專利名稱：人源免疫活性細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人體淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞等免疫應(yīng)答所必需的各種細(xì)胞在生物體內(nèi)的增殖以及人免疫系統(tǒng)重建的技術(shù)。
背景技術(shù)：
關(guān)于人體干細(xì)胞的研究，在生物體內(nèi)測定是很重要的，因此通常按照使用免疫缺陷嚙齒類或羊胎仔(Flake，A.W.等人，1986.Science 233776-778)的異種動物間移植來進(jìn)行。Scid-hu測定由McCune等人于1988年發(fā)表報告(Science 2411632-1639(1988))，該測定是在CB17/SCID小鼠中檢測出人細(xì)胞的最早的例子。之后大多采用NOD/SICD(Pflumio，F(xiàn).等人，1996.Blood 883731-3740.)、NOD/RAG-1null(Shultz，L.D.等人，2000.Journal of Immunology 1642496-2507.)、beige/nude/scid(Dao，M.A.，和J.A.Nolta.1998.International Journal of Molecular Medicine 1257-264.)或NOD/SICD/β2Mnull(Kollet，O.等人，2000.Blood 953102-3105)等免疫缺陷小鼠作為用于移植人造血細(xì)胞的受體。
但是，作為異種動物間干細(xì)胞移植受體使用的小鼠幾乎都是8-12周齡的成熟小鼠。另外，使用通常的成熟SCID小鼠時，為了長時間保持移植物，必須施用外源細(xì)胞因子，由前體細(xì)胞分化T細(xì)胞是很困難的(Ito，M.等人，2002.Blood 1003175-3182)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于在異種動物宿主中構(gòu)建人免疫系統(tǒng)，通過自然或人為地發(fā)生免疫反應(yīng)，生成必需的人免疫細(xì)胞、特別是抗原特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞或免疫球蛋白、細(xì)胞因子等。
本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過對免疫缺陷動物移植造血前體細(xì)胞或成熟造血細(xì)胞，可以解決上述課題，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下。
(1)移植有人源造血前體細(xì)胞或成熟造血細(xì)胞的未成熟(包括由胚胎經(jīng)新生兒達(dá)到生殖年齡)免疫缺陷哺乳動物(人除外)，所述動物可生成該人源的免疫活性細(xì)胞和/或來自該免疫活性細(xì)胞的生理活性物質(zhì)。本發(fā)明還涉及飼養(yǎng)上述未成熟免疫缺陷哺乳動物(人除外)而得到的免疫缺陷哺乳動物或其后代。
上述未成熟免疫缺陷哺乳動物的例子有新生免疫缺陷哺乳動物或胎兒免疫缺陷哺乳動物。
上述造血前體細(xì)胞可以例舉來自骨髓、來自臍血、(G-CSF)動員末梢血、來自ES細(xì)胞的中肺葉系細(xì)胞或來自末梢血的細(xì)胞。這些細(xì)胞例如有CD34陽性細(xì)胞(例如CD34+細(xì)胞、CD133+細(xì)胞、SP細(xì)胞、CD34+CD38-細(xì)胞、c-kit+細(xì)胞或CD3-、CD4-、CD8-、CD34+細(xì)胞)。免疫活性細(xì)胞有選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞核NKT細(xì)胞的至少一種。這些免疫活性細(xì)胞無需處死受體，可由末梢血采集，需要純化更多的細(xì)胞或來自上述免疫活性細(xì)胞的生理活性物質(zhì)(例如免疫球蛋白、細(xì)胞因子等)時，可以將骨髓、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)等作為細(xì)胞來源利用。免疫缺陷哺乳動物優(yōu)選為免疫缺陷小鼠。上述免疫球蛋白包含例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等所有的同種型。
(2)本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該人源免疫活性細(xì)胞和/或來自該免疫活性細(xì)胞的生理活性物質(zhì)的動物或其后代的制備方法，其特征在于將人源造血前體細(xì)胞或成熟造血細(xì)胞移植到未成熟免疫缺陷哺乳動物中(人除外)。未成熟免疫缺陷哺乳動物的例子有新生免疫缺陷哺乳動物或胎兒免疫缺陷哺乳動物。造血前體細(xì)胞可以例舉來自骨髓、來自臍血、(G-CSF)動員末梢血、來自ES細(xì)胞的中肺葉細(xì)胞或來自末梢血的細(xì)胞。這些細(xì)胞例如有CD34陽性細(xì)胞(例如CD34+細(xì)胞、CD133+細(xì)胞、SP細(xì)胞、CD34+CD38-細(xì)胞、c-kit+細(xì)胞或CD3-、CD4-、CD8-、CD34+細(xì)胞)。免疫活性細(xì)胞是選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的至少一種。生理活性物質(zhì)的例子有細(xì)胞因子和/或免疫球蛋白。上述免疫球蛋白包含例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等所有的同種型。免疫缺陷哺乳動物優(yōu)選為免疫缺陷小鼠。
(3)本發(fā)明還涉及上述抗體的制備方法，其特征在于從上述免疫缺陷哺乳動物或其后代中回收免疫活性細(xì)胞，在抗原或適當(dāng)?shù)拇碳の镔|(zhì)存在下培養(yǎng)該免疫活性細(xì)胞，由所得培養(yǎng)物采集人源抗體。免疫活性細(xì)胞的例子有選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的至少一種。
(4)本發(fā)明又涉及上述抗體的制備方法，其特征在于用抗原或刺激物質(zhì)免疫上述免疫缺陷哺乳動物或其后代，由所得免疫動物采集該人源抗體?？贵w的采集來源有血漿或血清。
(5)本發(fā)明還涉及疾病模型動物或其后代，該疾病模型動物或其后代是對上述免疫缺陷哺乳動物或其后代施用任意的選自細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞和腫瘤抗原肽的物質(zhì)得到的。上述疾病的例子有感染病。
(6)本發(fā)明涉及免疫相關(guān)藥物的篩選方法，其特征在于將受試物質(zhì)施用于上述免疫缺陷哺乳動物或其后代或者上述感染病動物或其后代，評價受試物質(zhì)的有效性。免疫相關(guān)藥物中也包含疫苗、抗病毒藥物或抗生素。上述方法在對本發(fā)明的人抗體的免疫應(yīng)答和變應(yīng)性的安全性確認(rèn)(特別是前期臨床試驗階段)方面有用。
(7)本發(fā)明涉及上述免疫活性細(xì)胞的制備方法，其特征在于由上述免疫缺陷哺乳動物或其后代回收免疫活性細(xì)胞。
(8)本發(fā)明涉及由上述免疫缺陷哺乳動物或其后代回收的免疫活性細(xì)胞。
(9)本發(fā)明涉及含有(8)中的免疫活性細(xì)胞的疫苗。
(10)本發(fā)明涉及上述免疫活性細(xì)胞的制備方法，其特征在于由上述疾病模型動物或其后代回收免疫活性細(xì)胞。
(11)本發(fā)明涉及由上述疾病模型動物或其后代回收的免疫活性細(xì)胞。
(12)本發(fā)明涉及含有(11)中的免疫活性細(xì)胞的疫苗。
(13)本發(fā)明涉及由上述疾病模型動物或其后代回收的人源抗體。
(14)本發(fā)明涉及由在抗原或刺激物質(zhì)的存在下培養(yǎng)上述免疫活性細(xì)胞得到的培養(yǎng)物采集的人源抗體。
(15)本發(fā)明涉及由疾病模型動物或其后代回收的人源抗體。
(16)本發(fā)明涉及含有(15)中的人源抗體的疫苗。
附圖簡述

圖1A是表示在受體小鼠中重建人B細(xì)胞系(CD19+細(xì)胞)的圖。
圖1B是表示各種人免疫球蛋白在受體小鼠中表達(dá)的圖。
圖2是表示OVA特異性IgM的ELISA結(jié)果的圖。
圖3是表示在受體小鼠的骨髓、脾藏和末梢血中重建人T細(xì)胞系的圖。
圖4是表示淋巴組織的FISH分析和免疫組織學(xué)分析結(jié)果的圖。
圖5是表示NOD/SCID/IL2rg-null小鼠骨髓(BM)中人紅細(xì)胞構(gòu)成物的鑒定的圖。
圖6是表示NOD/SCID/IL2rg-null小鼠的BM和脾臟中人B細(xì)胞發(fā)生的圖。
圖7是表示CD19+B系細(xì)胞中人免疫球蛋白的表達(dá)的圖。
圖8是表示NOD/SCID/IL2rg-null小鼠中的人T細(xì)胞發(fā)生的圖。
圖9是表示NOD/SCID/IL2rg-null小鼠的脾臟中的人樹突狀細(xì)胞的存在的圖。
圖10是表示NOD/SCID/IL2rg-null小鼠腸道中的粘膜免疫的發(fā)生的圖。
圖11是表示卵清蛋白免疫后對IgG+細(xì)胞的誘導(dǎo)的圖。
圖12是表示由在NOD/SCID/IL2rg-null小鼠中生成的人T細(xì)胞介導(dǎo)的、對同種異型靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖。
實施發(fā)明的最佳方式以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
本發(fā)明是為了將人造血細(xì)胞在異種哺乳動物的機(jī)體內(nèi)分化、增殖，在異種哺乳動物中重建人免疫系統(tǒng)而完成的。具體來說，其特征在于將來自人源的造血前體細(xì)胞移植到作為宿主的未成熟免疫缺陷哺乳動物(例如SCID小鼠)中，在該宿主內(nèi)使人源細(xì)胞分化和增殖。即，利用免疫缺陷動物的體內(nèi)構(gòu)建人免疫系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)，應(yīng)用于人抗體的生成以及腫瘤或病毒抗原特異性疫苗的開發(fā)。
1.未成熟的免疫缺陷動物本發(fā)明中，作為受體使用的動物是除人之外的免疫缺陷哺乳動物，該受體用于移植人源造血前體細(xì)胞。本發(fā)明中，“未成熟”動物包含由胚胎經(jīng)新生兒至生殖年齡，優(yōu)選胚胎和出生后7天以內(nèi)，更優(yōu)選出生后2天以內(nèi)的新生兒。使用未成熟的免疫缺陷動物作為受體，則伴隨個體生長，人免疫活性細(xì)胞也高效增殖，因此本發(fā)明優(yōu)選采用未成熟個體。
哺乳動物的例子有小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、羊、仔豬、豬、猴等。從模型動物豐富、可確立系統(tǒng)的角度考慮，優(yōu)選免疫缺陷小鼠。免疫缺陷小鼠是指缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞的生成能力的重癥混合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)，特別優(yōu)選不具NK細(xì)胞活性的NOD/SICD/β2微球蛋白敲除小鼠(NOD/SICD/B2M)或NOD/SICD/commonγ鏈敲除小鼠。使用該SCID小鼠的未成熟個體，可以在小鼠機(jī)體內(nèi)高比例生成人源免疫細(xì)胞和造血細(xì)胞。上述SCID小鼠市場有售(JacksonLaboratory)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地獲得。
2.細(xì)胞的制備和移植作為移植對象的造血前體細(xì)胞例如可由臍血、骨髓、末梢血、(G-CSF)動員末梢血、來自ES細(xì)胞的中肺葉細(xì)胞獲得，優(yōu)選臍血。
臍血(CB)細(xì)胞可由日本紅十字中心臍血庫獲得臨床檢體(例如臨床檢查等完畢、由于細(xì)胞數(shù)的問題或家族史的問題而廢棄的檢體)。另外，骨髓細(xì)胞可由骨髓庫獲得，也可由經(jīng)骨髓穿刺采集的細(xì)胞或其中廢棄的細(xì)胞獲得。末梢血可以使用為常規(guī)血液檢查而采集的血液或其廢棄血液。為了更有效地取得末梢血中的干細(xì)胞團(tuán)，也可以由G-CSF動員骨髓中的干細(xì)胞，然后再采集。
接著，通過密度梯度離心，從上述細(xì)胞中分離單核細(xì)胞(MNCs)。
本發(fā)明中用于移植的細(xì)胞例如是表現(xiàn)CD34陽性(CD34+、CD133+細(xì)胞、SP細(xì)胞、CD34+CD38-細(xì)胞、c-kit+細(xì)胞)的細(xì)胞、即造血前體細(xì)胞或成熟造血細(xì)胞。CD34+細(xì)胞可通過將試樣與抗人CD34微珠一起溫育來獲得。
作為上述造血前體細(xì)胞來源的試樣中，除造血前體細(xì)胞之外，還包含分化為T細(xì)胞的細(xì)胞。為了除去所述T細(xì)胞，可以使其與抗T細(xì)胞標(biāo)記的抗體反應(yīng)。例如將MNCs與小鼠抗人CD3、CD4和/或CD8抗體一起溫育。將其洗滌后，將細(xì)胞與綿羊抗小鼠免疫磁珠一起溫育，回收未結(jié)合的細(xì)胞。CD3、CD4和CD8均是T細(xì)胞的標(biāo)記(表面抗原)，因此使用這些抗原的抗體進(jìn)行上述處理，可以除去T細(xì)胞。這樣得到的前體細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原為CD3陰性(CD3-)、CD4陰性(CD4-)、CD8陰性(CD8-)。接著將除去了T細(xì)胞的試樣與抗人CD34微珠一起溫育。通過該操作，可得到表現(xiàn)CD34+的造血前體細(xì)胞。然后將細(xì)胞過磁柱，富集的CD34+細(xì)胞的純度優(yōu)選為90％或以上。
成熟造血細(xì)胞可利用造血干細(xì)胞和造血前體細(xì)胞等的增殖能力，特別是無需細(xì)胞因子等的輔助即可獲得。不過施用G-CSF、青灰因子、GM-CSF、TPO、EPO等細(xì)胞因子，可以有效地獲得特定的組分。
本發(fā)明的動物可如下獲得預(yù)先對受體動物進(jìn)行全身放射線照射，然后將制備為規(guī)定量的造血前體細(xì)胞或成熟造血細(xì)胞移植到受體動物(NOD/SCID/B2M、NOD/SCID/IL2rg-null小鼠等)中。移植的細(xì)胞數(shù)可根據(jù)動物的種類適當(dāng)確定。例如以SCID小鼠作為受體動物時，移植造血細(xì)胞時，每只至少為1×103個，對上限并沒有特別限定?？蓛?yōu)選使用1×103個-1×107個細(xì)胞。利用多數(shù)細(xì)胞，可有望獲得高比例的人細(xì)胞的分化。
移植優(yōu)選靜脈移植，也可以是腹腔、心腔、肝臟內(nèi)移植。經(jīng)由靜脈進(jìn)行移植時，可從面靜脈、尾靜脈等注入細(xì)胞。此時可以使用26-30號(G)注射針(例如29G)。例如優(yōu)選通過靜脈注射，將除去了T細(xì)胞的1×105個CB細(xì)胞(CD3-CD4-CD8-CD34+)移植到預(yù)先接受了100cGy全身照射的未成熟NOD/SCID/B2M小鼠或NOD.Cg-Prkdcscid小鼠。
細(xì)胞移植后，要在充分的無菌管理下飼養(yǎng)?！盁o菌管理”是指不含感染癥等的病原微生物或抗原物質(zhì)地進(jìn)行管理，即，在所謂的SPF(無特殊病原體)水平的無菌室中進(jìn)行飼養(yǎng)，施用經(jīng)放射線照射的飼料(或低分子化飼料)，或者施用滅菌水。當(dāng)為小鼠時，在上述無菌管理下飼養(yǎng)2周-16周、優(yōu)選3-4周，即可用于免疫細(xì)胞的回收或用于免疫。本發(fā)明也提供上述飼養(yǎng)的動物。所述本發(fā)明的動物也包含其后代。只要保持無菌環(huán)境，即可通過常規(guī)交配獲得其后代。
如上所述得到的“人源化動物”的體內(nèi)建立了來自供體(人)的免疫系統(tǒng)，可回收人源免疫活性細(xì)胞等。本發(fā)明中，“免疫活性細(xì)胞”(也稱為免疫細(xì)胞)是指建立了免疫應(yīng)答的細(xì)胞，其例子有抗體生成細(xì)胞或造血細(xì)胞，具體有B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等。
免疫活性細(xì)胞不僅擔(dān)負(fù)全身免疫、粘膜免疫(后述)的作用，還在各組織中擔(dān)負(fù)保護(hù)宿主及其組織的作用。例如，皮膚中，朗格漢斯細(xì)胞進(jìn)行抗原呈遞，在真皮中使被動員的T細(xì)胞、B細(xì)胞發(fā)揮功能。肝臟中，肝巨噬細(xì)胞具有吞噬能力。神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞為預(yù)防神經(jīng)變性而吞噬不需要的物質(zhì)。因此，本發(fā)明中，各組織的免疫活性細(xì)胞可構(gòu)建人免疫系統(tǒng)。
這些人源細(xì)胞相對于來自受體的細(xì)胞的比例如下對于造血細(xì)胞為5-90％、優(yōu)選20-90％，抗體生成細(xì)胞為2-80％、優(yōu)選10-80％。
上述免疫活性細(xì)胞是來自供體人的細(xì)胞，這些細(xì)胞可以生產(chǎn)各種生理活性物質(zhì)。單核或樹突狀細(xì)胞等主要發(fā)揮抗原呈遞細(xì)胞的功能。生理活性物質(zhì)例如有細(xì)胞因子、免疫球蛋白等。細(xì)胞因子是控制各種血細(xì)胞的增殖和分化的蛋白質(zhì)性的生理活性物質(zhì)，可以例舉白細(xì)胞介素(IL)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子等。近年的研究顯示這些細(xì)胞因子的異常分泌或控制調(diào)節(jié)錯誤與各種病態(tài)密切相關(guān)。它們生成的減少對重癥感染病顯示一種免疫缺陷狀態(tài)的可能性高。另外，免疫球蛋白(Ig)是具有抗體的功能和結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，同種型有IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。本發(fā)明的免疫球蛋白包含所有同種型。IgG和IgA還存在它們的亞類(分別為G1-G4、A1-A2)，這也包含在上述免疫球蛋白中。
B細(xì)胞是在表面或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Ig受體的淋巴細(xì)胞，生成IgG、IgM、IgA、IgD等免疫球蛋白或IL-6等細(xì)胞因子。T細(xì)胞是與免疫應(yīng)答有關(guān)的淋巴細(xì)胞，是在胸腺中分化、成熟的細(xì)胞，生成IL-2～I(xiàn)L-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16等。樹突狀細(xì)胞是在免疫應(yīng)答開始時發(fā)揮輔助細(xì)胞(佐細(xì)胞)作用的具有樹突狀突起的細(xì)胞，表達(dá)II類主要組織相容性(MHC)抗原，發(fā)揮對輔助T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞的作用。NK(天然殺傷細(xì)胞)是不受MHC抗原限制，對病毒感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞等顯示細(xì)胞傷害活性的細(xì)胞。NKT(天然殺傷T細(xì)胞)是同時具有T細(xì)胞受體和NK細(xì)胞標(biāo)記(例如CD16、CD56)的細(xì)胞，通過糖脂質(zhì)α半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α半乳糖苷神經(jīng)酰胺)的刺激生成IFN-γ或IL-4。
3.嵌合現(xiàn)象的確認(rèn)以及抗體和疫苗的生成對于人源細(xì)胞在受體動物中表達(dá)，只要采集受體動物的末梢血、骨髓細(xì)胞、其它免疫組織，確認(rèn)它們來自人即可。
例如，受體為免疫缺陷小鼠時，可以在移植后3周至3個月之間，從后眼窩血管叢采集末梢血，從股骨和脛骨采集骨髓細(xì)胞。還可以切取脾臟、淋巴結(jié)和胸腺后切碎，將分離的細(xì)胞過網(wǎng)眼濾器，得到單一細(xì)胞懸浮液。通過使用FACSCalibur或FACSVantage(BectonDickinson)進(jìn)行人CD45(白細(xì)胞共同抗原、造血系細(xì)胞的主要膜糖蛋白)的表達(dá)分析，這些細(xì)胞鑒定為來自供體的造血細(xì)胞。也可以通過小鼠抗人抗體進(jìn)行染色。
本發(fā)明的動物可以建立來自供體人的免疫系統(tǒng)。特別是當(dāng)為小鼠時，骨髓、脾臟、淋巴結(jié)、末梢血、胸腺幾乎接近100％地被人的細(xì)胞置換(以下，本發(fā)明中將這樣的小鼠稱為“人源化小鼠”)。因此用抗原或適當(dāng)?shù)拇碳の镔|(zhì)刺激免疫活性細(xì)胞B細(xì)胞(抗體生成細(xì)胞)、高比例含有B細(xì)胞的脾臟細(xì)胞等，可以生成人源抗體。例如，在細(xì)菌、病毒、腫瘤(包含腫瘤細(xì)胞、抗原肽等)存在下培養(yǎng)本發(fā)明的免疫活性細(xì)胞，可以促進(jìn)人源抗體的生成。B細(xì)胞的表面抗原表現(xiàn)CD19陽性(CD19+)，因此抗體生成能力的測定可通過細(xì)胞分選儀等對CD19+細(xì)胞中的IgM、IgG、IgD和IgA的表達(dá)進(jìn)行分析。
用規(guī)定的抗原或適當(dāng)?shù)拇碳の镔|(zhì)免疫本發(fā)明的動物，從所得免疫細(xì)胞中收集抗體，由此可得到來自供體(人)的抗原特異性抗體。例如，通過對本發(fā)明的動物或其后代施用細(xì)菌、病毒、腫瘤(包含腫瘤細(xì)胞、抗原肽等)，或者在細(xì)菌、病毒、腫瘤(包含腫瘤細(xì)胞、抗原肽等)存在下培養(yǎng)由本發(fā)明的動物或其后代得到的組織或細(xì)胞，可以促進(jìn)人源抗體的生成，還可以開發(fā)疫苗。已知通過上述刺激而脈沖(刺激)的樹突狀細(xì)胞可以有效誘導(dǎo)T細(xì)胞。因此，選擇在機(jī)體內(nèi)脈沖的樹突狀細(xì)胞，可以作為疫苗應(yīng)用。
當(dāng)為小鼠時，將抗原或適當(dāng)?shù)拇碳の镔|(zhì)施用于一只動物的施用量為10μg-1mg，可以根據(jù)佐劑的有無適當(dāng)調(diào)節(jié)。佐劑的例子有弗氏完全佐劑(FCA)、不完全佐劑弗氏(FIA)、氫氧化鋁等。
抗原或適當(dāng)?shù)拇碳の镔|(zhì)的種類沒有特別限定，有蛋白質(zhì)、肽、凝集素等。
施用部位為靜脈內(nèi)、皮下、足(足墊)或腹腔內(nèi)。免疫的間隔沒有特別限定，以數(shù)天至數(shù)周的間隔、優(yōu)選以1-2周的間隔進(jìn)行1-3次免疫。最終免疫后約1周至2周后，測定血清或血漿中的抗體滴度，得到抗血清或抗血漿?？贵w滴度的測定可通過酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等進(jìn)行。
需要從抗血清或抗血漿中純化抗體時，可適當(dāng)選擇硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾、親和柱層析等公知的方法，或通過將它們組合來純化抗體。
以大型動物、特別是免疫缺陷豬作為受體使用，則在抗體生成的量方面有優(yōu)勢。該大型動物的例子有敲除IL7R、IL2R commonγ鏈、Jak/Stat，RAG-1、RAG-2等而制備的免疫缺陷動物。
另一方面，為了開發(fā)高質(zhì)量的疫苗，受體優(yōu)選使用小型動物。小型動物中可以容易地判定各種肽或抗原等在具有人免疫系統(tǒng)的本發(fā)明的動物的機(jī)體內(nèi)具有怎樣有效的抗腫瘤效果，或者是否具有肽識別效率。另外，如果使用本發(fā)明人開發(fā)的白血病細(xì)胞的機(jī)體內(nèi)評價系統(tǒng)，則可以評價所開發(fā)的疫苗或樹突狀細(xì)胞或者T細(xì)胞對于機(jī)體內(nèi)增殖的白血病細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞是怎樣地有效。
因此，本發(fā)明提供免疫相關(guān)藥物的篩選方法，其特征在于將受試物質(zhì)施用于本發(fā)明的動物(包含未成熟個體、活體、后代、模型動物)，評價受試物質(zhì)的有效性?！懊庖呦嚓P(guān)藥物”例如以抗體藥物、疫苗(肽或樹突狀細(xì)胞等)為代表，也包含抗病毒藥物或抗生素等針對感染病的藥物。還廣泛包含細(xì)胞因子療法所涉及的體液因素。免疫相關(guān)藥物的給藥量和給藥方法可以以體表面積、體重和性別為基準(zhǔn)設(shè)定，特別是靜脈內(nèi)、骨髓內(nèi)、腹腔、肝臟、皮下等為主要的給藥途徑。免疫相關(guān)藥物的對象疾病極為廣泛，例如有腫瘤性疾病、自體免疫疾病、病毒性疾病、真菌性疾病、神經(jīng)性疾病、寄生性疾病、疑難病、細(xì)菌性疾病、分枝桿菌疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或SLE等膠原病、白血病或淋巴腫瘤等造血器官惡性疾病、實體腫瘤、良性的造血器官和實體腫瘤性疾病、花粉癥、變應(yīng)性疾病、特應(yīng)性疾病、艾滋病等。
該方法在對本發(fā)明的人抗體的免疫應(yīng)答和變應(yīng)性的安全性確認(rèn)(特別是前期臨床試驗階段)方面有用。
本發(fā)明的動物或其后代的粘膜免疫、消化道免疫、呼吸道免疫也可由人免疫系統(tǒng)構(gòu)建。這里，粘膜免疫特別是指生成IgA等分泌型免疫球蛋白，在粘膜特有的淋巴小結(jié)或淋巴集結(jié)等含有大量T細(xì)胞的組織等中的免疫。消化道免疫是指排除對因口服而被攝入到體內(nèi)的細(xì)菌等抗原不需要的物質(zhì)或?qū)ι眢w有害的物質(zhì)的整個系統(tǒng)。呼吸道免疫是指包含與消化道免疫同樣地生成分泌型免疫球蛋白，對經(jīng)由呼吸道(由鼻腔到支氣管、肺泡)侵入的的外來性抗原進(jìn)行整體免疫應(yīng)答。
利用本發(fā)明的人源化動物中的粘膜免疫系統(tǒng)，則可以進(jìn)行口服疫苗的開發(fā)、消化道感染癥的確診、食物變應(yīng)性病態(tài)的確診、變應(yīng)性反應(yīng)藥物的開發(fā)等，該免疫系統(tǒng)的應(yīng)用范圍極廣。例如，關(guān)于口服疫苗，經(jīng)典的有脊髓灰質(zhì)炎的疫苗，人們還希望有對引起致死性食物中毒的O157、霍亂、痢疾等感染病的疫苗?？梢允褂糜杀景l(fā)明的疾病模型動物或其后代回收的體液(主要是血清)或者細(xì)胞、或者將本發(fā)明的免疫活性細(xì)胞作為上述疫苗使用。
可以說克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾病的病因是由于免疫系統(tǒng)的異常。因此今后也可在使用本發(fā)明的動物、方法、抗體、疫苗等的這些病態(tài)的確診、干細(xì)胞移植或T細(xì)胞注入等的新型治療方法的開發(fā)中應(yīng)用。
本發(fā)明的動物或其后代可作為疾病模型動物(特別是感染病模型動物、腫瘤模型動物)使用。其中，特別有望得到病毒感染病模型動物。特別是病毒具有種特異性，因此人的HIV、HSV等目前認(rèn)為臨床上很重要的病毒并不會感染小鼠。因此，以往只是使用與小鼠皰疹病毒、小鼠反轉(zhuǎn)錄病毒等同樣系統(tǒng)的病毒進(jìn)行感染試驗，有不能直接使用HIV的問題。本發(fā)明的模型動物保有人的免疫系統(tǒng)，因此可以通過將細(xì)菌、真菌、病毒感染小鼠來構(gòu)建疾病模型。本發(fā)明的疾病模型可以通過以μg-mg單位施用各種量的抗原來獲得。施用途徑如上所述，可以例舉靜脈、骨髓、肝臟、腹腔、皮下等。關(guān)于抗原，除細(xì)菌、真菌、病毒之外，不僅有OVA，還包含蛋白質(zhì)、肽、細(xì)胞等。
例如本發(fā)明人在對HIV、HTLV-1等病毒在生物體內(nèi)的情況進(jìn)行觀察時，已經(jīng)有效確認(rèn)在小鼠體內(nèi)，作為宿主的人CD4陽性細(xì)胞例如由干細(xì)胞分化，成熟T細(xì)胞直接附著于其上。因此，有望可以進(jìn)行包括上述病毒的、曾出現(xiàn)各種臨床上問題的病毒感染試驗。
4.其它嵌合現(xiàn)象的試驗(1)組織學(xué)分析將受體小鼠解剖后，將組織進(jìn)行固定或冷凍。由低聚甲醛固定的組織優(yōu)選使用梯度濃度的乙醇進(jìn)行脫水，包埋石蠟?？墒褂们衅瑱C(jī)或恒冷切片機(jī)等制備切片，并對各切片進(jìn)行常規(guī)的免疫組織染色法。
(2)熒光原位雜交(FISH)法FISH法是確定染色體的基因座的公知技術(shù)，將用熒光物質(zhì)等標(biāo)記的單鏈探針DNA在染色體DNA的互補(bǔ)位點雜交，在顯微鏡下鑒定特異性需求細(xì)胞等的位點。
實施例以下，通過實施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明。本發(fā)明并不受這些實施例的限定。
人的造血細(xì)胞向免疫缺陷小鼠的移植臍血(CB)細(xì)胞由日本紅十字中心臍血庫獲得。在得到書面的知情同意書后，從要廢棄的臍血中采集CB細(xì)胞。使用密度梯度(淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基、ICN Biomedicals)，以370×g離心30分鐘，從CB中分離單核細(xì)胞(MNCs)。將MNCs與小鼠抗人CD3、CD4、CD8抗體(BDImmunocytometry)一起在4℃溫育30分鐘。洗凈后，將細(xì)胞與綿羊抗小鼠免疫磁珠(DYNAL)一起在4℃溫育30分鐘，回收未結(jié)合的細(xì)胞。為分離CD34+群，將除去了T細(xì)胞試樣與抗人CD34微珠(MiltenyiBiotech)一起溫育40分鐘(按照廠商的說明書)。將細(xì)胞過2次磁柱，結(jié)果，富集的CD34+細(xì)胞的純度為90％或以上。
通過靜脈注射，將上述制備的CB細(xì)胞(CD3-CD4-CD8-CD34+、1×105個)移植到預(yù)先經(jīng)100cGy全身照射的新生兒NOD/SCID/B2M小鼠(Jackson Laboratory)中，制備構(gòu)建包含人源免疫細(xì)胞在內(nèi)的人免疫系統(tǒng)的小鼠。
對小鼠機(jī)體內(nèi)的人源B系細(xì)胞的分析為了研究小鼠機(jī)體內(nèi)是否重建了人淋巴細(xì)胞，對作為人CD45+細(xì)胞的CD19+細(xì)胞(B細(xì)胞)的移植水平進(jìn)行多重造血組織分析。
分析移植后飼養(yǎng)至第3個月的受體小鼠骨髓(BM)、脾臟、末梢血(PB)、淋巴結(jié)(LN)中是否存在人源B系細(xì)胞。將BM、脾臟、PB、LN用FLTC結(jié)合免疫球蛋白和PE結(jié)合CD19染色。
結(jié)果如圖1A和圖1B所示。圖1A中，a為由BM、b為由脾臟、c為由PB、d為由LN采集的細(xì)胞的流式細(xì)胞計量術(shù)圖。在各淋巴組織中鑒定出高水平的人CD45+CD19+細(xì)胞。圖1A的a-d所示的各數(shù)值(分別為64.6、23.6、50.1、44.6)表示CD45+CD19+細(xì)胞占由各組織采集的全部細(xì)胞的比例(％)。
圖1B的16個圖中，第1行(e)、第2行(f)、第3行(g)、第4行(h)的圖分別表示用FITC-結(jié)合IgM(第1列)、IgD(第2列)、IgG(第3列)、IgA(第4列)和PE結(jié)合CD19抗體對來自BM、脾臟、PB、LN的造血細(xì)胞進(jìn)行染色的結(jié)果。各圖內(nèi)的數(shù)值表示各類免疫球蛋白在CD19+細(xì)胞中表達(dá)的比例(％)。例如e的第1行的90.1是表達(dá)IgM的來自骨髓的細(xì)胞的比例。
這些結(jié)果顯示在BM、脾臟、PB、LN各組織中，人源免疫球蛋白高比例表達(dá)。
接著，為研究小鼠中著生的人淋巴細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)答，用100μg卵清蛋白(OVA)免疫實施例1中制備的小鼠，通過ELISA分析OVA特異性IgM和IgG的存在。將受體小鼠的血漿稀釋至10倍(IgM分析用)或3倍(IgG分析用)，對各樣品進(jìn)行吸光度測定。另外，從受體小鼠中采集B細(xì)胞，用RPMI/FCS(胎牛血清)/商陸促分裂原培養(yǎng)基培養(yǎng)5天。然后通過ELISA測定培養(yǎng)上清中的免疫球蛋白。測定人血清中的免疫球蛋白作為陰性對照。
結(jié)果如圖2所示。圖2中，圖a是IgM、圖b是IgG的結(jié)果。圖表由左至右表示血漿、培養(yǎng)上清、陰性對照1(人血清)、陰性對照2(陰性對照1的血清1/10量)。圖2顯示高比例生成抗原特異性IgM和IgG。
B細(xì)胞的分化和成熟通過細(xì)胞分選儀，從受體小鼠的末梢血(PB)、骨髓(BM)和脾臟中采集CD19+細(xì)胞(B細(xì)胞)，研究B細(xì)胞的IgM、IgG、IgD和IgA的表達(dá)。關(guān)于IgM/IgG在CD19+細(xì)胞中的表面表達(dá)，在PB中為90.0％/54.0％，在BM中為19.7％/3.4％，在脾臟中為59.0％/22.7％。
再使用商陸促分裂原(PWM)，將脾臟細(xì)胞在試管內(nèi)培養(yǎng)5天。還制備用100μg/ml OVA免疫的受體小鼠。接著使用ELISA研究人免疫球蛋白向培養(yǎng)上清和血漿中的分泌(表1)。使用PWM、培養(yǎng)5天的培養(yǎng)基(上清)含有114ng/ml-19.8μg/ml IgM、2.6-47.6ng/ml IgG、1.9-5.7ng/ml IgA(表1)。
表1人免疫球蛋白的生成

(生成量單位ng/ml)
由受體小鼠采集的血漿含有17.2-225μg/ml IgM、4.1-823ng/mlIgG、9.4-553ng/ml IgA。
如表1所示，用OVA免疫受體小鼠時，人B細(xì)胞含有OVA特異性IgM，分泌了大量的IgM、IgG和IgA。因此，本實施例顯示新生NOD/SCID/B2M小鼠中生成的人B細(xì)胞成熟，具有生成人源IgM和IgD，并生成抗原特異性且來自人的IgM、IgG和IgA的功能。
這些認(rèn)識顯示由本發(fā)明的小鼠得到的B細(xì)胞不僅作為人抗體生成細(xì)胞使用，還生成重癥感染病的病原微生物或腫瘤的人免疫球蛋白(單克隆抗體)，因此極為有用。
對小鼠機(jī)體內(nèi)的人源T細(xì)胞的分析本實施例中，對受體小鼠的BM、脾臟和PB中的人T細(xì)胞的存在(CD45和CD3)進(jìn)行流式細(xì)胞定量分析。
結(jié)果如圖3所示。圖3a-c的各圖分別為BM(a)、脾臟(b)、PB(c)的分析結(jié)果。T細(xì)胞與B細(xì)胞相比為少數(shù)，但有分化，移植到受體小鼠中后的第3個月，CD3+細(xì)胞在BM中為0.17％、在脾臟中為1.44％、在PB中為1.8％。
以HLA-DR+CD11c+表型為特征的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)在BM中為1.09％(圖3d)。另外在胸腺中鑒定出CD19+IgM+的B細(xì)胞(圖3e)。
淋巴組織的FISH分析和免疫熒光分析為了原位研究人淋巴細(xì)胞的分布，使用來自受體小鼠的脾臟，對人和小鼠染色體進(jìn)行雙重FISH分析。FISH按照常規(guī)方法進(jìn)行(Vysis)。樣品的分析使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510MetaCarl Zeiss)。
從使用人X染色體探針的實驗中可得到與FACS分析結(jié)果不矛盾的高頻度出現(xiàn)的人細(xì)胞。由使用人和小鼠X染色體的雙重FISH分析可知起源于小鼠的間質(zhì)細(xì)胞也存在于脾臟中(圖4)。
人細(xì)胞鑒定為綠色信號(人X染色體)(圖4a)。來自受體小鼠的脾臟細(xì)胞的一部分被小鼠抗人CD3染成了紅色(圖4c)。圖4b是將圖a和b重疊的圖，染成藍(lán)色的位置表示核。
受體小鼠在移植前都失去成熟淋巴細(xì)胞，但通過移植除去了來自人CB的T細(xì)胞的CD34+細(xì)胞，可以在小鼠內(nèi)很好地重建人源淋巴組織。
還對組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織染色。由小鼠采集的脾臟組織的免疫組織染色的結(jié)果如圖4d和e所示。大多數(shù)的脾臟細(xì)胞被抗人IgM陽性(d)、抗人IgD陽性(e)染成紅色，顯示極高比例地著生人源脾臟細(xì)胞。用小鼠抗人CD3染色脾臟組織，結(jié)果脾臟的一部分被抗人CD3染色成陽性(紅色)(圖4f)。使用濾泡樹突狀細(xì)胞的特異抗體進(jìn)行免疫染色，也可以確認(rèn)人APCs的存在(圖4g)。
異種宿主中人細(xì)胞的多細(xì)胞系的重建本實施例的目的在于開發(fā)由造血細(xì)胞重建的“人源化小鼠”。人CB造血干細(xì)胞/前體細(xì)胞的受體使用NOD/SCID/IL2rg-null(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtmlWjl/Sz)小鼠(Jackson Laboratory)，向該小鼠移植人的造血干細(xì)胞，這可按照與實施例1的方法大體同樣的方法進(jìn)行。臍血(CB)細(xì)胞由日本紅十字中心臍血庫獲得。在得到書面的知情同意書后，從要廢棄的臍血中采集CB細(xì)胞。使用小鼠抗CD3、CD4、CD8、CD11b、CD19、CD20、CD56和血型糖蛋白A單克隆抗體(BDImmunocytometry)，從單核細(xì)胞(MNCs)中除去Lin(譜系抗原)陽性細(xì)胞。為了以高純度分離CD34+造血干細(xì)胞群，將單核細(xì)胞與抗人CD34微珠(Miltenyi Biotech)一起在10℃溫育30分鐘(按照廠商說明書)，將細(xì)胞過磁柱2次。結(jié)果，富集的CD34+細(xì)胞的純度為95％或以上，CD19+細(xì)胞和CD3+細(xì)胞的比例為0.1％或以下。在通過靜脈注射移植上述制備的Lin-CD34+細(xì)胞(1×105個)之前，預(yù)先對新生NOD/SCID/IL2rg-null小鼠和NOD/SCID/β2mnull小鼠實施100cGy的全身照射。
NOD/SCID/IL2rg-null小鼠的成熟B和T細(xì)胞完全缺失，并且NK細(xì)胞的活性水平顯著低，因此將該小鼠用作受體時，可以降低排斥異種細(xì)胞的危險性。另外，新生小鼠免疫性未成熟，因此新生小鼠受體生長期間，人干細(xì)胞固定，可得到由其分化的造血體系的細(xì)胞。實際上，1×105個Lin-CD34+細(xì)胞被高效地移植到受體小鼠的BM中，在初級或次級淋巴器官中產(chǎn)生被分化為多細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞。
與實施例2同樣地，對移植后第3個月的受體小鼠機(jī)體內(nèi)的人源B細(xì)胞進(jìn)行分析。使用FACSCalibur(Becton Dicinson)分析CD45及其系列標(biāo)記(譜系標(biāo)記)的表達(dá)。結(jié)果，受體小鼠的造血系統(tǒng)中含有所有的人的造血系統(tǒng)構(gòu)成要素。受體小鼠的BM中，人GPA+紅細(xì)胞以9.5±6.2％(n＝5)、人CD41+巨核細(xì)胞以1.64±0.42％(n＝5)的頻度存在。
來自人CB的Lin-CD34+細(xì)胞在BM內(nèi)生成CD33+脊髓細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞以及CD3+T細(xì)胞(分別見圖5B-D)。
為評價該NOD/SCID/IL2rg-null小鼠的優(yōu)越性，與現(xiàn)有小鼠系統(tǒng)中被認(rèn)為移植效率最好的NOD/SCID/β2mnull小鼠(NOD/LtSz-Prkdcscid/Prkdcscid/B2mnull)(Jackson Laboratory)進(jìn)行移植水平的比較。將1×105個來自Lin-CD34+的人CB細(xì)胞移植到NOD/SCID/β2mnull小鼠或NOD/SCID/IL2R-γcnull小鼠中。對移植3個月后的受體小鼠的BM、脾臟和末梢血(PB)中的人CD45+細(xì)胞的移植水平進(jìn)行分析。
結(jié)果，PB中，NOD/SCID/IL2rg-null小鼠(68.9±11.6％、n＝5)與NOD/SCID/β2mnull小鼠(12.4±5.9％、n＝5)相比，人細(xì)胞的移植水平顯著高，確認(rèn)人成熟紅細(xì)胞(圖5E)和血小板(圖5F)兩者與人白細(xì)胞共同存在。NOD/SCID/IL2rg-null小鼠在BM(72.9±9.8％、n＝5)和脾臟(54.5±8.0％、n＝5)中也顯示高比例的移植水平(表2)。
與BM、脾臟相同，人細(xì)胞在末梢血中也循環(huán)，特別是在受外源性的抗原或細(xì)胞因子刺激時，可以分析人細(xì)胞的游走或流動。
表2NOD/SCID/β2mnull小鼠和NOD/SCID/IL2rg-null小鼠中的CD45+細(xì)胞的嵌合現(xiàn)象
NOD/SCID/IL2rg-null中的人免疫系統(tǒng)的分化由實施例6可以確認(rèn)受體小鼠(NOD/SCID/IL2R-γcnull小鼠)的免疫系統(tǒng)中人B細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的存在。B細(xì)胞發(fā)生的各階段、即CD19+CD20hi成熟B細(xì)胞(圖6A、D)、CD10+CD19+未成熟B細(xì)胞(圖6B、E)和CD34+CD19+pro-B細(xì)胞(圖6C、F)在移植后的小鼠的BM(圖6A-C)和脾臟兩處均得到確認(rèn)(圖6D-F)。
接著，調(diào)查移植后3個月時人免疫球蛋白各同種型在來自BM、末梢血(PB)和脾臟(SP)的人CD19+細(xì)胞中的表達(dá)。
結(jié)果如圖7所示。各區(qū)域中的數(shù)字表示按表示細(xì)胞由來的各標(biāo)記區(qū)分的抗體和各類免疫球蛋白的抗體顯示雙陽性的細(xì)胞的比例(％)。圖7中，在由淋巴組織分化的CD19+B細(xì)胞中，免疫球蛋白表達(dá)，這顯示該淋巴組織變化為人免疫系統(tǒng)。BM中保有B前體細(xì)胞并表達(dá)，末梢血(PB)中生成成熟IgM+和IgD+B細(xì)胞(圖7)。BM和脾臟中存在人IgA+B細(xì)胞，這顯示由人細(xì)胞重建粘膜免疫系統(tǒng)。
接著，為研究上述B細(xì)胞的功能，通過ELISA法對受體血清中所含的人免疫球蛋白的生成量進(jìn)行定量。使用移植了來自人CB的Lin-CD34+細(xì)胞3個月后的NOD/SCID/β2mnull小鼠和NOD/SCID/IL2rg-null小鼠，通過ELISA分析血清中的人IgM和IgG抗體生成量。
結(jié)果，檢查的全部受體血清中存在人IgM(600±197μg/ml、n＝3)和人IgG(256.7±76.4μg/ml、n＝3)。因此通過本實施例可以確認(rèn)可有效地生成人免疫球蛋白(表3)。
表3受體血清中人IgM和IgG的生成

移植的上述NOD/SCID/β2mnull小鼠和NOD/SCID/IL2rg-null小鼠中免疫球蛋白生成水平的大的差異可在受體血清中的人IgG類抗體量中體現(xiàn)。即表示有效的類別轉(zhuǎn)換(Class Switch)是通過變化為NOD/SCID/IL2rg-null受體小鼠中的人免疫系統(tǒng)來調(diào)節(jié)的。
接著，對異種宿主中的人T細(xì)胞的發(fā)生進(jìn)行分析。通過流式細(xì)胞計量術(shù)對胸腺(圖8A)和脾臟(圖8B)中的人T細(xì)胞的發(fā)生進(jìn)行分析。
結(jié)果如圖8所示。胸腺中，未成熟CD4+CD8+雙陽性T細(xì)胞占88.1％(A)，而次級淋巴組織脾臟中，CD4+CD8-的單陽性人T細(xì)胞占了大部分(B)。
還通過免疫熒光試驗鑒定移植的T細(xì)胞。用抗人CD4抗體(圖8C)和抗人CD8抗體(圖8D)對胸腺中的T細(xì)胞進(jìn)行染色。將用低聚甲醛固定的切片用熱檸檬酸緩沖液處理，用抗體進(jìn)行免疫染色。使用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510MetaCarl Zeiss)進(jìn)行檢測。圖8E是圖8C和D的重疊圖像，由此顯示大部分的胸腺細(xì)胞為CD4和CD8雙陽性。而用抗人CD4抗體(綠)和抗人CD8(紅)對脾臟進(jìn)行染色，則CD4或CD8單陽性的T細(xì)胞為顯性(圖8F)。
以上結(jié)果表明通過免疫染色，受體的胸腺中，CD4+CD8+T細(xì)胞、CD4+CD8-T細(xì)胞、CD4-CD8+人T細(xì)胞形成組織性結(jié)構(gòu)。在象脾臟這樣的次級淋巴組織中，單陽性T細(xì)胞以1.39±0.61(n＝5，0.94-2.43)CD4/CD8比存在。上述結(jié)果顯示來自人CB-干細(xì)胞/前體細(xì)胞的T細(xì)胞成熟、以及經(jīng)受了增殖刺激，這意味著與人機(jī)體中的相同。
為了使對抗原的免疫應(yīng)答發(fā)生最佳的變化，需要樹突狀細(xì)胞或單核細(xì)胞發(fā)揮抗原呈遞細(xì)胞的功能。因此，對NOD/SCID/IL2R-γcnul小鼠脾臟中的人樹突狀細(xì)胞的存在進(jìn)行了研究。
結(jié)果如圖9所示。圖9A中，以流式細(xì)胞計量術(shù)表示脾臟中HLA-DR+CD11c+細(xì)胞的存在。圖9B是通過抗人CD11c抗體進(jìn)行免疫染色，顯示人樹突狀細(xì)胞保持了預(yù)想的形態(tài)學(xué)特征的圖。圖9A顯示HLA-DR+CD11c+樹突狀細(xì)胞以1.32±0.54％(n＝6)的頻度存在于NOD/SCID/IL2rg-null受體小鼠的脾臟中。另外，通過人CD11c抗體免疫染色，顯示移植的人樹突狀細(xì)胞在小鼠器官中具有形態(tài)學(xué)特征(圖9B)。受體的脾臟中，由人CD19+細(xì)胞和CD3+細(xì)胞形成組織化的結(jié)構(gòu)(圖9C和D)，與此相伴，在異種淋巴組織中的人免疫系統(tǒng)的功能性重建，這可通過人樹突狀細(xì)胞的存在顯示出來。
以上結(jié)果顯示，免疫體系中必須不可缺少的三要素——人源T細(xì)胞、B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞在異種宿主(小鼠)中適當(dāng)成熟，并由CBLin-CD34+細(xì)胞高比例分化。
人粘膜免疫的重建胃腸道系統(tǒng)的組織是通過針對外源性抗原的粘膜免疫支撐宿主防御的主要部位。本發(fā)明人證實了受體小鼠的BM和脾臟中存在IgA+B細(xì)胞，又研究了異種宿主的消化道中是否存在人免疫細(xì)胞。從小鼠體內(nèi)摘取由胃至直腸的消化道，用PBS染色，然后用3％低聚甲醛在室溫下固定1小時。將石蠟包埋樣品切片成5μm厚度，用于免疫染色。免疫熒光試驗采用激光掃描共聚焦顯微鏡。
結(jié)果如圖10所示。圖10表示NOD/SCID/IL2rg-null小鼠消化道中粘膜免疫的發(fā)生。圖10A和B是在進(jìn)行DAPI核染色的同時還進(jìn)行抗人CD3抗體(A、綠)和抗人IgA抗體(B、紅)的免疫染色，由此表示受體小鼠的腸管標(biāo)本中存在人粘膜免疫。圖10C是通過DIC圖像明確絨毛的輪廓的圖。圖10D是將A、B和C的圖像重疊的圖。圖10A-D顯示通過免疫熒光試驗，可證實受體小鼠的腸管絨毛中同時含有人IgA+B細(xì)胞和人CD3+T細(xì)胞。即，該結(jié)果表示粘膜免疫通過人Lin-CD34+干細(xì)胞/前體細(xì)胞重建。并且移植小鼠的回腸漿膜下可見節(jié)結(jié)構(gòu)(圖10E)。
通過抗人IgA(紅)和抗人CD3(綠)抗體對派爾淋巴集結(jié)樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，則可明確上皮下穹隆區(qū)(ド-ム)中富含人T細(xì)胞(圖10F)。如上所述，小鼠腸系膜淋巴結(jié)也明顯地由人細(xì)胞重建。因此，本發(fā)明的模型可作為用于分析胃腸道中人粘膜免疫系統(tǒng)的作用的實驗動物使用。
由移植的B細(xì)胞生成抗原特異性免疫球蛋白為了研究人免疫系統(tǒng)的組織性應(yīng)答，以及為了研究體內(nèi)抗原特異性人抗體的生成，在移植3個月后，用卵清蛋白(100μg、sigma)免疫3只NOD/SCID/IL2rg-null受體小鼠2次。卵清蛋白使用用100μg氫氧化鋁(sigma)乳化的物質(zhì)。該免疫后，通過流式細(xì)胞計量術(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示二次免疫后經(jīng)過兩周的受體小鼠的BM中，人CD38+IgG+細(xì)胞被有效誘導(dǎo)(圖11)。圖11A和B是通過流式細(xì)胞計量術(shù)、在人IgG+細(xì)胞存在下，對卵清蛋白免疫前后的受體小鼠的BM細(xì)胞進(jìn)行分析的圖。
接著，使用接受了免疫的受體小鼠的血清，測定卵清蛋白特異性人IgM和IgG的生成。將上述3只接受了免疫的小鼠、即用卵清蛋白免疫NOD/SCID/IL2rg-null受體小鼠2周后，采集受體小鼠的血清，通過ELISA法分析卵清蛋白特異性人IgM和IgG的存在。山羊抗人IgM和IgG抗體由Bethyl購入，在確認(rèn)與小鼠抗人IgM和IgG抗體不發(fā)生交叉反應(yīng)后才使用。使用來自未免疫的NOD/SCID/IL2rg-null受體小鼠的血清作為非特異性IgM和IgG對照。為了分析卵清蛋白特異性人IgM和IgG抗體，在96孔多孔板的底部鋪100μg/ml濃度的卵清蛋白，用于ELISA法。
結(jié)果，ELISA顯示，接受了免疫的受體的血清中與未免疫的受體(對照)相比較，人IgM(圖11C白色柱圖)和IgG(圖11C黑色柱圖)的光學(xué)濃度非常高。也顯示人細(xì)胞的嵌合化為高水平(圖11)?？紤]到卵清蛋白是T細(xì)胞依賴性抗原，可認(rèn)為其具有調(diào)和功能，使變化為人免疫系統(tǒng)特性的人樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞在異種宿主受體小鼠中生成抗原特異性的人IgM和IgG。
同種異體抗原特異性的人T細(xì)胞的存在本實施例明確了由異種宿主的淋巴組織中的Lin-CD24+CB細(xì)胞分化得到的人T細(xì)胞的同種異體抗原特異性功能。
從受體的脾臟中分離人T細(xì)胞后，分化同種異體抗原特異性的CD4+T細(xì)胞株和CD8+T細(xì)胞株。將CD4+細(xì)胞株和CD8+T細(xì)胞株兩者與同種異型(異源的)靶細(xì)胞(TAK-LCL)一起培養(yǎng)，為研究其對同種異型靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性，進(jìn)行51Cr游離測定。
將各種細(xì)胞數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞與1×104個51Cr標(biāo)記的同種異型靶細(xì)胞在圓底微量滴定孔板中，在添加有10％熱滅活胎牛血清的0.2mLRPMI1640中培養(yǎng)。靶細(xì)胞向只有培養(yǎng)基的孔、以及培養(yǎng)基中加入了1％Trito X-100的孔中添加，各游離量是將51Cr的自發(fā)游離和51Cr的最大游離值用于后面的計算。5小時后，從各孔中分別回收0.1mL上清，由以下的計算式求出特異性51Cr游離量。
(特異性的51Cr游離量)(％)＝(實測值(cpm)-自發(fā)游離值(cpm))/(最大游離值(cpm)-自發(fā)游離值(cpm))×100為了確定HLA限制，將靶細(xì)胞與抗HLA-A，B，C單克隆抗體(w6/32)(ATCC)或HLA-DR單克隆抗體(L243)(ATCC)溫育30分鐘，然后通過效應(yīng)T淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)。各細(xì)胞毒性的測定至少進(jìn)行2次。
KIN-LCL不共有同種異型的靶細(xì)胞和任意的HLA型，作為陰性對照使用(圖12、KIN-LCL、(×))。
效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的HLA型如下。由受體脾臟分離的T細(xì)胞，HLA-A24/33，B44/52，Cw12/w14，DRB1*1302/*15021，TAK-LCL，HLA-A24/26，B62/-，Cw4/w9，DRB1*0405/*0901，KIN-LCL，HLA-A01/30，B13/17，Cw6/-，DRB1*0701/*0701。
結(jié)果如圖12所示。圖12A-C分別表示3個CD4+T細(xì)胞株的刺激細(xì)胞濃度(效應(yīng)/靶比例)依賴性細(xì)胞毒性(％細(xì)胞毒性)。人CD4+T細(xì)胞株的細(xì)胞毒性對作為靶細(xì)胞使用的同種異型LCL(TAK-LCL)顯示細(xì)胞毒性(圖12、none、(◆))。為了研究異種環(huán)境中生成的人T細(xì)胞的MHC限制，使用抗I類HLA抗體和抗HLA-DR抗體，進(jìn)行人T細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞毒性抑制的測定。結(jié)果，細(xì)胞毒性受HLA-DR抗體(圖12、anti-HLA-DR、(▲))抑制，但不受I類HLA單克隆抗體(圖12、抗I類HLA(■))抑制。這顯示細(xì)胞毒性受II類HLA的限制。
圖12D-F分別表示3個CD8+T細(xì)胞株的刺激細(xì)胞濃度依賴性細(xì)胞毒性。CD8+T產(chǎn)生的細(xì)胞毒性受I類HLA單克隆抗體的抑制，但不受HLA-DR抗體抑制。這顯示與由通常環(huán)境下生成的CD8+CTL介導(dǎo)的同樣，由在異種環(huán)境下生成的CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性受I類HLA抗體限制。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明可提供使用新生免疫缺陷動物的人源免疫活性細(xì)胞的制備方法。本發(fā)明的新生免疫缺陷動物可在其體內(nèi)構(gòu)建人源免疫系統(tǒng)，因此可用于對淋巴組織的功能進(jìn)行分析，以及制備使用B細(xì)胞的人源抗體。
權(quán)利要求
1.移植有人源造血前體細(xì)胞或成熟造血細(xì)胞的未成熟免疫缺陷哺乳動物(人除外)，所述動物可生成來自該人的免疫活性細(xì)胞和/或來自該免疫活性細(xì)胞的生理活性物質(zhì)。
2.免疫缺陷哺乳動物或其后代，該免疫缺陷哺乳動物或其后代是飼養(yǎng)權(quán)利要求1的未成熟免疫缺陷哺乳動物(人除外)而得到的。
3.權(quán)利要求1或2的動物或其后代，其中未成熟免疫缺陷哺乳動物是新生免疫缺陷哺乳動物或胎兒免疫缺陷哺乳動物。
4.權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2或3的動物或其后代，其中造血前體細(xì)胞是來自骨髓、來自臍血或來自末梢血的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2或3的動物或其后代，其中免疫活性選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的至少一種。
6.權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2或3的動物或其后代，其中生理活性物質(zhì)為細(xì)胞因子和/或免疫球蛋白。
7.權(quán)利要求6的動物或其后代，其中免疫球蛋白是選自IgG、IgM、IgA、IgD、IgE的任意一種的免疫球蛋白。
8.權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2或3的動物或其后代，其中免疫缺陷哺乳動物為免疫缺陷小鼠。
9.人源免疫活性細(xì)胞和/或可生成來自該免疫活性細(xì)胞的生理活性物質(zhì)的動物或其后代的制備方法，其特征在于將來自人的造血前體細(xì)胞或成熟造血細(xì)胞移植到未成熟免疫缺陷哺乳動物(人除外)中。
10.權(quán)利要求9的方法，其中未成熟免疫缺陷哺乳動物為新生免疫缺陷哺乳動物或胎兒免疫缺陷哺乳動物。
11.權(quán)利要求9的方法，其中造血前體細(xì)胞為來自骨髓、來自臍血或來自末梢血的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求9的方法，其中免疫活性細(xì)胞為選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的至少一種。
13.權(quán)利要求9的方法，其中生理活性物質(zhì)為細(xì)胞因子和/或免疫球蛋白。
14.權(quán)利要求13的動物或其后代，其中免疫球蛋白為選自IgG、IgM、IgA、IgD、IgE的任意一種。
15.權(quán)利要求9的方法，其中免疫缺陷哺乳動物為免疫缺陷小鼠。
16.抗體的制備方法，其特征在于從權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2-8中任一項的動物或其后代中回收免疫活性細(xì)胞，在抗原或適當(dāng)?shù)拇碳の镔|(zhì)存在下培養(yǎng)該免疫活性細(xì)胞，由所得培養(yǎng)物收集人源抗體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中免疫活性細(xì)胞為選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞的至少一種。
18.抗體的制備方法，其特征在于用抗原或刺激物質(zhì)免疫權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2-8中任一項的動物或其后代，由所得免疫動物采集該人源抗體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中抗體的采集來源為血漿或血清。
20.疾病模型動物或其后代，該疾病模型動物或其后代是對權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2-8中任一項的動物或其后代施用選自細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞和腫瘤抗原肽的物質(zhì)而得到的。
21.權(quán)利要求20的動物或其后代，其中所述疾病是感染病。
22.免疫相關(guān)藥物的篩選方法。其特征在于將受試物質(zhì)施用于權(quán)利要求1的動物、或者2-8、20和21中任一項的動物或其后代，評價受試物質(zhì)的有效性。
23.權(quán)利要求22的方法，其中免疫相關(guān)藥物為疫苗。
24.免疫活性細(xì)胞的制備方法，其特征在于從權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2-8中任一項的動物或其后代中回收免疫活性細(xì)胞。
25.免疫活性細(xì)胞，該免疫活性細(xì)胞是由權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2-8中任一項的動物或其后代回收的。
26.疫苗，該疫苗含有權(quán)利要求25的免疫活性細(xì)胞。
27.免疫活性細(xì)胞的制備方法，其特征在于由權(quán)利要求20的動物或其后代回收免疫活性細(xì)胞。
28.免疫活性細(xì)胞，該免疫活性細(xì)胞是由權(quán)利要求20的動物或其后代回收的。
29.疫苗，該疫苗含有權(quán)利要求28的免疫活性細(xì)胞。
30.人源抗體，該人源抗體是由權(quán)利要求1的動物或者權(quán)利要求2-8中任一項的動物或其后代回收的。
31.人源抗體，該人源抗體由在抗原或刺激物質(zhì)的存在下培養(yǎng)權(quán)利要求25或28的免疫活性細(xì)胞得到的培養(yǎng)物采集。
32.人源抗體，該人源抗體由權(quán)利要求20的動物或其后代回收的。
33.疫苗，該疫苗含有權(quán)利要求32的人源抗體。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供可生成人源淋巴細(xì)胞的免疫缺陷動物、人源淋巴細(xì)胞以及人抗原特異性抗體生成的方法。上述目的的解決手段是移植有人源造血前體細(xì)胞的未成熟免疫缺陷哺乳動物、其可生成該人源造血細(xì)胞或免疫活性細(xì)胞；抗體的制備方法，其包括由上述動物回收免疫活性細(xì)胞，培養(yǎng)該免疫活性細(xì)胞，由所得培養(yǎng)物采集人源抗體。
文檔編號C07K14/47GK1835679SQ20048002339
公開日2006年9月20日 申請日期2004年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者石川文彥, 原田實根, 安川正貴 申請人:國立大學(xué)法人九州大學(xué)