專利名稱：編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、β－1,3－葡聚糖酶和奇甜蛋白樣蛋白 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼參與歐洲板栗對致病真菌肉桂疫霉(Phytophthtora cinnamomi)的抗性的核苷酸序列的分離和鑒定，所述肉桂疫霉導(dǎo)致栗的墨水病，(ink disease)還涉及通過用含有分離的基因之一的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物以改進(jìn)抗性的方法，以及用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物和種子。
背景技術(shù)：
歐洲板栗(Castanea sativa Mill.)是一種在僅次于木材和水果的重要的具有經(jīng)濟(jì)價值的木本物種。從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度，栗的培養(yǎng)提供了土壤保護(hù)和固定，特別是在山區(qū)和山坡地區(qū)。
在過去十年中，由于以下多種因素，歐洲板栗的分布地區(qū)顯著減少群體的老化和由真菌肉桂疫霉和栗黑水疫霉導(dǎo)致的疾病，即墨水病，以及更近年，由真菌Criphonectria parasitica導(dǎo)致的癌癥疾病。
在葡萄牙，歐洲板栗自從1886年起就由于墨水病而嚴(yán)重減少[Malato-Beliz(1987)，O castanheiro na economia e na paisagem，Edicao da Camara Municipal de Castelo de Vide]。Vieira Natividade在40年代啟動了獲得耐受克隆的選擇程序，并且在60年代由CarvalhoFernandes繼續(xù)[Fernandes，C.T.(1966)，A″doenga da tinta″doscastanheiros.Parasitas do Género Phytophthora de Bary，Dissertacaode Concurso para Investigador em Patologia Vegetal，Direccao Geraldos Services Florestais e Aquicolas，Centro de InvestigacoesFlorestais，Alcobaca]。在過去50年，在對墨水病的抗性基礎(chǔ)上選擇的大多數(shù)克隆已經(jīng)丟失，目前僅僅保留了很少的關(guān)于存活者遺傳身份的信息。
在Telhada J.A.B.M.(1990，A″tinta″do castanheiro-aspectosprincipais e perspectivas de luta.Vida Rural，5，36-39)之后，由胚根和幼根變暗和表皮變軟而證實(shí)了成體栗樹中的墨水病。根組織分解，導(dǎo)致樹枝的進(jìn)展性減少。在老根和樹皺褶部分觀察到暗點(diǎn)[Grente，J.(1961)，La maladie de L′Encre du Chataignier I-Etiologie et Biologie.Ann.Epiphyties，12，5-24]。
Telhada和Grente報道，在空中部分，葉變黃起始于樹枝的上部，從上到下發(fā)展。葉片可能輕微閉合成V型。變黃的葉子不發(fā)生秋季落葉。
肉桂疫霉受感染的結(jié)構(gòu)相當(dāng)于可能存在于根附近的游動孢子，特別是在發(fā)洪水的條件下。真菌可以通過細(xì)胞間途徑穿透到植物組織中，其中發(fā)芽管在兩個表皮垂周壁之間進(jìn)展，或通過細(xì)胞內(nèi)途徑，也可以通過發(fā)芽管模式[Dale，M.L.，Irwin，J.A.G.(1991)，Stomata asan infection court forPhytophthora megaspermaf sp.medicaginis inchickpea and a histological study of infection，Phytopathology，81，375-379]。在幼根和未木質(zhì)化的莖中，發(fā)生穿過表皮的真菌穿透[Wyhiteside，J.O.(1971)，Some factors affecting the occurrence anddevelopment of root rot on citrus trees，Phytopathology，61，1233-1238]。在木質(zhì)化的、栓化的、或根帽組織中，發(fā)芽管穿透作用僅僅是在受傷后達(dá)到的[Boccas，B.，Laville，E.(1978)，Les maladies a.Phytophthora des agrumes，SETCO-IRFA Ed.，Paris]。
根據(jù)在對墨水病的耐受克隆中的RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)分子表征研究[Seabra，RC.，Ribeiro，G.，Cotrim，H.，Pals，S.(1996)，F(xiàn)irst Approach for the Molecular Characterisation ofChestnut Clones，Silva Lusitana，4(2)，251-253；Seabra，R.M.L.C.(1998)，Transformacao Genetica de Castanea sativa Mill.eCaracterizaco Molecular do Genera Castanea，Dissertacao deDoutoramento，F(xiàn)aculdade de Ciencias da Universidade de Lisboa]，概括出了天然群體具有大的遺傳多樣性。這些結(jié)果指出了進(jìn)行墨水病抗性基因分離和表征研究的科學(xué)基礎(chǔ)。
在過去幾年中，開發(fā)了一些研究，以便鑒定負(fù)責(zé)植物對幾種疾病的抗性的基因(R基因)，證實(shí)了它們之間有很大的同源性程度。R基因鑒定和克隆可以導(dǎo)致通過遺傳轉(zhuǎn)化將它們轉(zhuǎn)移到選定的基因型。
已經(jīng)描述過編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)、β-1，3-葡聚糖酶和奇甜蛋白樣蛋白的基因在使一些植物防御微生物攻擊方面非常重要。
茉莉酮酸生物合成途徑中由AOC催化的步驟至少在煙草、馬鈴薯和擬南芥中的創(chuàng)傷疾病中非常重要。在過去十年中，茉莉酮酸被認(rèn)為是以脂為基礎(chǔ)的信號傳遞級聯(lián)中的決定性元件，在植物抗病原體的防御反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。以下文獻(xiàn)公開了在煙草中進(jìn)行的對AOC的參考研究Stenzel，I.，Hause，B.，Maucher，H.，Pitzschke，A.，Miersch，O.，Ziegler，J.，Ryan，C.A.e Wasternack，C.(2003)，Allene oxide cyclase dependence of the wound response and vascularbundle-specific generation of jasmonates in tomato-amplification inwound signalling，The Plant Journal，33，577-589。
半胱氨酸蛋白酶抑制劑干擾對蛋白組更新的調(diào)節(jié)，并且在對昆蟲和病原體的抗性中具有重要作用。它們也被稱作半胱氨酸蛋白酶抑制劑，因?yàn)樗鼈円种浦参锸芨腥緯r病原體釋放的蛋白酶，導(dǎo)致對宿主細(xì)胞的顯著損傷。在擬南芥葉中，由創(chuàng)傷、無毒病原體攻擊或一氧化氮顯著誘導(dǎo)了半胱氨酸蛋白酶抑制劑[Belenghi，B.，Perazzolli，M.，Delledonne，M.(2002)，ATCYS from Arabidopsis thaliana encodes acysteine-protease inhibitor that functions as a negative regulator ofhypersensitive cell death，Proceedings of the XLVI Italian Society ofAgricultural Genetics-SIGA Annual Congress，Giardini Naxos，Italy，18/21 September，Poster Abstract 5.13]。該酶的更多細(xì)節(jié)描述于Kondo，H.，Abe，K.，Nishimura，I.，Watanabe，H.，Emori，Y.eAral.S.(1990)，Two Distinct Cystatin Species in Rice Seeds withDifferent Specificities against Cystatin Proteinases，The Journal ofBiological Chemistry，Vol.265，No.26，15832-15837。
β-1，3-葡聚糖酶是參與一些生理和發(fā)育機(jī)制，包括微出芽、花粉發(fā)芽、種子授粉和發(fā)芽以及病原體防御的充足蛋白。植物β-1，3-葡聚糖酶根據(jù)一級結(jié)構(gòu)至少分為三類。第III類包括由病原體誘導(dǎo)的葡聚糖酶。許多β-1，3-葡聚糖酶的表達(dá)可以由真菌誘導(dǎo)物、創(chuàng)傷、唾液酸、乙烯和其它化學(xué)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)。β-1，3-葡聚糖酶基因也可以在TMV病毒接種的煙葉中的超敏反應(yīng)中表達(dá)。認(rèn)為β-1，3-葡聚糖酶直接作用于真菌，水解細(xì)胞壁的β-1，3-葡聚糖，或間接作用，水解病原體和宿主多糖以產(chǎn)生能夠產(chǎn)生起始反應(yīng)的引發(fā)物。β-1，3-葡聚糖酶是許多研究的目標(biāo)，其中包括Cheong，Y.H.，Kim，C.Y.，Chun，H.J.，Moon，B.C.，Park，H.C.，Kim，J.K.，Lee，S.-H.，Han，C.-D.，Lee，S.Y.，Cho，M.J.(2000)，Molecular cloning of a soybean class III/β-1.3-glucanase gene that is regulated both developmentally and inresponse to pathogen infection，Plant Science，154，71-81中的一個研究。
一些同工型的作用在一些非水溶性奇甜蛋白樣蛋白單位與β-1，3-葡聚糖結(jié)合后很可能參與靶病原體細(xì)胞的細(xì)胞膜透化。除其它參考文獻(xiàn)外，在以下文獻(xiàn)描述了奇甜蛋白樣蛋白Trudel，J.，Grenier，J.，Potvin，C.，Asselin，A.(1998)，Several Thaumatin-Like Proteins Bindto β-1，3-glucans，Plant Physiology，118，1431-1438；Darby，RM.，F(xiàn)irek，S.，Mur，L.A.J.，Draper，J.(2000)，A thaumatin-like genefrom Asparagus offcinalis(AoPRT-L)exhibits slow activation followingtissue maceration or salicylic acid treatment，suggesting convergentdefence-related signalling in monocots，Molecular Plant Pathology，1(6)，357-366。
發(fā)明概述在用致病真菌肉桂疫霉接種之后，從墨水病抗性歐洲板栗植物中分離了AOC、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、β-1，3-葡聚糖酶和奇甜蛋白樣蛋白編碼基因。這些基因在感染后和感染期間表達(dá)，并且在植物對病原體的抗性中具有重要作用。分離的基因調(diào)節(jié)所報道的酶的表達(dá)，并且在沉默時產(chǎn)生對墨水病具有高度易感性的植物。
所述基因可以以有義方向插入栗或殼斗科(水青岡屬，櫟屬…)的其它物種。因此，經(jīng)濟(jì)學(xué)上重要的歐洲板栗品種可以達(dá)到對真菌肉桂疫霉導(dǎo)致的墨水病的高度耐受。
發(fā)明詳述和本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明提供了新的從歐洲板栗分離的基因，所述基因在肉桂疫霉感染后表達(dá)。這些基因編碼病原體防御信號傳遞-AOC-、抵抗真菌酶蛋白水解-半胱氨酸蛋白酶抑制劑-、真菌細(xì)胞壁水解-β-1，3-葡聚糖酶-、和真菌細(xì)胞膜透化-奇甜蛋白樣蛋白。
如本發(fā)明所提供的，要求保護(hù)的核酸序列可以用于改進(jìn)任何器官中AOCCs、CystCs、GlucCs和TLPCs基因的內(nèi)源表達(dá)，增加對墨水病的耐受?？梢酝ㄟ^“有義上調(diào)”獲得超量表達(dá)。以有義方向插入的mRNA、RNA、cDNA和DNA分子的分子可以起這種作用。
從植物分離核酸序列可以采用本領(lǐng)域公知的不同方法從接種的植物葉中分離本發(fā)明的基因。具體地，可以使用此處描述的一種方法。它依賴于從數(shù)據(jù)庫公開的分離自相同物種的感興趣基因的保守部分設(shè)計的特異性引物。對于半胱氨酸蛋白酶抑制劑和奇甜蛋白樣蛋白基因是如此。在該方法中，用數(shù)據(jù)庫中公開的分離自其它物種的相同基因的序列，由序列比對的保守部分設(shè)計簡并引物。對于AOC和β-1，3-葡聚糖酶是如此。
用于根據(jù)本發(fā)明分離編碼蛋白的RNA或cDNA、將其進(jìn)行cDNA片段的分離、將片段與克隆載體連接并轉(zhuǎn)化宿主的程序是本領(lǐng)域公知的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用Sambrook et.al.(1989)，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd Editon，Cold Spring Harbor，New York或重組DNA技術(shù)的其它手冊中描述的所述程序或?qū)ζ溥M(jìn)行改進(jìn)。本發(fā)明的基因的片段也是本發(fā)明所考慮的。
設(shè)計的特異性引物可以由其它引物替代，其目的是分離此處要求保護(hù)的序列的稍有不同的cDNA片段，促進(jìn)對序列的了解。設(shè)計的簡并引物可以用于獲得栗屬物種中相同基因的異構(gòu)酶或通過PCR和其它體外擴(kuò)增方法從其它物種分離同源基因。對于PCR的概括性綜述，參見PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Innis，M.，Gelfand，D.，Sninsky，J.e White，T.eds.)，Academic Press，San Diego(1990)。
也可以通過技術(shù)文獻(xiàn)中描述的公知技術(shù)合成多核苷酸。然后可以通過合成互補(bǔ)鏈和將鏈在合適的條件下一起退火，或通過用DNA聚合酶和合適的引物序列加入互補(bǔ)鏈而獲得雙鏈DNA片段。
一旦從物種分離了本發(fā)明的編碼基因，它可以用作雜交探針，通過在低或中等嚴(yán)格條件下的交叉雜交從其它物種分離相應(yīng)的基因。作為異源探針，分離的基因可以用于從任何物種篩選cDNA文庫或基因組文庫。作為同源探針，分離的核酸序列可以用于篩選從栗屬的任何物種構(gòu)建的文庫。
本發(fā)明的核酸在抑制基因表達(dá)中的用途根據(jù)本發(fā)明，DNA分子也可以與能夠調(diào)節(jié)所述DNA分子表達(dá)的啟動子可操作性連接，以形成嵌合基因。可以將嵌合基因?qū)肟蓮?fù)制的表達(dá)載體，用于轉(zhuǎn)化植物。也可以通過重組DNA技術(shù)中的公知方法，用可復(fù)制的表達(dá)載體獲得由本發(fā)明的基因編碼的多肽。
可復(fù)制的表達(dá)載體通常包含啟動子(至少)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)片段、終止信號、或在合適的讀框中可操作性連接的這些元件中的兩個或多個。所述載體優(yōu)選也編碼選擇標(biāo)記，例如抗生素抗性?？蓮?fù)制表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體和病毒。
可以用分離的序列制備用于許多技術(shù)中的表達(dá)盒。例如，這些表達(dá)盒可以用于增強(qiáng)內(nèi)源AOCCs、CystCs、GlucCs和TLPCs基因的表達(dá)。例如，超量表達(dá)可以用于改進(jìn)易感的歐洲板栗品種中的墨水病抗性，產(chǎn)生防御反應(yīng)的信號(AOCCs基因)、起始對病原真菌的損傷(GlucCs和TLPCs基因)或?qū)Σ≡w產(chǎn)生威脅作用(Cyst基因)。
為了用有義技術(shù)增加植物中的基因表達(dá)，可以將編碼核酸序列或可讀框與啟動子(例如，CaMV35S啟動子或根特異性啟動子)操作連接，以便RNA的有義鏈將作為轉(zhuǎn)錄物。這種表達(dá)盒可以用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，其中有義RNA鏈將作為轉(zhuǎn)錄物。加入內(nèi)源生產(chǎn)的編碼感興趣的酶的mRNA的更高度積累，將暗示與易感品種中的墨水病防御相關(guān)的酶的合成更多。另一方面，CaMV35S在多種植物類型中高度有活性，能夠提供感興趣基因的組成型表達(dá)，從而改進(jìn)抗肉桂疫霉的保護(hù)作用。
本發(fā)明的核酸在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物中的用途可以將本發(fā)明中分離的核酸序列摻入表達(dá)載體，從而導(dǎo)入宿主細(xì)胞。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用該序列制備重組細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括，但不限于，細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲、植物等。宿主細(xì)胞優(yōu)選是細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
可以將本發(fā)明中要求保護(hù)的核苷酸序列插入表達(dá)載體，所述載體可以通過多種常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入所需植物宿主的基因組。采用分離的基因的構(gòu)建體可以導(dǎo)入常規(guī)的根癌土壤桿菌宿主載體中。當(dāng)細(xì)菌感染細(xì)胞時，土壤桿菌宿主的毒力功能將指導(dǎo)構(gòu)建體和鄰近的標(biāo)記插入植物細(xì)胞DNA。
或者，可以采用諸如電穿孔和微量注射到植物細(xì)胞原生質(zhì)體的技術(shù)直接將DNA構(gòu)建體直接導(dǎo)入植物細(xì)胞基因組DNA。彈道方法，如DNA粒子轟擊，使得DNA能夠直接導(dǎo)入植物組織。
可以培養(yǎng)來源于上述任一轉(zhuǎn)化技術(shù)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生完整的植物，所述植物具有轉(zhuǎn)化的基因型，因此具有需要的表型，如增加的果實(shí)堅(jiān)硬度。所述再生技術(shù)依賴于培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物和植物激素的操作，所述培養(yǎng)基含有抗生素、除草劑或與感興趣的核苷酸序列一起導(dǎo)入的其它標(biāo)記。也可以從不同的植物外植體或胚獲得再生。對于概括性的綜述，參見Plant Cell，Tissue and Organ Culture，F(xiàn)undamental Methods(O.L.Gamborg e G.C.Philips eds.)，Springer-Verlag，1995。適于轉(zhuǎn)化的植物組織包括，但不限于花芽、葉組織、根組織、分生組織、合子胚和體細(xì)胞胚、花藥、微孢子和巨孢子。
盡管栗不容易進(jìn)行外植體再生，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了通過土壤桿菌基因組轉(zhuǎn)化將基因?qū)霘W洲板栗基因組DNA[Seabra，R.M.L.C.(1998)，Transformacao Genetica de Castanea sativa Mill.E CaracterizacaoMolecular do Genero Castanea，Dissertacao de Doutora mento，F(xiàn)aculdade de Ciencias da Universidade de Lisboa]。還沒有檢驗(yàn)作為栗轉(zhuǎn)化的替代的具有很大潛力的其它系統(tǒng)，如體細(xì)胞胚粒子轟擊[Seabra，R.C.，Pais，M.S.(2003)Genetic Transformation ofChestnut，em Plant Genetic Engineering，Vol.3，Singh，R.P.，Jaiwal，P.K.eds.，SCI Tech Publishing LLC，USA]。Neto，H.(1995)，Estudodas Condicoes de Cultura in vitro e de Transferencia de Genes emQuercus suber L.，Disseretacao de Mestrado，F(xiàn)aculdade de Ciencias daUniversidade de Lisboa已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了通過粒子轟擊對歐洲栓皮櫟體細(xì)胞胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。用于遺傳轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞胚是有益的，因?yàn)榕呤菑?fù)制母體植物的特征的遺傳學(xué)上不同的器官。通過體細(xì)胞胚發(fā)生而再生，避開了通過器官發(fā)生(具有多細(xì)胞來源)而再生的許多缺點(diǎn)[Dunstan，D.I.，Thorpe，T.A.(1986).Regeneration in Forest Trees.Cell Cultureand Somatic Cell Genetics of Plant，Vol.3]。
可以在用含有分離的cDNA序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中實(shí)現(xiàn)病原體攻擊控制。得到的具有本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)化的植物可以具有AOCCs、CystCs、GlucCs或TLPCs基因的超量表達(dá)。這些植物可以具有增強(qiáng)的抗病原體真菌攻擊的抗性，防止、延緩或減少創(chuàng)傷/損壞擴(kuò)展。
本發(fā)明的DNA分子可以用于轉(zhuǎn)化任何植物，所述植物中，需要由所述DNA分子編碼的特定蛋白的表達(dá)。本發(fā)明的DNA分子可以在廣泛的植物中使用，但對栗屬和櫟屬特別有用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識到，可以用酶活性測定、免疫測定、蛋白印跡和其它檢測測定在蛋白水平檢測分離的序列所編碼的蛋白的存在或不存在。在DNA水平，可以進(jìn)行DNA印跡、RNA印跡和PCR分析以確定所需基因在植物DNA中的有效整合，以及由于導(dǎo)入的序列導(dǎo)致的有效基因(內(nèi)源和外源)表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在表達(dá)盒穩(wěn)定摻入轉(zhuǎn)基因植物并且證明是可操作的之后，可以通過有性雜交將其導(dǎo)入其它植物。取決于待雜交的物種，可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)?？梢垣@得轉(zhuǎn)基因種子和無性繁殖體(如切割)，并且通過培養(yǎng)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
此處描述的實(shí)施方案和以下實(shí)施例是為了更好說明本發(fā)明的實(shí)施而提供的，不應(yīng)該用于限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于為此目的選擇的特定材料、材料和程序的組合。這些詳細(xì)內(nèi)容可以有許多變化，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解所述變化。
實(shí)施例實(shí)施例1擴(kuò)增來自于歐洲板栗的丙二烯氧化物環(huán)化酶(aoccs)基因在液氮中冷凍處于肉桂疫霉的有毒品種感染的不同感染期的歐洲板栗Cv Vimeiro(抗墨水病品種)葉，在臼中研磨成細(xì)粉末，并且在-80℃儲存。將大約3g粉末與20ML RNA提取緩沖液混合，用于根據(jù)熱硼酸鹽方法(Wan and Wilkins，1994，Anal.Biochem.，2237-12)提取RNA。根據(jù)制造商的說明，用聚腺苷酸示蹤系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行信使RNA(mRNA)分離。將RNA和mRNA沉淀物在-80℃儲存在DEPC處理的水中。在TE緩沖液中進(jìn)行比色定量。在80v下在0.8％的瓊脂糖凝膠上對RNA和mRNA電泳1.5小時，以檢查其完整性。
為進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)，將50mM Tris-HCl pH 8.5、8mMMgCl2、30mM KCl和1mM DTT的反應(yīng)混合物中的1μg mRNA和1U禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶在55℃下溫育90分鐘，所述混合物含有1.0mM每一種dNTP、12.5μg放線菌素D和10μM寡(dT)17(用5′/3′RACE試劑盒，Roche提供)。用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種簡并引物AOCfwd和AOCrev(表1)的20mM Tris-HCl pH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在45℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)。隨后采用72℃下10分鐘的最終延伸步驟以確保產(chǎn)物的全長擴(kuò)增。所采用的熱循環(huán)儀是Perkin Elmer-Gene Amp PCR System 2400。
將獲得的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，并且連接到載體pBluescript(KS+)(Stratagene)中。將連接的混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在含有氨芐青霉素(100pL/mL)X-Gal(80μg/mL)和IPTG(0.5mM)的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。用堿裂解方法分離質(zhì)粒DNA。
采用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems)，在自動化測序儀ABI 310 Applied Biosystems上進(jìn)行DNA測序。
通過PCR獲得的帶為大約450Pb。將核苷酸序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與從其它物種分離的丙二烯氧化物環(huán)化酶基因有顯著的同源性。由于獲得的序列相當(dāng)于大約60％的基因編碼區(qū)，進(jìn)行了RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)。
為了進(jìn)行5′RACE反應(yīng)，用4μg mRNA進(jìn)行Marathon試劑盒(Clontech)cDNA合成反應(yīng)。連接反應(yīng)允許使用AP1(連接引物，由Maratho試劑盒，Clontech提供)。用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol引物AP1和AOCrev的20mM Tris-HCl pH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增Marathon cDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為94℃下30秒，60℃下45秒和72℃下45秒，進(jìn)行35個循環(huán)，以及72℃下最終延伸10分鐘。按照上文所述對783pb PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。
為進(jìn)行3′RACE反應(yīng)，用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol引物AOCfwd和AP的20mM Tris-HCl pH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增MarathoncDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為94℃下30秒，60℃下45秒和72℃下45秒，進(jìn)行35個循環(huán)，以及72℃下最終延伸10分鐘。按照上文所述對873pb PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。
將AOC核苷酸序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與從其它物種分離的AOC基因有顯著的同源性。用BLASTn程序在DNA水平發(fā)現(xiàn)的最高同源性是與番茄mRNA clone# AJ272026的99.8％的同源性。
實(shí)施例2擴(kuò)增來自于歐洲板栗的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cvstcs)基因完全按照實(shí)施例1中對aoccs分離的描述進(jìn)行歐洲板栗葉提取、RNA提取、mRNA分離和RT反應(yīng)。
用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種特異性引物Cysfwd和Cysrev(表1)的20mM Tris-HCl pH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在55℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)。隨后采用72℃下10分鐘的最終延伸步驟以確保產(chǎn)物的全長擴(kuò)增。所采用的熱循環(huán)儀是Perkin Elmer-GeneAmp PCR System 2400。
將獲得的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，并且連接到載體pBluescript(KS+)(Stratagene)中。將連接的混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在含有氨芐青霉素(100pL/mL)X-Gal(80μg/mL)和IPTG(0.5mM)的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。用堿裂解方法分離質(zhì)粒DNA。
采用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems)，在自動化測序儀ABI 310 Applied Biosystems上進(jìn)行DNA測序。
通過PCR獲得的帶為大約450Pb。將核苷酸序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與從栗(#AJ224331)分離的半胱氨酸蛋白酶抑制劑mRNA具有幾乎100％同源性并且含有編碼區(qū)。在所有可獲得的蛋白和DNA庫中進(jìn)行的檢索不能找到與任何存在的克隆有100％同源性。
實(shí)施例3擴(kuò)增來自于歐洲板栗的β-1，3-葡聚糖酶(gluccs)基因完全按照實(shí)施例1中對aoccs分離的描述進(jìn)行歐洲板栗葉提取、RNA提取、mRNA分離和RT反應(yīng)。
用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種簡并引物Glucfwd和Glucrev(表1)的20mM Tris-HCl pH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在45℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)。隨后采用72℃下10分鐘的最終延伸步驟以確保產(chǎn)物的全長擴(kuò)增。所采用的熱循環(huán)儀是Perkin Elmer-GeneAmp PCR System 2400。
將獲得的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，并且連接到載體pBluescript(KS+)(Stratagene)中。將連接的混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在含有氨芐青霉素(100pL/mL)X-Gal(80μg/mL)和IPTG(0.5mM)的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。用堿裂解方法分離質(zhì)粒DNA。
采用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems)，在自動化測序儀ABI 310 Applied Biosystems上進(jìn)行DNA測序。
通過PCR獲得的帶為大約496Pb。將核苷酸序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與從其它物種分離的β-1，3-葡聚糖酶基因具有顯著同源性。由于獲得的序列相當(dāng)于大約48％的基因編碼區(qū)，并且為了分離完整的ORF，設(shè)計了新的特異性引物Glu5′rev和Glu3′fwd(表1)，以分別進(jìn)行5′RACE(cDNA末端的迅速擴(kuò)增)和3′RACE反應(yīng)。
為了進(jìn)行5′RACE反應(yīng)，用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種引物Glu5’rev和AP1的20mM Tris-HCl pH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增Marathon cDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在55℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)，以及72℃下最終延伸10分鐘。按照上文所述對大約600pb PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。
為進(jìn)行3′RACE反應(yīng)，用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種引物Glu3’fwd和Vial9(由5’/3′RACE試劑盒，Roche提供)的20mM Tris-HCl pH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的TaqDNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增如實(shí)施例1所述進(jìn)行的RT得到的cDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在55℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)，以及72℃下最終延伸10分鐘。按照上文所述對大約300pb PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。
通過PCR擴(kuò)增融合到一起，613pb、496pb和300pb序列代表歐洲板栗β-1，3-葡聚糖酶的完整編碼區(qū)。所有三種分離的β-1，3-葡聚糖酶片段一起包含大小為1374pb的cDNA分子，并且包括100％的編碼區(qū)。將完整的核苷酸序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與從其它物種分離的β-1，3-葡聚糖酶基因具有顯著同源性。用BLASTn程序在mRNA水平發(fā)現(xiàn)的最高同源性是與葡萄mRNA克隆#AF239617的81％同源性。在所有可獲得的蛋白和DNA庫中進(jìn)行的檢索不能找到與任何存在的克隆有100％同源性。
實(shí)施例4擴(kuò)增來自于歐洲板栗的奇甜蛋白樣蛋白(tlpcs)基因完全按照實(shí)施例1中對aoccs分離的描述進(jìn)行歐洲板栗葉提取、RNA提取、mRNA分離和RT反應(yīng)。
用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種特異性引物Thaufwd和Thaurev(表1)的20mM Tris-HCl pH8.4和50mMKCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA。在94℃下起始變性5分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在55℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)。隨后采用72℃下10分鐘的最終延伸步驟以確保產(chǎn)物的全長擴(kuò)增。所采用的熱循環(huán)儀是Perkin Elmer-Gene Amp PCR System 2400。
將獲得的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，并且連接到載體pBluescript(KS+)(Stratagene)中。將連接的混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在含有氨芐青霉素(100pL/mL)X-Gal(80μg/mL)和IPTG(0.5mM)的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。用堿裂解方法分離質(zhì)粒DNA。
采用Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems)，在自動化測序儀ABI 310 Applied Biosystems上進(jìn)行DNA測序。
通過PCR獲得的帶為大約550Pb。將核苷酸序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與奇甜蛋白樣蛋白基因有顯著同源性，與從栗(#AJ242828)分離的奇甜蛋白樣蛋白mRNA具有幾乎100％的同源性，并且含有77.1％的編碼區(qū)。為了分離完整的ORF，設(shè)計了新的特異性引物Thau5′fwd和Thau3′rev(表1)，以分別進(jìn)行5′RACE和3′RACE反應(yīng)。
為了進(jìn)行5′RACE反應(yīng)，用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種引物Thau5′fwd和Thaurev的20mM Tris-HClpH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶Advantage 2(Clontech)擴(kuò)增Marathon cDNA。在94℃下起始變性2分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在55℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)，以及72℃下最終延伸10分鐘。按照上文所述對大約750pb產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。
為了進(jìn)行3′RACE反應(yīng)，用含有2.0mM MgCl2、0.25mM每種dNTP和10pmol每種引物Thaufwd和Thau3’rev的20mM Tris-HClpH8.4和50mM KCl混合物中的2.0U的Taq DNA聚合酶Advantage 2(Clontech)擴(kuò)增Marathon cDNA。在94℃下起始變性2分鐘后，PCR參數(shù)為在94℃下進(jìn)行30秒的模板變性，在55℃下進(jìn)行45秒的引物退火，并且在72℃下進(jìn)行2分鐘的引物延伸，共35個循環(huán)，以及72℃下最終延伸10分鐘。按照上文所述對大約600pb產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。
通過連接融合到一起，750pb和600pb序列代表歐洲板栗奇甜蛋白樣蛋白的完整編碼區(qū)。兩種分離的奇甜蛋白樣片段一起包含大小為806pb的cDNA分子，并且包含100％的編碼區(qū)。將完整的核苷酸序列發(fā)送到NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與從其它物種分離的奇甜蛋白樣蛋白具有顯著同源性，并且與從栗(#AJ242828)分離的奇甜蛋白樣蛋白mRNA具有幾乎100％的同源性，并且包含編碼區(qū)。在所有可獲得的蛋白和DNA庫中進(jìn)行的檢索不能找到與任何存在的克隆有100％同源性。
在每個實(shí)施例中用前面通過PCR獲得的核酸序列作為模板，設(shè)計5′和3′RACE的特異性引物。表1表示用于基因分離的所有設(shè)計的引物。
表1.為本發(fā)明設(shè)計的引物序列
序列表<110>CASTANIA Sociedade Agroflorestal SA<120>編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、β-1，3-葡聚糖酶和奇甜蛋白樣蛋白的歐洲板栗基因及其用途<130>1<140>
<141>2004-06-07<150>PT 102979-S<151>2003-06-26<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>735<212>DNA<213>歐洲板栗(Castanea sativa)<400>1atg gcc act gtt tcc tca gcc tct gct gct ctt aga acc att tct tct 48Met Ala Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Leu Arg Thr Ile Ser Ser1 5 10 15tcc tca tcc aag cta tct tct gcc ttc caa act aaa aag atc caa tct 96Ser Ser Ser Lys Leu Ser Ser Ala Phe Gln Thr Lys Lys Ile Gln Ser20 25 30ttt aaa cta cct aac cct ctc att tct cag aat cat aaa ctt act acc144Phe Lys Leu Pro Asn Pro Leu Ile Ser Gln Asn His Lys Leu Thr Thr35 40 45acc tct act act gct tcc aga tca ttt tcc tgc aag agc cag agc acc192Thr Ser Thr Thr Ala Ser Arg Ser Phe Ser Cys Lys Ser Gln Ser Thr50 55 60tca aca gat tca act aac act gaa gtt caa gaa ctt agt gtc tat gag240Ser Thr Asp Ser Thr Asn Thr Glu Val Gln Glu Leu Ser Val Tyr Glu65 70 75 80
atc aat gaa cgt gat cgt gga agc cct gct tat ctt cga ttg agc caa288Ile Asn Glu Arg Asp Arg Gly Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Leu Ser Gln85 90 95aag act gtt aat tca ctc gga gat ctt gtc ccc ttt agc aac aag cta336Lys Thr Val Asn Ser Leu Gly Asp Leu Val Pro Phe Ser Asn Lys Leu100 105 110tat act gca gat cta aag aag aga att gga ata aca gca gga ctc tgc384Tyr Thr Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ile Gly Ile Thr Ala Gly Leu Cys115 120 125att ctg atc aag cac gaa gaa gag aag aaa gga gat cgc tat gaa gct432Ile Leu Ile Lys His Glu Glu Glu Lys Lys Gly Asp Arg Tyr Glu Ala130 135 140gtt tac agc ttc tac ttc ggc gat tac ggt cat atc gcc gtt cag gga480Val Tyr Ser Phe Tyr Phe Gly Asp Tyr Gly His Ile Ala Val Gln Gly145 150 155 160gcg tac tta acc tat gaa gaa act tac cta gcc gtc acc ggt gga tcc528Ala Tyr Leu Thr Tyr Glu Glu Thr Tyr Leu Ala Val Thr Gly Gly Ser165 170 175ggc ata ttt gca ggg gtt tcc ggt caa gtg aaa ttg cag caa ctc att576Gly Ile Phe Ala Gly Val Ser Gly Gln Val Lys Leu Gln Gln Leu Ile180 185 190ttc cct ttc aag cta ttt tac act ttt tac ttg aag ggg atc ccc ggt624Phe Pro Phe Lys Leu Phe Tyr Thr Phe Tyr Leu Lys Gly Ile Pro Gly195 200 205ctg cca tct gaa ttg ttg tgt acg gcg gtt cct ccg tcg ccg acg gtg672Leu Pro Ser Glu Leu Leu Cys Thr Ala Val Pro Pro Ser Pro Thr Val210 215 220gag cca aca cct gaa gct aaa gct tgt gag gaa ggg gcc gca ctg aaa720Glu Pro Thr Pro Glu Ala Lys Ala Cys Glu Glu Gly Ala Ala Leu Lys225 230 235 240aat tac act aat taa735Asn Tyr Thr Asn<210>2<211>244<212>PRT
<213>歐洲板栗<400>2Met Ala Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Leu Arg Thr Ile Ser Ser1 5 10 15Ser Ser Ser Lys Leu Ser Ser Ala Phe Gln Thr Lys Lys Ile Gln Ser20 25 30Phe Lys Leu Pro Asn Pro Leu Ile Ser Gln Asn His Lys Leu Thr Thr35 40 45Thr Ser Thr Thr Ala Ser Arg Ser Phe Ser Cys Lys Ser Gln Ser Thr50 55 60Ser Thr Asp Ser Thr Asn Thr Glu Val Gln Glu Leu Ser Val Tyr Glu65 70 75 80Ile Asn Glu Arg Asp Arg Gly Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Leu Ser Gln85 90 95Lys Thr Val Asn Ser Leu Gly Asp Leu Val Pro Phe Ser Asn Lys Leu100 105 110Tyr Thr Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ile Gly Ile Thr Ala Gly Leu Cys115 120 125Ile Leu Ile Lys His Glu Glu Glu Lys Lys Gly Asp Arg Tyr Glu Ala130 135 140Val Tyr Ser Phe Tyr Phe Gly Asp Tyr Gly His Ile Ala Val Gln Gly145 150 155 160Ala Tyr Leu Thr Tyr Glu Glu Thr Tyr Leu Ala Val Thr Gly Gly Ser165 170 175
Gly Ile Phe Ala Gly Val Ser Gly Gln Val Lys Leu Gln Gln Leu Ile180 185 190Phe Pro Phe Lys Leu Phe Tyr Thr Phe Tyr Leu Lys Gly Ile Pro Gly195 200 205Leu Pro Ser Glu Leu Leu Cys Thr Ala Val Pro Pro Ser Pro Thr Val210 215 220Glu Pro Thr Pro Glu Ala Lys Ala Cys Glu Glu Gly Ala Ala Leu Lys225 230 235 240Asn Tyr Thr Asn<210>3<211>318<212>DNA<213>歐洲板栗<400>3atg aga aaa ttg gca gca cta gtt gga gga gtg tca gat gtt aag gga48Met Arg Lys Leu Ala Ala Leu Val Gly Gly Val Ser Asp Val Lys Gly1 5 10 15cat gag aac agc ttg cag atc gac gac ctc gct cgt ttt gct gtc gac96His Glu Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Leu Ala Arg Phe Ala Val Asp20 25 30gac cac aac aag aaa gcg aat aca ctg ctg cag ttt aag aag gtg gtg144Asp His Asn Lys Lys Ala Asn Thr Leu Leu Gln Phe Lys Lys Val Val35 40 45aat gcg aaa cag cag gtg gtt tct gga aca ata tac att eta acg ttg192Asn Ala Lys Gln Gln Val Val Ser Gly Thr Ile Tyr Ile Leu Thr Leu50 55 60gag gtg gag gat ggc ggg aag aag aaa gtt tat gaa gcc aag att tgg240Glu Val Glu Asp Gly Gly Lys Lys Lys Val Tyr Glu Ala Lys Ile Trp65 70 75 80gag aag cca tgg ttg aac ttc aag gag gtg cag gaa ttt aag ctc att288
Glu Lys Pro Trp Leu Asn Phe Lys Glu Val Gln Glu Phe Lys Leu Ile85 90 95ggt gat gcc cct aca cac cat agt gct taa318Gly Asp Ala Pro Thr His His Ser Ala100 105<210>4<211>105<212>PRT<213>歐洲板栗<400>4Met Arg Lys Leu Ala Ala Leu Val Gly Gly Val Ser Asp Val Lys Gly1 5 10 15His Glu Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Leu Ala Arg Phe Ala Val Asp20 25 30Asp His Asn Lys Lys Ala Asn Thr Leu Leu Gln Phe Lys Lys Val Val35 40 45Asn Ala Lys Gln Gln Val Val Ser Gly Thr Ile Tyr Ile Leu Thr Leu50 55 60Glu Val Glu Asp Gly Gly Lys Lys Lys Val Tyr Glu Ala Lys Ile Trp65 70 75 80Glu Lys Pro Trp Leu Asn Phe Lys Glu Val Gln Glu Phe Lys Leu Ile85 90 95Gly Asp Ala Pro Thr His His Ser Ala100 105<210>5<211>927<212>DNA<213>歐洲板栗
<400>5atg aga atc tat gat ccg aat cag gct gtt cta caa gcc ctt aga ggc48Met Arg Ile Tyr Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Gln Ala Leu Arg Gly1 5 10 15tct aac att gaa gtc atg cta ggt gtc cca aac tca gac ctt caa agc96Ser Asn Ile Glu Val Met Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Ser20 25 30ctt gcc aac cct tcc aat gca caa gca tgg gta caa aga aac gta ctt144Leu Ala Asn Pro Ser Asn Ala Gln Ala Trp Val Gln Arg Asn Val Leu35 40 45aac ttc tgg cct agt gtc agg ttt cga tac att gca gtt gga aat gaa192Asn Phe Trp Pro Ser Val Arg Phe Arg Tyr Ile Ala Val Gly Asn Glu50 55 60gtg agt cct gtt aat gga ggc aca get ggg tta gca caa att gtt ctc240Val Ser Pro Val Asn Gly Gly Thr Ala Gly Leu Ala Gln Ile Val Leu65 70 75 80cct gcc tta acc aac gta ttc aat gca att aga tca gct ggc ctt aag288Pro Ala Leu Thr Asn Val Phe Asn Ala Ile Arg Ser Ala Gly Leu Lys85 90 95gac caa atc cag gtt tca att gca att gac atg acc tta ata gga aac336Asp Gln Ile Gln Val Ser Ile Ala Ile Asp Met Thr Leu Ile Gly Asn100 105 110tcc tat cct ccg tca gca ggg gct ttc aga ggt gat gtt aga tca tat384Ser Tyr Pro Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Gly Asp Val Arg Ser Tyr115 120 125tta gac cca atc att ggt cac cta gta tat gct aag gca ccc tta cta432Leu Asp Pro Ile Ile Gly His Leu Val Tyr Ala Lys Ala Pro Leu Leu130 135 140gcc aat gtg tac act tat ttt agc tat gct gga aat cca cgc gac att480Ala Asn Val Tyr Thr Tyr Phe Ser Tyr Ala Gly Asn Pro Arg Asp Ile145 150 155 160tct ctt ccc tat gct ttg ttt act tcc cca tca gtt gtg gca tgg gat528Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ser Pro Ser Val Val Ala Trp Asp165 170 175ggt cct aag gga tac caa aac ctt ttt gat gca atg atg gat gca ttg576Gly Pro Lys Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Met Asp Ala Leu
180 185 190tac tca gct ctc gag agg tcg tgg ggc ggt tca ttg gag gtt gtt gtt624Tyr Ser Ala Leu Glu Arg Ser Trp Gly Gly Ser Leu Glu Val Val Mal195 200 205tca gag agt gga tgg cca tca gca gca ggt gga ttc gct aca tca ttt672Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Ala Ala Gly Gly Phe Ala Thr Ser Phe210 215 220gat aat gca cgt act tat tac tca aat ttg att aag cat gtc aaa ggg720Asp Asn Ala Arg Thr Tyr Tyr Ser Asn Leu Ile Lys His Val Lys Gly225 230 235 240ggt aca cca aag agg cct ggg gga gct ata gag acc tat ctt ttt gcc768Gly Thr Pro Lys Arg Pro Gly Gly Ala Ile Glu Thr Tyr Leu Phe Ala245 250 255atg ttt aat gag aat cag aaa caa cca gag cta gag aaa aac ttt ggc816Met Phe Asn Glu Asn Gln Lys Gln Pro Glu Leu Glu Lys Asn Phe Gly260 265 270tta ttc ttc cca aat aaa cag ccc aaa ttt aac ctc aat ttt ggt gga864Leu Phe Phe Pro Asn Lys Gln Pro Lys Phe Asn Leu Asn Phe Gly Gly275 280 285gaa aga atc tgg gat gtc act gct gaa tat aat gca aca gtt tcc ctc912Glu Arg Ile Trp Asp Val Thr Ala Glu Tyr Asn Ala Thr Val Ser Leu290 295 300agt agt gat atg taa927Ser Ser Asp Met305<210>6<211>308<212>PRT<213>歐洲板栗<400>6Met Arg Ile Tyr Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Gln Ala Leu Arg Gly1 5 10 15Ser Asn Ile Glu Val Met Leu Gly Val Pro Asn Ser Asp Leu Gln Ser20 25 30
Leu Ala Asn Pro Ser Asn Ala Gln Ala Trp Val Gln Arg Asn Val Leu35 40 45Asn Phe Trp Pro Ser Val Arg Phe Arg Tyr Ile Ala Val Gly Asn Glu50 55 60Val Ser Pro Val Asn Gly Gly Thr Ala Gly Leu Ala Gln Ile Val Leu65 70 75 80Pro Ala Leu Thr Asn Val Phe Asn Ala Ile Arg Ser Ala Gly Leu Lys85 90 95Asp Gln Ile Gln Val Ser Ile Ala Ile Asp Met Thr Leu Ile Gly Asn100 105 110Ser Tyr Pro Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Gly Asp Val Arg Ser Tyr115 120 125Leu Asp Pro Ile Ile Gly His Leu Val Tyr Ala Lys Ala Pro Leu Leu130 135 140Ala Asn Val Tyr Thr Tyr Phe Ser Tyr Ala Gly Asn Pro Arg Asp Ile145 150 155 160Ser Leu Pro Tyr Ala Leu Phe Thr Ser Pro Ser Val Val Ala Trp Asp165 170 175Gly Pro Lys Gly Tyr Gln Asn Leu Phe Asp Ala Met Met Asp Ala Leu180 185 190Tyr Ser Ala Leu Glu Arg Ser Trp Gly Gly Ser Leu Glu Val Val Val195 200 205Ser Glu Ser Gly Trp Pro Ser Ala Ala Gly Gly Phe Ala Thr Ser Phe210 215 220
Asp Asn Ala Arg Thr Tyr Tyr Ser Asn Leu Ile Lys His Val Lys Gly225 230 235 240Gly Thr Pro Lys Arg Pro Gly Gly Ala Ile Glu Thr Tyr Leu Phe Ala245 250 255Met Phe Asn Glu Asn Gln Lys Gln Pro Glu Leu Glu Lys Asn Phe Gly260 265 270Leu Phe Phe Pro Asn Lys Gln Pro Lys Phe Asn Leu Asn Phe Gly Gly275 280 285Glu Arg Ile Trp Asp Val Thr Ala Glu Tyr Asn Ala Thr Val Ser Leu290 295 300Ser Ser Asp Met305<210>7<211>732<212>DNA<213>歐洲板栗<400>7atg aaa acc ctg gca ctc tac ggc ctt acc ttg gcc ttc ttt ttc tta 48Met Lys Thr Leu Ala Leu Tyr Gly Leu Thr Leu Ala Phe Phe Phe Leu1 5 10 15tct ggt gca cac tct gct aaa ata act ttc aca aac aac tgt cca aga 96Ser Gly Ala His Ser Ala Lys Ile Thr Phe Thr Asn Asn Cys Pro Arg20 25 30acc atc tgg cca gga acc cta act tcg gat caa aaa cct caa ctt tca144Thr Ile Trp Pro Gly Thr Leu Thr Ser Asp Gln Lys Pro Gln Leu Ser35 40 45aaa act gga ttt gag tta gca tcc aaa gca tcc tta aca ttg gaa tgt192Lys Thr Gly Phe Glu Leu Ala Ser Lys Ala Ser Leu Thr Leu Glu Cys50 55 60
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<210>8<211>226<212>PRT<213>歐洲板栗<400>8Met Lys Thr Leu Ala Leu Tyr Gly Leu Thr Leu Ala Phe Phe Phe Leu1 5 10 15Ser Gly Ala His Ser Ala Lys Ile Thr Phe Thr Asn Asn Cys Pro Arg20 25 30Thr Ile Trp Pro Gly Thr Leu Thr Ser Asp Gln Lys Pro Gln Leu Ser35 40 45Lys Thr Gly Phe Glu Leu Ala Ser Lys Ala Ser Leu Thr Leu Glu Cys50 55 60Ser Ser Ser Met Glu Arg Pro Val Leu Gly Pro Asn Pro Met His His65 70 75 80Gln Ile Arg Lys Val His Leu Arg Asp Cys His Arg Ser Gly Cys Met Gln85 90Trp Arg Cys Asn Pro Thr Ser Phe Phe Ser Arg Asn Gln His Ser Ser Gln100 105 110Ser Trp Asp Gly Leu Leu Pro Cys Arg Trp Leu Gln Leu Ala Cys Phe Cys115 120 125 130Ser His Gln Arg Arg His Trp Leu Gln Gly His Lys Leu Ser Ser Cys Glu135 140 145Arg Ser Leu Pro Ser Gly Ile Thr Ser Glu Arg Val Trp Glu Arg Ala Cys150 155 160 165
Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Cys Phe Gln Ser Thr Thr Val Leu Leu His Trp170 175 180Cys Ile His Pro Glu Asn Met Ser Thr His Lys Ile Phe Ser His Leu Ala185 190 195Thr Met Ser Ser Ser Leu Ser Tyr Gln His Leu Tyr Leu Leu Lys Cys Thr200 205 210 215Arg Leu Cys Tyr Arg Ile Leu Ser Ile Asn220 22權(quán)利要求
1.來自于歐洲板栗的4種分離的核酸序列，包含丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOCCs)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CystCs)、β-1，3-葡聚糖酶(GlucCs)和奇甜蛋白樣蛋白(TLPCs)的編碼區(qū)。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ.ID.NO1的序列。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸編碼丙二烯氧化物環(huán)化酶多肽。
4.權(quán)利要求2的分離的核酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有SEQ.ID.NO2的氨基酸序列的蛋白或多肽。
5.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ.ID.NO3的序列。
6.權(quán)利要求5的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸編碼半胱氨酸蛋白酶抑制劑多肽。
7.權(quán)利要求5的分離的核酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有SEQ.ID.NO4的氨基酸序列的蛋白或多肽。
8.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ.ID.NO5的序列。
9.權(quán)利要求8的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸編碼β-1，3-葡聚糖酶多肽。
10.權(quán)利要求8的分離的核酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有SEQ.ID.NO6的氨基酸序列的蛋白或多肽。
11.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ.ID.NO7的序列。
12.權(quán)利要求11的分離的核酸分子，其中所述多核苷酸編碼奇甜蛋白樣蛋白多肽。
13.權(quán)利要求11的分離的核酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有SEQ.ID.NO8的氨基酸序列的蛋白或多肽。
14.權(quán)利要求1的分離的核酸序列，作為RNA、mRNA、cRNA、DNA或cDNA分子存在。
15.權(quán)利要求1的分離的核酸序列，可以與在歐洲板栗中表達(dá)的其它基因一起使用。
16.嵌合基因，包含有義方向的一種或多種權(quán)利要求1的核酸分子，所述核酸分子可以與啟動子可操作性連接。
17.包含權(quán)利要求16所述的嵌合基因之一的表達(dá)盒。
18.包含權(quán)利要求16所述的嵌合基因之一的任何可復(fù)制表達(dá)載體。
19.包含權(quán)利要求16所述的嵌合基因之一的植物基因組。
20.用權(quán)利要求16所述的嵌合基因之一轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
21.包含權(quán)利要求16所述的嵌合基因之一的遺傳修飾的植物，其中所述嵌合基因穩(wěn)定整合到植物基因組中。
22.涉及權(quán)利要求21所述的植物的交叉雜交的后代。
23.包含權(quán)利要求16所述的嵌合基因之一的果實(shí)或種子，其中所述嵌合基因穩(wěn)定整合到植物基因組中。
24.改進(jìn)對墨水病的防御反應(yīng)信號傳遞的任何方法，該方法包括將權(quán)利要求17所述的表達(dá)盒導(dǎo)入植物。
25.改進(jìn)真菌蛋白酶作用抵消的任何方法，該方法包括將權(quán)利要求17所述的表達(dá)盒導(dǎo)入植物。
26.改進(jìn)對真菌細(xì)胞壁的攻擊的任何方法，該方法包括將權(quán)利要求17所述的表達(dá)盒導(dǎo)入植物。
27.改進(jìn)真菌細(xì)胞膜的通透和破裂的任何方法，該方法包括將權(quán)利要求17所述的表達(dá)盒導(dǎo)入植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了在致病真菌肉桂疫霉感染栗期間差異表達(dá)的分離和純化的核苷酸序列。所述分離的基因可以插入表達(dá)盒并且在可以用于通過選定的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表達(dá)載體中克隆。可以通過體外培養(yǎng)技術(shù)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明中公開的核苷酸序列編碼描述為對植物對致病真菌的抗性具有有效作用的蛋白。當(dāng)以有義方向使用時，它們可以延緩或甚至防止植物感染，給栗、軟橡樹或其它木本樹木物種的生產(chǎn)者提供益處。
文檔編號C07K14/415GK1842599SQ200480024566
公開日2006年10月4日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者S·M·特拉夸特塞拉齊納, S·C·馬蒂阿斯芬塞卡, M·S·索里斯佩斯, A·巴爾德 申請人:卡斯坦尼亞農(nóng)林股份公司