雌二醇，醋酸甲地孕酮(megesterol acetate)，氟他胺，尼魯米特，以及trilotane。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，預(yù)期的抗腫瘤劑包括酶或氨基吖啶衍生物，其中酶可包括但不限于左旋門冬酰胺酶，而氨基吖啶衍生物可包括但不限于安吖啶。其它的抗腫瘤劑包括Skeel，Roland T.，″Antineoplastic Drugs and Biologic ResponseModifierClassification，Use and Toxicity of Clinically Useful Agents，″Handbook of Cancer Chemotherapy(3rd ed.)，Little Brown & Co.(1991)中所述的那些抗腫瘤劑，在此將其內(nèi)容引入作為參考。除了例如人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物之外，本發(fā)明的方法也可用于治療各種其它的哺乳動(dòng)物。例如，可被治療的哺乳動(dòng)物包括但不限于母牛，綿羊，山羊，馬，狗，貓，豚鼠，大鼠或其它的?？?，綿羊科，馬科，犬科，貓科，嚙齒目或鼠科動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)″治療有效量″是指主題化合物的用量，其能引起研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)生所探尋的組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)，例如減輕細(xì)胞增生性疾病的影響/癥狀。術(shù)語(yǔ)″藥學(xué)上可接受的″是指載體，稀釋劑或賦形劑必須和制劑中的其它成分相容，并且對(duì)其接受者無(wú)害。術(shù)語(yǔ)″給予(administration of)″和或″提供(administering a)″化合物應(yīng)該理解為，向需要治療的個(gè)體提供本發(fā)明的化合物。給予本發(fā)明化合物可以在其它治療劑或其它抗腫瘤劑給藥之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。為進(jìn)行本發(fā)明化合物給藥的藥物組合物可方便地以單位劑型存在，并且可采用制藥領(lǐng)域任何公知的方法進(jìn)行制備。所有的方法都包括使活性組分和載體結(jié)合的步驟，該載體構(gòu)成了一種或多種輔助的組分。通常，藥物組合物是通過(guò)將活性組分和液體載體或細(xì)分的固體載體或兩者均勻緊密地結(jié)合，必要時(shí)再將產(chǎn)物制成所需制劑形式而制備的。在藥物組合物中，活性目標(biāo)化合物的含量足以產(chǎn)生對(duì)病程或病況的預(yù)期效果。含有活性組分的藥物組合物可以為適合口服的劑型，如片劑，小藥錠，錠劑，水性或油性懸浮液，可分散粉末或顆粒，乳液，硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。用于口服的組合物可根據(jù)藥物組合物制備領(lǐng)域公知的任何方法制備得到，并且這類組合物可含有選自甜味劑，調(diào)味劑，著色劑和防腐劑的一種或多種試劑，以獲得藥學(xué)上精致和可口的制劑。片劑含有活性組分，其與適于制造片劑的非毒性藥學(xué)可接受賦形劑相混合。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑，例如碳酸鈣，碳酸鈉，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；成粒和崩解劑，例如玉米淀粉或藻酸；粘結(jié)劑，例如淀粉，白明膠或阿拉伯膠；以及潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石。片劑可為未包衣的，也可采用已知技術(shù)進(jìn)行包衣以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而獲得較長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)作用。例如，可采用延時(shí)材料，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可對(duì)片劑進(jìn)行包衣而形成可控制釋放的滲透性治療片劑。用于口服的制劑也可以硬明膠膠囊存在，其中活性組分和惰性固體稀釋劑如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土相混合；或者可以軟明膠膠囊存在，其中活性組分與水或油介質(zhì)如花生油，液體石蠟或橄欖油相混合。水性懸浮液含有活性材料，該活性材料與適于制造水性懸浮液的賦形劑相混合。這類賦形劑有懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，藻酸鈉，聚乙烯-吡咯烷酮，黃蓍膠和阿拉伯膠；分散或潤(rùn)濕劑，可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或環(huán)氧烷烴與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，如聚環(huán)氧乙烷硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，如十七亞乙氧基鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合產(chǎn)物，如聚乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。水性懸浮液也可含有一種或多種防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酸乙酯或正丙酯；一種或多種著色劑；一種或多種調(diào)味劑，以及一種或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。油性懸浮液可通過(guò)將活性組分懸浮于植物油如花生油，橄欖油，芝麻油或椰子油，或懸浮于礦物油如液體石蠟中而配制得到。油性懸浮液可包含增稠劑，例如蜂蠟，硬石蠟或鯨蠟醇?？杉尤肷鲜龅奶鹞秳┖驼{(diào)味劑以獲得可口的口服制劑?？杉尤肟寡鮿┤缈箟难嵋员４孢@些組合物。適于通過(guò)加入水而制得水性懸浮液的可分散粉末和顆粒中含有與分散或潤(rùn)濕劑、懸浮劑以及一種或多種防腐劑預(yù)混合的活性組分。合適的分散或潤(rùn)濕劑以及懸浮劑的例子已在上文中列舉。也可存在其他的賦形劑，例如甜味劑，調(diào)味劑和著色劑?？刹捎锰鹞秳?，例如甘油，丙二醇，山梨糖醇或蔗糖配制成糖漿或酏劑。這類制劑還可含有緩和劑，防腐劑以及調(diào)味劑和著色劑。藥物組合物可以是無(wú)菌的可注射水性或油性懸浮液形式。該懸浮液可采用上述合適的分散或潤(rùn)濕劑以及懸浮劑，按照本領(lǐng)域的方法配制而成。無(wú)菌的可注射制劑也可以是存在于無(wú)毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如存在于1，3-丁二醇中的溶液?？刹捎玫目山邮茌d體和溶劑中有水、Ringer′s溶液(林格氏液)和氯化鈉等滲溶液。此外，無(wú)菌的不揮發(fā)性油通常也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可采用包括合成的單-或二甘油酯在內(nèi)的無(wú)刺激性不揮發(fā)性油。另外，脂肪酸如油酸也可用于制備可注射制劑。本發(fā)明的化合物也可以直腸給藥的栓劑形式給藥。這些組合物可通過(guò)將藥物和合適的非刺激性賦形劑相混合而制得，其中的非刺激性賦形劑在常溫下是固態(tài)，但在直腸溫度下是液態(tài)，從而在直腸中融化而釋放出藥物。這類材料是可可油和聚乙二醇。在局部使用的情況下，可采用含有本發(fā)明化合物的乳膏、油膏、凝膠劑、溶液或懸浮液等。本發(fā)明的化合物和組合物可以與其他治療劑相同的方式，在例如針對(duì)家畜的獸醫(yī)應(yīng)用中或針對(duì)人類的臨床應(yīng)用中向哺乳動(dòng)物給藥。一般來(lái)說(shuō)，達(dá)到療效所要求的劑量會(huì)隨著應(yīng)用類型和給藥方式，以及單個(gè)主體的具體要求而有所不同。通常，劑量范圍為主體體重的約0.001到1000μg/kg，更通常為主體體重的0.01到10μg/kg?？蛇x地，這些范圍內(nèi)的劑量可在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)，通常在超過(guò)24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行持續(xù)輸注，直到達(dá)到期望的治療效果。然而，應(yīng)該理解，對(duì)任何具體患者的具體劑量水平和劑量頻率可以是不同的，并取決于各種因素，包括所采用的具體化合物的活性，該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)間長(zhǎng)短，年齡，體重，一般健康狀況，性別，食欲，給藥方式和時(shí)間，排泄率，聯(lián)合用藥情況，具體病癥的嚴(yán)重性，以及受治療的主體?，F(xiàn)在將參照以下非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的描述。
實(shí)施例方法和材料HPLC-本發(fā)明化合物的純化是在C18-固體相(Aldrich)上進(jìn)行RP-MPLC法，在Kontes Flex-柱(15×7mm)上采用分步梯度而完成的。半制備性HPLC是在等度HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行的，該系統(tǒng)的正相柱Si-Dynamas-60(250×5mm)或反相柱C18-Dynamax-60上帶有Waters泵6000H，流速為2mL/分鐘，并帶有差示折射率檢測(cè)儀Waters R401。LC-MS-LC-MS色譜分析是在帶有DAD和MSD 1100檢測(cè)的Hewlett-Packard系統(tǒng)系列HP1100上進(jìn)行的。在反相C18柱(AgilentHypersil ODS 5μm，柱尺寸為4.6×100mm)上進(jìn)行分離，流速為0.7mL/分鐘，采用的標(biāo)準(zhǔn)梯度為10％乙腈，15分鐘；98％乙腈(Burdick &Jackson高純度溶劑)。MS-檢測(cè)是在ESI正離子模式下進(jìn)行的，毛細(xì)管電壓為3500eV，碎裂電壓為70eV，質(zhì)量范圍m/z為100-1000。APCI-模式在流速為0.5mL/分鐘、正離子檢測(cè)、毛細(xì)管電壓為3000eV、碎裂電壓為70eV的條件下測(cè)定。NMR-NMR譜是在對(duì)1H或2D-NMR譜具有反相模式的Varian300MHz梯度場(chǎng)光譜儀上測(cè)得的。13C和DEPT譜是在Varian 400MHz的寬譜帶儀器上測(cè)得的。參照物是內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷(TMS，0.00ppm)。MS-EI-低分辨率MS-EI光譜是在帶有扇形磁場(chǎng)設(shè)備(magneticsector field device)的Hewlett-Packard質(zhì)譜儀上測(cè)得的，以20℃/分鐘的加熱速率升溫到320℃，并直接注入進(jìn)樣。FTMS-MALDI-高分辨MS數(shù)據(jù)是在IonSpec Ultima FT質(zhì)譜儀上以MALDI操作模式獲得的。IR-紅外光譜是在Perkin-Elmer FT紅外光譜儀上采用NaCl窗測(cè)得的。
實(shí)施例1″鹽孢菌″種的分離和表征培養(yǎng)物編號(hào)為CNB392和CNB476CNB392和CNB476在其16S rDNA內(nèi)具有標(biāo)記核苷酸，這在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上將這些菌株與所有其他的小單孢菌科成員區(qū)分開來(lái)(參見圖15)。這些標(biāo)記核苷酸已經(jīng)被確認(rèn)為是這組成員的決定性標(biāo)記物，該組成員對(duì)鈉也具有生理學(xué)生長(zhǎng)需求。利用Ribosomal Database Project中1-31-01上所有存在的小單孢菌科成員將標(biāo)記核苷酸排列到大腸桿菌(E.coli)位27-1492上。對(duì)″鹽孢菌″分化枝，45個(gè)部分測(cè)序的形態(tài)型顯示出所有來(lái)自位置207-468的標(biāo)記核苷酸。這七個(gè)幾乎全部測(cè)序的″鹽孢菌″分離物(參見圖2)顯示出圖15中的全部標(biāo)記。菌株CNB392和CNB476在瓊脂上形成了鮮橙色至黑色的菌落，并且不存在氣生菌絲體。取決于細(xì)胞的生長(zhǎng)階段，產(chǎn)生了深棕色和鮮橙色的可擴(kuò)散色素。孢子使菌落表面變黑，并負(fù)載在基質(zhì)菌絲體上。營(yíng)養(yǎng)菌絲體被微細(xì)地分支且并不分裂成碎片。孢子被單獨(dú)地或成群地產(chǎn)生。對(duì)這些菌株，既沒(méi)有觀察到孢子囊的游動(dòng)性，也沒(méi)有觀察到孢子的游動(dòng)性。CNB392和CNB476對(duì)鈉具有專性生長(zhǎng)需求，不會(huì)在用于維持小單孢菌科其它屬成員的通常介質(zhì)中生長(zhǎng)。已發(fā)現(xiàn)，CNB392和CNB476于30℃下在固體介質(zhì)TCG或M1上最佳地生長(zhǎng)。
TCG3g胰蛋白胨M110克淀粉5克酪胨 4克酵母提取物4克葡萄糖 2克蛋白胨18克瓊脂(任選) 18克瓊脂(任選)1升過(guò)濾海水 1升過(guò)濾海水發(fā)酵于35℃下，在1升的搖動(dòng)AlBfe+C或CKA-液體介質(zhì)中培養(yǎng)CNB392和CNB476達(dá)9天。4天之后，加入20克Amberlite XAD-16樹脂(Sigma，非離子型聚合物吸附劑)。
AlBfe+C10克淀粉 CKA 5克淀粉4克酵母提取物 4mL水溶性物(50％)2克蛋白胨 2克鯡魚粉1克CaCO32克海藻粉5mL KBr(水溶液，20g/l) 2克殼聚糖5mL Fe2(SO4)3×4H2O(8g/l) 1升過(guò)濾海水
1升過(guò)濾海水提取過(guò)濾XAD-16樹脂，并先用1升乙酸乙酯，再用1升甲醇洗脫有機(jī)提取物。然后，用乙酸乙酯(3×200mL)提取濾液。XAD吸收的粗提取物為105mg。對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的分析試驗(yàn)得到的細(xì)胞毒性為IC50＜0.076μg/mL。
從CNB392分離出鹽孢菌酰胺A在C 18反相(RP)色譜上采用分段梯度，對(duì)粗提取物進(jìn)行快速色譜分析(圖5)。HCT-116分析獲得了兩種活性級(jí)分，CNB392-5和CNB392-6。然后，在等度的RP-HPLC上對(duì)合并的活性級(jí)分(51.7mg，HCT-116＜0.076μg/mL)進(jìn)行色譜分析，采用流速為2mL/分鐘的85％甲醇作為洗脫液，并采用折射率檢測(cè)。采用流速為2mL/分鐘的乙酸乙酯∶異辛烷(9∶1)，在等度正相HPLC的硅膠上純化活性級(jí)分CNB392-5/6(7.6mg，HCT-116＜0.076μg/mL)。分離出的鹽孢菌酰胺A(圖1)是無(wú)色的無(wú)定形固體，產(chǎn)率為每升6.7mg(6.4％)。在硅膠上進(jìn)行的TLC分析(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)表明，鹽孢菌酰胺A的rf＝0.6，在256nm處無(wú)UV消光或熒光，采用H2SO4/乙醇時(shí)是黃色，采用Godin試劑(香蘭素/H2SO4/HClO4)時(shí)是暗紅棕色。鹽孢菌酰胺A可溶解于CHCl3，甲醇，以及其它極性溶劑如DMSO，丙酮，乙腈，苯，吡啶，N，N-二甲基甲酰胺和類似溶劑。1HNMR(d5-吡啶，300MHz)1.37/1.66(2H，m，CH2)，1.70，2.29(2H，m，CH2)，1.91(2H，寬，CH2)，2.07(3H，s，CH3)，2.32/2.48(2H，ddd，3J＝7.0Hz，CH2)，2.85(1H，寬，m，CH)，3.17(1H，dd，3J＝10Hz，CH)，4.01/4.13(2H，m，CH2)，4.25(1H，d，3J＝9.0Hz，CH)，4.98(1H，寬，OH)，5.88，(1H，ddd，3J＝10Hz，CH)，6.41(1H，寬d，3J＝10Hz，CH)10.62(1H，s，NH).13C NMR/DEPT(d5-吡啶，400MHz)176.4(COOR)，169.0(CONH)，128.8(＝CH)，128.4(＝CH)，86.1(Cq)，80.2(Cq)，70.9(CH)，46.2(CH)，43.2(CH2)，39.2(CH)，29.0(CH2)，26.5(CH2)，25.3(CH2)，21.7(CH2)，20.0(CH3)
LC-MS(ESI)tr＝10.0分鐘，流速0.7mL/分鐘m/z(M+H)+314，(M+Na)+336；片段(M+H-CO2)+292，(M+H-CO2-H2O)+270，252，204.Cl圖樣(M+H，100％)+314，(M+H，30％)+316.
LC MS(APCI)tr＝11.7分鐘，流速0.5mL/分鐘，m/z(M+H)+314，片段(M+H-CO2-H2O)+270，252，232，216，160.Cl圖樣(M+H，100％)+314，(M+H，30％)+316.
EIm/z269，251，235，217，204，188(100％)，160，152，138，126，110，81.
FTMS-MALDIm/z(M+H)+314.1144FT-IR(cm-1)2920，2344，s，1819m，1702s，1255，1085s，1020s，797s.
分子式C15H20ClNO4，實(shí)施例2生物活性分析試驗(yàn)鹽孢菌酰胺A對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的活性，IC50值為0.011μg/mL(參見圖4)。對(duì)抗細(xì)菌或抗真菌活性的篩選表明沒(méi)有明顯的活性，參見表1。
表1分析試驗(yàn)鹽孢菌酰胺 A的IC50(μg/mL)HCT-116 0.011白色念珠菌 250白色念珠菌(耐兩性霉素 NSA*B)
金黃色葡萄球菌(耐甲NSA*氧西林)尿腸球菌(耐萬(wàn)古霉素) NSA*NSA*＝無(wú)明顯活性實(shí)施例3絕對(duì)立體化學(xué)的測(cè)定結(jié)構(gòu)I的化合物從乙酸乙酯/異辛烷中結(jié)晶，得到單個(gè)立方晶體，其作為單斜晶系P2(1)進(jìn)行衍射。3009不尋常的大單胞體積內(nèi)容納了四個(gè)獨(dú)立的分子，其中對(duì)柔性氯乙基取代基，觀察到不同的構(gòu)象位置。從氯取代基的衍射各向異性，指定絕對(duì)結(jié)構(gòu)，分辨出鹽孢菌酰胺A的絕對(duì)立體化學(xué)為2R，3S，4R，5S，6S(圖16和17)，F(xiàn)lack參數(shù)為0.01，而esd為0.03。盡管參照上述實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明展開了描述，但應(yīng)該理解，修飾和改變均落入本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受限于所附權(quán)利要求書。
權(quán)利要求
1.一種具有結(jié)構(gòu)(I)的獨(dú)立化合物 其中R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，?；貂；?，氨基甲酸酯，磺?；?，氨磺酰，或砜基；每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5，或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基；以及X為0至8；限制性條件是所述獨(dú)立化合物不具有化合物(VI)的結(jié)構(gòu)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中E1，E3和E4為-O，及E2為-NH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1和R2為-H、烷基或取代烷基，和R3為羥基或烷氧基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為取代烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中所述的取代烷基為鹵化烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中所述的鹵化烷基為氯化烷基。
7.藥物組合物，包括權(quán)利要求1所述的至少一種化合物，該化合物存在于藥學(xué)上可接受的載體中。
8.一種用來(lái)抑制高增生性哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生的藥物組合物，其包括有效量藥學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求1所述的化合物，限制性條件是所述化合物不具有化合物(V)的結(jié)構(gòu)
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，進(jìn)一步包括至少一種另外的抗腫瘤劑。
10.一種治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生性疾病的方法，其包括將治療有效量的具有結(jié)構(gòu)(I)的化合物提供給需要的患者 R1至R3各自獨(dú)立地為-H，烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環(huán)基，取代雜環(huán)基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羥基，鹵素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，?；貂；?，氨基甲酸酯，磺?；?，氨磺酰，或砜基；每個(gè)R4獨(dú)立地為烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基；E1至E4各自獨(dú)立地為-O，-NR5，或-S，其中R5為-H或C1-C6烷基；以及X為0至8；從而治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞增生性疾病，限制性條件是所述化合物不具有化合物(VI)的結(jié)構(gòu)
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人的。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述疾病的特征是腫瘤形成。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述腫瘤選自乳腺腫瘤，小細(xì)胞肺部腫瘤，非小細(xì)胞肺部腫瘤，結(jié)直腸腫瘤，白血病，黑素瘤，胰腺癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤，卵巢腫瘤，前列腺腫瘤，軟組織或骨肉瘤，頭頸部腫瘤，包括甲狀腺非何杰金氏病在內(nèi)的胃癌，胃部腫瘤，骨髓瘤，膀胱腫瘤，腎部腫瘤，包括甲狀腺和非何杰金氏及何杰金氏病在內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述腫瘤是結(jié)直腸腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)海洋放線菌菌株CNB392和CNB476的某些發(fā)酵產(chǎn)物是高增生性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的有效抑制劑。CNB392和CNB476菌株存在于小單孢菌科中，而且鹽孢菌這一屬名已經(jīng)被提議用于這種專性海洋族群。由這種菌株產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物被歸為鹽孢菌酰胺，在治療腫瘤疾病方面特別有效，這是由于其具有低分子量、低IC50值、高藥效，以及癌細(xì)胞對(duì)真菌的選擇性。
文檔編號(hào)C07D491/04GK1823070SQ200480020530
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月20日
發(fā)明者W·H·費(fèi)尼科, P·R·詹森, T·J·明瑟, R·H·R·費(fèi)林格 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)