專利名稱：眼部疾病的抗cd－20治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用于CD20結(jié)合的拮抗劑諸如抗體的眼部疾病的治療。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞是血細(xì)胞生成過程中由骨髓產(chǎn)生的多種類型白細(xì)胞中的一種。淋巴細(xì)胞有兩類主要群體B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)。本發(fā)明特別感興趣的淋巴細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞。
B細(xì)胞在骨髓中成熟，離開骨髓時(shí)在其細(xì)胞表面表達(dá)與抗原結(jié)合的抗體。當(dāng)初始B細(xì)胞首次與其膜結(jié)合抗體特異的抗原相遇時(shí)，細(xì)胞開始迅速分裂，其子代分化成記憶B細(xì)胞和稱為“漿細(xì)胞”的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞壽命很長，并繼續(xù)表達(dá)與其親代細(xì)胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不產(chǎn)生膜結(jié)合抗體，而代之產(chǎn)生可分泌型的抗體，可分泌的抗體是體液免疫的重要效應(yīng)分子。
CD20抗原(也稱為人B淋巴細(xì)胞限制性分化抗原Bp35)是原B細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大約35kD(Valentine等生物學(xué)化學(xué)雜志264(19)11282-11287(1989)；和Einfeld等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志7(3)711-717(1988))。該抗原也在大于90％的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(dá)(Anderson等，血液63(6)1424-1433(1984))，但在造血干細(xì)胞，原B細(xì)胞，正常漿細(xì)胞或其它正常組織中未發(fā)現(xiàn)(Tedder等，免疫學(xué)雜志135(2)973-979，1985)。CD20在細(xì)胞周期啟動(dòng)和分化的活化過程早期階段起調(diào)節(jié)作用(Tedder等，同上)，并可能發(fā)揮鈣離子通道的功能(Tedder等，細(xì)胞生物學(xué)雜志14D195(1990))。
由于CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，這一抗原可作為用于“靶向”這類淋巴瘤的候選者。實(shí)質(zhì)上，這種靶向可如下歸納將B細(xì)胞表面抗原CD20的特異性抗體給予患者。這些抗CD20抗體與正常和惡性B細(xì)胞(表面的)CD20抗原特異結(jié)合；與表面抗原CD20結(jié)合的抗體可引起腫瘤性B細(xì)胞的破壞和耗竭。此外，具有破壞腫瘤潛力的化學(xué)制劑或放射活性標(biāo)記能與抗CD20抗體偶聯(lián)，從而將所述制劑特異性“運(yùn)送”至腫瘤性B細(xì)胞。不管用什么方法，一個(gè)主要目的是破壞腫瘤；可根據(jù)所使用的具體抗CD20抗體確定具體方法，因此，靶向CD20抗原的現(xiàn)有方法很多。
rituximab(RITUXAN)抗體是一種遺傳工程化鼠/人嵌合單克隆抗CD20抗體。Rituximab在1998年4月7日授權(quán)的美國專利5,736,137號(hào)(Anderson等)中稱為“C2B8”的抗體。RITUXAN被指示用于治療復(fù)發(fā)或難治的低級(jí)或?yàn)V泡性CD20陽性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。體外作用機(jī)制研究顯示RITUXAN與人補(bǔ)體結(jié)合，并通過補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)裂解淋巴樣B細(xì)胞系(Reff等，血液83(2)435-445(1994))。此外，在抗體依賴的細(xì)胞性細(xì)胞毒作用(ADCC)試驗(yàn)中有顯著活性。最近，RITUXAN在氚標(biāo)胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)中顯示抗增殖效應(yīng)并直接誘導(dǎo)凋亡，而其它抗CD20抗體則不能(Maloney等，血液88(10)637a(1996))。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)RITUXAN與化療和毒素有協(xié)同作用。尤其是RITUXAN使耐藥的人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系對阿霉素，CDDP，VP-16，白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細(xì)胞毒效應(yīng)較敏感(Demidem等，癌癥化療及放射性藥物(Cancer Chemotherapy &Radiopharmaceuticals)12(3)177-186(1997))。體內(nèi)臨床前研究顯示RITUXIMAB使來源于彌猴(cynomolgus)外周血，淋巴結(jié)和骨髓的B細(xì)胞耗竭，推測是通過補(bǔ)體和細(xì)胞介導(dǎo)的過程完成(Reff等，血液83(2)435-445(1994))。
涉及CD20抗體的專利和專利申請包括美國專利5,776,456，5,736,137，6,399,061，和5,843,439，以及美國專利申請US 2002/0197255A1，US2003/0021781A1，US 2003/0082172 A1，US 2003/0095963 A1，US2003/0147885 A1(Anderson et al.)；美國專利6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO00/44788(Braslawsky et al.)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO01/10460(White和Grillo-Lopez)；美國專利申請US2002/0006404和WO02/04021(Hanna和Hariharan)；美國專利申請US2002/0012665 A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美國專利申請US 2002/0058029 A1(Hanna，N.)；美國專利申請US 2003/0103971 A1(Hariharan和Hanna)；美國專利申請US2002/0009444A1，和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/97858(White，C.)；美國專利申請US2002/0128488A1 and WO02/34790(Reff，M.)；WO02/060955(Braslawsky et al.)；WO2/096948(Braslawsky etal.)；WO02/079255(Reff和Davies)；美國專利6,171,586B1，andWO98/56418(Lam et al.)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美國專利6,194,551B1，美國專利6,242,195B1，美國專利6,528,624B1 and美國專利6,538,124(Idusogie et al.)；WO00/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd et al.)；WO01/03734(Grillo-Lopez et al.)；美國專利申請US 2002/0004587A1和WO01/77342(Miller and Presta)；美國專利申請US2002/0197256(Grewal，I.)；美國專利申請US 2003/0157108A1(Presta，L.)；美國專利6,090,365B1，6,287,537B1，6,015,542，5,843,398，and 5,595,721，(Kaminski et al.)；美國專利5,500,362，5,677,180，5,721,108，and 6,120,767(Robinson et al.)；美國專利6,410,391B1(Raubitschek et al.)；美國專利6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；US Appl No.US2003/01339301 A1 and WO00/74718(Goldenberg and Hansen)；WO00/76542(Golay et al.)；WO01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美國專利6,368,596B1(Ghetie et al.)；美國專利申請US2002/0041847 A1，(Goldenberg，D.)；美國專利申請US2003/0026801A1(Weiner和Hartmann)；WO02/102312(Engleman，E.)；美國專利申請2003/0068664(Albitar et al.)；WO03/002607(Leung，S.)；WO049694(Wolin et al.)；WO03/061694(Sing和Siegall)，每篇文獻(xiàn)都包含在本文作為參考。也參見，美國專利5,849,898和EP申請330,191(Seed et al.)；美國專利4,861,579和EP332,865A2(Meyer andWeiss)；USP4,861,579(Meyer et al.)和WO95/03770(Bhat et al.)。
涉及利用Rituximab的治療的公開出版物包括Perotta和Abuel“Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab”Abstract# 3360 Blood 10(1)(part 1-2)p.88B(1998)；Stashi et al.“Rituximab chimericanti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura” Blood 98(4)952-957(2001)；Matthews，R.“Medical Heretics”New Scientist(2001-4-7)；Leandro et al.“Clinicaloutcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocytedepletion”Ann Rheum Dis 61833-888(2002)；Leandro et al.“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritisearly evidence for safety，efficacy and doseresponse.Arthritis and Rheumatism 44(9)S370(2001)；Leandro et al.“Anopen study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthris & Rheumatism 46(1)2673-2677(2002)；Edwards and Cambridge“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designedto deplete B lymphocytes”Rhematology 40205-211(2001)；Edwards et al.“B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmunedisorders”Biochem.Soc.Trans.30(4)824-828(2002)；Edwards et al.“Efficacyand safety of Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibodyArandomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis and Rheumatism 46(9)S197(2002)；Levine and Pestronk“IgMantibody-related polyneuropathiesB-cell depletion chemotherapy usingRituximab”Neurology 521701-1704(1999)；DeVita et al.“Efficacy ofselective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis”Arthritis &Rheum 462029-2033(2002)；Hidashida et al.“Treatment ofDMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab.”，參見AnnualScientific Meeting of the Ameican College of Rheumatology；Oct 24-29；NewOrleans，LA 2002；Tuscano，J.“Successful treatment of Infliximab-refractoryrheumatoid arthritis with rituximab”，參見Annual Scientific Meeting of theAmerican College of Rheumatology；Oct 24-29；New Orleans，LA 2002。
涉及眼部疾病中的自身免疫抗體的公開出版物包括Haldar et al.Invest Ophthalmol Visual Sci 2937(1988)；Kahaly et al.Horm.Metab.Res.21(3)137-141(1989)；Peek et al.Investigative Ophthalmology & VisualSciece 39(10)1976-1979(1998)；Harper和Foster InternationalOphthalmology Clinics 38(1)1-19(1998)；Bartalena et al.Bailliere’s ClinicalEndocrinology and Metabolism 11(3)521-536(1997)；Seider et al.BritishJournal of Ophthalmology 85(11)1287-1288(2001)；Hiromatsu et al.Endocrinologia Japonica 39(6)593-600(1992)；Donnelly，J Autoimmunity1(3)207-216(1988)；Hollows，F(xiàn).Australian Journal of Ophthalmology9(3)239-245(1981)；Weetman and McGregor Endocrine Reviews 5(2)309-355(1984)；Waltman和Yarian American Journal of Ophthalmology 77(6)891-894(1974)；Aronson et al.JAMA 196(3)225-228(1966)；Hekenlively et al.ArchOphthalmol.118(11)1497-507(2000)；和Bartalena et al.European Journal ofNuclear Medicine 29(Suppl.2)S458-S465(2002)。
WO00/402262描述了利用抗CD4單鏈Fv(scFv)片段治療眼部疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及治療哺乳動(dòng)物中的眼部疾病的方法，包括將有效治療所述眼部疾病的量的CD20拮抗劑給予所述哺乳動(dòng)物。優(yōu)選，所述拮抗劑是抗體諸如Rituximab或人源化的2H7，包括完整抗體以及抗體片段。本發(fā)明可治療的眼部疾病的實(shí)例包括葡萄膜炎(uveitis)(包括虹膜炎)，甲狀腺眼病(thyroid eye disease)或Grave’s眼病(Graves’ophthalmology)，眼白塞病(ocularBehcet’s disease)，眼重癥肌無力(ocular myasthenia gravis)，眼類天皰瘡(ocular pemphigoid)，自身免疫性視網(wǎng)膜病(autoimmune retinopathy)，盤尾絲蟲病(onchocerciasis)，鞏膜表外層炎(episcleritis)，鞏膜炎(scleritis)，復(fù)發(fā)型類固醇依賴性視神經(jīng)炎(relapsing steroid dependent optic neuritis)，韋格納肉芽腫的眼部累及(ocular involvement of Wegener’s granulomatosis)，干燥綜合征眼部并發(fā)癥(Sjogren’s eye complication)，黑素瘤相關(guān)的視網(wǎng)膜病(melanoma associated retinopathy)以及癌相關(guān)的視網(wǎng)膜病(cancer associatedretinopathy)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述I.定義本文術(shù)語“眼部疾病(ocular disorder)”是涉及眼的疾病或病癥。具有本發(fā)明的眼部疾病的哺乳動(dòng)物通常顯示眼疾病的一或多種癥狀。具體感興趣的本發(fā)明的眼部疾病包括，但不限于，葡萄膜炎(包括虹膜炎和急性前葡萄膜炎)，甲狀腺眼病或Grave’s眼病，眼白塞病，眼重癥肌無力，眼類天皰瘡，自身免疫性視網(wǎng)膜病，盤尾絲蟲病，鞏膜表外層炎，鞏膜炎，復(fù)發(fā)型類固醇依賴性視神經(jīng)炎，韋格納肉芽腫的眼部累及，干燥綜合征眼部并發(fā)癥，黑素瘤相關(guān)的視網(wǎng)膜病以及癌相關(guān)的視網(wǎng)膜病等。
本文術(shù)語“自身抗體”指哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的針對一或多種其自身抗原的抗體。自身抗體可在來自哺乳動(dòng)物的生物樣品(諸如淚液，眼活檢，血清，血漿等)中，利用Western印跡分析，ELISA，免疫組織化學(xué)，chromatoscanning等檢出。
本文術(shù)語“眼抗原”是抗原，諸如蛋白抗原，其存在于眼內(nèi)或眼周圍。所述眼抗原可存在眼以及其它組織(例如骨骼肌組織)的內(nèi)部或周圍，或相比于哺乳動(dòng)物的其它細(xì)胞或組織而言，可主要或僅僅存在眼內(nèi)或周圍，例如視網(wǎng)膜蛋白諸如recoverin，眼肌肉抗原，視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞，uveal等。
為本發(fā)明的目的，“免疫復(fù)合物”包含非共價(jià)連接的復(fù)合物，其是抗體(例如自身抗體)和抗原(例如眼內(nèi)和周圍發(fā)現(xiàn)的抗原)形成的。
“CD20”抗原是在90％以上來自外周血或淋巴器官的B細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的一種～35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育階段表達(dá)，并保持到漿細(xì)胞分化。CD20在正常B細(xì)胞和惡性B細(xì)胞上均可發(fā)現(xiàn)。文獻(xiàn)中CD20亦稱為“B淋巴細(xì)胞限制性抗原”或“Bp35”。例如，在Clark等PNAS(USA)821766(1985)有對CD20抗原的描述。
“拮抗劑”是這樣的分子，其一旦結(jié)合B細(xì)胞上的CD20，就破壞和耗竭哺乳動(dòng)物中的B細(xì)胞和/和干擾一或多種B細(xì)胞功能，例如通過降低和防止B細(xì)胞激發(fā)的體液反應(yīng)。所述拮抗劑優(yōu)選可耗竭利用其治療的哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞(即降低循環(huán)B細(xì)胞水平)。所述耗竭可經(jīng)由各種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，諸如抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(CDC)，抑制B細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)B細(xì)胞死亡(例如經(jīng)由凋亡)。包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的拮抗劑包括抗體，合成和天然序列肽，以及結(jié)合CD20的小分子拮抗劑，可選偶聯(lián)和融合于細(xì)胞毒制劑。優(yōu)選的拮抗劑包括抗體。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”和“ADCC”指一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(如自然殺傷(NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγR III，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)，464頁的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，如美國專利5,500,362號(hào)或5,821,337號(hào)中所述。這類試驗(yàn)中有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。任選或另外，目的分子的ADCC活性可在體內(nèi)評(píng)估，例如在Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)公開的動(dòng)物模型種。
“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)物的功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞表達(dá)至少FcγR III并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物的功能。例如可介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞包括人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的受體(γ受體)，其包括FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III亞型，以及這些受體的等位基因變體和可替換的剪接形式。FcγR II受體包括FcγR IIA(“活化型受體”)和FcγR IIB(“抑制型受體”)，二者的氨基酸序列相似，主要區(qū)別在其胞漿結(jié)構(gòu)域。活化型受體FcγR IIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγR IIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見Daeron，免疫學(xué)年鑒15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫學(xué)方法)425-34(1994)；和de Haas等，實(shí)驗(yàn)室及臨床醫(yī)學(xué)雜志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中對FcR進(jìn)行了綜述。其它FcR，包括將來被確定的，均被包含在術(shù)語“FcR”中。該術(shù)語也包括新生期的受體，F(xiàn)cRn，其負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒(Guyer等，免疫學(xué)雜志117587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用”或“CDC”是指在補(bǔ)體存在時(shí)分子裂解標(biāo)靶的能力。補(bǔ)體活化途徑由補(bǔ)體系統(tǒng)第一個(gè)成分(Clq)結(jié)合至一個(gè)與同源抗原形成化合物的分子(如抗體)來啟動(dòng)。為評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫學(xué)方法雜志202163(1996)所述進(jìn)行CDC試驗(yàn)。
“生長抑制”拮抗劑是指那些阻止或減少可與拮抗劑結(jié)合之抗原的表達(dá)細(xì)胞增殖的拮抗劑。例如拮抗劑可在體內(nèi)或體外阻止或減少B細(xì)胞的增殖。
“誘導(dǎo)凋亡”的拮抗劑是指那些可誘導(dǎo)例如，B細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的拮抗劑，所述凋亡可通過標(biāo)準(zhǔn)凋亡試驗(yàn)，如annexin V的結(jié)合，DNA片段化，細(xì)胞皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，細(xì)胞碎裂，和/或膜泡(稱為凋亡小體)形成確定。
這里的術(shù)語“抗體”用其最廣泛的意義，尤其包含完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及能顯示所需生物學(xué)活性的任何抗體片段。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，和Fv片段；二價(jià)抗體；線性化抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)構(gòu)成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，免疫球蛋白不同型的重鏈中二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個(gè)重鏈在其一個(gè)端有可變區(qū)(VH)，緊接著多個(gè)恒定區(qū)。每個(gè)輕鏈在其一端有可變區(qū)(VL)，而另一端有恒定區(qū)；輕鏈恒定區(qū)與重鏈第一恒定區(qū)并列，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)并列。認(rèn)為某些氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變的”是指不同抗體的可變區(qū)特定部分序列差異很大，且這些部分在每種抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性中有用。然而在抗體整個(gè)可變區(qū)中可變性的分布并不均等。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個(gè)被稱為高變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)的更高度保守部分被稱為框架區(qū)(FR)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別包含四個(gè)FR，它們大多采用β片層構(gòu)象，通過三個(gè)高變區(qū)相連，這些高變區(qū)形成環(huán)狀，有時(shí)形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的高變區(qū)通過FR緊密連接，并與其他鏈的高變區(qū)共同形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體對抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)功能，如使抗體參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。
抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的稱為“Fab”的抗原結(jié)合片段和一個(gè)殘余“Fc”片段，每個(gè)Fab片段具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)c的名稱反映了其容易形成結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab’)2片段，它有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍能與抗原交叉結(jié)合。
“Fv”是包含完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這個(gè)區(qū)域是由一條重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)緊密、非共價(jià)結(jié)合成的二聚體。在VH-VL二聚體表面，每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)在此構(gòu)型中相互作用，從而限定一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特性。但即使單個(gè)可變區(qū)(或Fv中僅包含三個(gè)抗原特異性高變區(qū)的那一半)也能識(shí)別并結(jié)合抗原，只是比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力低。
Fab片段還包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’不同于Fab片段之處在于，其重鏈CH1區(qū)的羧基端添加了數(shù)個(gè)殘基，其中包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一或多個(gè)半胱氨酸。本文中Fab’-SH指一種Fab’，其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基有至少一個(gè)游離巰基。F(ab’)2抗體片段最初是作為Fab’片段對且它們之間有鉸鏈區(qū)半胱氨酸的形式產(chǎn)生的?？贵w片段的其它化學(xué)連接也是已知的。
脊椎動(dòng)物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以是兩種完全不同的型(κ和λ)之一，型別區(qū)分的依據(jù)是其恒定區(qū)氨基酸序列。
抗體依據(jù)其重鏈恒定區(qū)氨基酸序列分為不同的類。完整抗體有五大類IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中幾種能進(jìn)一步分為亞型(同種型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α，δ，ε，γ和μ。免疫球蛋白不同類的亞單位和三維構(gòu)型是已知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個(gè)多肽接頭，它能使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學(xué)》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術(shù)語“二價(jià)抗體(diabodies)”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，906444-6448(1993)中有對二價(jià)抗體的更詳細(xì)描述。
本文中術(shù)語“單克隆抗體”指從實(shí)質(zhì)上均一的抗體群獲得的抗體，即包含該群體的單個(gè)抗體除了可能自然發(fā)生的很少量突變以外都相同。單克隆抗體均以高度特異性直接針對單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體直接針對抗原上的單個(gè)決定簇。單克隆抗體除了具有特異性，其優(yōu)勢還在于，它們是通過雜交瘤培養(yǎng)而合成的，無其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆的”指抗體獲自實(shí)質(zhì)上均一的抗體群的特征，不應(yīng)理解為需要由任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以用由Kohler等，自然，256495(1975)首次描述的雜交瘤方法來制備，或用重組DNA法(如美國專利4,816,567)來制備?！皢慰寺】贵w”還可以是用Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991)所述技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離得到。
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于來自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列，鏈的其余部分等同于或同源于來自其它物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列，只要它們展示所需生物學(xué)活性(見美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，816851-6855(1984))。本文的目標(biāo)嵌合抗體包括“靈長源化(primatized)”抗體，其包含源于非人靈長類可變區(qū)的抗原結(jié)合序列(如Old WorldMonkey，如狒狒，獼猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgus monkey))和人的恒定區(qū)序列(美國專利5,693,780)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在多數(shù)情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(受者(recipient)抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類(供者(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和容量(capacity)的高變區(qū)的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步改進(jìn)抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)完整可變區(qū)，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白、通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。詳見Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
本文中術(shù)語“高變區(qū)”是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)含有“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))。“框架區(qū)”或“FR”殘基是除本文所定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
與CD20抗原結(jié)合的抗體有“C2B8”現(xiàn)在被稱為“rituximab”(“RITUXAN”)(美國專利5,736,137，引入作為參考)；釔-[90]-標(biāo)記的2B8鼠抗體“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan ZEVALIN”(美國專利5,736,137，引入作為參考)；任選用131I標(biāo)記鼠IgG2a“B1”(也稱為Tositumomab)產(chǎn)生“131I-B1”抗體(碘I131tositumomab BEXXARTM)(美國專利5,595,721，引入作為參考)；鼠單克隆抗體“IF5”(Press等Blood 69(2))584-591(1987))；和“框架區(qū)修補(bǔ)的(patched)“或人源化的IF5嵌合2H7抗體(美國專利5,677,180，引入作為參考)(WO03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏號(hào)HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗體(美國專利5,677,180，包含在本文作為參考)；人源化的2H7；huMax-CD20(Genmab，Denmark)；AME-133(AppliedMolecular Evolution)；；和可從國際白細(xì)胞分型小組(International LeukocyteTyping Workshop)獲得的單克隆抗體L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2(Valentine等，在《白細(xì)胞分型III)》(McMichael編，第440頁，OxfordUniversity Press(1987))。
本文中術(shù)語“rituximab”或“RITUXAN”指經(jīng)遺傳工程改造的、針對CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利5,736,137(引入作為參考)中命名為“C2B8”，包括其保持與CD20的結(jié)合能力的片段。
完全為了本發(fā)明的目的，“人源化的2H7″指完整抗體和包含可變輕鏈序列的抗體片段DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO1)；以及可變重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQM[NSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO2)如果人源化的2H7抗體是完整抗體，優(yōu)選其包含輕鏈氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO3)；和重鏈氨基酸序列MGWSCIILFLVATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO4)。
“分離”的拮抗劑是已經(jīng)從其自然環(huán)境組分中鑒定并分離和/或回收的拮抗劑。其自然環(huán)境中的污染成分有，可干擾該拮抗劑的診斷和治療應(yīng)用的物質(zhì)，可能包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，，該拮抗劑的純度應(yīng)達(dá)到(1)經(jīng) Lowery 法確定的拮抗劑比重為95％以上，最優(yōu)選99％以上，(2)足以獲得用旋轉(zhuǎn)杯狀(spinning cup)序列分析儀所測至少15個(gè)殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列，(3)通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色、優(yōu)選銀染所證實(shí)的均質(zhì)性。分離的拮抗劑包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位拮抗劑，因?yàn)樵撧卓箘┑淖匀画h(huán)境中的至少一種組分已不存在。但一般情況下分離的拮抗劑可通過至少一個(gè)純化步驟來制備。
需要治療的“哺乳動(dòng)物”是指歸為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)場動(dòng)物，以及動(dòng)物園里的動(dòng)物、參與運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的動(dòng)物或?qū)櫸锶绻?、馬、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物為人類。
“治療”是指治療方法和預(yù)防措施。需要治療者包括已經(jīng)患眼部疾病者，以及需要對眼部疾病進(jìn)行預(yù)防者。因此，哺乳動(dòng)物可能被診斷為患眼部疾病或?qū)λ黾膊∮袃A向或易感。
“治療有效量”是指能有效阻止，改善或治療目標(biāo)眼部疾病的拮抗劑的量。
本文用于輔助治療的術(shù)語“免疫抑制劑”是指能抑制或掩蓋所治哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將包括能抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，下調(diào)或抑制自身抗原的表達(dá)，或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。這些制劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利4,665,077，其全文引入本文作參考)；非類固醇類抗炎藥(NSAID)；硫唑嘌呤(azathioprine)；環(huán)磷酰胺；溴麥角環(huán)肽；達(dá)那唑；氨苯砜；戊二醛(它掩蓋MHC抗原，如美國專利4,120,649所述)；抗MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇如糖皮質(zhì)激素，例如強(qiáng)的松，甲基強(qiáng)的松和地塞米松；氨甲蝶呤(口服或皮下)；羥氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；leflunomide；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑包括抗IFN-γ，-β或-α抗體，抗TNF-α抗體(infliximab或adalimumab)；抗TNF-α免疫粘附素(etanercept)，抗TNF-β抗體，抗IL-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；泛(pan)-T抗體，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；包含LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(公開于7/26/90的WO90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶(streptodorrrnase)；源于宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細(xì)胞受體(Cohen等，美國專利5,114,721)；T細(xì)胞受體片段(Offner等，科學(xué)，251430-432(1991))；WO90/11294；Ianeway，自然，341482(1989)；和WO91/01133)；和T細(xì)胞受體抗體(EP 340,109)例如T10B9。
本文中術(shù)語“細(xì)胞毒制劑”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和镥的放射性同位素)，化療制劑，毒素如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素，或它們的片段。
“化療制劑”是在癌癥治療中使用的化學(xué)化合物。化療制劑實(shí)例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如芐替哌(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車霉素(calicheamicin)，carabicin，更生霉素(carminomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放線菌素D(dactinomycin)，道諾紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；磷氨氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfomithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine)；新霉酰氨(navelbine)；二羥基蒽酮(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。
術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一個(gè)細(xì)胞群釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白的總稱。這類細(xì)胞因子有淋巴因子，單核因子，和傳統(tǒng)的多肽激素。包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；原胰島素；松馳素；原松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細(xì)胞生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；苗勒-抑制物；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍(activin)；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語細(xì)胞因子包括天然蛋白或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等效物。
本發(fā)明使用的術(shù)語“前體藥物”是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較小且可酶促活化或被轉(zhuǎn)換成更具活性的親本形式。例見Wilman，“癌癥化療中的前體藥物”Biochemical Society Transaction，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物一種藥物定向運(yùn)送的化學(xué)方法”定向藥物運(yùn)送，Borchardt等(編)，pp.247-267，Humana press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內(nèi)酰胺的前體藥物，含有任選取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或含有任選取代的苯基乙酰胺的前體藥物，可轉(zhuǎn)化為更具細(xì)胞毒活性的游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明所用前體藥物形式細(xì)胞毒藥物包括，但不限于上述化療試劑。
“B細(xì)胞惡性疾病”是涉及B細(xì)胞的惡性疾病。實(shí)例包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)，包括淋巴細(xì)胞優(yōu)勢型霍奇金病(lymphocytepredominant Hodgkin’s disease)(LPHD)；非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)(NHL)；濾泡中心細(xì)胞淋巴瘤(follicular center cell(FCC)lymphoma)；急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia(ALL))；慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia(CLL))；毛細(xì)胞白血病(hairycell leukemia)；漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞淋巴瘤(plasmacytoid lymphocyticlymphoma)；套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS和HIV-相關(guān)的淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(central nervoussystem(CNS)lymphoma)；移植后淋巴增生性疾病(post-transplantlymphoproliferative disorder)(PTLD)；Waldenstrom′s巨球蛋白血癥(macroglobulinemia)(淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma))；粘膜相關(guān)的淋巴樣組織淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue(MALT)lymphoma)；以及邊緣區(qū)淋巴瘤/白血病(and marginal zonelymphoma/leukemia)。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括，但不限于低級(jí)/濾泡(low grade/follicularNHL)，復(fù)發(fā)型和難治性(relapsed or refractory)NHL，前線低級(jí)(front line lowgrade)NHL，III/IV期NHL，化療抗性(chemotherapy resistant)NHL，小淋巴細(xì)胞性(small lymphocytic)(SL)NHL，中間級(jí)/濾泡(intermediategrade/follicular)NHL，中間級(jí)彌漫型(intermediate grade diffuse)NHL，彌漫型大細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)，進(jìn)展性(aggressive)NHL(包括進(jìn)展性前線NHL和進(jìn)展性復(fù)發(fā)型NHL)，自體干細(xì)胞移植后的NHL復(fù)發(fā)或自體干細(xì)胞移植難治性NHL(relapsing after or refractory to autologousstem cell transplantation)，高級(jí)免疫母細(xì)胞性(high grade immunoblastic)NHL，高級(jí)淋巴母細(xì)胞性(high grade lymphoblastic)NHL，高級(jí)小非凹陷的細(xì)胞(high grade small non-cleaved cell)NHL，bulky病NHL等。
II.拮抗劑的制備本發(fā)明的方法和制品使用，或摻入了一種能結(jié)合CD20的拮抗劑。相應(yīng)地，本文還描述了產(chǎn)生這類拮抗劑的方法。
用于產(chǎn)生或篩選拮抗劑的CD20可以是，如CD20的可溶形式或其一部分，包括所需表位?；蛘?，或任選，在表面表達(dá)所述CD20的細(xì)胞可用于產(chǎn)生或篩選拮抗劑?？捎糜诋a(chǎn)生拮抗劑的其它形式的CD20為本領(lǐng)域所顯而易見。
雖然優(yōu)選的拮抗劑是抗體，但除抗體以外的其它拮抗劑也包括在此。例如，拮抗劑可含有任選融合至或偶聯(lián)于細(xì)胞毒制劑(如本文所公開的那些)的小分子?？稍谛》肿游膸熘泻Y選本文的目標(biāo)CD20，以便鑒定能與該抗原結(jié)合的小分子。還可進(jìn)一步篩選小分子的拮抗特性和/或其與細(xì)胞毒試劑的偶聯(lián)。
拮抗劑也可以是經(jīng)合理設(shè)計(jì)或噬菌體展示產(chǎn)生的肽(例見WO98/35036，1998年8月13日公開)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所選的分子可以是“CDR類似物”或基于抗體CDR而設(shè)計(jì)的抗體類似物。盡管所述肽本身可能就有拮抗性，但任選將此肽與細(xì)胞毒制劑融合，以便添加或增強(qiáng)此肽的拮抗性。
以下為本發(fā)明所用抗體拮抗劑的產(chǎn)生技術(shù)舉例。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過多次給動(dòng)物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。將所述相關(guān)抗原與在所免疫的物種中具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來酰亞氨苯甲?；虼牾啺孵?通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，進(jìn)行偶聯(lián)是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點(diǎn)皮內(nèi)注射該溶液。1個(gè)月后，多位點(diǎn)皮下注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑中的偶聯(lián)物來加強(qiáng)免疫。7-14天后，對動(dòng)物采血，測定血清中的抗體滴度。對動(dòng)物的加強(qiáng)免疫直到滴度達(dá)到平臺(tái)期為止。優(yōu)選給動(dòng)物加強(qiáng)注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)。偶聯(lián)物還可以是重組細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體來自基本均一的抗體群，即該群體中的每個(gè)抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞“單克隆”指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適合的宿主動(dòng)物如倉鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，可體外免疫淋巴細(xì)胞。然后用適當(dāng)融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種至適當(dāng)培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長。
優(yōu)選骨髓瘤細(xì)胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細(xì)胞和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。也有報(bào)道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))可在含有生長的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中分析針對所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選，雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來分析。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來測定。
一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進(jìn)一步克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，PP.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可作為腹水中腫瘤的形式在動(dòng)物體內(nèi)生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中適宜地分離。
編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易地分離和測序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是這類DNA的優(yōu)選來源。DNA分離后，可將其插入表達(dá)載體中，然后用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述見Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一實(shí)施方案中，可從用 McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。后來的文獻(xiàn)描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術(shù)10779-783(1992))，以及用于構(gòu)建大規(guī)模噬菌體文庫的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來分離克隆抗體。
DNA也可通過例如用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來修飾(美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)結(jié)合來修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)的可變區(qū)，形成二價(jià)嵌合抗體，其中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于一種抗原而另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于另一種抗原。
(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已有關(guān)于人源化非人類抗體的制備方法的描述。優(yōu)選人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個(gè)源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進(jìn)的”殘基，它們通常來自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)，2391534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
對用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)包括重鏈和輕鏈的選擇，對降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)”方法，針對已知人類可變區(qū)序列的整個(gè)文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計(jì)算機(jī)程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和力增加?？傊?，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原結(jié)合的影響。
(iv)人類抗體除了進(jìn)行人源化以外還可制備人類抗體。例如現(xiàn)在已能產(chǎn)生如下轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它們通過免疫能產(chǎn)生人類抗體的所有成分而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，有報(bào)道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠中將導(dǎo)致因抗原攻擊而誘導(dǎo)人類的抗體產(chǎn)生。見Jakobovits等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.733(1993)；和美國專利5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，自然348552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成而體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點(diǎn)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致對顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進(jìn)行選擇。因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；這些綜述見Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)?？墒褂肰基因片段的多個(gè)來源進(jìn)行噬菌體展示。Clackson 等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因的隨機(jī)組合小文庫中分離了抗-惡唑酮抗體的多樣性陣列?？苫救鏜arks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)，或 Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構(gòu)建未免疫人類供者的V基因所有組成成分，并分離針對抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國專利5565332和5573905。
人類抗體也可通過體外活化的B細(xì)胞而產(chǎn)生(見美國專利5,567,610和5,229,275)。
(v)抗體片段已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見 Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學(xué)，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458?？贵w片段也可以是“線性化抗體”，如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體可以與CD20抗原的兩種不同表位結(jié)合。其它這類抗體可以結(jié)合第一個(gè)CD20并再結(jié)合第二個(gè)CD20?；蛘?，可將抗B細(xì)胞標(biāo)志物的結(jié)合臂與結(jié)合白細(xì)胞上引發(fā)分子的臂結(jié)合，從而集中針對B細(xì)胞的細(xì)胞防御機(jī)制，所述引發(fā)分子如T細(xì)胞受體分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγR I(CD64)、FcγR II(CD32)和FcγR III(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒制劑定位至B細(xì)胞。這些抗體具有B細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機(jī)分配，這些四交瘤(quadroma)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進(jìn)行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ，103655-3659(1991)。
依據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建的實(shí)施方案中，能夠非常靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例無特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。
在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。
根據(jù)美國專利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子的界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“溝”可通過將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比其它不需要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與親和素偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，這類抗體可用于將免疫細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當(dāng)?shù)慕宦?lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國專利4676980號(hào)中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻(xiàn)。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab’)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進(jìn)展促進(jìn)了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，經(jīng)體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，還能引發(fā)人類細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對人乳腺腫瘤靶的裂解活性。
直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，906444-6448(1993))描述的“二價(jià)抗體”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外還報(bào)道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價(jià)以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
III.偶聯(lián)以及對拮抗劑的其它修飾本文方法或制品中提到的拮抗劑可任選與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)。
可用于制備這些拮抗劑-細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)物的化療試劑如上述。
本文還涉及拮抗劑與一或多種小分子毒素，如加利車霉素(calicheamicin)，美登素(maytansine)(美國專利5,208,020)，單端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使拮抗劑與一或多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(如每個(gè)拮抗劑分子與約1-10個(gè)美登素分子偶聯(lián))。美登素可轉(zhuǎn)化成May-SS-Me，然后還原成May-SH3，并與修飾過的拮抗劑反應(yīng)(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))產(chǎn)生美登木素生物堿-拮抗劑偶聯(lián)物。
另外，拮抗劑可以與一或多個(gè)加利車霉素分子結(jié)合。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車霉素結(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG以及θ1I(Hinmam等，癌癥研究533336-3342(1993)和Lode等，癌癥研究582925-2928(1998))。
可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見1993年10月28日公開的WO93/21232。
本發(fā)明還涉及與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)的拮抗劑。
多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的拮抗劑，實(shí)例包括At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。
拮抗劑與細(xì)胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)2381098(1987)所述制備。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至拮抗劑的示例性偶聯(lián)劑。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
或者，可通過重組技術(shù)或肽合成來獲得拮抗劑與細(xì)胞毒制劑的融合蛋白。
在另一實(shí)施方案中，拮抗劑可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的“受體”(如鏈霉親和素)偶聯(lián)，將該拮抗劑-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細(xì)胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如親和素)。
本發(fā)明的拮抗劑還可與前體藥物活化酶相結(jié)合，該酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見WO81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。見WO88/07378和美國專利4,975,278。
這些偶聯(lián)物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的細(xì)胞毒形式的任何酶。
本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；能將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬锓Q為游離藥物的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可用本領(lǐng)域稱為“抗體酶(abzyme)”的具有酶活性的抗體，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(見Massey，自然328457-458(1987))。可如本文所述制備拮抗劑-抗體酶偶聯(lián)物以便將抗體酶運(yùn)送至腫瘤細(xì)胞群。
本發(fā)明的酶可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如上述異源雙功能交聯(lián)試劑的使用而與拮抗劑共價(jià)結(jié)合?；蛘撸梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的DNA重組技術(shù)(如Neuberger等，自然，312604-608(1984))構(gòu)建含至少本發(fā)明拮抗劑的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白，所述拮抗劑與本發(fā)明酶的至少一個(gè)功能活性部分連接。
本文還涉及對拮抗劑的其它修飾。例如，拮抗劑可與多非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物中的一種交聯(lián)。
本文公開的拮抗劑還可配成脂質(zhì)體。含拮抗劑的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)823688(1985)；Hwang等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公開的WO97/38731。在美國專利5,013,566中公開了循環(huán)時(shí)間增加了的脂質(zhì)體。
特別有效的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體通過一定孔徑大小的濾膜而擠出后獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，生物學(xué)化學(xué)雜志，257286-288(1982)所述，經(jīng)二硫鍵交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)?？扇芜x在所述脂質(zhì)體中包含化療制劑。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
本發(fā)明還涉及對本文所述蛋白質(zhì)或肽類拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可預(yù)期改進(jìn)拮抗劑的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。拮抗劑的氨基酸序列變體可通過在拮抗劑核酸中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖?，或通過肽合成法來制備。所述修飾包括，如該拮抗劑的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代?？蓪θ笔А⒉迦搿⒑腿〈M(jìn)行任意組合以獲得最終構(gòu)建體，只要該最終構(gòu)建體具有所需特性。氨基酸的變化還可改變拮抗劑的翻譯后加工，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
一種鑒別拮抗劑中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電的氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實(shí)對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代點(diǎn)引入進(jìn)一步的或其他的變體而改進(jìn)。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但突變本身不必是預(yù)定的。例如，為分析在指定位點(diǎn)處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機(jī)誘變，并篩選所表達(dá)的具有預(yù)期活性的拮抗劑變體。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個(gè)殘基至包括100個(gè)或更多殘基的多肽)，以及序列內(nèi)單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或與細(xì)胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括在酶或多肽的拮抗劑的N-或C-末端進(jìn)行融合，以增加拮抗劑在血清中的半衰期。
另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使拮抗劑分子中至少一個(gè)氨基酸殘基被不同殘基取代。抗體拮抗劑分子中最有興趣進(jìn)行取代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，也可以改變FR。保守取代見表1的“優(yōu)先取代”欄。如果這些取代引起生物學(xué)活性的改變，則可引入表1中“取代舉例” 欄的更實(shí)質(zhì)性改變，或進(jìn)一步在下文的氨基酸分類中所述的更實(shí)質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。
表1

對拮抗劑的生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修改可通過選擇性取代來完成，所述取代的效應(yīng)在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子靶位點(diǎn)的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。
與維持拮抗劑正確構(gòu)象有關(guān)的任何半胱氨酸殘基也可被取代，如被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在拮抗劑中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當(dāng)拮抗劑為抗體片段如FV片段時(shí))。
取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體高變區(qū)的一或多個(gè)殘基。通常，所選用于進(jìn)一步開發(fā)的變體相對于其親本抗體應(yīng)具有改進(jìn)的生物學(xué)活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個(gè)方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區(qū)的幾個(gè)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))突變以便在每一位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點(diǎn)，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結(jié)合作出主要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?？蛇x或此外，分析抗原-抗體化合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定抗原與抗體之間的接觸點(diǎn)也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行取代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對它們?nèi)窟M(jìn)行篩選，選出在一或多個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)勢特性的抗體以便進(jìn)一步開發(fā)。
拮抗劑的另一種氨基酸變體改變了拮抗劑原來的糖基化模式。所謂改變就是去掉拮抗劑中的一或多個(gè)碳水化合物部分，和/或添加一或多個(gè)原本不存在于該拮抗劑中的糖基化位點(diǎn)。
多肽的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶促相連的識(shí)別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
在拮抗劑分子中添加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列，使其包含一或多個(gè)上述三肽序列(在N-連接糖基化位點(diǎn)的情況下)而常規(guī)實(shí)現(xiàn)。這種改變也可通過在原始的拮抗劑序列中添加或取代一或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來實(shí)現(xiàn)(在O-連接糖基化位點(diǎn)的情況下)。
抗體包含F(xiàn)c區(qū)的情況下，附著于所述抗體的碳水化合物可被改變。例如，具有缺乏附著于抗體Fc區(qū)的巖藻糖的成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體描述于美國專利申請US 2003/0157108 A1，Presta，L。具有位于附著于抗體Fc區(qū)的碳水化合物中的二分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體參見wO03/011878，Jean-Mairet et al.和美國專利6,602,684，Umana et al。具有在附著于抗體Fc區(qū)的寡糖中的至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體報(bào)道于AWO97/30087，Patel et al。也參見WO98/58964(Raju，S.)和WO99/22764(Raju，S.)，其涉及具有附著于其Fc區(qū)上的改變的碳水化合物。
編碼拮抗劑的氨基酸序列變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對早期制備的拮抗劑變體或未變異的拮抗劑進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變和盒式誘變來制備。
也可預(yù)期修飾拮抗劑的效應(yīng)物功能，如以此增強(qiáng)拮抗劑的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)。這可以通過在抗體拮抗劑FC區(qū)引入一或多個(gè)氨基酸取代而獲得。此外，可在FC區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用和ADCC。見Caron等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學(xué)雜志1482918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備?；蛘?，可通過工程改造產(chǎn)生具有雙FC區(qū)并因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解效應(yīng)及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設(shè)計(jì)(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。WO00/42072(Presta，L.)描述了在存在人效應(yīng)細(xì)胞下具有改善的ADCC功能的抗體，其中所述抗體包含其Fc區(qū)中的氨基酸取代。
具有改變的Clq結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒(CDC)的抗體描述于WO99/51642，美國專利6,194,551B1，美國專利6,242,195B1，美國專利6,528,624B1和美國專利6,538,124(Idusogie et al.)。所述抗體包含位于其Fc區(qū)的氨基酸位置270，322，326，327，329，313，333和/或334的氨基酸取代。
為了提高拮抗劑的血清半衰期，一種方法是在拮抗劑(尤其抗體片段)中摻入補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如美國專利5,739,277所述。本文中術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。其Fc區(qū)中具有取代且其血清半壽期延長的抗體描述于WO00/42072(Presta，L.)。
也涉及具有三或更多個(gè)(優(yōu)選四個(gè))功能抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體(美國專利申請US2002/0004587 A1，Miller et al.)。
IV.藥用制劑根據(jù)本發(fā)明使用的拮抗劑的藥用制劑通過將具有所需純度的拮抗劑與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(xué)(Remington’s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存?？伤幱幂d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸;防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨;氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量(少于10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬化合物(例如鋅-蛋白化合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
抗CD20抗體制劑的實(shí)例如WO98/56418所述，其已引入本文作為參考。其描述了一種液體多劑量制劑，該制劑包含40mg/ml rituximab，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酸酯(polysorbate)20，pH5.0，在2-8℃至少可保存2年。另一種抗CD20目標(biāo)制劑在9.0mg/ml氯化鈉，7.35mg/ml二水檸檬酸鈉，0.7mg/ml聚山梨酸酯80，注射用無菌水pH6.5中包含10mg/ml rituximab。
適于皮下給藥的凍干劑見WO97/04801所述。這種凍干劑可用適當(dāng)稀釋劑重新恢復(fù)至高蛋白濃度，所重建的制劑可皮下給藥至這里所治療的哺乳動(dòng)物。
所述制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性但相互無負(fù)面影響的那些。例如，優(yōu)選還提供細(xì)胞毒試劑，化療試劑，細(xì)胞因子或免疫抑制劑(如作用于T細(xì)胞的那些，如環(huán)孢菌素或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，如結(jié)合LFA-1的抗體)。所述其它試劑的有效量取決于該制劑中拮抗劑的量，疾病或病癥或治療的類型，及上述其它因素。通常應(yīng)用上文所述劑量和給藥方式，或迄今所用劑量的約1-99％。
活性成分也可容納在通過凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠囊中，如分別在膠體性質(zhì)的藥物運(yùn)送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)或大乳劑(macroemulsions)中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見雷氏藥學(xué)，第16版Osol，A.編(1980)。
也可制備控釋制劑?？蒯屩苿┑倪m當(dāng)實(shí)例包括含有拮抗劑的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊。控釋制劑實(shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實(shí)現(xiàn)。
V.利用所述拮抗劑的治療本發(fā)明涉及利用結(jié)合CD20的拮抗劑治療眼部疾病。優(yōu)選的拮抗劑氏結(jié)合CD20的抗體，例如Rituximab或人源化的2H7。所述抗體可以是完整抗體或抗體片段。
本發(fā)明待治療的疾病的實(shí)例包括但不限于葡萄膜炎(包括虹膜炎)，甲狀腺眼病或Grave’s眼病，眼白塞病，眼重癥肌無力，眼類天皰瘡，自身免疫性視網(wǎng)膜病，盤尾絲蟲病，鞏膜表外層炎，鞏膜炎，復(fù)發(fā)型類固醇依賴性視神經(jīng)炎，韋格納肉芽腫的眼部累及，干燥綜合征眼部并發(fā)癥，黑素瘤相關(guān)的視網(wǎng)膜病和/或癌相關(guān)的視網(wǎng)膜病等。通常，本發(fā)明治療的哺乳動(dòng)物將不患有B細(xì)胞惡性疾病。本發(fā)明的治療的哺乳動(dòng)物通常顯示一或多種眼疾病的癥狀，諸如視力模糊，疼痛，發(fā)紅等。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生結(jié)合一或多種自身抗原包括存在于眼中的抗原的自身抗體。所述哺乳動(dòng)物可接受預(yù)后檢測，以檢測所述自身抗體，其中在所述檢測中具有陽性結(jié)果的哺乳動(dòng)物或患者是本發(fā)明所述治療的候選者。一些情況諸如重癥肌無力中，存在于眼或其它地方內(nèi)或周圍的針對抗原的自身抗體(例如針對骨骼肌組織的自身抗體，包括眼外肌)可存在眼內(nèi)，其可利用預(yù)后檢測來檢測?？蛇x或此外，所述患者可具有沉積在眼內(nèi)的免疫復(fù)合物作為部分系統(tǒng)疾病過程，諸如源自類風(fēng)濕性血管炎的鞏膜炎。本發(fā)明還涉及檢測所述免疫復(fù)合物的存在，以及治療被發(fā)現(xiàn)具有所述免疫復(fù)合物的患者。
含一種與CD20結(jié)合的拮抗劑的組合物可根據(jù)常規(guī)醫(yī)療實(shí)踐而針對本文所述各種情況進(jìn)行配制、分劑量、并給藥。其中應(yīng)考慮的因素包括所治療的具體疾病或紊亂，所治療的具體哺乳動(dòng)物，具體患者的臨床狀況，疾病或紊亂的病因，藥物的給藥部位，給藥方法，給藥時(shí)間表，和醫(yī)務(wù)人員已知的其它因素。拮抗劑的治療有效量將參考上述因素而給予。
作為通常的傾向，經(jīng)胃腸外給藥的每劑拮抗劑的有效量為約20mg/m2-約10,000mg/m2患者身體，可通過一或多個(gè)劑量給予。完整抗體的示例性IV劑量方案包括375mg/m2每周一次×4；1000mg×2(例如在第1和15天)；或1克×3。對于局部給藥的抗體或抗體片段，例如作為滴眼劑或藥膏，或用于框內(nèi)或眼周注射，示例性劑量為約0.001-約100mg，例如約0.1-約10mg，例如每天應(yīng)用一次，每天應(yīng)用兩次，或更為頻繁。對于眼房內(nèi)(眼房內(nèi))或玻璃體內(nèi)(intravitreal)注射，考慮約0.01-約10mg的劑量，優(yōu)選約0.1-約1mg。
但是如上所述，所述拮抗劑的量需要大量治療判斷。選擇適宜劑量和方案的關(guān)鍵因素是所得的結(jié)果，如上所述，例如，可能在治療進(jìn)行性或急性疾病的開始需要相對較高的劑量。為獲得更為有效的效果，根據(jù)所述疾病或病癥，所述拮抗劑在盡可能接近所述疾病或病癥的病征、診斷、出現(xiàn)或發(fā)生時(shí)給藥，或在所述疾病或病癥的緩解期給藥。
所述拮抗劑通過適宜方法給藥，包括胃腸外，經(jīng)玻璃體內(nèi)，眼房內(nèi)，眶內(nèi)，眼周，局部(例如經(jīng)由滴眼劑或眼用藥膏)，經(jīng)皮下，經(jīng)腹腔內(nèi)，經(jīng)肺內(nèi)，經(jīng)鼻內(nèi)，和/或經(jīng)損傷內(nèi)給藥。經(jīng)胃腸外給藥包括經(jīng)肌內(nèi)，經(jīng)靜脈內(nèi)，經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)，經(jīng)腹腔內(nèi)，經(jīng)皮下給藥。也涉及經(jīng)鞘內(nèi)給藥。此外，所述拮抗劑可通過脈沖輸注例如利用劑量遞減的拮抗劑適宜給藥。優(yōu)選所述劑量通過注射給予，更優(yōu)選通過靜脈內(nèi)注射，或給予眼內(nèi)或眼周。
可給藥其它化合物，諸如細(xì)胞毒制劑，化療藥劑，免疫抑制劑和/或細(xì)胞因子連同本發(fā)明的拮抗劑。例如，所述CD20拮抗劑可與糖皮質(zhì)激素/強(qiáng)的松/甲基強(qiáng)的松(糖皮質(zhì)激素類)，靜脈內(nèi)免疫球蛋白(gamma球蛋白)，telecobalthotherapy，血漿除去法，左旋甲狀腺素(levothyroxine)，環(huán)孢素(cyclosporin)A，促生長素抑制素類似物(somatastatin analogues)，細(xì)胞因子拮抗劑(cytokine antagonist)，抗代謝物(anti-metabolites)，免疫抑制劑(immunosuppressive agent)，細(xì)胞毒制劑(cytotoxic agents)(例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，硝基咪唑硫嘌呤(azathioprine))，眼眶放療(orbital radiotherapy)，眼眶解壓(orbitaldecompression)，康復(fù)手術(shù)(rehabilitative surgery)，放射性碘(radioiodine)，甲狀腺切除(thyroidectomy)等。聯(lián)用的治療包括共給藥，利用分離的配制劑或單個(gè)藥物配制劑，以及任何順序的連續(xù)給藥，其中優(yōu)選存在兩種(或所有)同時(shí)發(fā)揮它們的生物活性的活性藥劑之間的期間。
除了向患者給藥蛋白拮抗劑，本申請還考慮通過基因治療給藥拮抗劑。這類編碼拮抗劑的核酸的給藥以“給予有效治療劑量的拮抗劑”的表達(dá)形式包括在內(nèi)。例見1996年3月14日公開的WO96/07321，其涉及利用基因治療產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體。
有兩種主要方法可將核酸(任選包含在載體中)引入患者細(xì)胞；體內(nèi)和離體(ex vivo)。體內(nèi)運(yùn)送核酸指直接給患者注射，通常注射至需要拮抗劑的位點(diǎn)。離體治療是將患者細(xì)胞取出，將核酸引入這些分離的細(xì)胞，然后將這些已改變的細(xì)胞直接給予患者或裝入多孔膜中再植入患者體內(nèi)(見美國專利4,892,538和5,283,187)。有多種技術(shù)可用于將核酸引入活細(xì)胞?？筛鶕?jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的細(xì)胞，還是轉(zhuǎn)移至目標(biāo)宿主的體內(nèi)細(xì)胞而使用不同方法。適于將核酸轉(zhuǎn)移至體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)有脂質(zhì)體的應(yīng)用、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等。常用于離體運(yùn)送基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(如腺病毒，單純皰疹病毒I型或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)型轉(zhuǎn)移的有效脂質(zhì)有DOTMA，DOPE和DC-Chol)的轉(zhuǎn)染。某些情況下，希望提供一種帶有能靶向靶細(xì)胞的試劑(如特異于細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞的抗體，針對靶細(xì)胞表面受體的配體，等)的核酸來源。當(dāng)使用脂質(zhì)體時(shí)，可使用能結(jié)合胞吞作用相關(guān)性細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白來靶向和/或促進(jìn)對下述蛋白的吸收，所述蛋白如對特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白的抗體，靶向細(xì)胞內(nèi)定位和提高細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(dǎo)型胞吞作用的技術(shù)見Wu等，生物學(xué)化學(xué)雜志2624429-4432(1987)；和Wagner等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，873410-3414(1990)。有關(guān)目前已知的基因制備和基因治療方案的綜述見Anderson等，科學(xué)256808-813(1992)。亦參見WO93/25673。
本發(fā)明的更詳細(xì)內(nèi)容通過以下非限制性實(shí)施例舉例說明。本說明書中所引用的所有文獻(xiàn)均引入作為參考。
實(shí)施例1診斷患有一或多種眼部疾病的癥狀的患者根據(jù)本實(shí)施例進(jìn)行治療。待本發(fā)明的待治療眼部疾病包括葡萄膜炎(包括虹膜炎)，甲狀腺眼病(也稱作Grave’s眼病)，眼白塞病，眼重癥肌無力，眼類天皰瘡，自身免疫性視網(wǎng)膜病，盤尾絲蟲病，鞏膜表外層炎，鞏膜炎，復(fù)發(fā)型類固醇依賴性視神經(jīng)炎，韋格納肉芽腫的眼部累及，干燥綜合征眼部并發(fā)癥，黑素瘤相關(guān)的視網(wǎng)膜病或癌相關(guān)的視網(wǎng)膜病。
所述患者利用完整Rituximab或人源化2H7，或Rituximab或人源化2H7的片段(諸如Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v，scFv或二價(jià)抗體)治療。
優(yōu)選，完整抗體經(jīng)靜脈內(nèi)(IV)給藥，所選劑量為375mg/m2每周一次×4,1000mg×2(例如在第1和15天)，或1克×3以耗竭(至少在一定程度上)循環(huán)CD20陽性B細(xì)胞，由此緩解眼部疾病的癥狀。
所述疾病在眼表面的情況下，例如在鞏膜炎或干燥綜合征中，所述抗體系統(tǒng)給藥(例如，如上述經(jīng)靜脈內(nèi))或所述抗體配制成用于通過滴眼劑或藥膏局部給藥。適宜劑量范圍為約0.1-10mg，每天使用一次，兩次或三次。
需要眼內(nèi)穿透的情況下，例如對于葡萄膜炎，所述抗體或抗體片段通過經(jīng)玻璃體內(nèi)或眼房內(nèi)注射給藥。根據(jù)該給藥模式，所述抗體優(yōu)選為抗體片段的形式，以改善眼內(nèi)的吸收。用于經(jīng)玻璃體內(nèi)或眼房內(nèi)注射給藥的抗體片段的劑量為約0.1-約1.0mg。所述抗體或抗體片段間歇給藥，例如每月一次，通過玻璃體內(nèi)或眼房內(nèi)注射。
利用CD20抗體的治療可選與一或多種其它治療眼部疾病的療法組合，諸如糖皮質(zhì)激素/強(qiáng)的松/甲基強(qiáng)的松(糖皮質(zhì)激素類)，靜脈內(nèi)免疫球蛋白(gamma球蛋白)，促生長素抑制素類似物，細(xì)胞因子拮抗劑，血漿除去法，左旋甲狀腺素，環(huán)孢素A，抗代謝物，免疫抑制劑，細(xì)胞毒制劑(例如苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，硝基咪唑硫嘌呤)，telecobalthotherapy，眼眶放療，眼眶解壓，康復(fù)手術(shù)，放射性碘，和/或甲狀腺切除。
用CD20治療的患者顯示眼部疾病的癥狀改善，諸如視力敏銳度提高，不適感或流淚減輕，視力損失得以改善或防止。
權(quán)利要求
1.治療哺乳動(dòng)物中的眼部疾病的方法，包括將有效治療所述眼部疾病的量的CD20拮抗劑給予所述哺乳動(dòng)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述拮抗劑包含抗體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體不與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體包含rituximab。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體包含人源化的2H7。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體與細(xì)胞毒制劑偶聯(lián)。
8.權(quán)利要求1的方法，其基本上包括給予將所述的拮抗劑給予哺乳動(dòng)物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生結(jié)合一或多種眼抗原的自身抗體或在眼內(nèi)具有免疫復(fù)合物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述眼部疾病選自以下疾病組成的組葡萄膜炎，虹膜炎，甲狀腺眼病或Grave’s眼病，眼白塞病，眼重癥肌無力，眼類天皰瘡，自身免疫性視網(wǎng)膜病，盤尾絲蟲病，鞏膜表外層炎，鞏膜炎，復(fù)發(fā)型類固醇依賴性視神經(jīng)炎，韋格納肉芽腫的眼部累及，干燥綜合征眼部并發(fā)癥，黑素瘤相關(guān)的視網(wǎng)膜病以及癌相關(guān)的視網(wǎng)膜病。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是完整抗體。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是包含與CD20結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗原結(jié)合片段選自Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v，單鏈Fv片段(scFv)，和二價(jià)抗體組成的組。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體經(jīng)靜脈內(nèi)給藥。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體經(jīng)眶內(nèi)、經(jīng)眼房內(nèi)，經(jīng)眼周，和經(jīng)玻璃體內(nèi)注射給藥。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體是包含結(jié)合CD20的抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體局部給藥于眼。
全文摘要
本申請描述了利用結(jié)合CD－20的拮抗劑諸如抗體的眼部疾病的治療。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1845755SQ200480024982
公開日2006年10月11日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者保羅·G·布魯尼塔 申請人:健泰科生物技術(shù)公司