專利名稱：抗人4－1bb(cd137)的完全人抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及完全人抗體，具體涉及人4-1BB(CD137)的完全(fully)人抗體。
背景技術(shù)：
多種證據(jù)明確證明，一定程度的抗癌免疫反應(yīng)存在人和動物中。癌癥患者中，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞組分能識別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原，諸如癌胚抗原的分化或突變的基因產(chǎn)物(S.Rosenberg，Nature，411380-4(2001)；P.van derBruggen等，Immunological Rev.，18851-64(2002))。多種臨床研究顯示腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞的具有有利的預(yù)后意義(E.Halapi，Med.Oncol.，15(4)203-11(1998)；Y.Naito等，Cancer Res.，58(16)3491-4(1998)；L.Zhang等，N.E.J.Med.，348(3)203-13(2003))。此外，利用免疫調(diào)節(jié)劑諸如細(xì)胞因子或細(xì)菌產(chǎn)物，癌癥疫苗或獲得性免疫治療的療法可導(dǎo)致腫瘤在許多患者中的退變(S.Rosenberg，Cancer J.Sci.Am.6(S)2(2000)；P.Bassi，Surg.Oncol.，11(1-2)77-83(2002)；S.Antonia等，Current Opinion in Immunol.，16130-6(2004))。盡管存在這些反應(yīng)，針對癌癥的免疫力經(jīng)常不能有效消除腫瘤細(xì)胞。導(dǎo)致所述失敗的原因可分為三組主要類型(i)免疫細(xì)胞的腫瘤識別受損，由腫瘤抗原的可變表達(dá)或I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的表達(dá)降低所導(dǎo)致；(ii)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，作為腫瘤細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子的結(jié)果(例如，TGF-β)；和(iii)由于缺乏共刺激分子在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)而產(chǎn)生的腫瘤免疫原性差，其導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不能有效刺激T細(xì)胞。我們對于腫瘤抗原識別和免疫效應(yīng)物功能的需要的理解的進(jìn)展表明用于增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的可能的策略是通過輔助分子提供共刺激。腫瘤抗原特異性T細(xì)胞需要共刺激以啟動和保持效應(yīng)物功能。因此，靶向共刺激分子的療法可用于調(diào)節(jié)和增強(qiáng)對腫瘤的免疫反應(yīng)。
目前T細(xì)胞活化的模型假定初始T細(xì)胞需要兩種信號以充分活化(i)經(jīng)加工的抗原的結(jié)合提供的信號，其通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類分子呈遞給T細(xì)胞受體；和(ii)T細(xì)胞表面的共刺激分子與抗原呈遞細(xì)胞上的其配體的相互作用提供的其它信號。通過初始T細(xì)胞識別抗原本身對于激發(fā)T細(xì)胞活化而言是不足的。沒有共刺激信號，T細(xì)胞可通過死亡或誘導(dǎo)無活性來消除。通過CD28共刺激分子的信號似乎是T細(xì)胞反應(yīng)啟動的關(guān)鍵。然而，CD137(4-1BB)信號顯示對于保持和擴(kuò)大對抗原的免疫反應(yīng)，以及對于產(chǎn)生記憶T細(xì)胞是重要的。
CD137(4-1BB)是腫瘤壞死因子受體(TNF-R)基因家族的成員，其包括參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和程序性細(xì)胞死亡的蛋白。CD137是30kDa的I型膜糖蛋白，其作為55kDa的同源二聚體表達(dá)。所述受體首先在小鼠中描述(B.Kwon等，P.N.A.S.USA，861963-7(1989))，隨后在人中鑒定(M.Alderson等，Eur.J.Immunol.，242219-27(1994)；Z.Zhou等，Immunol.Lett.，4567(1995))(也參見公開的PCT出版物WO95/07984和WO96/29348，和美國專利6,569,997,包含在本文作為參考(見，SEQ ID NO2.))。人和小鼠形式的CD137在氨基酸水平有60％的同一性。保守的序列存在細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以及分子的5個其它區(qū)域中，表明這些殘基對于CD137分子的功能而言可能是重要的(Z.Zhou等，Immunol.Lett.，4567(1995))。CD137的表達(dá)主要在淋巴細(xì)胞系諸如活化的T-細(xì)胞，活化的天然殺傷(NK)細(xì)胞，NKT-細(xì)胞，CD4CD25調(diào)節(jié)T-細(xì)胞上，也在活化的胸腺細(xì)胞以及皮內(nèi)淋巴細(xì)胞上。此外，CD137也在骨髓源性細(xì)胞諸如樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，以及嗜酸性細(xì)胞上表達(dá)。盡管CD137表達(dá)主要限制在免疫/炎性細(xì)胞，有報道描述其在與少數(shù)來自炎性位點(diǎn)和腫瘤的組織相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。
T細(xì)胞上的CD137的功能活性已經(jīng)充分表征。通過CD137在存在亞最佳劑量的抗CD3抗體下的信號已經(jīng)顯示誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子合成(主要是IFN-γ)，并抑制活化的細(xì)胞死亡。這些效應(yīng)已經(jīng)利用小鼠和人T-細(xì)胞觀察到(W.Shuford等，J.Exp.Med.，186(1)47-55(1997)；D.Vinay等，Semin.Immunol.，10(6)481-9(1998)；D.Laderach等，Int.Immunol.，14(10)1155-67(2002))。在人和小鼠中，共刺激改進(jìn)效應(yīng)物功能，諸如IFN-γ生成和細(xì)胞毒，者通過提高抗原特異性和效應(yīng)CD8+T-細(xì)胞的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)。在缺乏抗-CD3信號的情況下，通過CD137的刺激不改變T細(xì)胞功能，表明CD137是共刺激分子。
CD137刺激T細(xì)胞以后的觀察到的生理事件是由具有不同生理功能的NF-κB和PI3K/ERK1/2信號介導(dǎo)的。NF-κB信號激發(fā)Bcl-XL這種抗凋亡分子的表達(dá)，由此導(dǎo)致存活率提高，而PI3K和ERK1/2信號具體負(fù)責(zé)CD137-介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)展(H.Lee等，J.Immunol.，169(9)4882-8(2002))。CD137活化對活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抑制作用在體外通過Hurtado等(J.Hurtado等，J.Immunol.，158(6)2600-9(1997))顯示，并且也在體內(nèi)系統(tǒng)中，其中抗CD137單克隆(mab)顯示通過防止克隆缺失產(chǎn)生超抗原活化的CD8+T-細(xì)胞的長期存活(C.Takahashi等，J.Immunol.，1625037(1999))。隨后，兩個報告顯示，在不同試驗(yàn)條件下，CD137信號調(diào)節(jié)CD8+T-細(xì)胞的克隆擴(kuò)增和存活(D.Cooper等，Eur.J.Immunol.，32(2)521-9(2002)；M.Maus等，Nat.Biotechnol.，20143(2002))。共刺激后觀察到降低的凋亡與CD8+T-細(xì)胞中增加的Bcl-XL水平相關(guān)，而Bcl-2表達(dá)不變。抗凋亡基因Bcl-xL和bfl-1經(jīng)由4-1BB上調(diào)顯示由NF-κB活化介導(dǎo)，這是由于PDTC這種NF-κB-特異性阻斷物抑制4-1BB-介導(dǎo)的Bcl-xL上調(diào)(H.Lee等，J.Immunol.，169(9)4882-8(2002))。另一方面，活化的T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增顯示由細(xì)胞周期蛋白D2，D3，和E的表達(dá)增加以及p27kip1蛋白的下調(diào)介導(dǎo)。該效果以IL-2依賴的和非依賴的方式出現(xiàn)(H.Lee等，J.Immunol.，169(9)4882-8(2002))。
總而言之，CD137刺激導(dǎo)致新激發(fā)的CD8+T-細(xì)胞擴(kuò)增、存活和效應(yīng)功能增強(qiáng)，部分直接作用于這些細(xì)胞。CD4+和CD8+T-細(xì)胞已經(jīng)顯示對CD137刺激反應(yīng)，但顯示T細(xì)胞功能的增強(qiáng)在CD8+細(xì)胞中更高(W.Shuford等，J.Exp.Med.，186(1)47-55(1997)；I.Gramaglia等，Eur.J.Immunol.，30(2)392-402(2000)；C.Takahashi等，J.Immunol.，1625037(1999))?；贑D137刺激在CD8+T-細(xì)胞功能和存活的重要作用，CD137/CD137L系統(tǒng)的操作提供治療腫瘤和病毒抗原的似乎合理的方法。
最近，CD137在新鮮分離的樹突細(xì)胞(DC)上的構(gòu)成型表達(dá)在小鼠(R.Wilcox等，J.Immunol.，169(8)4230-6(2002)；T.Futagawa等，Int.Immunol.，14(3)275-86(2002))和人(S.Pauly等，J.Leukoc.Biol.72(1)35-42(2002))中證實(shí)。這些報道顯示刺激DC上的CD137導(dǎo)致IL-6和IL-12的分泌，并且更重要的是，其增強(qiáng)了DC刺激T細(xì)胞對同種異體抗原發(fā)生反應(yīng)的能力。此外，Pan等證實(shí)DC中的CD137信號導(dǎo)致MHC I類分子和共刺激分子上調(diào)，并使得DC浸潤腫瘤的能力增強(qiáng)(P.Pan等，J.Immunol.，172(8)4779-89(2004))。因此，DC上的CD137共刺激似乎是DC增殖、成熟和遷移的新途徑。
活化的天然殺傷(NK)細(xì)胞在用細(xì)胞因子刺激后表達(dá)CD137(I.Melero等，Cell Immunol.，190(2)167-72(1998)；R.Wilcox等，J.Immunol.，169(8)4230-6(2002))。數(shù)篇報道證實(shí)NK細(xì)胞對于由激動性CD137抗體誘導(dǎo)的抗腫瘤自身免疫而言是重要的((I.Melero等，Cell Immunol.，190(2)167-72(1998)；R.Miller等，J.Immunol.，169(4)1792-800(2002)；R.Wilcox等，J.Immunol.，169(8)4230-6(2002))。NK細(xì)胞的耗竭明顯降低抗-CD137 mabs的抗腫瘤活性。CD137在NK細(xì)胞上的連接誘導(dǎo)增殖和IFN-γ分泌，但不影響它們的細(xì)胞溶解活性。明顯地，在體外，CD137刺激的NK細(xì)胞表現(xiàn)對于CD8+細(xì)胞溶解型T-細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)或“輔助物”活性導(dǎo)致活化的T-細(xì)胞的擴(kuò)增。因此，NK細(xì)胞上的CD137信號可調(diào)節(jié)對腫瘤的內(nèi)在免疫力。
對于CD137刺激描述了可能的效果，其中激動性CD137抗體可在靈長類中和小鼠模型中誘導(dǎo)對T細(xì)胞抗原的體液反應(yīng)的抑制(H.Hong等，J.Immunother.，23(6)613-21(2000)；R.Mittler等，J.Exp.Med.，190(10)1535-40(1999))。明顯地，CD137激動性抗體顯示導(dǎo)致與抗體依賴性自身免疫疾病諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和試驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎相關(guān)癥狀的明顯緩解(J.Foell等，N.Y.Acad.Sci.，987230-5(2003)；Y.Sun等，Nat.Med.，8(12)1405-13(2002))。最近，Seo等證實(shí)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中，利用激動性抗-CD137抗體的治療防止了疾病的發(fā)生，并明顯阻斷了疾病的進(jìn)展(S.K.Seo等，Nat.Med.10；1099-94(2004))。導(dǎo)致該效果的機(jī)制沒有很好確定，但在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中，顯示利用CD137激動性抗體的治療導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-γ的CD11C-CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。IFN-γ反過來刺激樹突細(xì)胞產(chǎn)生吲哚胺(indolamine)-2，3-雙加氧酶(IDO)，其顯示免疫抑制活性。已經(jīng)推定抗原-活化的CD4+T-細(xì)胞上的CD137信號導(dǎo)致IFN-γ分泌的誘導(dǎo)，其活化巨噬細(xì)胞?；罨木奘杉?xì)胞可反過來產(chǎn)生B細(xì)胞死亡信號。通過CD4+T-細(xì)胞上的CD137的連續(xù)信號可隨后誘導(dǎo)這些CD4+活化的T-細(xì)胞的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，通過消除抗原活化的T-細(xì)胞和B細(xì)胞，觀察到降低的抗體反應(yīng)，由此觀察到Th2-介導(dǎo)的炎性疾病明顯減輕(B.Kwon等，J.Immunol.，168(11)5483-90(2002))。這些研究提示利用激動性CD137抗體治療炎癥或自身免疫病的用途，而無需誘導(dǎo)對免疫系統(tǒng)的全面抑制。
CD137的天然配體，CD137配體(CD137L)，TNF超家族的34kDa糖蛋白成員，主要在活化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)諸如B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞上檢出，并且也在鼠B-細(xì)胞淋巴瘤，活化的T-細(xì)胞，和人上皮來源的癌細(xì)胞系中檢出(R.Goodwin等，Eur.J.Immunol.，23(10)2631-41(1993)；Z.Zhou等，Immunol.Lett.，4567(1995)；H.Salih等，J.Immunol.，165(5)2903-10(2000))。人CD137L與其鼠對應(yīng)物共享36％同源性(M.Alderson等，Eur.J.Immunol.，242219-27(1994))。
除了將信號遞送給CD-137-表達(dá)型細(xì)胞，CD137與CD137L的結(jié)合啟動雙向信號，導(dǎo)致對CD137L-表達(dá)型細(xì)胞的功能效應(yīng)。Langstein等證實(shí)CD137-Ig融合蛋白與活化的單核細(xì)胞上的CD137L的結(jié)合誘導(dǎo)IL-6，IL-8，和TNF-α的產(chǎn)生，上調(diào)ICAM，并抑制IL-10，導(dǎo)致粘附增加(J.Langstein等，J.Immunol.，160(5)2488-94(1998))。此外，單核細(xì)胞的增殖顯示伴隨高比例的凋亡(J.Langstein等，J.Leukoc.Biol.，65(6)829-33(1999))。這些觀察通過Ju等(S.Ju等，Hybrid Hybridomics，22(5)333-8(2003))的研究證實(shí)，其顯示功能性抗-CD137L抗體誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞的高速率增殖。阻斷所述配體導(dǎo)致T細(xì)胞活化的抑制。此外，可溶性CD137L見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及血液惡性疾病患者的血清中(H.Salih等，J.Immunol.，167(7)4059-66(2001))。由此，CD137與CD137L的相互作用影響并導(dǎo)致對T-細(xì)胞和APC的功能效果。
T細(xì)胞功能的另一重要方面中，證實(shí)激動性抗-CD137抗體拯救(rescue)了對老年小鼠中的蛋白抗原的T細(xì)胞反應(yīng)。關(guān)于對抗原的免疫反應(yīng)的年齡相關(guān)性出現(xiàn)減少在很多文獻(xiàn)中有記載，這是已知為免疫衰老的過程(R.Miller，Science，27370-4(1996)；R.Miller，Vaccine，181654-60(2000)；F.Hakim等，Curr.Opinion Immunol.，16151-156(2004))。這種現(xiàn)象是由于細(xì)胞擴(kuò)增和細(xì)胞存活或死亡的程度之間的平衡改變導(dǎo)致的。Bansal-Pakala等檢測了該假設(shè)，次級共刺激通過CD137可用于在由于CD3或CD28的表達(dá)降低，或信號的質(zhì)量降低造成的T-細(xì)胞未接受足夠的刺激的情況下增強(qiáng)T-細(xì)胞反應(yīng)。他們的研究表明與年輕小鼠相比，老年小鼠缺乏體外回憶反應(yīng)(P.Bansal-Pakala等，J.Immunol.，169(9)5005-9(2002))。但是，用抗-CD137 mab處理的老年小鼠中，T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子反應(yīng)與在年輕小鼠中觀察到的情況相同。雖然導(dǎo)致這一效應(yīng)的具體機(jī)制不明，認(rèn)為抗凋亡分子例如Bcl-XL的表達(dá)增強(qiáng)以及促進(jìn)IL-2的體內(nèi)分泌在拯救缺陷T細(xì)胞反應(yīng)中起作用。這些研究證實(shí)了激動性抗CD137抗體拯救老年免疫受損的個體中的弱的T細(xì)胞反應(yīng)的可能性，并且對于抗CD137抗體在癌癥患者中的應(yīng)用有意義深遠(yuǎn)的啟示。
CD137靶向療法在癌癥治療中的作用通過利用激動性抗小鼠CD137單克隆抗體的小鼠體內(nèi)效力研究表明。在Melero等的文獻(xiàn)中，激動性抗-小鼠CD137抗體在P815肥大細(xì)胞瘤(mastocytoma)以及低免疫原性腫瘤模型Ag104中導(dǎo)致治愈(I.Melero等，Nat.Med.，3(6)682-5(1997))中抗-腫瘤效果需要CD4+、CD8+T-細(xì)胞和NK細(xì)胞，這是由于每種亞群的選擇性體內(nèi)耗竭導(dǎo)致抗腫瘤效應(yīng)的減少或完全缺失。多個研究者使用抗CD137抗體證實(shí)該方法對于癌癥治療的有效性(J.Kim等，Cancer Res.，61(5)2031-7(2001)；O.Martinet等，Gene Ther.，9(12)786-92(2002)；R.Miller等，J.Immunol.，169(4)1792-800(2002)；R.Wilcox等，Cancer Res.，62(15)4413-8(2002))。
為支持激動性CD137抗體的抗腫瘤效力數(shù)據(jù)，CD137L提供的信號顯示激發(fā)CTL活性和抗腫瘤反應(yīng)(M.DeBenedette等，J.Immunol.，163(9)4833-41(1999)；B.Guinn等，J.Immunol.，162(8)5003-10(1999))。數(shù)個報道證實(shí)CD137配體向小鼠肉瘤中的基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致腫瘤排斥，證實(shí)了需要共刺激來產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)(S.Mogi等，Immunology，101(4)541-7(2000)；I.Melero等，Cell Immunol.，190(2)167-72(1998)；B.Guinn等，J.Immunol.，162(8)5003-10(1999)).Salih等報道了CD137L在人癌癥和人癌細(xì)胞系中的表達(dá)(H.Salih等，J.Immunol.，165(5)2903-10(2000))，并證實(shí)了表達(dá)所述配體的腫瘤細(xì)胞能夠向T細(xì)胞遞送刺激信號，導(dǎo)致釋放IFN-γ和IL-2，該效應(yīng)與腫瘤上CD137L的水平有關(guān)。在人腫瘤中表達(dá)CD137L是否可使得這些腫瘤對于激動性CD137抗體更為敏感是未知的。
CD137L-/-小鼠已經(jīng)降低了CD137/CD137L系統(tǒng)在T細(xì)胞對病毒和腫瘤反應(yīng)中的重要性(M.DeBenedette等，J.Immunol.，163(9)4833-41(1999)；J.Tan等，J.Immunol.，164(5)2320-5(2000)；B.Kwon等，J.Immunol.，168(11)5483-90(2002))。利用CD137-和CD137L-缺陷小鼠的研究證實(shí)了CD137共刺激在移植物對宿主疾病，抗病毒溶細(xì)胞T細(xì)胞反應(yīng)中的重要性。CD137缺陷小鼠中T細(xì)胞的增殖增強(qiáng)，但細(xì)胞因子產(chǎn)生和毒性T細(xì)胞活性降低(B.Kwon等，J.Immunol.，168(11)5483-90(2002)；D.Vinay等，Immunol.Cell Biol.，81(3)176-84(2003))。最近，顯示敲除小鼠(CD137-/-)的腫瘤轉(zhuǎn)移與對照小鼠相比頻率更高(4-倍)。這些數(shù)據(jù)提示利用激動性抗-CD137抗體恢復(fù)CD137信號是增強(qiáng)對病毒抗原和癌癥的細(xì)胞免疫反應(yīng)的可行方法。
除了小鼠體內(nèi)模型中的數(shù)據(jù)(其支持CD137信號在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的參與)，在原代人腫瘤樣品中進(jìn)行的研究證實(shí)了CD137在產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞中的作用。在尤文肉瘤(Ewing sarcoma)的患者中，Zhang等顯示腫瘤內(nèi)效應(yīng)T-細(xì)胞呈現(xiàn)CD3+/CD8+/CD28-/CD137+表型。出人意料地，觀察到進(jìn)展性腫瘤生長和抗腫瘤免疫(效應(yīng)T細(xì)胞)的共存在。離體刺激研究利用患者的細(xì)胞證實(shí)腫瘤誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖且活化需要利用CD137L的共刺激。利用抗-CD3/CD137L，而非抗-CD3/抗-CD28刺激PBL導(dǎo)致溶腫瘤效應(yīng)物。這些研究提供進(jìn)一步證據(jù)，CD137介導(dǎo)的共刺激可導(dǎo)致腫瘤反應(yīng)性CTL的擴(kuò)增(H.Zhang等，癌癥Biol.Ther.，2(5)579-86(2003))。此外，CD137的表達(dá)證實(shí)肝細(xì)胞癌(HCC)中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(Y.Wan等，World J.Gastroenterol，10(2)195-9(2004))。通過RT-PCR在HCC中CD137表達(dá)的檢出率是19/19，通過免疫熒光染色的檢出率是13/19。反之，CD137在相同患者的外周單核細(xì)胞中沒有檢出。這些研究沒有意圖將臨床疾病與CD137表達(dá)相關(guān)。因此，在尤文肉瘤中和肝細(xì)胞癌進(jìn)行的研究顯示表達(dá)CD137的TIL的存在，伴隨疾病進(jìn)展。在尤文肉瘤中，證實(shí)CD137+TIL能殺死離體腫瘤細(xì)胞，提示CD137途徑在這些患者中完整，并且在腫瘤微環(huán)境中可能的抑制性因子抑制它們的功能。因此，可推定激動性CD137抗體的系統(tǒng)給藥可提供擴(kuò)增這些效應(yīng)T細(xì)胞必需的信號。
除了其在癌癥免疫力進(jìn)展中的作用，試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持了利用CD137激動性抗體治療自身免疫和病毒疾病中的用途(B.Kwon等，Exp.Mol.Med.，35(1)8-16(2003)；H.Salih等，J.Immunol.，167(7)4059-66(2001)；E.Kwon等，P.N.A.S.USA，9615074-79(1999)；J.Foell等，N.Y.Acad.Sci.，987230-5(2003)；Y.Sun等，Nat.Med.，8(12)1405-13(2002)S.K.Seo et al，Nat.Med.10；1099-94(2004))。
因此，基于4-1BB在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的作用，需要產(chǎn)生具有激動活性的抗-人4-1BB抗體，其可用于治療或預(yù)防人疾病諸如癌癥，感染疾病，和自身免疫病。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供完全人抗體，其結(jié)合人4-1BB(H4-1BB)并允許H4-1BB結(jié)合人4-1BB配體(H4-1BBL)。因此本發(fā)明涉及結(jié)合H4-1BB并不阻斷H4-1BB與H4-1BBL結(jié)合的抗體，由此允許本發(fā)明的抗體以及H4-1BBL與H4-1BB的結(jié)合。本發(fā)明還提供具有激動性活性的抗體，其中抗體與H4-1BB的結(jié)合導(dǎo)致H4-1BBL介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的增強(qiáng)和刺激。這些抗體可用作免疫增強(qiáng)物抗腫瘤或抗病毒免疫反應(yīng)的免疫增強(qiáng)物，或T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的免疫調(diào)節(jié)物。所述抗體也可用作診斷工具檢測癌癥、自身免疫或其它疾病的患者的血液或組織中的H4-1BB。
一方面，本發(fā)明提供單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特異性結(jié)合H4-1BB，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中輕鏈可變區(qū)包含如圖4所示的CDR1(互補(bǔ)決定區(qū)1)，CDR2(互補(bǔ)決定區(qū)2)，和CDR3(互補(bǔ)決定區(qū)3)，重鏈可變區(qū)包含如圖3或圖7所示的CDR1(互補(bǔ)決定區(qū)1)，CDR2(互補(bǔ)決定區(qū)2)，和CDR3(互補(bǔ)決定區(qū)3)。單克隆抗體(mab)可為，例如，IgG4抗體或IgG1抗體。
另一方面，本發(fā)明提供單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中輕鏈包含如圖4所示的可變區(qū)，重鏈包含如圖3或圖7所示的可變區(qū)。
另一方面，本發(fā)明提供單克隆抗體，其包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO6的氨基酸殘基21-236，重鏈包含SEQ ID NO3的氨基酸殘基20-467。另一方面，本發(fā)明提供單克隆抗體，其包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO6的氨基酸殘基21-236，重鏈包含SEQ ID NO9的氨基酸殘基20-470。
本發(fā)明的抗體作為疾病的免疫調(diào)節(jié)物具有廣泛的治療用途，所述疾病諸如癌癥，自身免疫病，炎性疾病，和感染疾病。
本發(fā)明還提供治療受試者中的癌癥的方法，包括給藥受試者治療有效量的本發(fā)明的抗體。一方面，該方法還包含給藥疫苗。適宜疫苗包括，例如，腫瘤細(xì)胞疫苗，DNA疫苗，GM-CSF-修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗，或加載抗原的樹突細(xì)胞疫苗。所述癌癥可為，例如，前列腺癌，黑素瘤，或上皮癌。
另一方面，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法，包含給藥本發(fā)明的抗體和SIV gag疫苗。另一方面，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法，包含給藥本發(fā)明的抗體和PSA疫苗。另一方面，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)對SIV gag疫苗的免疫反應(yīng)的方法，包含給藥本發(fā)明的抗體。另一方面，本發(fā)明提供用于增強(qiáng)對PSA疫苗的免疫反應(yīng)的方法，包含給藥本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合部分，和可藥用載體。所述藥物組合物可單獨(dú)或與其它藥劑聯(lián)用給藥，例如，治療癌癥的藥劑諸如化療劑或疫苗或其它免疫調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明還提供分離的多核苷酸，其包含選自下組的核苷酸序列(a)核苷酸，其編碼氨基酸序列SEQ ID NO3的氨基酸殘基20-467；(b)核苷酸，其編碼氨基酸序列SEQ ID NO3；(c)核苷酸，其編碼氨基酸序列SEQ IDNO6的氨基酸殘基21-236；(d)核苷酸其編碼氨基酸序列SEQ ID NO6；(e)核苷酸，其編碼氨基酸序列SEQ ID NO9的氨基酸殘基20-470；(f)核苷酸其編碼氨基酸序列SEQ ID NO9；和(g)核苷酸，其編碼氨基酸序列(a)-(f)的片段，諸如可變區(qū)，恒定區(qū)，或一或多個CDR。本發(fā)明分離的多核苷酸還包括編碼圖3的至少一個CDR，圖4的至少一個CDR，或圖7的至少一個CDR的核苷酸序列。本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQID NO1，SEQ ID NO4,或SEQ ID NO7。
本發(fā)明還提供分離的多肽，包含選自SEQ ID NO3，SEQ ID NO6，和SEQ ID NO9組成的組的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供分離的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO3的氨基酸殘基20-467，分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO6的氨基酸殘基21-236，分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO9的氨基酸殘基20-470。另一方面，本發(fā)明提供分離的多肽，其包含圖3，圖4，或圖7的至少一個CDR的氨基酸序列，或圖3，圖4，或圖7的至少可變或恒定區(qū)。
本發(fā)明還包括免疫球蛋白，其具有結(jié)合特異性H4-1BB，所述免疫球蛋白包含抗原結(jié)合區(qū)。一個方面中，所述免疫球蛋白是本發(fā)明的抗體的Fab或F(ab’)2。
本發(fā)明還包括產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分的細(xì)胞系，包括本發(fā)明的核苷酸的重組表達(dá)載體，以及通過培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的方法。
附圖簡述

圖1顯示pD17-20H4.9.h4a的質(zhì)粒圖。
圖2顯示pD16gate-20H4.9.LC的質(zhì)粒圖。
圖3(圖3A-3H)顯示質(zhì)粒pD17-20H4.9.h4a的核苷酸序列，包括編碼鏈(SEQ ID NO1)，互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO2)，和所述編碼鏈編碼的氨基酸序列(前導(dǎo)肽是SEQ ID NO3的氨基酸殘基1-19；重鏈?zhǔn)荢EQ ID NO3的氨基酸殘基20-467)。
圖4(圖4A-4F)顯示質(zhì)粒pD16gate-20H4.9.LC的核苷酸序列，包括編碼鏈(SEQ ID NO4)，互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO5)，和所述編碼鏈編碼的氨基酸序列(前導(dǎo)肽是SEQ ID NO6的氨基酸殘基1-20；輕鏈?zhǔn)荢EQ ID NO6的氨基酸殘基21-236)。
圖5顯示20H4.9-IgG1重鏈序列構(gòu)建體的示意圖。
圖6顯示20H4.9輕鏈序列構(gòu)建體的示意圖。
圖7(圖7A-7D)顯示20H4.9-IgG1重鏈構(gòu)建體的核苷酸序列和氨基酸序列，包括編碼鏈(SEQ ID NO7)，互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO8)，和所述編碼鏈編碼的氨基酸序列(前導(dǎo)肽是SEQ ID NO9的氨基酸殘基1-19；重鏈?zhǔn)荢EQ IDNO9的氨基酸殘基20-470)。
圖8(圖8A-8B)圖示獲自mab 20H4.9-IgG1與人CD137的結(jié)合的ELISA結(jié)果(圖8A)和mab 20H4.9-IgG1對CD137-CD137L相互作用的影響(圖8B)。
圖9(圖9A-9B)圖示獲自mab 20H4.9-IgG1與PMA-伊屋諾霉(ionomycin)素刺激的人或獼猴(cynomolgus monkey)細(xì)胞的結(jié)合的結(jié)果。人CEM(圖9A)或猴PBMC(圖9B)與20H4.9-IgG1或人CD137L融合蛋白一起保溫。
圖10(圖10A-10B)圖示利用抗-CD137抗體在共刺激研究中誘導(dǎo)IFN-γ所得的結(jié)果，其表示為相對于對照的pg/ml增加倍數(shù)。由于供者的背景反應(yīng)各異，數(shù)據(jù)相對于對照處理(＝1)標(biāo)準(zhǔn)化。用單獨(dú)的抗-CD3刺激從人T-細(xì)胞(圖10A)或猴PBMC(圖10B)的中值IFN-γ基線水平分別為592pg/ml和505pg/ml。
圖11提供mab 20H4.9-IgG4和mab 20H4.9-IgG1與人CD137結(jié)合的胞質(zhì)團(tuán)共振繪圖。
圖12圖示20H4.9-IgG4與PMA伊屋諾霉素刺激的人CEM細(xì)胞的濃度依賴性結(jié)合，但不結(jié)合未經(jīng)刺激的CEM細(xì)胞。
圖13(圖13A-B)圖示利用抗-CD137抗體的共刺激研究中對IFN-γ的誘導(dǎo)。結(jié)果表示為相對于對照的pg/ml增加倍數(shù)。由于由于供者的背景反應(yīng)各異，數(shù)據(jù)相對于對照處理(＝1)標(biāo)準(zhǔn)化。用單獨(dú)的抗-CD3刺激的人T-細(xì)胞(圖13A)或猴PBMC(圖13B)的中值IFN-γ基線水平分別為592pg/ml和505pg/ml。
圖14(圖14A-14B)圖示通過mab 20H4.9-IgG4對IFN-γ合成的劑量依賴型增強(qiáng)的結(jié)果(圖14A)，以及加入交聯(lián)型抗-人IgG抗體(7μg/ml)的抗體交聯(lián)的效果(圖14B)。
圖15圖示mab 20H4.9-IgG4對T-細(xì)胞存活和細(xì)胞周期進(jìn)展的影響。人T-細(xì)胞用抗-CD3(1ug/ml)±m(xù)ab 20H4.9-IgG4在所列濃度進(jìn)行共刺激。試驗(yàn)開始6天后，收集細(xì)胞并用膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙啶染色以確定存活細(xì)胞數(shù)(Annexin V/PI陰性)，或用PE-偶聯(lián)的細(xì)胞周期蛋白D2以染色檢測處于周期中的細(xì)胞。結(jié)果表示平行檢測的mab 20H4.9-IgG4的4個組的平均值(±SD)。
圖16(圖16A-16D)顯示利用DNA疫苗±抗-人4-1BB抗體處理之后，獼猴中抗原特異性IFN-γ反應(yīng)，如利用ELISPOT測定的那樣。動物用SIV gag疫苗(第0，28，56天；圖16A)，SIV gag疫苗(第0，28，56天)和mab20H4.9-IgG4(第12，15和19天；圖16B)，或SIV gag疫苗(第0，28，56天)和hu39E3.G4(第12，15和19天；圖16C)處理。一組動物未經(jīng)處理(圖16D)。處理后各個時間，收集血液，分離PBMC并評估它們在抗原刺激存在下分泌IFN-γ的能力。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抗體及其抗原結(jié)合片段的制備和定性(包括融合蛋白包含本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合片段)，其用于治療疾病諸如癌癥，感染性疾病，炎性疾病或自身免疫病。所述癌癥可為例如，前列腺癌，黑素瘤，或上皮癌。
所述抗體能結(jié)合H4-1BB，并可對H4-1BB表現(xiàn)高親和力以及有效增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)。一方面，所述抗體誘導(dǎo)共刺激測定法中IFN-γ的生成，但是不影響H4-1BB與其相應(yīng)配體H4-1BBL的結(jié)合，且不固定補(bǔ)體。
本發(fā)明的抗體可通過本領(lǐng)域已知的方法制備。一方面，所述抗體可通過在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞諸如永生化的真核細(xì)胞諸如骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞中表達(dá)來制備本發(fā)明的抗體可單獨(dú)使用，或與其他治療劑諸如放射治療(包括輻照)，激素治療，細(xì)胞毒劑，疫苗，以及其它免疫調(diào)節(jié)劑，諸如細(xì)胞因子和生物反應(yīng)修飾物一起使用。這些藥劑具體可用于治療癌癥和免疫增殖性疾病。
一方面，本發(fā)明提供單克隆抗體(mab)20H4.9-IgG4。圖1和2分別提供pD17-20H4.9.h4a和pD16gate-20H4.9.LC的質(zhì)粒圖，所述質(zhì)?？捎糜谥苽鋗ab 20H4.9-IgG4。圖3(圖3A-3H)提供質(zhì)粒pD17-20H4.9.h4a的核苷酸序列，包括編碼鏈(SEQ ID NO1)，互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO2)，和所述編碼鏈編碼的氨基酸序列(前導(dǎo)肽是SEQ ID NO3的氨基酸殘基1-19；重鏈?zhǔn)荢EQ IDNO3的氨基酸殘基20-467)。圖4(圖4A-4F)顯示質(zhì)粒pD16gate-20H4.9.LC的核苷酸序列，包括編碼鏈(SEQ ID NO4)，互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO5)，和所述編碼鏈編碼的氨基酸序列(前導(dǎo)肽是SEQ ID NO6的氨基酸殘基1-20；輕鏈?zhǔn)荢EQ ID NO6的氨基酸殘基21-236)。
另一方面，本發(fā)明提供單克隆抗體(mab)20H4.9-IgG1。圖5圖示了mab20H4.9-IgG1的重鏈序列構(gòu)建體。圖6圖示了mab 20H4.9的輕鏈序列構(gòu)建體，用于mab 20H4.9-IgG4和20H4.9-IgG1。圖7提供圖5的重鏈序列構(gòu)建體的核苷酸序列(編碼鏈(SEQ ID NO7)和互補(bǔ)鏈(SEQ ID NO8))，以及編碼鏈編碼的氨基酸序列(前導(dǎo)肽是SEQ ID NO9的氨基酸殘基1-19；重鏈?zhǔn)荢EQ ID NO9的氨基酸殘基20-470)。mab 20H4.9-IgG1的輕鏈與mab20H4.9-IgG4的輕鏈相同。
本發(fā)明還包括具有來自SEQ ID NOS3，6，和9所示重鏈和輕鏈氨基酸序列的保守氨基酸取代的抗體，其基本上對H4-1BB結(jié)合沒有影響。保守取代通常包括一種氨基酸對另一種性質(zhì)相似的氨基酸的取代，例如下組中的取代纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸通常還包括表達(dá)控制序列，其可操作連接于多肽編碼序列，包括天然連接的和異源啟動子區(qū)。優(yōu)選，所述表達(dá)控制序列將為載體中的真核啟動子系統(tǒng)，其能轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞，但用于真核宿主的控制序列也可使用。一旦載體被摻入適宜宿主，宿主在適于高水平表達(dá)所述核苷酸序列的條件下保持，如所需那樣，然后可收集并純化輕鏈，重鏈，輕/重鏈二聚體或完整抗體，結(jié)合片段或其它免疫球蛋白形式。(見，S.Beychok，Cells of Immunoglobin Synthesis，Academic Press，N.Y.(1979))。單鏈抗體或微型抗體(融合于一或多個CH結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體)也可通過將本發(fā)明公開的編碼VL和VH區(qū)的核酸序列與編碼多肽接頭的DNA相連來制備。
原核宿主諸如大腸桿菌以及其它微生物諸如酵母可用于表達(dá)本發(fā)明的抗體。除了生物體，哺乳動物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可用于表達(dá)并制備本發(fā)明的抗體。真核細(xì)胞是優(yōu)選的，因?yàn)槟芊置谕暾庖咔虻鞍椎亩喾N適宜宿主細(xì)胞系已經(jīng)被開發(fā)，包括，例如，CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞系，COS(非洲綠猴纖維母細(xì)胞細(xì)胞系)細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞系，和雜交瘤。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，諸如啟動子或增強(qiáng)子和必要的加工信息位點(diǎn)，諸如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA剪接位點(diǎn)，多聚腺苷酸位點(diǎn)，和轉(zhuǎn)錄終止序列，所有均為本領(lǐng)域已知的。
含有目的DNA片段的載體(例如，重鏈和/或輕鏈編碼序列和表達(dá)控制序列)可通過已知方法轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，其有賴于細(xì)胞宿主的類型。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染常用于真核細(xì)胞，而磷酸鈣處理，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔可用于其它細(xì)胞宿主。(見，例如，T.Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1982))。
一旦表達(dá)，抗體，它們的二聚體，單個輕和重鏈，或其它免疫球蛋白形式，可根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法純化，諸如硫酸銨沉淀，親和柱，柱層析，凝膠電泳等。均質(zhì)度至少90-95％的基本純的免疫球蛋白是所需的，均質(zhì)度98-99％或更高的是更合意的。
本發(fā)明的抗體可用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。通常適于治療的疾病狀態(tài)包括癌癥，感染疾病，炎性疾病，和自身免疫病諸如多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和重癥肌無力。
本發(fā)明還提供藥物組合物包含本發(fā)明的至少一種抗體和可藥用載體.所述藥物組合物可通過本領(lǐng)域已知常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌。所述藥物組合物也可含有可藥用輔助物質(zhì)，這是適宜生理?xiàng)l件所需的，諸如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，穩(wěn)定性提高劑諸如甘露醇或吐溫(tween)80，毒性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣或人血清白蛋白。
本發(fā)明的抗體和藥物組合物具體可用于胃腸外給藥，包括經(jīng)皮下，肌內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥。胃腸外給藥的藥物組合物可包括溶于可接受載體優(yōu)選水性載體的抗體溶液。多種水性載體可使用，均為本領(lǐng)域已知，例如水，緩沖的水，鹽水，甘氨酸等。這些溶液是無菌的通常沒有顆粒物質(zhì)。尤其有利地是配制單位劑量形式的胃腸外組合物用于易化給藥和試劑的均一性。
所述藥物組合物可進(jìn)一步包括其它藥劑用于治療疾病。一方面，所述藥物組合物包括用于治療癌癥，感染性疾病，炎性疾病和自身免疫病的藥劑。本發(fā)明的抗體也可共給藥或與另一種用于治療疾病的藥劑分別給藥。
本發(fā)明的抗體可與其它藥劑一同給藥以增強(qiáng)患者中對癌性細(xì)胞的免疫反應(yīng)。一方面，所述抗體與免疫原性藥劑，諸如癌性細(xì)胞，純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白，肽和碳水化合物分子)，或用編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和細(xì)胞表面抗原聯(lián)用。另一方面，所述抗體與疫苗諸如腫瘤細(xì)胞疫苗，DNA疫苗，基因-修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗，諸如GM-CSF-修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗，肽疫苗，或加載抗原的樹突細(xì)胞疫苗聯(lián)用。
許多針對腫瘤進(jìn)行接種的試驗(yàn)策略已經(jīng)被研發(fā)。在這些策略之一當(dāng)中，疫苗利用自體或同種異基因腫瘤細(xì)胞制備。這些細(xì)胞疫苗已經(jīng)顯示當(dāng)腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)GM-CSF時最為有效。GM-CSF顯示是腫瘤接種的抗原呈遞的有效活化物(Dranoff等，P.N.A.S.，903539-43(1993)；E.Jafee等，J.Clin.Oncol.，19145-56(2001)；R.Salgia等，J.Clin.Oncol.，21624-30(2003))。
各種腫瘤中基因表達(dá)和大規(guī)?；虮磉_(dá)模式的研究導(dǎo)致定義所謂的腫瘤特異性抗原(S.Rosenberg，Immunity 10281-7(1999))。許多情況中，這些腫瘤特異性抗原是在腫瘤中和產(chǎn)生腫瘤的細(xì)胞中表達(dá)的不同抗原，例如黑色素細(xì)胞抗原gp 100，MAGE抗原，Trp-2。這些抗原中有許多是宿主中的腫瘤特異性T細(xì)胞的靶。本發(fā)明的抗體可與多種在腫瘤中表達(dá)的重組蛋白和/或肽聯(lián)用以擴(kuò)增并指導(dǎo)對這些抗原的Th1免疫反應(yīng)。這些蛋白通常作為自體抗原通過免疫系統(tǒng)觀察到并由此對其耐受。
本發(fā)明一方面，所述抗體與免疫調(diào)節(jié)劑包含SIV gag抗原(作為模型HIV DNA疫苗)或前列腺特異性抗原(PSA)，或包含編碼SIV gag抗原或前列腺特異性抗原(PSA)的核苷酸序列的DNA疫苗聯(lián)用。PSA疫苗描述于例如，M.Pavlenko等，Br.J.Cancer，91(4)688-94(2004)；J.Wolchok等，Semin.Oncol.，30(5)659-66(2003)；J.Kim等，Clin.Cancer Res.，7(3Suppl.)882s-889s(2001)。SIV gag疫描述于，例如，B.Makitalo等，J.Gen.Virol.，85(Pt8)2407-19(2004)；N.Letvin等，J.Virol.，78(14)7490-7(2004)；S.Mossman等，AIDS Res.Hum.Retroviruses.，20(4)425-34(2004)；F.Bertley等，J.Immunol.，172(6)3745-57(2004)；L.Patterson等，J.Virol.，78(5)2212-21(2004)；E.O′Neill等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，19(10)883-90(2003)；Z.Bu等，Virology，309(2)272-81(2003)。
腫瘤抗原可包括，例如蛋白端粒酶，其是合成染色體端粒酶所需的，并在超過85％的人癌癥和僅僅有限數(shù)目的軀體組織中表達(dá)(N.Kim等，Science，266，2011-2013(1994))。腫瘤抗原也為癌細(xì)胞中表達(dá)的″neo-抗原″，其原因是改變蛋白序列和產(chǎn)生兩種無關(guān)序列之間的融合蛋白的體細(xì)胞突變或來自B細(xì)胞腫瘤的獨(dú)特型。其它腫瘤疫苗也可包括來自與人癌癥有關(guān)的病毒的蛋白質(zhì)，諸如人乳頭瘤病毒(HPV)，肝炎病毒(HBV和HCV)，和卡波奇皰疹肉瘤病毒(Kaposi′s Herpes Sarcoma Virus)(KHSV)?？膳c本發(fā)明的抗體一起使用的另一種形式的腫瘤特異性抗原是分離自腫瘤組織本身的純化的熱休克蛋白(HSP)。這些熱休克蛋白含有來自腫瘤細(xì)胞的蛋白的片段且這些HSP可高效遞送到抗原呈遞細(xì)胞以激發(fā)腫瘤免疫(R.Suot等，Science 2691585-1588(1995)；Y.Tamura等，Science 278117-120(1997))。
本發(fā)明的抗體也可用于增強(qiáng)疫苗對病毒抗原的免疫反應(yīng)，所述病毒抗原諸如HIV或HCV。本發(fā)明的抗體也可用于增強(qiáng)對其它免疫調(diào)節(jié)劑的免疫反應(yīng)，以及激發(fā)記憶性免疫反應(yīng)。這些藥劑的實(shí)例是細(xì)胞因子諸如GM-CSF，IL-2，IL-15，IL-12，F(xiàn)13配體，CD40配體，佐劑諸如CpG-寡聚脫氧核糖核苷酸(細(xì)菌DNA)，或抗OX-40或CTLA-4抗體。
本發(fā)明的藥物組合物可給藥用于預(yù)防性和/或治病性治療。在治病性應(yīng)用中，所述藥物組合物以足以治愈或至少部分阻滯或治療疾病的量給予已經(jīng)患有疾病的患者。適宜實(shí)現(xiàn)這一結(jié)果的量定義為“治療有效量”。這種用途的有效量將有賴于疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和患者(包括，例如，疾病自身免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài))，并可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。具體的應(yīng)用中，將所述藥物組合物給予并非已經(jīng)處于疾病狀態(tài)中的患者，以增強(qiáng)患者對疾病狀態(tài)的抵抗力。所述量定義為“預(yù)防有效量”。在這種用途中，精確的量有賴于患者的健康狀態(tài)(包括，例如，患者自身免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài))，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。一方面，所述預(yù)防應(yīng)用是用于防止腫瘤復(fù)發(fā)。
實(shí)施例實(shí)施例1抗體的制備材料和方法人CD137(4-1BB)受體的完全人單克隆抗體在HuMAb-Mouse中產(chǎn)生(Medarex，Inc.，Princeton，New Jersey)。HuMAb小鼠經(jīng)腹腔(i.p.)和皮下(s.c.)用RIBI佐劑(Ribi Immunochemical)中的25μg人CD137細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域免疫5次。輸注前，小鼠經(jīng)靜脈內(nèi)(i.v.)用相同量的抗原強(qiáng)化。來自具有適當(dāng)抗huCD137抗體滴度的經(jīng)免疫小鼠的脾細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法融合于小鼠骨髓瘤細(xì)胞。
抗-人CD3 mab(可隆HIT3a)，用于人和猴IFN-γ的ELISA試劑盒，細(xì)胞測定法珠陣列(cytometric bead array)(CBA)試劑盒，和所有偶聯(lián)用于流式細(xì)胞術(shù)的抗體購自BD Pharmingen(San Diego，California)。人IgG1和人IgG1κ購自Sigma-Aldrich(St.Louis，Missouri)。CEM細(xì)胞(ATCC-CRL 2265)購自ATCC，培養(yǎng)基(RPMI)，胎牛血清(FBS)購自Mediatech Inc.(Herndon，Virginia)。綿羊紅細(xì)胞Alsevers購自Colorado Serum Co.(Denver，Colorado)。
雜交瘤篩選通過ELISA檢測與huCD137的結(jié)合為鑒定分泌抗-人CD137抗體的雜交瘤，用1μg/ml人CD137-小鼠IgG2b融合蛋白PBS溶液在4℃包被ELISA板(Nunc MaxiSorp)過夜。該板隨后用含有0.01％吐溫-80(PBS-T)的PBS洗滌三次，然后用PBS-T加1％牛血清白蛋白(BSA)在室溫封閉20min。將在PBS-T中稀釋的50微升上清加入板在環(huán)境溫度保溫1-2小時。然后如前述洗滌板，抗體的結(jié)合通過與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊F(ab’)2抗-人IgG抗體(Jackson Laboratories，West Grove，Pennsylvania)保溫檢測。板用pNPP顯色并在405nm讀板。
封閉試驗(yàn)通過ELISA評估識別huCD137的26種分泌抗體的雜交瘤允許CD137-CD137L反應(yīng)的能力。這些分析最初在ELISA模式中進(jìn)行。板用人CD137-muIgG2b、0.2μg/ml，100μl/孔包被。將mab 20H4.9-IgG1，或?qū)φ湛贵w，在PBS-T中的連續(xù)稀釋液以及1％牛血清白蛋白被加入板。將CD137L-CD8融合蛋白以濃度0.2μg/ml加入板?？贵w的結(jié)合利用生物素化的抗-CD8抗體(0.2μg/ml，Ancell Corporation，Bayport，Minnesota)檢測。洗滌數(shù)次后，加入鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶(1∶2000)和pNPP用于檢測結(jié)合的抗體，在405nm讀板。
為證實(shí)所選抗體不改變CD137-CD137L結(jié)合，純化的抗體隨后通過BIAcore分析定性。所有試驗(yàn)均在BIAcore 3000裝置(BIAcore Inc.，Piscataway，New Jersey)上進(jìn)行。人CD137以高密度共價固定在BIAcore傳感芯片(sensorchip)(BIAcore Inc.，Piscataway，New Jersey)的羧基-甲基化的葡聚糖表面。注射以2μg/mL在10mM乙酸鹽緩沖液，pH 5.0中進(jìn)行。未占據(jù)的活性酯隨后通過諸如過量乙醇胺封閉。表面的再生利用10mM甘氨酸，pH 2.0進(jìn)行。
純化的抗-CD137抗體樣品利用HEPES緩沖的鹽水，pH 7.4稀釋到濃度200-1000nM，所述鹽水中補(bǔ)充了0.15M NaCl和0.005％表面活性劑P20(HBS-EP)。人CD137L-CD8融合蛋白(huCD137L)用作CD137配體的來源。進(jìn)行試驗(yàn)，其中huCD137L在抗-CD137抗體之前注入或反之。注射可以流速5μL/min進(jìn)行。結(jié)合的配體和抗體通過利用10mM甘氨酸緩沖液，pH 2.0再生來去除。
人T-細(xì)胞純化T-細(xì)胞或PBMC獲自健康人供體。血液收集在EDTA中，懸浮于淘洗緩沖液(RPMI，其中含有2.5mM EDTA，10μg/ml多粘菌素B)，下層是淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)(Lymphocyte Separation Medium)(LSM，Mediatech Inc.，Herndon，Virginia)，1800rpm離心25分鐘。收集細(xì)胞界面，1500rpm離心10分鐘。隨后，將細(xì)胞碎片重懸于淘洗緩沖液并洗滌綿羊紅細(xì)胞(SRBC，1∶10稀釋度)，在冰上保溫1小時。細(xì)胞隨后置于LSM上，2500rpm離心25分鐘。去除界面并用SRBC裂解緩沖液裂解SRBC。洗滌分離的T-細(xì)胞并重懸于10％FBS/RPMI中。
流式細(xì)胞分析抗-人CD137抗體與細(xì)胞上表達(dá)的CD137的結(jié)合通過流式細(xì)胞術(shù)測定。人T-細(xì)胞白血病細(xì)胞系(CEM)或獼猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)用于這些研究。這些細(xì)胞不構(gòu)成型表達(dá)CD137，但受體可通過用佛波醇肉豆蔻酸鹽(酯)(PMA，10ng/ml)和伊屋諾霉素(1μM)刺激18hr來誘導(dǎo)。隨后洗滌細(xì)胞并用各種濃度抗體在各種染色緩沖液(磷酸鹽緩沖的鹽水，PBS，加1％FCS，和0.01％疊氮化鈉)中保溫?？贵w與刺激的或未刺激的細(xì)胞的結(jié)合通過螢光素(FITC)或phycoerithrin(PE)偶聯(lián)的山羊抗-人IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania)檢測。為證買CD137的表達(dá)，使用CD137配體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和小鼠CD8組成的融合蛋白(AncellCorporation，Bayport，Minnesota)，然后與PE-偶聯(lián)的抗-小鼠CD8(BDPharmingen，San Diego，California)保溫。樣品在1％福爾馬林中固定，保存在4℃，通過流式細(xì)胞術(shù)讀數(shù)。
功能測定法獲自健康供體的原代人T-細(xì)胞或猴PBMC用未固定的抗-CD3抗體刺激以提供T細(xì)胞活化的第一信號，并用人抗-人CD137抗體共刺激。作為非特異性對照，人源化抗癌抗體(BR96)以相同的抗體濃度使用。板用抗-CD3抗體(0.5-1μg/ml)在4℃保溫過夜。第二天，T-細(xì)胞或PBMC以1-1.5×105/孔的濃度鋪板。37℃培養(yǎng)72小時后，IFN-γ的合成通過細(xì)胞計數(shù)珠陣列(CBA)或ELISA測定。
細(xì)胞因子測定ELISA在各個時間刺激T-細(xì)胞后，離心板并去除培養(yǎng)基。細(xì)胞因子水平通過ELISA根據(jù)生產(chǎn)商說明(BD Pharmingen，San Diego，California)檢測。簡而言之，加入受試樣品和標(biāo)準(zhǔn)品到抗細(xì)胞因子包被的96孔板中。在環(huán)境溫度保溫2小時后，在PBS-T中洗板3次，然后首先與工作檢測抗體保溫然后加入底物。405nm讀取吸光度，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。
細(xì)胞計數(shù)珠測定法用于測定體外細(xì)胞因子生成的方法是流式細(xì)胞術(shù)，其利用BD Pharmingen的細(xì)胞珠陣列(CBA)。IFN-γ，IL-2，IL-5，IL-4，IL-10，和TNF-α水平在培養(yǎng)上清中根據(jù)生產(chǎn)商說明測定。結(jié)果在流式細(xì)胞術(shù)中利用CBA分析軟件分析。
結(jié)果與人CD137結(jié)合的雜交瘤分泌型抗體進(jìn)一步擴(kuò)增并亞克隆。分泌的抗體被純化并檢測其結(jié)合huCD137和允許CD137-CD137L相互作用的能力。在評估的抗-人CD137抗體組中，選擇mab 20H4.9-IgG1以基于其結(jié)合圖譜和非結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步評估。20H4.9-IgG1抗體是IgG1 kappa，如通過ELISA利用堿性磷酸酶抗-人IgG1，2，3，4，和抗-kappa以及l(fā)ambda試劑(Southern Biotech，Birmingham，Alabama)測定的。圖8(圖8A-ELISA測定的與人CD137的結(jié)合；圖8B-mab 20H4.9-IgG1對CD137-CD137L相互作用的影響)提供對mab 20H4.9-IgG1的初步定性。評估m(xù)ab 20H4.9-IgG1，26G6(阻斷型抗-CD137抗體)，或破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid)(TT，陰性對照)的連續(xù)稀釋物改變CD137與CD137L結(jié)合的能力。濃度達(dá)10μg/ml的Mab20H4.9-IgG1不阻斷CD137L結(jié)合，而mab 26G6濃度＞0.37μg/ml時抑制結(jié)合。
也檢測Mab 20H4.9-IgG1對人T細(xì)胞(CEM)上表達(dá)的CD137的反應(yīng)性以及用PMA和伊屋諾霉素刺激的獼猴外周血單核細(xì)胞(PBMC)中對CD137的反應(yīng)性。以前的研究測定，CD137在T-細(xì)胞上上調(diào)，然后用PMA和伊屋諾霉素活化。對照分子為無關(guān)人IgG抗體(陰性對照)或CD137L-CD8融合蛋白(陽性對照，BD Pharmingen，San Diego，California)組成的。這些研究的結(jié)果表明mab 20H4.9-IgG1結(jié)合活化的人CEM以及來自獼猴的PBMC，與未經(jīng)刺激的細(xì)胞的結(jié)合最少。陽性細(xì)胞的類似百分比利用mab 20H4.9-IgG1或CD137L檢出。圖9提供所得結(jié)果證實(shí)mab 20H4.9-IgG1與PMA-伊屋諾霉素刺激的人或獼猴細(xì)胞的結(jié)合。人CEM(圖9A)或猴PBMC(圖9B)與20H4.9-IgG1或人CD137L融合蛋白保溫。加入次級抗體并通過流式細(xì)胞術(shù)讀取樣品。
隨后，測定mab 20H4.9-IgG1能否在共刺激測定法在存在抗-CD3刺激的條件下誘導(dǎo)IFN-γ增加，這是激動性CD137抗體所需的關(guān)鍵功能效應(yīng)。在人和猴淋巴細(xì)胞的功能研究中評估Mab 20H4.9-IgG1的共刺激活性?；诔跏紨?shù)據(jù)，濃度20ug/ml的抗-CD137抗體(過量抗體)用于這些研究中。檢測0.2-1μg/ml的抗-CD3抗體，其導(dǎo)致10-20％CD137-陽性淋巴細(xì)胞。上清中的IFN-γ濃度在培養(yǎng)72h后測定。如圖10所示，mab 20H4.9-IgG1使人和猴共刺激試驗(yàn)中的IFN-γ合成增加到明顯高于對照的水平。利用分離自8名健康人供者的T細(xì)胞的研究結(jié)果顯示，在其中的6名中，mab 20H4.9-IgG1相對于對照提高IFN-γ合成2.2-4.3-倍。另外兩名供者之一顯示1.6-倍的增加。增加的水平超過利用hu39E3.G4 PCT申請WO04/010947(包含在本文作為參考)提供的這種人源化抗-CD137抗體觀察到的結(jié)果，其顯示在8名供者中的5名中，IFN-γ增加并水平低于利用mab 20H4.9-IgG1的情況(1.5-2-倍增加)(圖10A)。在猴共刺激研究中，mab 20H4.9-IgG1也證實(shí)增強(qiáng)的功能活性導(dǎo)致IFN-γ相對于對照的明顯增加(圖10B)。在人研究中，IFN-γ的增加一致性高于利用hu39E3.G4的情況。
TNF-α合成的誘導(dǎo)超過對照水平也在人培養(yǎng)物中觀察到，但是水平比IFN-γ低得多。單獨(dú)的抗-CD3抗體誘導(dǎo)的TNF-α水平(基線)比IFN-γ基線水平低約20-50倍。Mab 20H4.9-IgG1誘導(dǎo)8名供體中的3名出現(xiàn)～2到4.7-倍的增加。hu39E3.G4(平行檢測)在此誘導(dǎo)相同供者中的～2-倍增加但水平較低。其它受試細(xì)胞因子，IL-2，IL-5，IL-10，和IL-4在每種處理的情況下沒有明顯改變。
這些研究共同證實(shí)mab 20H4.9-IgG1通過誘導(dǎo)Th1型反應(yīng)表現(xiàn)人和猴中所需的功能活性。明顯地，由于體內(nèi)抗腫瘤活性與抗-CD137抗體誘導(dǎo)IFN-γ合成的能力相關(guān)，這些結(jié)果支持了mab 20H4.9-IgG1相對于同種型轉(zhuǎn)換的選擇。
實(shí)施例2mab 20H4.9-IgG4的體外定性基于其結(jié)合動力學(xué)，不能阻斷CD137-CD137L作用，以及對人T細(xì)胞的功能作用，選擇mab 20H4.9-IgG1轉(zhuǎn)換成IgG4形式。mab 20H4.9-IgG1的IgG4形式是20H4.9-IgG4(圖示于圖3和4)。
該研究的第二階段涉及比較mab 20H4.9-IgG4和mab 20H4.9-IgG1的體外性質(zhì)。在該部分中，描述了抗體在人和猴淋巴細(xì)胞中的結(jié)合動力學(xué)性質(zhì)以及功能效應(yīng)。
結(jié)合動力學(xué)抗-人CD137抗體的動力學(xué)特性利用表面胞質(zhì)團(tuán)共振、利用BIAcore3000裝置評估。抗原，人CD137-鼠IgG2a低密度共價固定在CM5傳感芯片表面。Mab 20H4.9-IgG4和mab 20H4.9-IgG1以25-200nM的濃度注入。圖11描述mab 20H4.9-IgG1h mab 20H4.9-IgG4以100nM的注射。利用BIAevaluation software(bivalent model，global curve fit analysis)計算數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示兩種抗體的動力學(xué)參數(shù)相似(見表1)。mab 20H4.9-IgG1和mab20H4.9-IgG4的解離常數(shù)KD分別測定為11.2and 16.6nM。在相似試驗(yàn)條件下，mab 20H4.9-IgG4不結(jié)合鼠4-1BB。
表1-比較mab 20H4.9-IgG4與mab 20H4.9-IgG1的結(jié)合動力學(xué)

流式細(xì)胞分析檢測濃度范圍0.32ng/ml-5μg/ml的、生物素化的mab 20H4.9-IgG4與CEM細(xì)胞±PMA-伊屋諾霉素的結(jié)合。結(jié)合于PMA-伊屋諾霉素的Mab20H4.9-IgG4以濃度依賴的方式刺激CEM細(xì)胞。在0.2μg/ml達(dá)飽和。另一方面，如對其親本分子所示那樣，mab 20H4.9-IgG1，mab 20H4.9-IgG4不結(jié)合沒有經(jīng)PMA-伊屋諾霉素刺激的CEM細(xì)胞(圖12)。mab 20H4-.9-IgG4的濃度依賴性結(jié)合在PMA-伊屋諾霉素刺激的CEM細(xì)胞中證實(shí)(圖12)。樣品通過流式細(xì)胞術(shù)讀數(shù)。
細(xì)胞/功能測定法為證實(shí)轉(zhuǎn)換mab 20H4.9-IgG1同種型的過程不改變抗體活性，進(jìn)行體外試驗(yàn)以比較mab 20H4.9-IgG4與親本mab 20H4.9-IgG1在猴PBMC和人T-細(xì)胞中的活性。測定mab 20H4.9-IgG4對人和猴T-細(xì)胞或PBMC的影響并與其親本分子，mab 20H4.9-IgG1比較。獲自健康人供體的原代人T-細(xì)胞或猴PBMC用抗-CD3抗體(0.5μg/ml-1μg/ml)+/-抗-人CD137抗體刺激。IFN-γ的合成在37℃培養(yǎng)72小時后利用細(xì)胞計數(shù)珠陣列(cytometric beadarray)(CBA)(對人樣品)或通過ELISA(對猴樣品)測定?？贵w在共刺激試驗(yàn)中、在存在亞最佳濃度的抗-CD3抗體(1μg/ml)或Concavalin A(1μg/ml)的條件下檢測(僅僅對于供體M5170和81)。結(jié)果表達(dá)為相對于對照的pg/ml增加倍數(shù)。由于供體的背景反應(yīng)可變，數(shù)據(jù)相對于對照治療(＝1)標(biāo)準(zhǔn)化。圖13A提供人T-細(xì)胞結(jié)果，圖13B提供猴PBMC結(jié)果。如圖13A-13B所示，mab20H4.9-IgG4證實(shí)與對照相比，共刺激特性在人和猴細(xì)胞中產(chǎn)生高水平IFN-γ。IFN-γ合成水平的提高在人和猴樣品中與其親本分子的情況相比較。
隨后，評估抗體交聯(lián)對mab 20H4.9-IgG4的功能效應(yīng)的影響。顯示抗體的交聯(lián)導(dǎo)致它們產(chǎn)生信號能力的增強(qiáng)。由此，進(jìn)行試驗(yàn)以測定數(shù)批mab20H4.9-IgG4±抗-人IgG抗體的功能活性。如圖14A所示，在交聯(lián)型抗體存在下，對于所有受試組觀察到IFN-γ合成明顯增加，在濃度400ng/ml出現(xiàn)平臺。mab 20H4.9-IgG4對IFNγ合成的促進(jìn)通過加入圖14B所示的抗-人IgG交聯(lián)型抗體而進(jìn)一步增強(qiáng)。不同批次的mab 20H4.9-IgG4具有可比的細(xì)胞活性。
由此mab 20H4.9-IgG4的交聯(lián)導(dǎo)致抗體誘導(dǎo)IFN-γ合成的能力增強(qiáng)?？贵w體內(nèi)交聯(lián)可通過免疫球蛋白Fc部分的細(xì)胞受體或通過抗體二聚化出現(xiàn)。Mab 20H4.9-IgG4是IgG4同種型，其與其它IgG同種型相比，對Fc受體的親和力較低。然而，IgG4可結(jié)合單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上表達(dá)的Fc RI(CD64)。
采用兩種其它方法進(jìn)一步定性mab 20H4.9-IgG4(i)對T-細(xì)胞存活的影響和(ii)對細(xì)胞周期蛋白D2表達(dá)的影響。為測定mab 20H4.9-IgG4是否激發(fā)通過CD137對人T-細(xì)胞的信號，并提供對T-細(xì)胞的共刺激信號導(dǎo)致細(xì)胞存活和擴(kuò)增，已知誘導(dǎo)IFN-γ合成的濃度的抗-CD3抗體+/-mab20H4.9-IgG4刺激的人T-細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙啶染色以檢測活細(xì)胞數(shù)(膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶陰性)，并染色細(xì)胞周期蛋白D2以檢測其對細(xì)胞進(jìn)展的影響。圖15顯示4組不同mab 20H4.9-IgG4對細(xì)胞周期蛋白D2表達(dá)和T-細(xì)胞的存活的平均結(jié)果。濃度0.4-10μg/ml的mab 20H4.9-IgG4導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)增加大約1.8-2倍，細(xì)胞周期蛋白D2-表達(dá)型T-細(xì)胞數(shù)明顯增加(2.5-3倍)。
實(shí)施例3在獼猴藥效學(xué)模型中對4-1BB抗體的體內(nèi)評估本實(shí)施例圖示mab 20H4.9-IgG4和mab hu39E3.G4增強(qiáng)DNA疫苗激發(fā)的抗原特異性免疫反應(yīng)的能力。
材料和方法試驗(yàn)動物組用于該試驗(yàn)的雌性和雄性獼猴(2.5-5.0kg)購自CharlesRiver BRF(Houston，Texas)并成對圈養(yǎng)。每只試驗(yàn)組由4只雄性和2只雌性組成，其通過體重隨機(jī)分組。試驗(yàn)分組如下組1-SIV gag和PSA DNA疫苗(2mg每只)，第0，28，56天，i.m.，加鹽水對照，i.v.，在第12，15和19天；
組2-SIV gag和PSA DNA疫苗(2mg每只)，第0，28，56天，i.m.，加mab hu39E3.G4，i.v.，在第12，15和19天；組3-SIV gag和PSA DNA疫苗(2mg每只)，第0，28，56天，i.m.，加mab 20H4.9-IgG4，i.v.，在第12，15和19天；組4-未經(jīng)治療的對照組。
免疫和抗體治療PSA和SIV gag DNA疫苗獲自David B.Weiner，Department of Pathology and Laboratory of Medicine，University ofPennsylvania。(見，Kim等，Oncogene 20，4497-4506(2001)；Muthumani等，Vaccine 21，629-637(2003).)猴子同時用PSA和SIV gag DNA構(gòu)建體(2mg/構(gòu)建體/免疫)經(jīng)肌內(nèi)途徑免疫，然后進(jìn)行間隔4周的兩次增強(qiáng)(第0，28，和56天)。初次免疫后第12天，開始用mab 20H4.9-IgG4或mab hu39E3.G4治療。首次免疫后第12，15和19天，抗體以50mg/kg i.v給藥。選擇該方案是因?yàn)槠湟种茖abhu39E3.G4的抗體反應(yīng)。
臨床和臨床病理整個研究過程中，由獸醫(yī)對所有猴子進(jìn)行身體檢查。血液學(xué)和血清化學(xué)分析的血樣在接種前以及免疫后第12，42，70，97，134，和168天收集。
免疫測定法為測定對這些治療方案誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的效果，利用酶聯(lián)免疫點(diǎn)測定法(ELISPOT)檢測抗原-特異性刺激的淋巴細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生。ELISPOT分析的血樣在接種前以及免疫后12，42，70，97，134，and 168天收集。對應(yīng)SIVgag和PSA抗原的完整序列的合成肽用于離體刺激PBMC。
結(jié)果應(yīng)答于PSA或SIV gag肽的抗原特異性IFN-γ分泌型細(xì)胞通過ELISPOT定量。圖16(圖16A-16D)分別圖示組1-4的結(jié)果。對PSA的反應(yīng)水平在所有組中非常低，表明與未經(jīng)免疫接種的動物相比，疫苗本身不誘導(dǎo)可檢測且固定的(consistent)免疫反應(yīng)。另一方面，單獨(dú)的SIV gag免疫接種在大量抗原-特異性IFN-γ分泌型細(xì)胞中隨時間增強(qiáng)(圖16A)。整個研究過程中，未經(jīng)治療的動物(未接種的)顯示100-1,000點(diǎn)/106PBMC(圖16D)。這些結(jié)果確定了對疫苗的域值反應(yīng)；代表＜1,000點(diǎn)/106PBMC的動物被認(rèn)為是無反應(yīng)者。接受疫苗的動物組中，6只猴子中有5只顯示反應(yīng)隨時間增強(qiáng)，第三次免疫后點(diǎn)的平均數(shù)目(第天70)為1,727點(diǎn)/106PBMC(SD＝242，范圍＝1,403-1,968點(diǎn)/106PBMC)。一只猴被認(rèn)為是無反應(yīng)者(620點(diǎn)/百萬PBMC)。由于在這些研究中沒有進(jìn)行MHC分型。很可能一些猴子由于MHC錯配而缺乏對疫苗的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。明顯地，在第70天，與對照動物(圖16D)相比以及與用單獨(dú)的DNA疫苗免疫的獼猴相比(圖16A)，用SIV gag加mab20H4.9-IgG4處理的6只動物中有4只表現(xiàn)明顯更高數(shù)目的IFN-γ點(diǎn)(圖16C)。mab 20H4.9-IgG4-處理的組經(jīng)過第三次免疫之后點(diǎn)的平均數(shù)目是3,465點(diǎn)/106PBMC(SD＝1,236，范圍＝2,070-4,780點(diǎn)/106PBMC)。該組中的兩只猴子對疫苗無反應(yīng)(＜800點(diǎn)/百萬PBMC)。第三次免疫(第70天)后，利用mab hu39E3.G4加DNA疫苗的治療導(dǎo)致6只動物中有6被認(rèn)為是反應(yīng)者，平均點(diǎn)數(shù)目為2,348點(diǎn)/106PBMC(SD＝588，范圍＝1,738-3,283)(圖16B)。對于該組，點(diǎn)數(shù)目的范圍與用mab 20H4.9-IgG4治療的那些獼猴相比較低。
利用20H4.9-IgG4和mab hu9E3.G4的治療被較好耐受并沒有導(dǎo)致相對于對照猴子的臨床病癥，臨床化學(xué)或血液學(xué)參數(shù)的明顯改變。
這些數(shù)據(jù)顯示mab 20H4.9-IgG4治療聯(lián)用DNA疫苗激發(fā)相對于對照或利用mab hu39E3.G4的治療而言的、針對受試抗原的特異性反應(yīng)的體內(nèi)增強(qiáng)，例如通過抗原特異性IFN-γ-分泌細(xì)胞測定的。由于這些初步研究中僅僅使用一個劑量水平的抗體和一個劑量方案，不可能誘導(dǎo)最大反應(yīng)，并需進(jìn)一步工作研究最佳條件。然而，很明顯，即使利用這些未優(yōu)化的方案，對受試抗原的細(xì)胞反應(yīng)也可增強(qiáng)利用mab 20H4.9-IgG4實(shí)現(xiàn)，提示CD137功能的調(diào)節(jié)是提高DNA疫苗的有效性的吸引人的方法。
盡管本發(fā)明通過舉例和實(shí)施例詳述，為了清楚和理解，很明顯可進(jìn)行一些改變和修飾，其包括在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
序列表<110>布里斯托爾-邁爾斯.斯奎布公司Jure-Kunkel，MariaHefta，LauraSantoro，MarcGanguly，Subinay<120>抗人4-1BB(CD137)的完全人抗體<130>10060 PCT<150>US 60/510193<151>2003-10-10<150>not yet assigned<151>2004-10-08<160>9<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>7057<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列<400>1cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc60aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt120aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta180tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg240gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga300cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt360tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg420gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc480cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg540taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat600aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac660gactcactat agggagaccc aagcttggta ccgccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc720tcctggtggc agctcccaga tgggtcctgt cccaggtgca actacagcag tggggcgcag780gactgttgaa gccttcggag accctgtccc tcacctgcgc tgtctatggt gggtccttca840gtggttacta ctggagctgg atacgccagt ccccagagaa ggggctggag tggattgggg900
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<223>人工序列<400>2gctacatgcc cggtctatat gcgcaactgt aactaataac tgatcaataa ttatcattag60ttaatgcccc agtaatcaag tatcgggtat atacctcaag gcgcaatgta ttgaatgcca120tttaccgggc ggaccgactg gcgggttgct gggggcgggt aactgcagtt attactgcat180acaagggtat cattgcggtt atccctgaaa ggtaactgca gttacccacc tgataaatgc240catttgacgg gtgaaccgtc atgtagttca catagtatac ggttcatgcg ggggataact300gcagttactg ccatttaccg ggcggaccgt aatacgggtc atgtactgga ataccctgaa360aggatgaacc gtcatgtaga tgcataatca gtagcgataa tggtaccact acgccaaaac420cgtcatgtag ttacccgcac ctatcgccaa actgagtgcc cctaaaggtt cagaggtggg480gtaactgcag ttaccctcaa acaaaaccgt ggttttagtt gccctgaaag gttttacagc540attgttgagg cggggtaact gcgtttaccc gccatccgca catgccaccc tccagatata600ttcgtctcga gagaccgatt gatctcttgg gtgacgaatg accgaatagc tttaattatg660ctgagtgata tccctctggg ttcgaaccat ggcggtactt tgtggacacc aagaaggagg720
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aagcgaaaga agggaaggaa agagcggtgc aagcggcccg gagagttttt tccctttttt2580tcgtacgtag agttaatcag tcgttggtat cagggcgggg attgaggcgg gtagggcggg2640gattgaggcg ggtcaaggcg ggtaagaggc ggggtaccga ctgattaaaa aaaataaata2700cgtctccggc tccggcggag ccggagactc gataaggtct tcatcactcc tccgaaaaaa2760cctccggatc cgaaaacgtt tttcgaacct gtcgagtccc gacgctaaag cgcggtttga2820actgccgtta ggatcgcact tccgaccatc ctaaaatagg ggcgacggta gtaccaagct2880ggtaacttga cgtagcagcg gcacagggtt ttatacccct aaccgttctt gcctctggat2940gggaccggag gcgagtcctt gctcaagttc atgaaggttt cttactggtg ttggagaagt3000caccttccat ttgtcttaga ccactaatac ccatcctttt ggaccaagag gtaaggactc3060ttcttagctg gaaatttcct gtcttaatta tatcaagagt catctcttga gtttcttggt3120ggtgctcctc gagtaaaaga acggttttca aacctactac ggaattctga ataacttgtt3180ggccttaacc gttcatttca tctgtaccaa acctatcagc ctccgtcaag acaaatggtc3240cttcggtact tagttggtcc ggtggaatct gagaaacact gttcctagta cgtccttaaa3300ctttcactgt gcaaaaaggg tctttaacta aaccccttta tatttgaaga gggtcttatg3360ggtccgcagg agagactcca ggtcctcctt tttccgtagt tcatattcaa acttcagatg3420ctcttctttc tgattgtcct tctacgaaag ttcaagagac gaggggagga tttcgatacg3480taaaaatatt ctggtaccct gaaaacgacc gaaatctaga gaaacacttc cttggaatga3540agacaccaca ctgtattaac ctgtttgatg gatgtctcta aatttcgaga ttccatttat3600attttaaaaa ttcacatatt acacaatttg atgactaaga ttaacaaaca cataaaatct3660aaggttggat accttgacta cttaccctcg tcaccacctt acggaaatta ctccttttgg3720acaaaacgag tcttctttac ggtagatcac tactactccg atgacgactg agagttgtaa3780gatgaggagg ttttttcttc tctttccatc ttctggggtt cctgaaagga agtcttaacg3840attcaaaaaa ctcagtacga cacaaatcat tatcttgaga acgaacgaaa cgataaatgt3900ggtgtttcct ttttcgacgt gacgatatgt tcttttaata cctttttata agacattgga3960aatattcatc cgtattgtca atattagtat tgtatgacaa aaaagaatga ggtgtgtccg4020tatctcacag acgataatta ttgatacgag tttttaacac atggaaatcg aaaaattaaa4080catttcccca attattcctt ataaactaca tatcacggaa ctgatctcta gtattagtcg4140gtatggtgta aacatctcca aaatgaacga aattttttgg agggtgtgga gggggacttg4200gactttgtat tttacttacg ttaacaacaa caattgaaca aataacgtcg aatattacca4260atgtttattt cgttatcgta gtgtttaaag tgtttatttc gtaaaaaaag tgacgtaaga4320
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<223>人工序列<400>3Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys20 25 30Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe35 40 45Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro65 70 75 80Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln85 90 95Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp115 120 125Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu145 150 155 160Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Leu Gly Lys465<210>4<211>6435<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列<400>4gacggatcgg gagatctgct agcccgggtg acctgaggcg cgccggcttc gaatagccag60agtaaccttt ttttttaatt ttattttatt ttatttttga gatggagttt ggcgccgatc120tcccgatccc ctatggtcga ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca180gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc240
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<223>人工序列<400>5ctgcctagcc ctctagacga tcgggcccac tggactccgc gcggccgaag cttatcggtc60tcattggaaa aaaaaattaa aataaaataa aataaaaact ctacctcaaa ccgcggctag120agggctaggg gataccagct gagagtcatg ttagacgaga ctacggcgta tcaattcggt180catagacgag ggacgaacac acaacctcca gcgactcatc acgcgctcgt tttaaattcg240atgttgttcc gttccgaact ggctgttaac gtacttctta gacgaatccc aatccgcaaa300acgcgacgaa gcgctacatg cccggtctat atgcgcaact gtaactaata actgatcaat360aattatcatt agttaatgcc ccagtaatca agtatcgggt atatacctca aggcgcaatg420tattgaatgc catttaccgg gcggaccgac tggcgggttg ctgggggcgg gtaactgcag480ttattactgc atacaagggt atcattgcgg ttatccctga aaggtaactg cagttaccca540cctcataaat gccatttgac gggtgaaccg tcatgtagtt cacatagtat acggttcatg600cgggggataa ctgcagttac tgccatttac cgggcggacc gtaatacggg tcatgtactg660
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<223>人工序列<400>6Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser35 40 45Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser100 105 110Asn Trp Pro Pro Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn145 150 155 160Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu165 170 175Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp180 185 190Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr195 200 205Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser210 215 220Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>7<211>1413<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列<400>7atgaaacacc tgtggttctt cctcctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag60gtgcaactac agcagtgggg cgcaggactg ttgaagcctt cggagaccct gtccctcacc120tgcgctgtct atggtgggtc cttcagtggt tactactgga gctggatacg ccagtcccca180gagaaggggc tggagtggat tggggaaatc aatcatggtg gatacgtcac ctacaatccg240tccctcgaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag300ctgagctctg tgaccgccgc ggacacggct gtatattact gtgcgaggga ctatggtccg360gggaattatg actggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca420gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg480ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg540tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca600ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc660tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc720aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga780
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<223>人工序列<400>8tactttgtgg acaccaagaa ggaggaggac caccgtcgag ggtctaccca ggacagggtc60cacgttgatg tcgtcacccc gcgtcctgac aacttcggaa gcctctggga cagggagtgg120acgcgacaga taccacccag gaagtcacca atgatgacct cgacctatgc ggtcaggggt180ctcttccccg acctcaccta acccctttag ttagtaccac ctatgcagtg gatgttaggc240agggagctct cagctcagtg gtatagtcat ctgtgcaggt tcttggtcaa gagggacttc300gactcgagac actggcggcg cctgtgccga catataatga cacgctccct gataccaggc360cccttaatac tgaccatgaa gctagagacc ccggcaccgt gggaccagtg acagaggagt420cggaggtggt tcccgggtag ccagaagggg gaccgtggga ggaggttctc gtggagaccc480ccgtgtcgcc gggacccgac ggaccagttc ctgatgaagg ggcttggcca ctgccacagc540accttgagtc cgcgggactg gtcgccgcac gtgtggaagg gccgacagga tgtcaggagt600cctgagatga gggagtcgtc gcaccactgg cacgggaggt cgtcgaaccc gtgggtctgg660atgtagacgt tgcacttagt gttcgggtcg ttgtggttcc acctgttctc tcaactcggg720tttagaacac tgttttgagt gtgtacgggt ggcacgggtc gtggacttga ggacccccct780ggcagtcaga aggagaaggg gggttttggg ttcctgtggg agtactagag ggcctgggga840
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<223>人工序列<400>9Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys20 25 30Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe35 40 45Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro65 70 75 80Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln85 90 95Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr100 105 110
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu355 360 365Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn370 375 380Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile385 390 395 400Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr405 410 415Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys420 425 430Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys435 440 445Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu450 455 460Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合4-1BB的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含圖4所示的CDR1，CDR2，和CDR3；和所述重鏈可變區(qū)包含圖3所示的CDR1，CDR2，和CDR3。
2.權(quán)利要求1的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述輕鏈包含圖4所示的可變區(qū)；和所述重鏈包含圖3所示的可變區(qū)。
3.包含輕鏈和重鏈的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO6的氨基酸殘基21-236且所述重鏈包含SEQ ID NO3的氨基酸殘基20-467。
4.藥物組合物，包含權(quán)利要求1的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分；和可藥用載體。
5.藥物組合物，包含權(quán)利要求3的單克隆抗體；和可藥用載體。
6.治療受試者中的癌癥的方法，包括給予所述受試者治療有效量的權(quán)利要求1的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。
7.分離的多核苷酸，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO3的氨基酸殘基20-467的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求7的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO1。
9.分離的多核苷酸，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO6的氨基酸殘基21-236的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求9的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO4。
全文摘要
完整人抗體及其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合人4－1BB并允許人4－1BB與人4－1BB配體的結(jié)合。一方面，所述抗體是IgG4抗體。還提供用于治療受試者中的疾病的方法，包括將治療有效量的抗體給予所述受試者。
文檔編號C07K16/28GK1867585SQ200480029775
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者瑪麗亞·朱爾-孔克爾, 勞拉·J·赫夫塔, 馬克·桑托羅, 蘇比內(nèi)伊·甘古利, 愛德華·L·哈爾克 申請人:布里斯托爾-邁爾斯·斯奎布公司