專利名稱：：ErbB配體的剪接變體、其組合物及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及ErbB配體的核酸和氨基酸序列，此ErbB配體是先前已知的ErbB配體的剪接變體，還涉及包括這些序列的組合物，及其在診斷、治療和預防ErbB受體介導疾病和受體介導紊亂中的用途。
背景技術：
：通常在由特定激活配體激活時，受體酪氨酸激酶在機體細胞間信號傳導起重要作用。1-型酪氨酸激酶受體，也稱為ErbB/HER蛋白，包括這樣一個以表皮生長因子(EGFR;ErbB-l)為其代表的受體酪氨酸激酶家族。迄今為止哺乳動物/人類ErbB家族由4個已知受體(ErbB-l至ErbB-4)組成。在受體結合配體二聚時，信號由其內部細胞質酪氨酸激酶催化的自身磷酸化反應轉導，并恢復下游的信號級聯(由Yarden和Sliwkowski于2001綜述)。ErbB配體ErbB受體由大量配體激活。人類的這個配體家族由至少ll個獨立基因編碼，它們的剪接變體包括神經調節(jié)蛋白(NRG-l、NRG-2、NRG-3&NRG-4)、表皮生長因子(EGF)、TGF-a、卩纖維素、雙調蛋白(Amphiregulin)、肝素-EGF復合體(HB-EGF)、表皮調節(jié)素(Epiregulin)和Epigen(綜述于Harari等人1999;Harris等人2003)。這些配體都具有一個它們優(yōu)先結合的選擇性受體鐠系，各帶有其自己的差異性結合親和力的陣列。通常但并非僅僅是，神經調節(jié)蛋白優(yōu)先結合ErbB3和/或ErbB4，而其余的配體優(yōu)先結合ErbBl。配體一結合，受體的同型二聚體與異型二聚體得到特定的補充。與未知配體結合的ErbB2仍然可以作為異型二聚體依靠配體(ligand-dependent)的方式積極地得到補充。依賴于激活配體，大多數同型二聚體與異型二聚體ErbB的結合可以由其結合的配體決定，從而從這4種受體得到一個多元的下游信號網絡。然而，對不同ErbB受體的二聚化配體的選擇并非任意的。不同ErbB受體在體內的空間和時間表達通常不重疊，從而縮小了表達的配體對一個所給細胞類型可以激活的受體的結合范圍(綜述于Harari等人1999;Harari和Yarden2000)。通過依靠配體的方式對不同ErbB受體復合物的信號分級優(yōu)選。其中，含有ErbB-2的結合通常是最有效的、由多個配體施加的延長信號，可能是由ErbB-2介導減速配體解離。與可能的ErbB4和ErbB-4同型二聚體形成相比，對沒有已知直接配體的ErbB-2，和缺少內部酪氨酸激酶活性的ErbB-3，同型二聚體或者不能形成，或者是無活性的。異型二聚的ErbB復合體在體內的重要性是有爭議的。例如，編碼NRG-1基因的缺陷、編碼受體ErbB-2基因的缺陷或編碼受體ErbB-4基因的缺陷的小鼠，都導致胚胎心臟的小梁不能形成，這與小梁形成需要由NRG-1激活ErbB-2/ErbB-4異二聚體的觀點一致(綜述于Harari等人1999)。ErbB配體和受體的鐠系在簡單和更多的復雜有機體之間不同。在秀麗線蟲(C.elegans)中，編碼單個ErbB配體和受體(Moghal和Sternberg2003)。在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中同樣的編碼單個ErbB受體基因，但具有4個激動物的擴大的配體家族(Vein、Gurken、Spitz和Keren)和稱為Argos的單個拮抗物(Shino2003;表1)。哺乳動物中，具有進一步擴大的編碼至少U個配體和4個受體的基因。然而，迄今為止還沒有發(fā)現哺乳動物抑制的Argos-類似ErbB配體。這些已知的ErbB配體列在表1中。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>調節(jié)ErbB配體家族的EGF域的基序(motif)的受體隨著有機體進化的分離選擇，ErbB配體都隱含一個保守基序，稱為EGF域。EGF域(包括來自無脊推動物衍生的拮抗配體Argos)對受體結合和調節(jié)是關鍵性的。大多數配體有共同的一般特性，即隱含單個EGF域和單個跨膜域。研究發(fā)現，EGF域鄰接跨膜區(qū)并且在其氨基末端側，這樣組成配體細胞外域的一部分。對大量配體，已經證明EGF域對受體結合和活化是既必需又充分的。例外地，表皮生長因子包括9個細胞外的EGF域，其中只有第9個EGF域即最接近跨膜區(qū)的，已經表現出促成受體結合(Carpenter和Cohen1990)?？缒び虬雅潴w束繂在細胞表面。細胞外域的翻譯后的蛋白質水解裂解的復雜過程需要釋放束縛的EGF域，其在很多情況下對配體活化是關鍵性的(Harris等人2003)。然而，確實存在缺乏跨膜域的天然配體，例如NRG-1的一些剪接變體的情況。此外，已經描述了帶有截短的EGF域的NRG-1的變體(heregulin-Y;NRGl-y)，盡管有報導說其可能不具有生物活性(Falls2003)。ErbB-受體-結合EGF域包含6個不變的半胱氨酸殘基，其負責形成3個二硫鍵(認為形成鍵Cysl-Cys3、Cys2-Cys4和Cys5-Cys6),表示為環(huán)A、B和C(圖1來自Harari和Yarden2000)。除了保守的半胱氨酸以外，這些配體的受體-結合的EGF域編碼許多保守和半保守的殘基，包括靠近Cys6的甘氨酸和精氨酸殘基(如其它文章定義的，圖1中的對應于Gly-40&Arg-42或Gly-39&Arg-41合成多肽的框內殘基用于分別編碼TGF-a和表皮生長因子的配體結合EGF域(Jorissen等人2003))。這些甘氨酸與精氨酸的保守性并不是一致的。這些殘基的替代式突變嚴重地危害了配體結合或功能(Campion和Niyogi1994;Groenen等人1994;Su腿erfield等人1996)。昆蟲Argos來自蒼蠅的遺傳證據證明Argos在EGFR信號傳導中作為負調控因子(Howes等人1998)。黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)配體Argos含有包含B-環(huán)的EGF域，此環(huán)比用于活化配體的環(huán)大(圖1)。盡管這不同于ErbB配體家族的其它成員，但是已經說明了ArgosEGF域直接與果蠅EGF受體結合(Jin等人2000;Vinos和Freeman2000)。據報道ArgosEGF域不僅在受體結合也在配體的拮抗功能上起重要作用。ArgosEGF域交換到激動物配體Vein中，把這個活性配體轉變?yōu)橐种苿?Schnepp等人1998)。而且，Argos阻滯分泌的Spitz與果蠅EGF受體結合，暗示抑制配體竟爭性地取代拮抗配體結合(Jin等人2000)。當發(fā)現Argos沒有直接結合EGF受體而是以高親和力結合到活性配體Spitz時，Argos結合果蠅EGFR并抑制受體功能的假設近來已經被爭論。這提出了一種完全不同的機制，其中Argos以此機制通過螯合配體，而不是通過直接Argos-EGF受體結合而抑制EGF受體信號(MarkLemmon;TheFourthDubrovnikSignalingConference,FEBS，2004年5月)?？傊?，盡管遺傳證據證明Argos作為EGF受體通路的抑制配體，它發(fā)揮其抑制功能的一般機制還在爭論中。在C-環(huán)中，黑腹杲蠅Argos含有通常存在于這個配體家族的典型的甘氨酸和精氨酸殘基(加框區(qū)域；圖1;等價于EGF的Gly39和Arg41(Groenen等人1994))。然而，在從另一個昆蟲種一家蠅(Muscadomestica)測序的Argos中，這個典型的精氨酸殘基由組氨酸取代，這證明這個殘基上的絕對保守性對于Argos功能是不需要的(Howes等人1998)。這個發(fā)現再次表示于圖2,作為3個昆蟲種的多重比對。家蠅Argos中His取代Arg的重要性不應該被低估，尤其是如果考慮到Argos結合于EGF受體的模式。EGFArg41(或TGF-a對應的Arg42)的取代突變的嵌合表示，配體-受體結合的親和力的降低超過100倍(Campion和Niyogi1994;Defeo-Jones等人1989;Engler等人1992)。以刺激性果蠅配體Spitz取代Argos的C-環(huán)，導致形成保持適度抑制活性的融合蛋白(Howes等人1998)。這些發(fā)現不提供對Argos作用的機制的理解。然而，它們提供了證據以支持Argos的C-環(huán)不可以被認為是負責(或至少完全負責)Argos的抑制功能的假定。ErbB配體已經表現出對細胞增殖的誘導和繁殖是重要的，也廣泛涉及多種生理和病理狀況下的許多其它細胞信號通路中。因此，ErbB信號通路的拮抗物和激動物都有巨大的治療潛力(由Mendelsohn和Baselga評論，2003)。上述ErbB配體和其使用方法說明不同ErbB配體可以有不同結構和功能。ErbB配體的新的剪接變體很可能具有系統或組織特異性的生理作用。因此，人們已經意識到分離和鑒定ErbB配體剪接變體是一項有意義的工作，這些變體包括截短、缺失、可選外顯子剪接或可翻譯的內含子序列，其改變調節(jié)EGF域的受體的構成、長度或功能。發(fā)明概要本發(fā)明提供了新的ErbB配體的剪接變體，包括截短變體、缺失變體、可選的外顯子使用、和內含子序列，它們各包括至少一EGF域的改變部分，其影響配體介導的ErbB受體活化。為了不局限于特定的機制或作用機理，變異EGF域可以直接通過受體結合、或非直接地通過配體螫合、或通過改變ErbB受體活化的任何其它機制影響受體活化。本發(fā)明涉及編碼這些ErbB配體新變體分離的多核苷酸，包括包含這些多核苦酸的重組DNA構建體、包含這些構建體的栽體、由它們轉化的宿主細胞、和特異地識別這種剪接變體上存在的一個或多個表位的抗體。本發(fā)明的一個目標是提供載體，包括含有本發(fā)明多核苷酸的表達載體、含有本發(fā)明多核苷酸的工程化細胞、遺傳工程改造過的表達本發(fā)明多核苷酸的細胞、以及使用這些載體以生產本發(fā)明的重組ErbB配體的剪接變體的方法。本發(fā)明另一個目的是提供包括本文所公開的新的氨基酸序列的合成肽。需要說明的是，本文公開的作為ErbB配體的新剪接變體，無論是來自保守基因組DNA序列、來自cDNA序列，或來自其它來源的，可以由任何涉及重組技術、合成肽化學方法或其任何組合的適合方法生產。本發(fā)明又一個目的是提供包含ErbB配體的新剪接變體或編碼它的多核苷酸的藥物組合物。本發(fā)明另一個目的是提供診斷和治療ErbB受體相關疾病的方法，包括向需要的患者施用一種藥物組合物，此組合物包括作為活性成分的新ErbB配體或編碼它的多核苷酸。根據一個方面，本發(fā)明提供ErbB配體剪接變體多肽和編碼它的多核苷酸。公開了已知ErbB配體的新類型和假定類型，其特征在于它們不包括EGF域的C-環(huán)。換言之，本發(fā)明的剪接變體的統一特征是它們缺少迄今已知ErbB配體的受體結合的不變6個半胱氨酸的半胱氨酸5和6,或受體調節(jié)EGF域。根據一個實施方式，本發(fā)明提供具有ErbB受體拮抗物或激動物活性的新的成熟多肽，及其片段、類似物和衍生物。一些實施實施方式，本發(fā)明的多肽來源于非哺乳動物的脊推動物。另一些實施方式，本發(fā)明的多肽來源于哺乳動物。其它實施方式，多肽來源于人類。根據一個實施方式，本發(fā)明提供一種多肽，其包括ErbB配體的剪接變體，此剪接變體是由不同的外顯子編碼的，此外顯子包括一個截短的EGF域——^:少C-環(huán)的EGF域。根據某一優(yōu)選實施方式，本發(fā)明提供ErbB配體剪接變體，其包括在SEQIDNOs:73至84中所列的任一序列。能夠理解的是，本發(fā)明包括這些序列的活性片段、缺失、嵌入、延伸，附帶條件為任何這種延伸都缺少相應已知EGF域的C-環(huán)。根據某一特定實施方式，本發(fā)明的包括截短EGF域的新剪接變體具有在SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列的任一序列。根據另一個實施方式，本發(fā)明提供編碼ErbB配體的剪接變體的多核苷酸，其包括分離的多核普酸，此多核苷酸包括在SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列的任一序列。將要理解的是，本發(fā)明包括本文所公開序列的所有活性片段、變體和類似物，他們保持所來源序列的生物活性，附帶條件為所述變體和類似物缺少EGF域的C-環(huán)。本發(fā)明也提供一種多核苦酸序列，其在嚴格條件下與編碼設定于SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列任一氨基酸序列的多核苷酸或所述多核苷酸序列的片段雜交。本發(fā)明還提供一種多核苷酸序列，其包括編碼了SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列的任一氨基酸序列的多核苦酸序列的補體，或所述多核苷酸序列的片段或變體。才艮據一些實施方式，本發(fā)明分離的多核苷酸包括一種多核苷酸，其包括SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列任一核苷酸序列，或其片段、變體以及類似物。本發(fā)明還提供SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列的任一多核香酸的互補序列，或其片段、變體和類似物。本發(fā)明的多核苷酸還包括在嚴格雜交條件下與SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列任一核苷酸序列的補體相雜交的多核苷酸。根據另一個實施方式，本發(fā)明提供一種表達載體，其至少含有公開的任一多核苷酸序列的一個片段。在另一個實施方式中，含有此多核苷酸序列的表達載體包含在宿主細胞中。本發(fā)明還提供生產本發(fā)明多肽的方法，其包括a)在適于表達多肽的條件下，培養(yǎng)含有表達載體的宿主細胞，此載體至少含有編碼ErbB配體剪接變體的多核苦酸序列的一個片段，此片段包括編碼變體EGF域的序列；及b)從此宿主細胞培養(yǎng)物中分離的多肽。根據另一個方面，本發(fā)明也提供在生物樣品中檢測編碼ErbB配體的剪接變體多核苷酸的方法，包括以下步驟a)把編碼多肽的多核苦酸序列的補體與生物樣品的核酸材料雜交，從而形成一個雜交復合體，此多肽具有SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列的任一序列；和b)檢測此雜交復合體，其中復合體的存在與生物樣品中編碼ErbB配體的變體的多核苷酸的存在相關聯。根據一個實施方式，此生物樣品的核酸材料在雜交前由聚合酶鏈式反應擴增。又一個方面，本發(fā)明提供一種藥用混合物，其包括具有SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列任一氨基酸序列的多肽，或編碼其的多核苷酸，還包括一種制藥學上可接受的稀釋劑或載體。根據另一方面，本發(fā)明提供一種純化的分子或化合物以阻止或抑制本發(fā)明的ErbB配體剪接變體的功能。抑制劑可以選自抗體、肽、模擬肽(peptidomimeric)和小的有機分子。抑制劑，優(yōu)選具有多種應用的特異性抗體，這些應用包括鑒定、純化和檢測變體的ErbB配體，尤其是任何能夠識別ErbB配體的剪接變體上存在的表位的抗體，此剪接變體缺少EGF域的C-環(huán)，即缺少包括EGF域的C-環(huán)已知對應物。根據一個實施方式，本發(fā)明提供一種純化的抗體，其結合于包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列的任一氨基酸序列的多肽、或其特定片段、類似物和變體上的至少一個表位，附帶條件為此表位應該不存在于與之對應的ErbB配體上。本發(fā)明的另一方面提供預防、治療或改善ErbB受體相關疾病或紊亂的方法，包括向需要的患者施用一種藥物組合物，其包括上文所公開的作為活性成分的ErbB配體剪接變體。根據一個實施方式，本發(fā)明提供預防、治療或改善ErbB受體相關疾病或紊亂的方法，包括向需要的患者施用一種藥物組合物，其包括作為活性成分的多肽，此多肽包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列的任一序列。才艮據另一個實施方式，本發(fā)明提供預防、治療或改善ErbB受體相關疾病或紊亂的方法，包括向需要的患者施用一種藥物組合物，其包括作為活性成分的多核苷酸，此多核苷酸編碼了包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列的任一序列的多肽。根據另一個實施方式，本發(fā)明提供預防、治療或改善ErbB受體相關疾病或紊亂的方法，包括向需要的患者施用一種藥物組合物，其包括作為活性成分的多核苷酸，此多核苷酸包括SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176所列的任一序列。根據另一個實施例，ErbB受體相關疾病或紊亂選自如下組成的組腫瘤疾病、過增殖紊亂、血管發(fā)生、再狹窄、創(chuàng)傷愈合、精神紊亂、神經學紊亂和神經損傷。由于期望至少一些具有缺少完整EGF域C-環(huán)的截短EGF域的新的ErbB剪接變體可以作為拮抗物而不是激動物，要理解的是這些變體對預防或減小配體激動物介導的任何病理學反應是有用的。這樣，可以減少或甚至消除腫瘤、過增殖、血管生成或其它反應，通過暴露于或由根據本發(fā)明的一種拮抗物治療。而且，如果激動物配體偏向于使干細胞增殖、存活、移動、進入或定向于特定語系，然后暴露于拮抗物或以拮抗物治療將可能改變譜系定型(lineagecommitment)和分化才莫式(differentiation),或定向于給定細月包鐠系之前加強增殖。根據另一些方面，本發(fā)明提供了選擇性地調節(jié)表達ErbB受體的干細胞的存活、增殖、移動或分化的方法，包括把干細胞暴露于根據本發(fā)明的ErbB配體剪接變體。優(yōu)選地，所述干細胞是神經的、心臟的或胰臟的語系，由于在本領域中已知ErbB配體涉及這些譜系的發(fā)展。根據一個實施方式，本發(fā)明提供一種選擇性地調節(jié)表達ErbB受體的干細胞的存活、增殖、移動或分化的方法，包括把干細胞暴露于根據本發(fā)明的ErbB配體剪接變體，此剪接變體包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列任一氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述千細胞選自神經的、心臟的或胰臟的干細胞謙系。才艮據另一些方面，本發(fā)明提供抑制ErbB配體剪接變體表達的方法，通過使用反義雜交、小抑制物(siRNA)或微RNA(microRNA)抑制物和核酶靶向目標，靶向于這種剪接變體的表達的轉錄物。在以下的說明、圖以及權利要求中更詳盡地解釋本發(fā)明。圖l表示對于蠕蟲(秀麗線蟲)、昆蟲(黑腹果蠅)和哺乳動物(人或鼠)的不同已知ErbB-配體鑒定，進化上保守的EGF域的多重序列比對。陰影灰色的序列表示了此比對中的不變殘基。六個半胱氨酸殘基被認為需要在所有這些已知配體的域內銜接形成三個二硫鍵。不變的甘氨酸和精氨酸殘基被認為對高親和力的配體-受體結合(框區(qū))是重要的。此多重序列比對由帶有更正的ClustalX(版本1.81)產生，使用以下方案哺乳動物序列是獨立地由ClustalX比對的(缺省參數)。對無脊推動物配體重復此步驟。然后作為獨立序型處理這些比對，其中哺乳動物序列的序型與無脊推動物序列的序型比對，再次使用ClustalX(序型模式)。所有計算都用缺省程序參數進行。圖2對于3個獨立昆蟲種黑腹果蠅、黑果蠅(Drosophilavirilis)和家蠅的所公開的Argos主要蛋白序列的多序列比對。兩個富含半胱氨酸的域定義為A1和A2，EGF域標以粗體和下劃線。區(qū)別這些域的定義已經從其它地方借鑒(Howes等人，1999)。高度保守的殘基區(qū)域表示，在Argos蛋白序列中存在關鍵的域。類似地，家蠅蛋白序列證明，在所有其它受體激動物(見圖1)的EGF域中發(fā)現的不變Arg殘基不是必要地保守在昆蟲Argos(加框區(qū)域)中。*表示不變的殘基；表示保守殘基；.表示半保守殘基。困3表示由不同哺乳動物ErbB-配體編碼的受體-調節(jié)的EGF域的多序列比對。由不同哺乳動物ErbB-配體編碼的受體-調節(jié)的EGF域的多序列比對用作輸入物，從其產生為了序列序型以便使用Compugen(主機在EMBL)Bioccelerator對各數據庫進行序型搜索。此比對由1.81版本的帶有次要的手動更正的ClustalX產生。*=不變的殘基；-保守殘基；.-半-保守殘基。圖4表示對神經調節(jié)蛋白/EGF配體家族的EGF域的編碼"外顯子A"的基因組位點的檢查。每個配體中編碼外顯子A的基因組序列從NCBI人類(或指出為鼠)基因組數據庫提取出。然后翻譯基因組序列，這包括延長序列進行到并超過5，外顯子內含子剪接聯結點，其通常區(qū)分外顯子A的末端。這個"延展外顯子A"可能地編碼一個不變的框內終止密碼子，其精確的位于對所有ErbB配體相對于EGF域的半胱氨酸4的同樣的坐標系。全長EGF域的蛋白質序列在這個圖中與延展外顯子A的翻譯序列比對。外顯子A和外顯子B是選擇性地加陰影。終止密碼子的存在由星號(*)表示。虛線(....)表示外顯子-編碼的序列延展超過這個比對。此圖中存在的蛋白序列如所示的在本文列出(SEQIDNOS:14-26和73-84)。還提編碼全長的鼠epigen的EGF域在這里給出，由于目前這種分析還不能得到人的序列。已經提供了對這兩個種的源自基因組數據的"延展外顯子A"序列。圖5證明編碼EGF域的基因而不是ErbB-配體在基因組水平表現出非均勻的內含子-外顯子結構。圖5A表示TGF-a、EGF和Notch-l的EGF域的示意圖。蛋白質TGF-a、EGF和Notch-l在它們如所示的各自的序列中包含1個、9個和36個EGF域(示意圖并非按比例的)。EGF域用框表示。EGF和TGF-a的跨膜域用垂直黑色條表示。其他無關區(qū)在此圖中忽略。負責受體活化(對EGF和TGF-a)的EGF域用帶星號(*)的陰影框表示。表皮生長因子包括另外八個EGF域，不認為它們直接活化受體。Notch-l不認為是ErbB配體，此處表示為也包含EGF域(未加陰影的框)的無關蛋白的例子。圖5B提供了對人TGF-a、EGF和Notch-l的編碼不同EGF域的基因組位點的檢查。TGF-a(i)、EGF(ii)和Notch-l(iii)的蛋白序列以blasted人類基因組數據庫(tblastn;NCBI)，以檢查這些基因的外顯子結構。這些蛋白序列的EGF域使用SMART數據庫以手動調節(jié)鑒別，這里忽略了側翼序列。比對這些域的序列(Clustalx版本1.81;標準參數)。黑色和輕的陰影表示在特定EGF域內區(qū)分外顯子-內含子邊界的基因組拓樸。每個EGF域的坐標在每種情況下提供。例如，跨越Notch-1的氨基酸24-57的第一EGF域表示為EGF—24—57。用于檢查TGF-a、EGF和Notch-1的蛋白序列和基因組序列源自NCBI分別添加[P01135，NT—022184.9]、[NP—001954.1,NT—028147.9]和[AAG33848,NT—024000.13]。在比對的域，ErbB-受體-活化EGF域的例外的例子以粗體打印并以星號(*)區(qū)分。在四十四個不直接活化的ErbB受體的EGF域(三十六個區(qū)是Notch-1的，八個區(qū)是EGF的)中，其中只有兩個(編號1和30的Notch-1EGF域)包含一個外顯子-外顯子分界，其分開半胱氨酸l-4與半胱氨酸5-6。Notch-l的第一EGF域不是完全陰影的，由于缺少在BLAST比對中發(fā)現的這個基因組序列的片段。圖6表示mEGF(l-32)和hNRG2(l-32)與固定化的卩纖維素的Biocore結合變量曲線。如所示濃度的mEGF(l-32)與hNRG2(l-32)注射到帶有固定化(3纖維素的Biacore芯片表面，所得到的傳感器曲線減去空白對照以產生所示的特異反應。結果表示，所示的兩種肽各自與卩纖維素以低親和力相互作用(RU-共振單位)。發(fā)明詳述本發(fā)明是指(i)認定為至少一種已知ErbB配體的剪接變體的新ErbB配體亞型；(ii)編碼此新剪接變體的多核苷酸序列；(iii)來自所述多核苷酸序列的寡核苷酸和寡核苷酸類似物；(v)鑒定所述剪接變體的抗體；(vi)來自所述剪接變體的肽或肽似物；(vii)藥用組合物；及(viii)采用所述多肽、肽或肽似物、所述寡核苷酸和寡核苷酸類似物、和/或所述多核苷酸序列調節(jié)至少一種ErbB受體介導的活性的方法。在構思本發(fā)明時，假定另外的、此前未知的ErbB配體可以存在。剪接變體，其在超過50%的人類基因中發(fā)生，在嘗試認定差異表達的基因時其通常被忽略，而它們的獨特序列特征包括供體-受體串聯、可選擇的外顯子、外顯子和保留的內含子，使它們的認定變得復雜。然而，剪接變體可以對理解疾病演變具有重要影響，并可以在各種病理學中作為有價值的標記。ErbB配體剪接變體可以組成ErbB-配體受體活化EGF域的邊界的準確定義是有爭論的事情。一種保守和局限的觀點是，它恰好跨越半胱氨酸1至半胱氨酸6(Cl-C6)(例如，Howes等人1998)。這個區(qū)域的甚至更小的亞域報道為微弱地結合于受體并裔導低水平的生物活性(綜述于Groenen等人1994)。一個可替換的定義是基于原配體(pro-ligand)的天然分裂方式，其中在最近的和末梢的分裂事件之后產生含有可變長度肽的EGF域(Harris等人2003)。而另一種定義依賴于具有可變長度的合成的和重組的肽的生物化學和生物活性分析，以重組"典型"配體功能。從這種分析，明顯的是需要另外的羧基和氨基末端序列側翼C1-C6以重組配體功能。"典型"功能所需的準確長度可以在配體之間有所不同，如已經在研究中基于結合和生物活性試驗的實驗證明的(Barbacci等人1995;Groenen等人1994;Jones等人1999K即使這樣，很明顯，這種定義可以依賴于進行的生物試驗而有所改變。例如，僅是基于對合成配體肽的受體-結合親和力的說明的生物試驗，可以證明限定長度的特定配體的結合很微弱。然而，已經描述了自然界中有效的促有絲分裂的低親和力配體(例如Tzahar等人1998)。這樣在這兩種生物參數中存在差異。盡管每個神經調節(jié)蛋白基因只編碼單個EGF域，NRG-1和NRG-2基因都包括剪接變體，其中EGF域的羧基-末端可以由兩個可替換的外顯子編碼(所得到的變體稱為a和卩)。這些選擇性編碼的配體具有與4種不同ErbB受體異型二聚化的不同的結合親和力和能力(由Falls綜述,2003)。產生對NRG-1和NRG-2的a和卩亞型的能力反映在基因組水平，這里EGF域的羧基末端由可選的外顯子編碼。更具體地，對NRG-1和NRG-2二者，單個外顯子編碼EGF域的氨基末端部分，其跨越Cl-C4并組成EGF域的A-環(huán)和B-環(huán)?？商鎿Q的選擇外顯子以編碼此域的其余部分，此其余部分包含這個EGF域的C5-C6和C-環(huán)(Crovello等人1998)。有趣地，ErbB配體家族的所有其它成員也具有類似的分段的外顯子域結構，其恰好編碼相鄰外顯子上受體-活化EGF域的Cl-C4和C5-C6。然而，對于除了NRG-1和NRG-2之外的所有這些配體，還沒有證據表明它們編碼EGF域的a和(3可選擇性亞型，因此在基因組水平保持這些保守的外顯子-外顯子拓樸的進化力量依然是個謎(Harris等人2003;D.Harari,BigRockSeminar,theWeizmannInstituteofScience,February5th,2001)。4呆持受體-活化EGF域的這種外顯子-外顯子結構的功能的重要性依然未解決，并且這是本發(fā)明的主要動力。目前，只認定了一個具有拮抗物活性的ErbB配體，稱為來自昆蟲的Argos配體。此ArgosEGF域對這個配體的抑制功能是必要的(Howes等人1998)。然而，Argos作用為抑制配體的機制是爭論的主題。例如，一個模型暗示，Argos直接結合昆蟲EGF受體，抑制激動物配體(諸如Spitz)的結合并抑制受體的二聚化(Jin等人2000)。然而一個替換的模型暗示，Argos直接結合激動物配體(諸如Spitz)，結合激動物不與活化受體結合(MarkLemmon;TheFourthDubrovnikSignalingConference,FEBS，2004年5月)。本發(fā)明的主要目的是鑒定具有抑制活性的另外的ErbB配體，尤其是天然存在的配體，優(yōu)選地來自脊稚動物種，更優(yōu)選地來自哺乳動物種，最優(yōu)選地來自人類。除了EGF域的重要性，果蠅(Drosophila)Argo包括兩個額外的富含半胱氨酸的區(qū)域，其已經定義為Al和A2(Howes等人1998)。來自這3個種的Argos的多序列比對證明，對于EGF域，域Al和A2以及相鄰序列是高度保守的(圖2),這支持了這些域在蛋白功能中的重要生理作用。這個多序列比對也證明了EGF域的序列和側翼羧基-末端序列的保守性(圖2)。在描述本蛋白、核苷酸序列、包括它們的組合物和它們使用方法之前，應當理解的是，本發(fā)明不限于所描述的特定的方法論、方案、細胞系、栽體和試劑，由于它們是可以改變的。還要理解的是，本文所使用的術語目的僅是描述特定實施方式，不意味著限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由附帶的權利要求限制。必須注意的是，本文和附帶的權利要求中所使用的，單數形式"一"、"一"和"此"包括復數的含意，除非上下文明確地另外指出。因此，例如，提及的"一宿主細胞"包括多個這種宿主細胞，所提及的"抗體"是指一個或多個抗體以及對本領域技術人員已知的它們的等價物，等等。除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語是本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。盡管在實踐或測試本發(fā)明時可以使用類似于或等價于本文所描述的任何方法和材料，但是現在所描述的是優(yōu)選的方法、裝置和材料。本文所提到的所有出版物都在此引用作為參考，目的是描述和公開報道于出版物中的細胞系、載體和方法學，其可以與本發(fā)明結合使用。因為在先發(fā)明，在此的描述沒有什么可解釋為承認本發(fā)明無權早于此公開。定義本文使用的ErbB配體，是指從任何種，特別是高等脊推動物，尤其是從包括牛、羊、豬、鼠、馬的哺乳動物，優(yōu)選為人的，來自任何源頭的，無論是天然的、合成的、半-合成的、或重組而得到的基本純化的ErbB配體的氨基酸序列。如本文說明書中和此后的權利要求部分中使用的短語"互補多核苷酸序列"包括使用逆轉錄酶或任何其它依賴于RNA的DNA聚合酶從信使RNA反轉錄得到的序列。然后這種序列可以使用依賴DNA的DNA聚合酶在體內或體外擴增。如在本文說明書中和隨其后的權利要求部分中使用的短語"基因組多核苷酸序列"包括來自染色體的序列，并反映染色體的鄰近部分。如在本文的說明書中和隨其后的權利要求部分中使用的短語"復合多核苷酸序列"包括至少部分互補的并至少部分是基因組的序列。復合序列可以包括編碼多肽所需的一些外顯子序列，以及介入其間的內含子序列。此內含序列可以是任何包括其它基因的源頭的，通常將包括保守的剪接信號序列。這種內含序列還可以包括順式作用表達的調節(jié)元件(regulatoryelement)。如在本文說明書中和權利要求中使用的短語"剪接變體"是指天然存在的核酸序列及其編碼的蛋白，它們是選擇性剪接(Alternativesplicing)的產物。選擇性剪接是指內含子內含物、外顯子排除、可選擇的使用外顯子或任何添加或缺失的末端序列，其導致在剪接變體序列和其它野生型序列之間的序列差異。盡管大多數選擇性剪接變體來自選擇性的使用外顯子，一些來自在RNA轉錄過程的中間階段未剪出的內含子的保留。本文使用的"等位基因"或"等位序列"是編碼ErbB配體的基因的可替換形式。等位基因可以來自核酸序列中的至少一個突變，并導致改變的mRNAs或多肽，這些mRNAs或多肽的結構或功能是可以改變或可以不改變的。任何所給的天然或重組基因可以具有無等位形式、一個等位形式、或許多等位形式。通常引起等位基因的突變歸因于核苷酸的天然缺失、附加或替代。這些類型的改變都可以單獨的、或與其它改變組合的、在所給序列中一次或多次的發(fā)生。本文所使用的編碼ErbB配體的"改變的"核酸序列包括那些帶有不同核苷酸的缺失、插入或替代的核普酸序列，其得到編碼相同的或功能上等價的ErbB配體的多核苷酸。包括在這個定義中的是多態(tài)性，其可以或不可以使用編碼特定ErbB配體的多核苷酸的特定寡核苷酸探針容易地檢測，并不適當或不期望地與等位基因雜交，其帶有一個位點，其同于編碼ErbB配體的多核苷酸序列的正常染色體位點。編碼的蛋白質也可以是"改變的"并含有氨基酸殘基的缺失、插入或替代，其產生沉默改變并導致功能上等價的ErbB配體。只要保留ErbB配體的生物學或免疫學活性，有意的氨基酸取代可以在類似的基礎上制造，此類似性在于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或兩性特性。例如，帶負電荷的氨基酸可以包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸可以包括賴氨酸和精氨酸；帶有具類似親水性值的不帶電極性頭部基團的氨基酸可以包括亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天東酰胺和谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸，以及苯丙氨酸和酪氨酸。本文所使用的"氨基酸序列，，是指寡肽、肽、多肽或蛋白質的序列，以及它們的片段，以及指天然存在的或合成的分子。優(yōu)選的ErbB配體的片段是大約二十至大約四十氨基酸的長度，并保持著完整配體的生物學活性或免疫活性。本文所述的"氨基酸序列"是指天然存在的蛋白質分子的氨基酸序列、氨基酸序列、和類似術語，這些不意味著把氨基酸序列限制在所述蛋白質分子相關的完整、天然氨基酸序列。本文所使用的"擴增"是指產生核酸序列的另外拷貝，通常使用本領域中熟知的鏈式聚合酶反應(PCR)技術進行(Dieffenbach,C.W.andG.S.Dveksler(1995)PCRPrimer,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.)。本文所使用的術語"活化的配體"或"激動物，，是指一種配體，其一旦結合就以受體依賴的方式促進ErbB信號轉導。不矛盾的是，在一定條件下，配體可以恰當的描述為既活化的又是抑制性的，依賴于描述它的背景的環(huán)境或實驗。本文可互換使用的術語"抑制性配體"或"拮抗物"，是指一種減少ErbB受體的已知配體的生物或免疫活性的效果的量或持續(xù)時間的分子。拮抗物可以由直接或間接地與ErbB受體結合而起作用。然而拮抗物可以由另一種機制另外地或單獨地起作用，其中拮抗物將直接或間接地結合一種活性ErbB配體，從而把它從受體-依賴的活化中螯合。術語"抑制物"是指一種分子或化合物，其對本發(fā)明的ErbB配體剪接變體的功能施加抑制作用。抑制物可以包括蛋白質、肽、核酸、抗體或任何其它降低變異ErbB配體效果的分子。本文所使用的術語"抗體"是指完整分子及其片段，諸如Fab、F(ab，)2、和Fv等，其能夠結合表位決定子。結合ErbB配體多肽的抗體可以使用完整多肽或含有感興趣的小肽的片段作為免疫抗原而制備。用于使動物免疫的多肽或寡肽可以來自RNA的翻譯或化學合成，且如果需要可以接合于載體蛋白。通常使用的化學偶聯于肽的載體包括牛血清白蛋白和甲狀腺球蛋白、匙孔血藍蛋白。然后偶聯的肽用于使動物(例如，小鼠、鼠、兔)免疫。本文所使用的術語"抗原決定子"，是指與特定抗體接觸的分子(即表位)的片段。當蛋白質或蛋白質的片段用于使宿主動物免疫時，蛋白質的許多區(qū)域可以誘導抗體產生，這些抗體特異地結合蛋白質上的給定區(qū)域或三維結構；這些區(qū)域或結構是指抗原決定子?？乖瓫Q定子可以與完整抗原(即，引起免疫反應的免疫原)竟爭結合抗體。本文所使用的術語"反義"，是指含有互補于特定DNA或RNA序列的核苷酸序列的任何組合物。術語"反義鏈"用于指與"有義"鏈互補的核酸鏈。反義分子包括肽、核酸，其可以由包括合成或轉錄的任何方法產生。一旦引入到細胞中，互補的核苷酸就與細胞產生的天然序列結合，以形成雙螺旋并阻滯轉錄或翻譯。命名"反向"有時用于指反義鏈，"正向，，有時用于指有義鏈。本文所使用的術語"生物活性，，，是指一種具有天然存在分子的結構的、調節(jié)的、或生物化學的功能蛋白質。類似地，"免疫活性"是指天然的、重組的、或合成的ErbB配體或其任何寡肽，在適合的動物或細胞中誘導特異性免疫反應并結合特異性抗體的能力。術語"活性片段，，是指作為最小的受體調節(jié)片段的具有缺少C-環(huán)的截短域的任何變體?；钚云慰梢远x為任何具有少于六個完整EGF域保守半胱氨酸的，并能夠擾亂至少一個ErbB受體亞型活性的片段。優(yōu)選地，術語活性片段是指任何具有少于六個完整EGF域保守半胱氨酸的，并能夠擾亂至少一個ErbB受體亞型活性的片斷，其還包括已知能增加受體結合和/或配體誘導的受體介導活性的側翼氨基酸序列的片段。本文所使用的術語"互補的"或"互補性"，是指多核苷酸在許可的鹽和溫度的條件下通過堿基配對自然結合。例如，序歹'j"A-G-T"結合于互補序歹'j"A-C-T，，.兩個單鏈分子之間的互補性可以是"部分的"，其中只有一些核酸結間的互補程度對核酸鏈之間雜交的效果和強度有重要影響。這在擴增反應中和在設計并使用肽核酸(PNA)分子時尤其重要，所述擴增反應依賴于核酸鏈之間的結合。本文所使用的"包括所給多核苷酸序列的組合物"，是寬泛地指任何含有所給多核苷酸序列的組合物。此組合物可以包括干燥制劑或含水溶液?？梢圆捎冒ň幋a本發(fā)明新的ErbB配體剪接變體的多核苷酸序列的組合物或此多核苷酸特定片段作為雜交探針。此探針可以以凍干形式保存，并與諸如碳水化合物等的穩(wěn)定劑相關聯。在雜交時，可以在水溶液中使用探針，此溶液含有鹽(例如NaCl)、去污劑(例如SDS)和其它成分(例如，Denhardt，s溶液、奶粉、鮭魚精子DNA等等)。本文所使用的"缺失"，是指在氨基酸或核苷酸序列中的改變，并導致一個或多個氨基酸殘基或核苷酸的缺失。本文使用的術語"衍生物"，是指編碼或互補于一種ErbB配體的核酸的化學修飾，或指所編碼的ErbB配體的化學修飾。這種修飾包括，例如由烷基、?；虬被〈鷼?。核酸衍生物編碼保留了天然分子的生物或免疫功能的多肽。多肽衍生物是由糖基化、聚乙二醇化(pegylation)或其它類似方法修飾的一種多肽，其保留了它所來源的多肽的生物或免疫功能。本文使用的術語"同源性"，是指基于所共享的氨基酸或核苷酸序列的序列相似性的程度。這里可以是部分同源性或完全同源性(即同一性)。對于氨基酸序列同源性，可以在不同生物信息學程序(如BLAST、FASTA、Sm他Waterman)中使用氨基酸相似性矩陣(如BLOSUM62、PAM79)。以不同矩陣或不同程序進行特定搜索時可以得到不同結果。如本領域所熟知的，核苷酸序列的同源性的程度依賴于帶有制造用于最優(yōu)化比對所需的缺口或插入的Ki的同一匹配。本文使用的術語"人源化抗體"，是指抗體分子，其中為了更加近似人類抗體，氨基酸在非抗原結合區(qū)域已經被替換，同時此抗體仍然保持原始的結合能力。本文使用的術語"雜交"是指任何通過堿基配對使一條核酸鏈與互補鏈結合的方法。本文使用的術語"插入"或"附加"，是指氨基酸或核苷酸序列的改變，與天然存在的分子相比，其分別導致添加一個或多個氨基酸殘基或核苷酸。"微陣列，，是指不同多核苷酸或寡核苷酸在基質上合成的陣列，此基質諸如紙、尼龍或其它類型膜、過濾物、芯片、玻片、或任何其它適合的固體支撐物。本文使用的術語"調節(jié)"，是指至少一個ErbB受體調節(jié)活性的活性改變。例如，調節(jié)可以導致蛋白活性、受體結合特征、配體螯合、或ErbB配體的任何其它生物的、功能的或免疫的特性的增加或降低。本文使用的"核酸序列"是指寡核苦酸、核苷酸和多核苷酸以及其片段，還指基因組或合成來源的DNA或RNA,其可能是單鏈或雙鏈的并代表有義或反義鏈。"片段，，是長度超過60核苷酸的核酸序列，最優(yōu)選地包括長度至少為IOO核苷酸的片段。術語"寡核苷酸"是指至少大約6核苷酸至大約60核苷酸的核酸序列，優(yōu)選地大約15至30核苷酸，更優(yōu)選地大約20至25核苷酸，其可以用于PCR擴增或雜交試驗、或樣i陣列。如本領域中通常定義的，本文所使用的寡核苷酸基本等價于術語"擴增引物"、"引物"、"寡聚物"、和"探針"。本文所使用的術語"肽核酸"(PNA)，是指核酸"模擬型"；分子的天然骨架由偽肽骨架(pseudopeptide)代替，只保留四個核普酸堿基。肽骨架終止于賴氨酸，其促進組合物的溶解度。PNAs可以被聚乙二醇化(pegylate)以延伸其在細胞中的壽命，在細胞中它們優(yōu)先結合互補的單鏈DNA和RNA并終止轉錄伸長(Nielsen,P.E.等人(1993)AnticancerDrugDes.8:53-63)。本文使用的術語"部分"，對于一種蛋白質(即在"所給蛋白質的部分"中)是指此蛋白的片斷。片段的尺寸可以在從5氨基酸殘基到整個氨基酸序列減去1個氨基酸的范圍內變動。因此，"包括氨基酸序列SEQIDN0:1的至少一個部分"的蛋白質包含全長的PNIN及其片段。本文使用的術語"樣品"以其最寬泛的意義使用。懷疑含有編碼ErbB配體的核酸、或其片段、或所編碼的多肽本身的生物樣品可以包括提取自細胞的體液、染色體、細胞器、或從細胞分離的膜、細胞、基因組DNA、RNA、或溶液中的或與固體支撐結合的cDNA、組織、組織印跡(print)、及類似物。本文使用的術語"特異結合，，或"特異性結合"，是指蛋白質或肽與激動物、抗體與拮抗物之間的相互作用。此相互作用依賴于由結合分子識別的蛋白質的特定結構(即，抗原決定子或表位)的存在。例如，如杲抗體是對表位"A"特異的，在含有標記的"A"和抗體的反應中，含有表位A(或自由的、未標記的A)的蛋白質的存在將減少標記的A與抗體結合的量。本文使用的術語"嚴格條件"或"嚴格性"，是指由核酸、鹽、和溫度限定的雜交的條件。這些條件是本領域中熟知的，且可以為了鑒別或檢測同樣的或相關的多核苷^列而改變。包括或低或高嚴格性的許多等價的條件依賴于一些因素，諸如序列(DNA、RNA、堿基組合物)的長度和性質、靶(DNA、RNA、堿基組合物)的性質、環(huán)境(在溶液中或是固定化到固體基質上)、鹽和其它成分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇)溫度大約20至25度的范圍之內)。可以改變一個或多個因素以產生或低或高嚴格性的條件，其不同于以上所列的條件，但等價于以上列出的條件。本文使用的術語"基本純化的"，是指從它們的天然環(huán)境移去、分離或分開的核酸或氨基酸序列，至少60%、優(yōu)選地75%、最優(yōu)選地90%不含有其天然相關的其余部分。本文使用的術語"取代"，是指一個或多個氨基酸或核苷酸分別由不同的氨基酸或核苷酸代替。本文使用的術語"轉化"，是指一個方法，外源DNA通過此方法進入受體細胞并改變受體細胞。這可以在天然條件下或者使用本領域中熟知的各種方法在人工條件下發(fā)生。轉化可以依賴于任何已知的用于把外源核酸序列插入到原核或真核宿主細胞的方法。基于要轉化的宿主細胞類型而選擇方法，方法包括但不限于，病毒感染、電穿孔、熱激、脂質轉染、粒子轟擊。這樣的"轉化"細胞包括穩(wěn)定轉化的細胞，其中插入的DNA能夠作為自主復制的質粒或作為部分宿主染色體而復制。它們還包括用于限制細胞周期時間的瞬時表達所插入的DNA或RNA的細胞。本文使用的術語ErbB配體的"變體"，是指一種氨基酸序列，其由一個或多個氨基酸改變。變體可以具有"保守的，，改變，其中取代的氨基酸具有類似的結構或化學特征，如，以異亮氨酸代替亮氨酸。更罕見地，變體可以具有"非保守的，，改變，如，以色氨酸代替甘氨酸。相似的次要改變還可以包括氨基酸缺失或插入、或兩者。用于確定哪個氨基酸殘基可以被取代、插入、或缺失，而不取消生物或免疫活性的向導，可以使用本領域中熟知的計算機程序而發(fā)現，例如DNASTAR軟件。本文和權利要求中使用的術語"剪接變體"，是指已知ErbB配體的任何變體，包括截短變體、缺失變體、可替換外顯子使用、和內含子序列，其各包括影響配體介導的ErbB受體活化的EGF域的至少一個改變的部分。特別的，術語剪接變體包括缺少相應于已知EGF域的C5-C6環(huán)的所有這樣的變體。由生物信息學方法鑒別的新的抑制配體使用序列比較的一種方法學，已經可能由生物信息學方法鑒別同源的ErbB配體激動物(如(Harari等人.1999))。然而，盡管出版了豐富的序列數據，到目前文獻中還沒有描述天然的已知哺乳動物的抑制性ErbB配體。事實上，一個初步的基于BLAST數據庫的搜索未能認定哺乳動物基因，此基因帶有的序列充分類似于易于鑒別的昆蟲類似Argos蛋白質的序列(數據未示出)。因此決定進行序列的搜索，此序列可以隱藏類似EGF域，其序型是對已知的哺乳動物ErbB配體家族成員是有些典型的。需要注意的是，由于目前所有已知哺乳動物配體都是激動物，這個搜索偏向于鑒別配體激動物。然而，如果哺乳動物ErbB拮抗物配體的EGF域是充分類似于它們的激動物相對物的域，由序列相似性搜索鑒別它們是可能的。因此從NCBI服務器恢復對不同哺乳動物配體的蛋白序列(見表5和表6)。坐標的近似鑒別由SMART服務器定義，其中展現了每個配體的受體-調節(jié)EGF域。這些域被任意地延長以提供更大范圍的氨基和羧基序列，其可以幫助鑒別新配體，并隨后使用ClustalX進行比對。對這些序列比對的次要修正由手動進行(圖3)。然后使用程序PROFILEWEIGHT(見材料與方法)進行多序列比對以產生序型。然后對EMBL站點(見材料與方法)上提供的EST數據庫進行翻譯后序型的搜索。在搜索時，EMBL站點上的EST數據庫分成5個區(qū)，每個區(qū)獨立地由TPROFILESEARH掃描。使用整體聯配(globalalignment)進行這些搜索，空位開放罰值(gapopeningpenalty)和空位拓展罰值(gapextensionpenalty)的選擇分別設在(10&1)或(12&1)，預設輸出量為每次搜索比對500個序列。沒有鑒別到具有類似于ErbB配體的EGF域典型序型的明顯的編碼的序列序型的新ESTs。由于已經觀察到，在EGF域的位點編碼所有哺乳動物ErbB配體的外顯子構造是保寺的，決定探究編碼了部分的、可替換的或截短的EGF域的可替換ErbB剪接變體可以表達的可能性。例如，已經報道了NRGl的截短形式，其編碼部分EGF域直到半胱氨酸4，隨后是終止密碼子(Falls2003)。當變體在編碼每個基因的基因組序列上下游中檢查時，剪接亞型可以更好地定義。因此決定提取編碼哺乳動物ErbB配體的共-目前(co-currently)基因組序列。為了方便，本文提供了命名以更好地描述外顯子，其通常編碼哺乳動物ErbB配體的受體-調節(jié)EGF域。編碼ErbB配體(包括Cl-C4)的EGF調節(jié)域第一部分的第一個外顯子本文描述為EGF域的"外顯子A"。編碼EGF域的第二部分(包括C5-C6)的第二個外顯子稱為EGF域的"外顯子B"。對包含EGF域的可替換的(a和P)羧基亞型的NRG1和NRG2的情況，這些在這里認為是EGF域的外顯子B(對a亞型)或外顯子B，(對P亞型)。編碼不同哺乳動物ErbB配體的基因組序列從NCBI數據庫提取(見表5和表6)。對每個基因，被鑒別和翻譯(使用Transeq)的編碼外顯子A的基因組區(qū)域包括側翼序列。觀察到令人驚訝的結果。不僅外顯子A和外顯子B的外顯子-外顯子接合點對所有哺乳動物ErbB配體是保守的，在恰好超過外顯子A范圍的通常認為是"內含子"的區(qū)域中，發(fā)現了不變的終止密碼子，并在外顯子A的框內并緊接挨其下游被編碼(圖4)。這提供了間接證據，以支持所有哺乳動物配體的可替換亞型可以存在于編碼的包含截短EGF域的蛋白質中。特別地，這種剪接變體將編碼EGF域至越過半胱氨酸4的一個氨基酸(圖4)，作為EGF域的外顯子A延伸長度的結果。類似的拓樸見于編碼其它小鼠和其它可得脊堆動物種包括例如牛和雞ErbB配體的基因，這說明對本文人類序列觀察到的結果對哺乳動物、鳥類和其它高等脊堆動物是共享的(數據未示出)。擴展的外顯子A核苷酸序列(SEQIDNOS:128-139)的4全查證明，對各配體，普通共有的方式導致翻譯產物的終止。此序列包含共有的G,TXX，這里逗號表示密碼子閱讀框，TXX表示終止密碼子。需要雙核苷酸模式"GT"以保持進化上保守的外顯子內含子剪接接合，其在此位點觀察到(Darnell等人.1986)。因此，提供了初始的假定，即保持EGF域的進化上保守的基因組拓樸是為了允許在EGF域的半胱氨酸-4之后產生截短的ErbB配體剪接變體。這種觀念的一個負向假定是，編碼哺乳動物ErbB配體受體-調節(jié)EGF域的外顯子-外顯子結構與剪接變體的形成毫無關系，而是為EGF域序列發(fā)現的通?；蚪M拓樸的結果(其原因是可以是已知或未知的)。EGF域通常由多個蛋白質編碼，其大多數部分的功能與ErbB-配體活化無關(CarpenterandCohen1990)。因此，如果ErbB配體的受體-調節(jié)EGF域發(fā)現的不變基因組結構，也保持在編碼無關EGF域的樣品的基因組序列中，將對其進行測試。為了測試這個假設，測試了蛋白質TGF-a(作為參照)、表皮生長因子和Notch-l。TGF-a包含單個負責受體結合和活化的EGF域。而相比較的表皮生長因子包括9個EGF域，其中只有第9個負責受體結合和活化。相反，Notch-l是另一個信號分子，包含36個EGF域，所有域都不負責ErbB-受體活化(圖5A)。檢查了編碼這些基因的基因組序列，為了說明編碼不同EGF域的基因組結構。對于表皮生長因子，只有ErbB-受體-結合的EGF域由一個分離密碼子編碼。相比之下，其余8個EGF域完全地在單個外顯子編碼(圖5B)。相反，對于Notch-l，對46個編碼的EGF域觀察到異源的基因組結構(圖5B)。其中，只有第1個和第30個EGF域在發(fā)現ErbB-受體結合域的位置包含分離外顯子拓樸。從這些數據可以推論，編碼EGF域的基因組DNA的一般拓樸通常不必分離的外顯子-外顯子結構，編碼的終止密碼子緊接外顯子A之后，如哺乳動物的ErbB-受體-結合域證明的。編碼ErbB配體的基因保持生物活性、此基因不包含編碼EGF域的分離外顯子-外顯子結構。例如，自然界中存在的病毒編碼的ErbB配體，盡管它們的基因組缺少分開EGF域編碼區(qū)域的內含子序列(例如，VGF、NCBI檢索號U18337、植入的蛋白序列弁AAA69306)。而且，在各種轉錄啟動子控制下，表達缺少內含子的cDNA序列形式的基因在分子生物學中是普通的操作(Maniatis等人.1982)。人們已經以這種方式構建了編碼缺少啟動子的ErbB配體的重組基因，它們編碼重組蛋白的功能和活性(Groenen等人.1994)。因此在編碼不同哺乳動物ErbB-配體(圖5)的基因中發(fā)現的進化上保守的外顯子-外顯子接合，對于在哺乳動物細胞中產生包含保守的6-半胱氨酸EGF域的功能配體是不需要的。帶有在半胱氨酸4后結束的縮短的EGF域的ErbB配體的功能可替換剪接變體形成，將提供對這個區(qū)域序列保守性的功能解釋。最好的證據，即這種截短的ErbB配體變體在自然界中存在，將證明確實表達了這種亞型。已經進行了飽和克隆的嘗試，以分出較好地特征化了的NRG1基因的所有亞型。事實上存在截短的NRG1亞型，其與其它典型NRGla亞型相同，除了其序列終止于EGF域的第4個半胱氨酸之后的一個氨基酸(hereguliny-不要與yheregulin混淆(Falls2003))。對此蛋白的涉及NRG1基因組位點的編碼序列(檢索號NP—004486和NM—004495)的檢查，更證明這個變體序列包含延展的外顯子A，導致其中蛋白質的截短(數據未顯示)。因此，對于NRG1，存在這種截短變體的原理的證據已經被證明。在諸如EST序列等的公眾數據庫中，隨機產生的轉錄子提供了極少的ErbB配體序列的展示，尤其是由于這些基因通常發(fā)現的非常低的表達。然而，進行生物信息學搜索以搜尋基因的或基因片段的表達的轉錄子，在EGF域內尋找截短ErbB配體。為了達到此目的，不同哺乳動物ErbB配體的EGF域(圖4)用于以TBLASTN方法查詢NCBINR、EST和PATENT基因組數據庫，為了搜尋帶有截短同源序列的序列。提取這些DNA序列，并適當地翻譯為6閱讀框(EMBOSS-Transeq)。選擇編碼截短EGF域的相應閱讀框。有趣地，發(fā)現了兩類不同的預測蛋白序列。I類編碼半胱氨酸-4之后截短的、期望在外顯子A延展上的蛋白質序列。II類編碼帶有可替換剪接變體的部分EGF域(外顯子A)的序列，其中不編碼外顯子B。由此類變體編碼的蛋白傾向于是異源的、長度超過縮短的EGF域所表達的蛋白質，其依賴于在外顯子A范圍之外出現的可替換外顯子序列。I類和II類蛋白序列的列表展示如下，包括它們編碼的蛋白序列。除非蛋白序列是已知的，翻譯此處所提供的序列，并選擇編碼截短EGF域的合適閱讀框。需要注意的是，這些序列中的某些，尤其是EST序列是部分的序列，也傾向于通常的序列錯誤。因此，通常給出完整翻譯后序列，不管起始甲硫氨酸是否在翻譯后序列中標出。這些數據證明了存在兩類ErbB配體的剪接變體，其編碼缺少EGF域C-環(huán)的截短的EGF域，在不同范圍的種中，包括人類和其它哺乳動物、鳥類和魚類。表2:I類變體在EST、NR和專利(DNA)數據庫中發(fā)現的序列，其具有編碼包括延長的外顯子A的ErbB配體的變體的序列，導致EGF域的保守的半胱氨酸-4后的截短的蛋白質序列。列表包括基因組片段和轉錄子數據。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>編碼截短I類變體的DNA序列(圖4)序列ID#128ACT—GGGACAAGCCATCTTGTAAAATGTGCGGAGAAGGAGAAAACTTTCTGTGTGAATGGAGGGGAGTGCTTCATCGTGAAAGACCTTTCMACCCCTCGAGA潔TTGTGCAAGTAA序列ID#129TCC—TGGTCGGGGCACGCCCGGAAGTGCAACGAGACAGCCAAGTCCTATTGCGTCAATGGAGGCGTCTGCTACTACATCGAGGGCATCAACOW5CTCTCCTGCAAGTAA序列ID#130GAGCC3ATCCGAGCACTTCAAACCCTGCCGAGACAAGGACCTTGCMACTGTCTCAATGATGGCGAOTGCTTTGTGATCGAAACCCTGACCGGATCCCATAAACACTGTCGGTAA序列ID#131GATCACGAAGAGCCCTGTGGTCCCAGTCACAAGTCGTTTTGCCTGAATGGGGGGCTTTGTTATGTGATACCTACTATTCCCAGCCCATTTTGTAGGTGA序列ID#132TCCGTAAGAAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAAGTAA序列D#133GCAGTGGTGTCCCATTTTAATGACTGCCCAGATTCCCACACTCACTTCTGCTTCCATGGAACCTGCAGGTTTTTGGTGCAGGAGGACAAGCCAGCATGTGTGTAA序列ID#134TCGTGGTGGCCGAGCAGACGCCCTCCTGTGTGTAA序列ID#135AGAAACAGAAAGAAGAAAAATCCATGTAATGCAGAATTTCAAAATTTCTGCATTCACGGAGAATGCAAATATATAGAGCACCTGGAAGCAGTAACATGCAAGTAA彭寸ID弁136GGGCTAGGGAAGAAGAGGGACCCATGTCTTCGGAAATACAAGGACTTCTGOVTCCATGGAGAATGCAAATATGTGAAGGAGCTCCGGGCTCCCTCCTGCATGTAA序列ID#137ATCTGGTGGACATGAGTCAAAACTACTGCAGGTAA序列ID#138GT^GCTCTGAAGTTCTCTCATCCTTGTCTGGAAGACCATAATAGTTACTGCATTAATGGAGCATGTGCATTCCACCATGAGCTGAAGCAAGCCATTTGCAGGTAA序列ID#139TCCACCATGAGCTAGAGAAAGCCATCTGCAGGTAA本申請中序列的概述序列l(wèi)-72是指圖3、4和5中描述的已知多肽序列，不包括權利要求中的新的ErbB剪接變體。序列73-182包括表4中所概述的新的ErbB剪接變體。表4:包含或編碼ErbB配體變體的序列概述，此序列不編碼EGF域的外顯子B<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>ErbB配體的新剪接變體目前，4艮據本發(fā)明優(yōu)選的實施方式包括選自以下的分離的多核苷酸1.編碼延展的EGF域的直接來自基因組數據(本文命名為I類)的多核苷酸即SEQIDNOS:128至139。2.編碼來自EST和NR數據庫的I類變體或變體片段的多核苷酸(表2排除heregulin(NRGl)y變體)即SEQIDNOS:148、150-159、164-165。3.編碼來自EST和NR數據庫的II類變體或變體片段的多核苷酸(表3):即SEQIDNOS:166至176。明確理解的是，所有已知序列都不包括在本發(fā)明范圍中。然而，更要明確理解的是，之前公開為缺少這種實用性的序列的任何新用途都包括在本發(fā)明內。目前，根據本發(fā)明優(yōu)選的實施方式包括包含如下的多肽1.包括截短的EGF域的直接來自基因組數據的多肽(此處命名為I類)即SEQIDNOS:73至84。2.來自EST、NR和專利數據庫的I類變體或變體片段的(來自EST、NR數據庫的表2序列的翻譯，排除NRG1y變體的)即SEQIDNOS:93、95-104、109-110。3.來自EST和NR數據庫的II類變體或變體片段(表3的翻譯序列):即SEQIDNOS:166至176。明確理解的是，所有已知序列都不包括本發(fā)明范圍中。因此，根據本發(fā)明的一個方面，提供了分離的核酸，其包括基因組的、互補的或復合的多核苷酸序列，此序列編碼能夠調節(jié)哺乳動物ErbB的多肽，此哺乳動物ErbB是至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%或更多、所述至少95%、或100%同源(類似+等同酸)于SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121。同源性是由例如使用帶有優(yōu)選矩陣BLOSUM62(基于蛋白質的搜索)的基于空位的BLAST的搜索(Altsclml等人.1997)而確定的，以下的缺省參數如由NCBIBLAST網頁定義-G開放空位的損失值(cost)[Integer]缺省=5對核苷酸ll蛋白質-E拓展空位的損失值[Integer]缺省=2核普酸1蛋白質-q核苷酸不匹配的處罰值[Integer]缺省=3-r核苷酸匹配的收益值[Integer]缺省=1-e期望值[Real]缺省=10-W字大小(wordsize)[Integer]缺省=11核苷酸3蛋白質-y在比特(bits)中對blast延伸的遺失值(X)(如果缺省為零)缺省=20對blato7對其它程序-X對空位比對(比特中)的X遺失值缺省=15對所有除了blastn以外的程序，它不適用于blastn-Z對空位比對(比特中)的最終X遺失值50對blastn25對其它程序因此，編碼ErbB配體的氨基酸序列的任何核酸序列可以用于產生表達此配體的重組分子。在特定實施方式中，才艮據本發(fā)明另一方面的多核普35酸編碼SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121中所列的多肽，或此多肽的一部分，其調節(jié)至少一個ErbB受體的已知配體的至少一種生物的、免疫的或其它功能的特征或活性。本文公開的EGF-編碼的變體域包括共有序列，其可表示如下(X-8)-C-(X-7)-C-(X2至3)-G-X-C-(X-10至13)-C-X,其中X是任何氨基酸。這是圖4中表示的共有序列圖案。較短或較長的氨基-末端序列(上述X-8)可以提供或限制生物活性。通常，源自新配體的合成肽可以具有包括氨基酸的氨基末端的尾巴的延伸。將要理解的是，本發(fā)明包括含有種氨基末端延伸的所有片段或變體，附帶條件為EGF域的C環(huán)在這些衍生物中不存在。用于DNA測序的方法是本領域中熟知并通?？傻玫模⑶铱梢杂糜谵鞅景l(fā)明的任何實施方式。此方法可以采用諸如DNA聚合酶I的Klenow片段、Sequenase⑧(U.S.BiochemicalCorp,Cleveland,Ohio)、Taq聚合酶(PerkinElmer)、熱穩(wěn)定的T7聚合酶(Amersham，Chicago,111.)等的酶、或聚合酶的組合，以及校正核酸外切酶諸如見于Gibco/BRL(Ga池ersburg，Md.)出售的ELONGASE擴增系統中的。優(yōu)選地，此方法由機器自動化，沖幾器i者如HamiltonMicroLab2200(Hamiiton，Reno,Nev,)、PeltierThermalCycler(PTC2000;MJRearch，Watertown，Mass.)和ABICatalyst和373與377DNASequencers(PerkinElmer)。本領域中技術人員將認識到的是，作為簡并遺傳密碼的結果，可以產生編碼ErbB配體亞型的多個核苷酸序列，它們一些與任何已知和天然存在基因的核香酸序列具有最小同源性的序列。因此，通過基于可能密碼選擇的組合，本發(fā)明設想可以制造核苷酸序列的每個可能變異。這種組合根據標準三聯遺傳密碼制造，應用于天然存在的ErbB配體亞型的核苷酸序列，所有這種變異都認為是明確公開的。在適合的所選嚴格性條件下，盡管編碼ErbB配體亞型以及其變體的核苷酸序列優(yōu)選地能夠雜交于天然存在的ErbB配體亞型,它可以有利的是生產編碼ErbB配體亞型或其^f汙生物的核苷酸序列，它們具有大致不同的密碼子使用?？梢赃x擇密碼子以增加肽在特定原核或真核宿主中發(fā)生表達的比率，這個比率與此宿主中采用的特定密碼子的頻率相同。基本改變編碼ErbB配體亞型以及其衍生物的核苦酸序列、而不改變所編碼的氨基酸序列的其它原因包括RNA轉錄子的產生，此轉錄子比產自天然存在序列的轉錄子具有更多的所期望的特性，諸如更長的壽命。本發(fā)明也包括完全由合成化學產生的DNA序列或其片段，此DNA序列或其片段編碼了ErbB配體亞型以及其衍生物。在產生后，此合成序列可以使用本領域熟知的試劑插入到任何的可得的表達載體和細胞系統中。而且，可以使用合成化學將突變插入編碼ErbB配體亞型或其任意片段的序列中。本發(fā)明還包括能夠與才艮據本發(fā)明的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。根據一個實施方式，此多核苷酸優(yōu)選地與SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121雜交。根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，長核酸(例如，長度為大約200bp)的雜交作用由嚴格或中度雜交作用影響，其中嚴格雜交，在65t:由含有10%硫酸葡聚糖、1MNaCl、P/。SDS和5xl06rpm32p標記的探針的雜交液影響，在，最終洗滌液為0.2xSSC和0.P/。SDS并在65。C最終洗滌；而中度雜交由在65。C的含有10%疏酸葡聚糖、1MNaCl、1%SDS和5xl06cpm32P標記的探針的雜交液影響，最終洗滌液為lxSSC和0.1。/。SDS并在5(TC洗滌。根據優(yōu)選實施方式，根據本發(fā)明這個方面的如SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121中所列的多核香酸或其一部分，所述部分優(yōu)選地編碼包括氨基酸段的多肽，此段為至少80%、優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%或更多，最優(yōu)選地95%或更多地等同于多核苷酸序列編碼截短的缺少C-環(huán)的ErbB受體-調節(jié)EGF域的位置。根據本發(fā)明的另一個實施方式，提供了一種至少17、至少18、至少19、至少20、至少22、至少25、至少30或至少40個堿基的寡核苷酸，此堿基特異地可與本文描述的分離的核酸雜交。較短的核酸(長度低于200bp，如長度為17-40bp)的雜交由嚴格、中度或輕度雜交影響，其中嚴格雜交由含有6xSSC、l。/。SDS或3MTMACI、O.OIM磷酸鈉(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、100pg/ml變性鮭魚精子DNA和4.1%脫脂干奶粉的雜交溶液影響，雜交溫度低于Tml-1.5°C,最終洗滌液為3MTMACI、0.01M磷酸鈉(pH6.8)、lmEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、在低于Tml-1.5°C最終洗滌。中度雜交由含有6xSSC、0.1%SDS或3MTMACI、0.01M磷酸鈉(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.6%SDS、lOOpg/ml變性鮭魚精子DNA和0.1%脫脂千奶粉的雜交溶液影響，雜交溫度低于Tn^-2.5。C，最終洗滌液為3MTMACI、O.OIM磷酸鈉(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、在低于Tml-1.5°C最終洗滌，最終洗滌液為6xSSC，此最終洗滌在22。C;而輕度雜交由含有6xSSC、1%SDS或3MTMACI、0.01M磷酸鈉(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、100pg/ml變性鮭魚精子DNA和0.1%脫脂千奶粉的雜交溶液影響，雜交溫度為37。C,最終洗滌液為6xSSC，最終洗滌在22。C。根據本發(fā)明的一個另外方面，提供了一對(成對)寡核苷酸，各獨立地為至少17-40堿基、特異地以相反方向與本文描述的分離核酸雜交，從而引導其一部分的指數式擴增，所述為核酸擴增反應中50-2000bp,諸如聚合酶鏈式反應。聚合酶鏈式反應和其它核酸擴增反應是本領域中熟知的，不需要在這里進一步介紹。根據本發(fā)明此方面的這對寡核苷酸是優(yōu)選地選擇以具有可比的熔化溫度(Tm),例如，熔化溫度差別少于7。C、優(yōu)選地少于5。C、更優(yōu)選地少于4。C、最優(yōu)選地少于3。C,理想地在3""C和0。C之間。因此，根據本發(fā)明另一方面，提供了使用本文描述的引物得到核酸擴增產物。這種核酸擴增產物可以由凝膠電泳或任何其它基尺寸的分離技術來分離?？商鎿Q地，這樣的核酸擴增產物可以用親和分離來分離，鏈親和力或序列親和力。此外，一旦分離了，這種產物可以由限制酶、連接酶或類似物進一步地進行遺傳操作，以用于關于調節(jié)ErbB活性的多種應用的任何之一，如本文進一步詳述的。編碼ErbB配體亞型的核酸序列可以使用部分核苷酸序列并采用本領域中已知的各種方法來延伸，以檢測諸如啟動子和調節(jié)元件等上游序列。例如，一種可以使用的方法"限制-位點"PCR，使用通用引物以找回靠近一個已知位點的未知序列(Sarkar，G.(1993)PCRmethodsApplic.2:318-322)。特別地，在連接區(qū)序列的引物和對已知區(qū)域特異性的引物存在時，首先擴增基因組DNA。然后擴增的序列進行第二輪PCR,用同樣的連接區(qū)引物和另一個第一個引物中的特異性引物。每輪PCR的產物以合適的RNA聚合酶轉錄，并4吏用逆轉錄酶測序。也可以用基于已知區(qū)域的反向引物使用反向PCR來擴增或延伸序列(Triglia,T.等人.(1998)NucleicAcidsRes.16:8186)?？梢允褂檬袌錾咸峁┑膶Ｇ?牛i者4口OLIGO4.06PrimerAnalysisl欠件(NationalBiosciencesInc.,Plymouth,Minn.)或其它合適的程序來設計引物，引物長度為22-30核苷酸，GC含量為優(yōu)選但并不排它地在40。/。至600/。，在大約68。C至72。C的溫度退火靶序列。此方法使用多個限制酶以在基因的已知區(qū)域產生合適的片段。然后由分子內連接使此片段成環(huán)，并用作PCR模板。另一種可以采用的方法是捕獲PCR，它涉及靠近人類和酵母人工染色體DNA中已知序列的DNA片段的PCR擴增(Lagerstrom,M.等人.(1991)PCRMethodsApplic.1:111-119)。在此方法中，也可以使用多個限制酶消化和連接，以在進行PCR之前，把構建的雙鏈序列放置到DNA分子的未知片段中。另一種可以使用以找回未知序列的方法是Parker,J.D.等人的(1991;NucleicAcidsRes.19:3055-3060)。此外，可以使用PCR、嵌套引物、和PromoterFinder文庫來運轉基因組DNA(Clontech，PaloAlto，Calif.)。此方法不需要篩選文庫，并對尋找內含子/外顯子接合是有用的。在篩選全長cDNAs時，優(yōu)選的是使用已經尺寸選擇的文庫以包括更大的cDNAs。隨機-引物文庫也是優(yōu)選的，在這些文庫中它們將含有更多包含基因的5，區(qū)的序列。對于寡d(T)文庫不產生全長cDNA的情況，使用隨^L引物文庫將是尤其優(yōu)選的。基因組文庫可以用于把序列延伸到5'非轉錄調節(jié)區(qū)。在解釋了例如引物延伸的用于產生新轉錄子的基因組DNA新的片方法、平板接種并分離cDNA黏粒/質?？寺『?，可以采用RT-PCR,此PCR使用通過閱讀基因組DNA序列的外顯子預測程序猜測的人工引物，如本領域中熟知的?？梢允褂檬惺鄣拿毠茈娪鞠到y以分析測序產物或PCR產物的核苷酸序列的大小或證實此序列。尤其是，毛細管測序中可以采用用于電泳分離的可流動聚合物、4種激光激活的不同熒光染料(每種對應一種核苷酸)、并由電荷偶聯的設計相機檢測發(fā)射的波長。輸出/光密度可以使用合適的軟件(例如Genotyper和SequenceNavigator,PerkinElmer)轉化為電信號，從栽入樣品到計算機分析和展示電子數據的整個過程可以是計算機控制的。毛細管電泳尤其優(yōu)選用于對小片DNA測序，此小片DNA可能在特定樣品中存在有限量。因此，本發(fā)明的這個方面包括(i)如SEQIDNOs:DNA序列IDs所主張的(排除已知的y亞型)128-139、148、150-159中所列的多核苷酸;(ii)此多核苷酸的片段；(iii)與其可雜交的序列；(iv)與其同源的序列；(v)編碼帶有不同密碼子用法的類似的多肽的序列；(vi)可變的序列，特征為突變，諸如一個或多個核苷酸的缺失、插入或取代，天然存在的或人工誘導的、隨機的或以耙向的方式的。包括新變體的構建體根據本發(fā)明的另一方面，提供了核酸構建體，其包括本文描述的分離的核酸。根據一個優(yōu)選實施方式，根據本發(fā)明這個方面的核酸構建體還包括啟動子用于調節(jié)在有義或反義方向的所分離核酸的表達。已知的這種啟動子是轉錄所需的順式-作用的序列元件，由于它們用于結合依賴DNA的RNA聚合酶，此聚合酶轉錄存在于其下游的序列。這種下游的序列可以兩個個可能方向的任一個，以導致有義RNA或反義RNA的轉錄，有義RNA由核糖體機制是可翻譯的，反義RNA通常不包含可翻譯的序列，卻能夠與內源序列形成雙鏈體或三鏈體并阻礙基因表達，此內源序列或是mRNA或是染色體DNA，如在下文將進一步詳述的。本文描述的分離的核酸是本發(fā)明中的必要部分，它是模塊式的，并可以用于不同上下文中。與本發(fā)明結合使用的選擇的啟動子是次級重要性，其將包括任何合適的啟動子序列。然而，本領域中技術人員將認識到是，確保轉錄起始位點將位于開放閱讀框的上游是必要的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所選擇的啟動子包括在所需的特定宿主細胞中有活性的元件。這些元件可以選自轉錄調解子，此調節(jié)子激活對細胞在脅迫或饑餓條件下存活是必要的基因的轉錄的，這些元件包括熱激蛋白。載體和宿主細胞為了表達生物活性的ErbB配體亞型，編碼根據本發(fā)明的ErbB配體亞型或功能等價物的核苷酸序列可以插入合適的表達栽體，即含有用于轉錄和翻譯插入的編碼序列的必需元件的栽體?？梢杂杀绢I域中多種已知方法中任意一種把載體導入細胞或組織，這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術、和體內遺傳重組。這種方法大致的描述于Sambrook等人.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork1989，1992;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD.1989;Chang等人，SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,Mich.1995;Vega等人，GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMich.1995;Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMass.1988;和Gilboa等人.(1986)Biotechnique4(6):504-512，且例如，包括穩(wěn)定或瞬時轉染、脂轉染、電穿孔和以重組病毒栽體感染。此外，見于美國專利No.4,866，042對涉及中樞神經系統的載體和美國專利No.5,464，764和5,487,992對于正-負選擇性方法。多種表達載體/宿主系統可用于包含和表達編碼ErbB配體亞型的序列。這些包括但不限于，諸如用重組噬菌體、質粒、或黏粒DNA表達載體等轉化的細菌；用酵母表達載體轉化的酵母；感染了病毒表達栽體(例如桿狀病毒)的昆蟲細胞系統；用病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV;煙草花葉病毒TMV)或細菌表達載體(例如Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統；或動物細胞系統。所采用的宿主細胞不能限制本發(fā)明。才艮據本發(fā)明的構建體在宿主細胞內的表達可以是瞬時的或可以是穩(wěn)定地整合于此宿主細胞基因組?？梢圆捎帽景l(fā)明的多核苦酸以由重組技術產生多肽。因此，例如，多核苷酸可以包括在用于表達多肽的多種表達載體中的任一種。這種載體包括染色體的、非染色體的以及合成的DNA序列，如SV40的衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質粒、來自質粒與噬菌體DNA組合的載體、病毒DNA諸如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和偽狂犬病(pseudorabies)。然而，可以使用任何其它載體，只要它在宿主中可復制并可存活。"控制元件"或"調節(jié)序列，，是栽體的非-翻譯區(qū)-增強子、啟動子、5'和3，非翻譯區(qū)，它們與宿主細胞內蛋白相互作用以實現轉錄和翻譯。這種元件的長度和特異性是可變的。依賴于采用的載體系統和宿主，可以使用任何數量的合適轉錄和翻譯元件，其包括組成型和誘導型還有啟動子。例如當在細菌系統中克隆時，可以使用誘導型啟動子諸如Bluescriptphagemid(Stratagene，Lajolla,Calif.)的雜合lacZ啟動子或pSportlTM質粒(GibcoBRL)和類似物。在昆蟲細胞中可以使用桿狀病毒多角體蛋白啟動子。來自植物細胞的基因組(如熱激蛋白基因、RUBISCO和貯存蛋白基因)或來自植物病毒(病毒啟動子或引導序列)的啟動子或增強子可以克隆到載體中。在哺乳動物細胞系統中，優(yōu)選的是來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。如果必需產生含有多個編碼變異ErbB-配體的多拷貝序列的細胞系，可以使用帶有合適的可選擇標記的基于SV40或EBV的載體。在細菌系統中，可以根據用于變異ErbB-配體表達的期望用途而選擇許多表達載體。例如，當需要大量變異ErbB-配體以誘導抗體時，可以使用引導易于純化的融合蛋白質高水平表達的載體。這種栽體包括但不限于，多功能的諸如Bluescript(Stratagene)等的大腸桿菌(E.coli)克隆和表達載體，其中編碼變異ErbB-配體的序列可以綽于載體，與用于氨基-末端的Met和隨后的7個p-半乳糖香酶的序列在同一閱讀框中，從而產生雜合蛋白；pIN載體(VanHeeke，G.和S.M.Schuster(1989)J，Biol.Chem.264:5503-5509);和類似物。pGEX栽體(Promega，Madison,Wis.)作為與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白可用于表達外源多肽。通常，這種融合蛋白是可溶的并能通過吸收到谷胱甘肽-瓊脂糖珠易于從溶解細胞純化，然后在游離谷胱甘肽存在時洗脫。這種系統中制造的蛋白可以設計為包括肝素、凝血酶、或因子XA蛋白酶切割位點，從而克隆的感興趣的多肽可以從GST部分如期望地釋放。在酵母即釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,可以使用許多含有組成型或誘導型啟動子諸如a因子、乙醇脫氫酶、和PGH等的栽體。綜述見于Ausubel等人.(supra)和Grant等人.(198"MethodsEnzymol.153:516-544。對于使用植物表達栽體的情況，編碼變異ErbB-配體的序列的表達可以由許多啟動子中的任何一種驅動。例如，諸如CaMV的35S和19S啟動子等的病毒啟動子可以單獨使用，或者與來自TMV的Q引導序列組合使用(Takamatsu,N.(1987)EMBOJ,6:307-311)?？商鎿Q地，可以使用諸如RUBISCO的小亞基或熱激啟動子等的植物啟動子(Coruzzi，G.等人.(1984)EMBOJ.3:1671-1680;Broglie，R.等人.(1984)Science224:838-843;以及Winter,J,等人.(1991)ResultsProbl.CellDiffer.17:85-105)?？梢酝ㄟ^直接DNA轉化或病原體介導的轉染將這些構建體插入植物細胞。這種技術描述在許多通?？傻玫木C述中(見于，如Hobbs，S.或Murry，L.E.inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill,NewYork,N.Y.;pp.191-196.)。也可以使用昆蟲系統以表達變異ErbB-配體。例如，在一個這種系統中，使用苜蓿丫紋夜蛾(awtogra;/wca/i/brm'c^(細胞)核的多角體病毒(AcNPV)作為栽體以在草地夜蛾f^oJo/tera/rwgz;^W^)細胞或在粉紋夜蛾^n'c/w;/^W幼蟲中表達外源基因。編碼變異ErbB-配體的序列可以克隆到病毒的非-必需區(qū)域，諸如多角體蛋白的基因，并置于多角體蛋白啟動子的控制下。變異ErbB-配體的成功插入將使多角體蛋白基因失活并產生缺少外殼蛋白質的重組病毒。然后重組病毒可以用于感染例如草地夜蛾(S./rwg^7eW"j細胞或粉紋夜蛾(m'c/w//i^a)幼蟲，變異的ErbB-配體可以在其中表達(Engelhard,E.K.等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.91:3224-3227)。在哺乳動物宿主細胞中，可以使用許多基病毒的表達系統。對于使用腺病毒作為表達載體的情況，編碼變異ErbB-配體的序列可以縛到由晚期的腺病毒的轉錄子/翻譯復合物。在病毒基因組的非必需El或E3區(qū)域插入可以用于得到能夠在感染的宿主細胞中表達變異ErbB-酉己體的能生存的病毒(Logan,J.andShenk,T.(1984)Proc.NatLAcad.Sci.81:3655-3659)。此外，可以使用諸如勞氏肉瘤病毒(RSV)增強子等的轉錄增強子，以增加在哺乳動物宿主細胞中的表達?？梢圆捎萌祟惾斯と旧w(HACs)以運送較大片段的DNA,這種片段比可以在質粒中包含和表達的片斷大。用于治療目的，構建6至10M的HACs并由常規(guī)運送方法(脂質體、聚陽離子氨基聚合物、或小泡)運送。也可以使用特定起始信號以達到對編碼變異ErbB-配體的序列更有效的翻譯。這種信號包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。對于編碼變異ErbB-配體的序列、它的起始密碼子和上游序列插入到合適的表達栽體中的情況，不需要另外的轉錄或翻譯控制信號。然而，對于只有編碼序列或其片段插入的情況，應該提供包括ATG起始密碼子的外源的翻譯控制信號。而且,起始信號應該位于正確的閱讀框中,以確保整個插入物的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是不同來源的、天然和合成的。表達的效率可以由包含的增強子而增強，此增強子適合于其所使用的特定細胞系統，諸如在那些文獻中描述的(Scharf，D.等人.(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:125-162)。多肽純化用編碼變異ErbB配體亞型的序列轉化的宿主細胞，可以在適合蛋白表達和從細胞培養(yǎng)物回收蛋白的條件下培養(yǎng)。依賴于所使用的序列和/或載體，轉化了的細胞產生的蛋白質可以是分泌的或細胞中內含的。編碼變異ErbB配體亞型的多核苷酸可以包括信號肽，它引導ErbB配體亞型的分泌物穿過原核細胞或真核細胞的膜?？梢允褂闷渌鼧嫿ㄎ镆园丫幋aErbB配體亞型的序列連接到編碼多肽域的核苷酸序列，此多肽域將促進可溶蛋白質的純化。這種促進純化的域包括但不限于，金屬螯合肽諸如允許在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸組件(module)、允許在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A域、和用于FLAG延伸/親和力純化系統中的域(Immunex44Corp.,Seattle,Wash.)。可切開的連接區(qū)序列的內含物，諸如那些對因子XA或腸激酶(Invitrogen,SanDiego,Calif.)特異的內含物，在純化域和ErbB配體亞型編碼的序列之間可以采用此內含物以促進純化。提供一種這樣的表達栽體用于融合蛋白的表達，此融合蛋白包含ErbB配體亞型和編碼在疏氧還蛋白和腸激酶切割位點之前的6個組氨酸殘基的核酸。組氨酸殘基促進在固定化金屬離子親和層析(IMIAC)的純化。(見于，如Porath，J等人.(1992)ProtE印.Purif.3:263-281.)腸激酶切割位點提供了從融合蛋白純化ErbB配體亞型的方法。(見于，如Kroll，D.J.等人.(1993)DNACellBiol.12:441-453.)ErbB配體亞型的片段不僅可以由重組產物產生，還可以由使用固相技術引導肽的合成而產生。(見于，如Creighton，T.E.(1984)Protein:StructuresandMolecularProperties,pp.55-60,W.H.FreemanandCo.NewYork,N.Y.)可以由手動技術或由自動裝置進行蛋白合成。可以實現自動合成，侈'j力口《吏用AppliedBiosystems431Apeptidesynthesizer(PerkinElmer)。ErbB配體亞型的各個片段可以單獨合成，然后組合以產生全長分子。轉基因動物或細胞系本發(fā)明具有提供轉基因的基因和多態(tài)基因動物和細胞的(細胞系)模型以及用于導入和敲除的模型的潛力。這些模型可以使用本領域中已知的標準方法構建，并如同美國專利No.5，487，992、5,464,764、5,387,742、5,360,735、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5，175，385、5,175,384、5，175，383、4，736，866中所陳述的，以及BurkeandOlson(1991)MethodsinEnzymology,194:251-270;Capecchi(1989)Science244:1288-1292;Davies等人.(1992)NucleicAcidsResearch,20(11)2693-2698;Dickinson等人.(1993)HumanMolecularGenetics,2(8):1299-1302;DuffandLincoln,"InsertionofapathogenicmutationintoayeastartificialchromosomecontainingthehumanAPPgeneandexpressioninEScells",ResearchAdvancesinAlzheimer'sDiseaseandRelatedDisorders,1995;Huxley等人.(1991)Genomics,9:74147501991;Jakobovits等人.(1993)Nature,362:255-261;Lamb等人.(1993)NatureGenetics,5:22-29;PearsonandChoi,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10578-82;Rothstein,(1991)MethodsinEnzymology,194:281-301;Schedl等人.(1993)Nature,362:258-261;Strauss等人.(1993)Science,259:1904-1907。而且，專利申請WO94/23049、WO93/14200、WO94/06408、W094/28123也提供了信息。所有來自本發(fā)明所聲明的實施方式的這種轉基因的基因和多態(tài)基因動物和細胞(細胞系)的模型以及導入或敲除的模型，組成了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。基因治療本文使用的基因治療是指感興趣的遺傳物質(例如DNA或RNA)轉移進入宿主，以治療或預防遺傳的或獲得的疾病或病況或表型。感興趣的遺傳物質編碼產物(例如蛋白質、多肽、肽、功能性RNA、反義)，這些產物需要在體內產生。例如，感興趣的遺傳物質可以編碼有治療價值的配體、激素、受體、酶、多肽或肽。評論通常見于文本"基因治療"(AdvancedinPharmacology40，AcademicPress,1997)?；蛑委煹膬煞N基本方法包括(i)體外和(ii)體內基因治療。在體外基因治療中，從患者移去細胞，并在培養(yǎng)中體外治療。通常，通過合適的基因運輸載體/方法(轉染、轉導、同源重組等等)把功能上替換基因引入細胞中，以及所需要的表達系統，然后修飾的細胞在培養(yǎng)中膨脹并回到宿主/患者。這些遺傳上移植的細胞已經表現為在原位表達轉染的遺傳物質。在體內基因治療中，靶細胞不從患者移去。而是把將要轉移的遺傳物質導入到受體有機體的細胞的原位中，原位即在受體中。在一個可替換的實施例方式，如果宿主基因是有缺陷的，就在原位修復基因(Culver,1998.(Abstract)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,February1998，Coronada,Calif.)。這些遺傳上改變的細胞已經表現為在原位表達轉染的遺傳物質?；虮磉_栽體能夠運輸/轉移異源核酸進入宿主細胞。表達載體可以包括以細胞選擇方式控制核酸靶向、表達和轉錄的元件，如在本領域中已知的。需要注意的是，基因的5'UTR和/或3'UTR經常可以由表達載體的5，UTR和/或3，UTR代替。因此，根據需要的，本文所使用的表達載體可以不包括將要轉移的現存基因的5'UTR和/或3'UTR,且只包括特定氨基酸編碼區(qū)域。表達載體可以包括用于控制異源物質轉錄的啟動子，并可以或是組成型或是誘導型的啟動子以允許選擇性轉錄?？梢苑潜匾陌ㄔ鰪娮樱尚枰嗽鰪娮右缘玫奖匾霓D錄水平。增強子通常是靠近編碼序列(順式)作用的任何非翻譯DNA序列，以改變由啟動子指示的基礎轉錄水平。表達載體也可以包括下文所述的選擇基因。用于基因治療的栽體如上文所述，載體可以由本領域中已知的許多方法中任意一種引入宿主細力包或纟且織。由感染而引入核酸提供了超越所列出的其它方法許多優(yōu)點。由于它們的感染性的本質可以得到更高的效率。而且，病毒在特定細胞類型中是非常專門的和典型地感染和繁殖。因此，可以使用它們的天然特異性以在體內或在組織中或細胞混合培養(yǎng)物中把載體輩巴向于特定細胞類型。也可以用以特定受體或配體修飾的病毒栽體通過受體介導事件改變乾向特異性。引導并表達重組序列的DNA病毒載體的一個特殊例子是腺病毒衍生的栽體Adenop53TK。此載體表達一個皰滲病毒胸苷激酶(TK)基因用于正向或負向選擇，和用于所需的重組序列的表達盒。此載體可以用于感染具有腺病毒受體的細胞，此受體包括大多數上皮來源的癌以及其它。此載體以及其它表現類似期望功能的可以用于治療混合種群的細胞，并且可以包括例如細胞、組織或人類患者的體內或體外培養(yǎng)物。還可以包括對特定細胞類型限制表達的特征。這種特征包括，例如對期望的細胞類型特異的啟動子和調節(jié)元件。此外，重組的病毒載體對期望核酸的體內表達是有用的，由于它們提供了諸如橫向感染和靶向特異性等優(yōu)點。橫向感染是生命周期中固有的，例如逆轉錄病毒，且此橫向感染是一種方法，通過這個方法單個感染的細胞產生許多后代病毒體，它們出芽并感染相鄰的細胞。這導致大片區(qū)域迅速被感染，其中大部分區(qū)域不是由最初的病毒顆粒起始感染的。這與垂直型感染相反，垂直型感染中感染因素只沿著子代后代傳播。也可以產生不能夠橫向傳播的病毒載體。這個特征是有用的，如果期望的目的是引導特定基因只進入有限數量的靶細胞。如以上所述，病毒是非常特異性的感染介質，在許多情況下，其已經進化以躲避宿主的防御機制。通常，病毒在特定細胞類型中感染和繁殖。使用病毒載體的天然特異性以特異性地靶向預設的細胞類型，并從而引導重組基因進入感染的細胞。用于本發(fā)明的方法中的載體將依賴于期望的將要靶定的細胞類型，并對本領域中技術人員是已知的。例如，如果將要治療乳癌，那么就使用對這種上皮細胞特異性的載體。類似地，如果將要治療造血系統的疾病或病理狀態(tài)，那么將使用對血細胞和其前體特異性的、優(yōu)選地使用對特定造血細胞類型特異性的病毒載體?？梢詷嫿孓D錄病毒載體，作用為感染顆?；蛑唤洑v感染的單個起始周期。對前一種情況，調節(jié)病毒的基因組從而使它保持必需基因、調節(jié)序列和包裝信號，以合成新的病毒蛋白和RNA。一旦和成了這些分子，宿主細胞就把RNA包裝為新的病毒顆粒，其能夠經歷感染的更多的周期。也構建栽體的基因組以編碼和表達期望的重組基因。對非感染性病毒栽體的情況，載體基因組通常變異以破壞病毒包裝信號，此信號對把RNA封裝為病毒顆粒是必須的。如果沒有這樣的信號，形成的任何顆粒將不包含基因組，從而不能進行到感染的隨后的周期。栽體的特定類型將依賴于打算的應用。實際的載體在本領域中也是已知的并易于得到，或者可以由本領域中技術人員使用熟知的方法學構建。重組的載體可以以多種方式施用。例如，如果使用病毒載體，此步驟可以利用它們靶向特異性，因此不需要局部地施用在疾病的位置上。然而，如果局部施用可以提供更快和更有效的治療，還可以例如由靜脈注射或皮下注射而施用于患者。也可以使用把病毒載體向脊髓液注射作為一種施用方式。注射后，病毒載體將流通直到識別帶有對于感染合適的靶向特異性的細胞。48因此，根據一個可替換實施方式，根據本發(fā)明的核酸構建體還可以包括正向和負向的選擇標記，并因此可以用于選擇同源重組事件，包括但不限于，用于導入和敲除步驟中的同源重組。本領域中普通技術人員將易于設計既包括正向也包括負向選擇基因敲除或導入構建體用于有效地選擇轉染的胚胎干細胞，此干細胞經歷了與構建體的同源重組事件。可以把這種細胞引入發(fā)展中的胚胎以產生嵌合體，其后代可以用于測試以攜帶敲除或導入構建體。根據本發(fā)明的敲除和/或導入構建體可以用于進一步研究ErbB配體亞型的功能性。如此，構建體也可以用于體細胞和/或生殖細胞基因治療以增加/降低ErbB信號的活性，從而調節(jié)ErbB相關的反應。關于構建和使用導入和敲除構建體的進一步詳情可以見于Fukushige，S.andIkeda,J.E.(1996)DNARes3:73-50;Bedell，M.A.等人(1997)GenesandDevelopment11:1-11;Bermingham,J，J，等人.(19%)GenesDev10:1751-1762，其在此引入作為參考。反義根據本發(fā)明的又另一個方面，提供了包括多核苷酸或多核苷酸類似物的反義寡核脊酸，它們?yōu)橹辽?0堿基、優(yōu)選地在10與15之間，更優(yōu)選地在5至20個堿基之間，最優(yōu)選地在至少17-40個堿基，是在生理條件下，在體內與多核苷酸鏈的一個部分雜交，此多核苷酸編碼一種多肽，此多肽是至少80%、優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%或更多、最優(yōu)選地至少95%或更多的同源(類似的+等同的酸)于由本發(fā)明公開的缺少C-環(huán)的ErbB受體-調節(jié)的EGF配體的序列。這種反義寡核苷酸可以用于減量調節(jié)表達，如下文進一步詳述的。這種寡核苷酸是易于使用固相寡核苷酸合成的?；瘜W合成具有選擇的預設定序列的寡核苷酸及其類似物，提供了向下調節(jié)基因表達的方法?？梢钥紤]3種類型的基因表達調節(jié)策略。在轉錄水平，通過鏈替換或形成三聯螺旋結合于基因組DNA的反義或有義寡核苷酸或類似物，可以阻止轉錄。在轉錄水平，結合于靶mRNA分子的反義寡核苷酸或類似物，導致雜化物由胞內RNaseH酶切割。在這種情況下，通過與靶mRNA雜交，寡核苷酸或寡核苷酸類似物提供了一種雙螺旋雜化物，RNaseH酶可以識別并破壞此雜化物?？商鎿Q地，這種雜化物的形成可以導致與正確剪接的干涉。作為一個結果，在這兩種情況中，準備翻譯的靶mRNA的完整轉錄物的數量減少或消除。在翻譯水平，由必需翻譯因子(核糖體)與靶mRNA的位阻結合，結合靶mRNA分子的反義寡核普酸或類似物阻止了一種本領域中稱為為雜交扣留的現象，此現象使得這種mRNA分子不能翻譯。因此，如上所述的反義序列可以扣留依賴于其特定序列的任何內源和/或外源基因的表達，這吸引了致力于把反義方法發(fā)展為一種新的藥理學工具的科學家和藥理學家的注意。例如，多個反義寡核苷酸已經顯示為扣留造血細胞的增殖(Szczylik等人，1991)、生長(Calabretta等人.,1941)、進入細胞周期的S階段(Heikhila等人，1987)、減少存活(Reed等人，1990)和阻止受體介導的反應(BurchandMahan,1991)。為了使用寡核苷酸或類似物在體內有效抑制基因表達，寡核苷酸或類似物必須實現以下要求(i)在結合于靶序列時足夠的特異性；(ii)水中的溶解性；(iii)對胞內和胞外核酸酶的穩(wěn)定性；(iv)穿過細胞膜的能力；和(v)當用于治療有機體時的低毒性。通常，未修飾的寡核苷酸用作反義序列是不切實際的，因為在體內的半衰期短，在此期間它們迅速由核酸酶降解。而且，難于以超過毫克的量制備它們。此外，這種寡核苷酸是差的細胞膜穿透者。因此很明顯，為了滿足以上列出的要求，需要以合適的方式設計寡核苷酸類似物。因此，開始了對改進寡核苷酸的廣泛搜索。例如，由三螺旋形成而引起的雙鏈DNA(dsDNA)識別的問題，已經由聰明的"扳回(switchback)"化學鍵而減少，從而識別一條鏈上的多噪呤序列，并由"扳回，，而識別另一條鏈上的同型噪呤序列。由使用人工堿基也已經得到了好的螺旋形成，從而改善了關于離子強度和pH的結合條件。塞核苷酸類似物此外，為了提高半衰期和膜通透性，已經完成了在寡核苷酸骨架中的大量變異?？梢栽趬A基、糖或磷酸部分中修改寡核苷酸。這些修飾包括例如使用甲基膦酸酯、單硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、橋式硫代磷酸酯、橋氨基磷酸酯、橋亞曱基膦酸酯、帶有硅氧烷橋的去磷酸核苷酸間類似物、碳酸橋、羧甲基酯橋、碳酸酯橋、羧甲基酯橋；乙酰胺橋、碳酸橋、疏醚橋、砜橋、sulfono橋、各種"塑性"DNAs、a-異頭橋和硼烷衍生物。國際專利申請WO89/12060公開了各種用于合成寡核苷酸類似物的建造單元，以及在定義的序列中由連接這種建造單元而形成的寡核苷酸類似物。建造單元可以是"剛性的"(即，含有環(huán)結構)或"柔性的"(即，缺少環(huán)結構)。對這兩種情況，建造單元含有羥基和巰基，建造單元由其連接以形成寡核苷酸類似物。寡核苷酸類似物中的連接部分選自疏化物(-S-)、亞砜(-SO-)、和砜(-S02)組成的組。國際專利申請WO92/20702描述了一種無環(huán)寡核苷酸，其包括肽骨架，任意所選的化學核堿基(nucleobase)或類似物是嚴格的并用于編碼特征的，如它們在天然DNA或RNA中的特征。這些新化合物，稱為肽核酸(PNAs)，不僅在細胞中比它們天然對應物更穩(wěn)定，還結合天然DNA和RNA，比天然核酸彼此之間的附著牢固50至100倍?？梢詮?個含有胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤的受保護的單體，通過Merrifield固相肽的合成而合成PNA寡聚物。為了增加在水中溶解度并阻止聚集，在C-末端區(qū)放置賴氨酸酰胺基團。因此，在一個優(yōu)選的方面，需要信使RNA配對的反義技術期望寡核苷酸形成抑制翻譯的雙螺旋。反義-介導的基因(gone)治療的概念已經在1978為癌的治療而引入。這個方法是基于某些在癌細胞的細胞分裂和生長中至關重要的基因。遺傳物質DNA的片段的合成可以達到這個目標。這種分子結合腫瘤細胞的RNA中的靶向基因分子，從而抑制周期時限(gate)的翻譯并導致這些細胞的功能紊亂生長。也提出了其它機制。已經使用了這些策略，一些成功地治療癌癥以及其它疾病，包括病毒或其它感染性疾病。反義寡核苷酸通常合成長度為13-30核苷酸。寡核苷酸分子在血液中的生命跨度是相當短的。這樣，它們必須化學修飾以阻止被體內無所不在的核酸酶破壞。硫代磷酸酯在正在進行的臨床試驗中廣泛用于反義寡核苷酸的修飾。新一代的反義分子由雜化物反義寡核苷酸與合成DNA的中心部分組成，而各末端的四種堿基已經用2，0-甲基核糖修飾以類似RNA。在實驗室動物進行的基礎研究中，已經證明這些化合物與第一代未修飾的疏代磷酸酯相比，在體組織中對新陳代謝具有更大的穩(wěn)定性和改進的安全性序型(HybridonInc.news)。已經在反義技術中測試了許多其它核香酸類似物。RNA寡核苷酸策略也用于反義抑制，由于它們與靶形成穩(wěn)定的RNA-RNA雙螺旋，這暗示著有效的抑制。然而，由于它們低穩(wěn)定性，RNA寡核苷酸典型地使用為此目的設計的載體在細胞內表達。當試圖靶定編碼豐富的和長壽命的蛋白質的mRNA時，這個方法是有利的。近來的科學出版物已經證實了反義化合物在肝炎、癌癥、冠狀動脈再狹窄和其它疾病的動物;溪型中的效力。第一個反義藥物近來由FDA批準了。這種由Isis開發(fā)的藥物福米韋生(Fomivirsen)，用于局部治療AIDS患者的細胞巨化病毒(cytomegalovirus),對CMV視網膜炎的其它治療不能耐受的或有禁忌征候的患者，或者是不能對之前的CMV視網膜炎的治療有響應的患者(PharmacotherapyNewsNetwork)。許多反義化合物目前在美國進行臨床試驗。這些包括局部施用的抗病毒的、系統癌癥療法。反義療法具有治療許多威脅生命的疾病的潛力，具有超過傳統藥物的優(yōu)點。傳統藥物在疾病-導致的蛋白形成之后干涉。然而，反義療法在蛋白形成之前阻滯mRNA轉錄/翻譯并千涉，并且由于反義療法只靶定一個特異mRNA,它們應該比目前的蛋白-抑制療法更有效、副作用更小。在轉錄水平干涉基因表達的第二個選擇使用能夠與雙鏈DNA雜交的合成的寡核苷酸。形成三螺旋。這種寡核苷酸可以阻止轉錄因子結合基因的啟動子并從而抑制轉錄?？商鎿Q地，它們可以阻止雙螺旋展開，并從而阻止在三聯螺旋結構內的基因的轉錄。因此，根據本發(fā)明的又一個方面，提供了藥用組合物，它包括本文描述的反義寡核苷酸和藥物上可接受的載體。藥物上可接受的栽體可以是例如，裝載了反義寡核苷酸的脂質體。用于局部施用的制劑可以包括但不限于，洗劑、藥膏、凝膠、乳膏、栓劑、滴劑、流質、噴霧和散劑。常規(guī)的藥物栽體、含水的、粉末的或含油的基質、增稠劑和類似物可以是必要或期望的。用于口服施用的組合物包括散劑或小粒、水或非-含水介質中的懸浮液或溶液、香嚢、膠囊或片劑。增稠劑、稀釋劑、增香劑、分散助劑、乳化劑或粘結劑可以是期望的。用于非腸道施用的制劑可以包括但不限于，無菌水溶液，此水溶液也包含緩沖液、稀釋劑和其它合適的添加物。根據本發(fā)明的另一方面，提供了一種核酶，它包括本文描述的反義寡核苷酸和與其融合的核酶序列。這種核酶是易于用固相寡核苦酸合成而合成的。通過裂解編碼感興趣蛋白的mRNAs，核酶正越來越多的用于序列特異的基因表達抑制。設計核酶以切割任何特異靶RNA的可能性已經使它們在基礎研究和治療應用中成為有價值的工具。在治療領域，已經使用核酶來靶定感染性疾病中的病毒RNAs、癌癥中的顯性致癌基因、和遺傳紊亂中的特定體細胞突變。最顯著地，多個用于HIV患者的核酶基因治療方法已經在階段l試驗中。最近，核酶已經用于轉基因動物研究、基因靶定確認和通路闡明。多種核酶在臨床試驗的各個階段中。ANGIOZYME是第一個化學合成的核酶，在人類臨床口服中研究。ANGIOZYME特異性地抑制VEGF-r(血管內皮生長因子受體)的形成，后者是血管生成通路中的重要成分，RibozymePharmaceuticals,Inc.和其它公司已經證明抗血管生成治療在動物模型中的重要性。HEPTAZYME是一種設計為選擇性地破壞肝炎C病毒(HCV)RNA的核酶，發(fā)現它在細胞培養(yǎng)試驗中有效減少肝炎C病毒RNA(RibozymePharmaceuticals,^>司網頁主頁)。根據本發(fā)明的另一方面，提供了重組或合成(即，使用固相肽合成作用制備)的蛋白質，它包括能夠調節(jié)ErbB受體的多肽，這種多肽是至少80%、優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%或更多、最優(yōu)選地至少95%或更多、或100%地等同或同源(等同+類似)于一種新的剪接變體，這種變體包括ErbB配體的受體調節(jié)EGF域，附帶條件為所述的配體缺少此受體調節(jié)EGF域的C-環(huán)。最優(yōu)選地，此多肽包括本發(fā)明的ErbB配體剪接變體的至少一部分，此部分可以包括跨越半胱氨酸l至4的氨基酸，但沒有受體調節(jié)EGF域的半胱氨酸5至6。此外或可替換地，根據本發(fā)明的這方面的多肽優(yōu)選地由可以在上述用于長核酸的嚴格或中度雜交條件下，與序列SEQIDNOs:128至139、148、150-159和164-176或其一部分雜交的多核苷酸來編碼。此外或可替換地，根據本發(fā)明的這方面的多肽優(yōu)選地由一種多核苷酸編碼，這種多核苷酸至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或100%等同于本發(fā)明公開的編碼缺少受體調節(jié)EGF域C-環(huán)的剪接變體的序列。因此，本發(fā)明的這個方面包括(i)如SEQIDNOs:73至84和93、95-104、109-121中所列的多肽；(ii)此多肽的片段；(iii)與其同源多肽；及(iv)改變的多肽，其特征為突變，諸如一個或多個氨基酸的缺失、插入或取代，天然發(fā)生或人工誘導的，隨機或以靶定的方式，天然、非-天然或在合成時或合成后修飾的，附帶條件為沒有受體調節(jié)域的C-環(huán)。根據本發(fā)明的又另一個方面，提供了一種藥用組合物，其包括本文描述的作為活性成分的重組蛋白，和以上描述的一種藥物上可接受的載體。勝如使用在本文的說明書和以下的權利要求部分中的短語"衍生自多肽"是指從指定蛋白質或蛋白衍生的肽，還指從蛋白質的相等區(qū)域衍生的同源肽，此蛋白與相同種或其它種的特定蛋白同源。此術語還涉及基于特定蛋白質或它們的同源蛋白質的氨基酸的序列而設計的容許的氨基酸交替和模擬肽(peptidomimetics)。解為包括20種天然存在的氨基酸；那些氨基酸通常在體內翻譯后修飾，包括例如羥脯氨酸、磷絲氨酸和磷蘇氨酸；以及其它不常用的氨基酸包括但不限于，2-氨基脂肪酸羥賴氨酸異鎖鏈素、正-擷氨酸、正-亮氨酸和鳥氨酸。而且，術語"氨基酸"包括D-和L-氨基酸。根據本發(fā)明可能使用的氨基酸的進一步說明和非天然氨基酸的例子在下文給出。親水的脂肪族天然氨基酸可以由合成的氨基酸取代，優(yōu)選地Nleu、Nval和/或a-氨基丁酸或由通式為HN(CH2)nCOOH的脂肪族氨基酸取代，其中n=3-5,以及由它們的支鏈衍生物取代，其中例如甲基、乙基或丙基等的烷基是位于n碳原子中任意之一或多個。氨基酸的每個或更多可以包括其D-異構體。帶正電荷的脂肪族羧酸,諸如但不限于，H2N(CH2)nCOOH(n=2-4)、H2N-C(NH)-NH(CH2)nCOOH(n=2-3),以及還可以采用羥賴氨酸、N-甲基賴氨酸或鳥氨酸(Orn)。此外，也可以采用擴大的芳族殘基，諸如但不限于，H2N-(C6H6)-CH2-COOH、對氨基苯丙氨酸、H2N-F(NH)-NH-(C6H6)-CHrCOOH、對胍基苯丙氨酸或吡啶丙氨酸(Pal)。氨基酸衍生物(如果是Ser、Tyr、Lys、Cys或Om)的支鏈可以保護-連接于烷基、芳基、烷酰基或芳?；?aryloyl)的部分。也可以使用氨基酸的環(huán)狀衍生物。可以通過酰胺鍵形成而得到環(huán)化，如通過在鏈(-CO-NH或-NH-CO鍵)的各位置上結合Glu、Asp、Lys、Om、二氨基丁(Dab)酸、二氨基丙(Dap)酸。也可以通過結合通式H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH2)n-COON)-C(R)H-NH2的經修飾的氨基酸而得到骨架與骨架環(huán)化，其中n-l-4，而且其中R是氨基酸的任何天然或非-天然的支鏈。通過合成兩個Cys殘基而形成S-S鍵而環(huán)化也是可能的。另外的支鏈與支鏈的環(huán)化，可以通過形成通式-(CH2-)n-S-CH2-C-的相互作用鍵而得到，其中n=l或2，例如通過合成Cys或homoCys并由它的游離SH基團與溴乙?；腖ys、Om、Dab或Dap反應，肽內的肽鍵(-CO-NH-)可以由如下取代N-甲基化鍵(-N(CH3)-CO-)、酯鍵(-C(R)H-CO誦O-C(R)-N-)、酮亞甲基(ketomethylene)鍵(-CO-CH2-)、a-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)(其中R例如曱基等的烷基)，carba鍵(-CHrNH-)、羥乙烯(hydroxyethylene)鍵(-CH(OH)-CH2-)、疏代酰胺鍵(-CS-NH-)、烯雙鍵(-CH=CH-)、反(retro)酰胺鍵(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)(其中R是天然存在于碳原子上的"普通"支鏈)。這些修飾可以在沿著肽鏈的任何鍵上發(fā)生，并甚至可以同時在幾個(2-3)鍵發(fā)生。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以由合成的port-天然酸取代，諸如TIC、萘基丙氨酸(naphthylelanine)(Nol)、Phe的環(huán)甲基化衍生物、Phe的鹵化衍生物或o-甲基Tyr。展示文庫根據本發(fā)明的另一方面，提供了包括多個展示載體(諸如噬菌體、病毒或細菌)展示文庫，各展示至少5-10或15-20連續(xù)的衍生來自一種多肽的氨基酸，此多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+類似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121。根據本發(fā)明此方面的一個優(yōu)選實施方式，基本上每5-10或15-20連續(xù)的衍生來自一種多肽的氨基酸，此多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+類似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121,此連續(xù)的氨基酸由多個展示載體中的至少一種展示，從而提供高度代表性的文庫。優(yōu)選地，根據本發(fā)明這個方面的肽或肽類似物的連續(xù)的氨基酸或氨基酸類似物，是衍生來自SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121，附帶條件為這些肽缺少EGF域的C-環(huán)。構建這些展示文庫的方法是本領域中熟知的，這種方法描述于例如YoungAC,等人，JMolBiol1997;274(4):622-34;GiebelLB等人.Biochemistry1995;34(47):15430-5;DaviesEL等人，JImmunolMethods1995;186(l):125-35;JonesC等人.JChromatogrA1995;707(l):3-22;DengSJ等人.ProcNatlAcadSciUSA1995;92(11):4992-6;以及DengSJ等人.JBiolChem1994;269(13):9533-8,將它們以引用的方式并入本文。根據本發(fā)明此方面的展示文庫可以用于鑒定和分離能夠上調或下調ErbB活性的多肽和變體?？贵w根據本發(fā)明的另一方面，提供了一種抗體，它包括特異性地識別和結合多肽的至少抗原結合部分，此多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+類似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121,附帶條件為這些抗體不顯著地結合完整EGF域的C-環(huán)。本發(fā)明可以使用血清免疫球蛋白、多克隆抗體或其片段(即抗體的免疫反應性衍生物)、或單克隆抗體或其片段。可以由常規(guī)步驟制備單克隆抗體或單克隆抗體的純化片段，其具有至少一部分抗原結合區(qū)域，包括諸如Fv、F(abl)2、Fab片段(HarlowandLane,1988Antibody,ColdSpringHarbor);單鏈抗體(美國專利No.4,946，778)、嵌合的或人工的抗體和56互補決定區(qū)(CDR)可以由常規(guī)的步驟制備。這些血清免疫球蛋白抗體或片段的純化可以由本領域中多種已知方法達到，包括通過硫酸銨或疏酸鈉沉淀、然后對鹽水透析、離子交換色譜、親和或免疫親和色語法以及膠過濾、區(qū)帶電〉永等(見GodinginMonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,2nded.，pp.104-126，1986，Orlando,Fla.，AcademicPress)。在正常生理條件下，發(fā)現抗體在血漿和其它體液中，還在某些細胞的膜中，并由稱為B細胞的淋巴細胞類型或其功能等同物產生。IgG類的抗體由四個多肽鏈通過二硫鍵連接在一起而形成。完整IgG分子的4條鏈是兩條稱為H-鏈的相等的重鏈和兩條稱為L-鏈的相等的輕鏈。另外的類包括IgD、IgE、IgA、IgM和相關蛋白。單克隆抗體產生和選擇單克隆抗體的方法是本領域中熟知的，概述于諸如TramontanoandSchloeder，MethodsinEnzymology178，551-568，1989的綜述中。本發(fā)明的重組的或合成的ErbB配體或其部分可以用于在體外產生抗體。更優(yōu)選地，本發(fā)明的重組的或合成的ErbB配體用于在體內誘導抗體。通常，用本發(fā)明的包括至少一個連續(xù)或不連續(xù)表位的重組的或合成的ErbB配體或其部分使合適的宿主動物免疫。有利地，使用的宿主動物是純系小鼠。通常以一種混合物使動物免疫，這種混合物包括在藥物上可接受的載體中的本發(fā)明的重組的或合成的ErbB配體或其部分的溶液，和任何合適的增強對免疫原的免疫應答的輔劑。以舉例的方式，由本發(fā)明的重組的或合成的ErbB配體的溶液或其部分與Freund，s完全輔劑可以方便地完成初級免疫，所述混合物以油包水乳劑的形式制備。通常免疫可以肌肉內地、皮內地、皮下地、腹膜內地、至爪墊中、或由任意合適的施用途徑而施用于動物。免疫原的免疫計劃可以如所需地調整，^it常包括多個隨后的或次級免疫，其使用柔和的輔劑諸如Freund，s不完全輔劑?？贵w滴定量和結合特異性可以在免疫計劃中通過任何適合的方法確定，這些方法包括例如放射性免疫測定、或稱為ELISA測定的酶聯免疫吸附測定法。當達到合適的抗體滴定量時，得到來自免疫動物的產生抗體的淋巴細胞，如本領域中已知的培養(yǎng)、選擇并密集它們。通常，從免疫動物的脾得到大量淋巴細胞，但是也可以從循環(huán)、淋巴結或其它淋巴器官中重新得到它們。然后把淋巴細胞與任何適合的骨髓瘤細胞系融合，以產生雜交瘤，正如本領域中熟知的?？商鎿Q地，也可以刺激、淋巴細胞以在培養(yǎng)中生長；可以由本領域中已知的方法使其無限增殖，方法包括^ai些淋巴細胞暴露于病毒；根據已建立的方案的化學制品或諸如致癌基因的核酸。在融合后，在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)雜交瘤，例如在多孔盤中，篩選培養(yǎng)物的上清液以鑒別含有能識別所選半抗原的抗體的培養(yǎng)物。在合適的培養(yǎng)條件下，分泌能識別本發(fā)明的重組或合成的NRG-4的抗體的雜交瘤，由限制稀釋和擴增而克隆。純化單克隆抗體并且根據免疫球蛋白類型和結合親和力描述其特征。用于調節(jié)ErbB受體活性的藥用組合物根據本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥用組合物，它包括作為活性成分的在體內或體外調節(jié)ErbB受體介導活性的一種藥劑。本發(fā)明的如下實施方式設計千涉ErbB配體活性并從而干涉ErbB受體信號。根據本發(fā)明的另一方面，提供了在體內或體外調節(jié)內源蛋白而影響ErbB受體活性的方法。根據本發(fā)明此方面的方法通過施用一種在體內調節(jié)內源蛋白活性的藥劑而作用，此內源蛋白至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+類似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121，附帶條件為它缺少EGF域的C-環(huán)。根據本發(fā)明可以使用的用于上調內源蛋白活性的藥劑可以包括，例如，可表達的有義多核苷酸，其至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100。/。等同于SEQIDNOs:128-139、148、150-159、164-176，附帶條件為它不編碼完整EGF域的C-環(huán)。根據本發(fā)明可以使用的用于下調內源蛋白活性的藥劑可以包括，例如，可表達的反義多核苷酸，其至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100。/o等同于SEQIDNOs:128誦139、148、150-159、164-176，附帶條件為它不編碼完整EGF域的C-環(huán)。可替換地，根據本發(fā)明可以使用的一種用于下調內源蛋白活性的藥劑可以包括，例如，反義寡核芬酸或核酶，其包括至少10堿基、優(yōu)選地10-15、更優(yōu)選地在15-20堿基之間、最優(yōu)選地17-40堿基的多核苷酸或多核苷酸類似物，其在生理條件下可以在體內與一種編碼多肽的多核苷酸鏈雜交，這種多肽，其至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+類似)于SEQIDNOs:128-139、148、150-159、164-176;還可替換地，根據本發(fā)明可以使用的用于下調內源蛋白活性的藥劑可以包括，例如，一種肽或肽類似物，其表現至少6-10、10-15、或15-20連續(xù)的氨基酸或其類似物的片段，它們衍生自一種多肽，這種多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+類似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121。含有根據本發(fā)明的相互作用的EGF-類似域的肽或肽類似物將由蛋白質相互作用竟爭而形成蛋白質與ErbB受體的復合物，抑制或加速涉及ErbB配體的通路。以下的生物化學的和分子的系統對鑒定和鑒別蛋白質-蛋白質相互作用是已知的，通過分析作為基質的肽，其系統可以用于鑒別抑制性肽序列。一個這種系統采用引導編碼功能性蛋白質或蛋白質的突變形式的遺傳物質進入細胞，突變形式包括氨基酸缺失和取代。通過在細胞中分析蛋白質活性和蛋白質的衍生突變體的活性，這個系統可以用于鑒別蛋白的功能域。另一個這種系統采用把基因的小的編碼片段引入細胞，如通過展示文庫的方法、或通過方向隨機起始的cDNA文庫，此文庫包括基因的片段，并在它們存在時分析內源蛋白的活性(見于，如，Gudkov等人.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3131-3236;GudkovandRobinson(1997)MethodsMolBiol69;221-240;andPestov等人.1999，BioTechniques26:102-106)。而另一個系統通過篩選帶有肽域的表達文庫而實現，例如，如Yamabhai等人.1998，JBiolChem273:31401-31407所例證的。在另一個這樣的系統中，使用來自特異基因產物的交迭的合成肽以研究和影響體內和體外的蛋白質-蛋白質相互作用。例如，來自HIV-l基因的合成的交迭肽(20-30氨基酸)測定為不同病毒活性(Baraz等人.1998,FEBSLetters441:419-426),并發(fā)現它們抑制純化的病毒蛋白酶活性；結合到病毒蛋白酶；抑制Gag-Pol聚蛋白裂解；并抑制成熟病毒在人類細胞中的產生。提供以下實施例的目的僅僅是說明本發(fā)明的原理，而并非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。包括新變體的合成肽使用所提供的標準的teW-叔丁氧羥基(f-Boc)化學方案(版本1.40;N-曱基吡咯酮/羥基苯并三唑)在AppliedBiosystems(ABI)430A肽合成器上合成肽。在每次活化酯偶聯后采用乙酸酐加帽。在甲基苯乙酰胺(phenylacetamidomethyl)聚苯乙烯樹脂上裝配肽，除了使用"BocGlu(O-環(huán)己基)和PBocAsp(O-環(huán)己基)以外，使用標準的支鏈保護。使用Tam等人.(7.CAew.5bc川5:"W(79W"的"低-高"氫氟酸(HF)方法對肽脫保護。在每種情況中，粗制HF產物由反相HPLC(C-18Vydac,22*250mm)純化，不經干燥稀釋到折疊緩沖液(1M尿素、100mMTris、pH8.0、1.5mM氧化谷胱甘肽、0.75mM還原谷胱甘肽、10mMMet)中，并在4。C攪拌48h。折疊的、完全氧化的肽從折疊混合物中由反相HPLC純化，并由電噴射質語學鑒定；由氨基酸分析定量。生物信息學對尤其是各種ErbB配體的EGF-類似域的同源物，由BLAST和基于Smith-Waterman的搜索，搜索了EST、基因組和非冗余數據庫(Altschul等人，1997;SamuelandAltschul,1990;SmithandWaterman,1981)。使用國家生物學中心(NCBI)網點進行了基于BLASTN、BLASTP和TBLASTN的搜索，采用網頁上提供的搜索引擎和數據庫。使用ClustalX(對Windows的版本1.81)進行多序列比對(Chenna等人.2003)。使用軟件包和歐洲分子生物學庫(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)上維護的CompugenBioccelerator(EMBL-界面)進行基于Smith-Waterman的搜索。也使用這個Bioccelerator進行基于序型的搜索；使用軟件PROFILEWEIGHT從蛋白的ClustalX多序列比對得到序列序型，此軟件作為EMBL-界面CompugenBioccderator的一個軟件部分而提供。然后使用程序TPROFILESEARCH(EMBL的CompugenBioccelerator;程序版本1.9)對DNA數據庫進行序型搜索。在本例中用于Bioccderator搜索的掃描的數據庫保持在EMBL站點。使用NCBIEntrez序列找回工具(sequenceretrievaltools)直接找回定義名字或檢索號的序列。使用程序Transeq進行DNA序列翻譯，此程序是EMBOSS包的一部分并由EMBL-歐洲生物信息學研究院網點提供(Rice等人.；TrendsGenet.2000Jun;16(6):276-7)。域結構在閱讀文獻的幫助和使用SMART(簡化模數結構搜索工具；EMBL)而界定(Letunic等人;NucleicAcidsRes，2002Jan1;30(l):242-4)。使用所j生物信息學工具時都使用缺省設置，除非在上下文中另外指出。在撰寫本草稿時，上述程序和網頁界面都可以從表5所示的站點訪問得到。表5:用于生物信息學分析的源頭/工具<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>ErbB配體家族的典型成員已經在別處描述(Harari等人，1999;Harris等人,2003;Strachan等人，2001)。這些配體的蛋白序列已經從NCBI服務器中提取出，通過使用Entrez序列找回工具以及由對NR蛋白數據庫使用BLASTP搜索。隨后得到相應的cDNA序列作為蛋白序列的參考連接，或由TBLASTN對NRDNA數據庫搜索。最后，通過對NCBI人類和小鼠基因組數據庫進行TBLASTN搜索而提取出編碼至少部分ErbB配體的基因組疊連序列。代表序列的檢索號提供于表6。需要注意的是，這些序列通常在數據庫中冗余地表示，而且存在對一些配體的可供選擇的剪接變體。因此此處給出的檢索號碼只是代表性的。對可替換檢索號的參考可以結合到文本中。表6:關于編碼不同ErbB配體的基因組、轉錄子和蛋白序列的檢索號<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>承多個NRG1變體以此單次檢索(singleaccession)提供。最初決定產生和分析合成的多肽，其編碼了圖4種描述的EGF的I類變體和NRG2的EGF域(序列IDNOS:77和74)。然而所產生的合成肽比所示的略小；從第1個半胱氨酸殘基之前的5個氨基酸跨越到第4個半胱氨酸的一個氨基酸殘基的羧基。產生缺少EGF域C環(huán)的變異ErbB配體。此前已經證明，來自不同活化ErbB配體的EGF域既必要又充分的使受體活化。例如，只包含NRG4EGF域的再折疊合成肽對引起ErbB4活化是充足的(Harari等人，1999)。因此決定合成地產生和再折疊的編碼兩個I類變異配體的EGF域。產生并由空氣氧化再折疊了的截短人類EGF和截短人類NRG2(長度為32氨基酸)(本文描述為EGF(l-32)NRG2(l-32))。產生的肽是圖4中列出的肽序列(序列ID弁77和#74)的亞序列(subsequence)。除了人類EGF以外，也以獨立的方式由區(qū)域選擇性二硫(regioselectivedisulphide)合成方法合成和再折疊了小鼠EGF(l-32)，小鼠EGF(l-32)的序列來自對小鼠基因組的翻譯后blast搜索(對小鼠基因組的tblastn搜索，使用NCBIblast服務器)。合成和再折疊的細節(jié)如下提供人EGFfl-32)和人NRG2fl-32)的合成和再折疊人EGF(l-32)即hEGF(l-32):序列IDNO:183(來自序列IDNO:77)NSDSECPLSHDGYCLHDGVCNYIEALDKYACK-OH對hEGF(l-32)使用固相Fmoc技術從市售的預載Tentagel-Lys(Boc)-Fmoc樹月旨(RappPolymere,Germany)開始的第一合成方法不成功。此合成中一個主要問題是肽序列的高聚集潛力，其導致不完全偶聯和序列終止。在第二合成中由轉換到Boc化學而繞過了這個問題。從而用固相Boc技術使用預載的1.5mmo1規(guī)模的Boc-Lys(2-Cl-Z)-Merrifield樹脂合成還原的hEGF(l-32)肽。使用3個當量的氨基酸合成的肽序列用于DCCI偶聯。在氨基酸#11(從N-末端)之后不需要再偶聯和一乙?；饔谩榱藴p少aspartimide的形成，使用了Boc-Asp(OcHxl)-OH，由于同樣的原因也使用了Boc-Glu(OcHxl)-OH。從帶有含10%苯曱醚(v/v)的HF的樹脂裂解，產生HPLC中等純度的粗制肽，主要峰值為主產物(tR37.9mins,見HPLC#1)。此粗產物的MS分析表示肽的還原形式(數據未顯示)。成批的粗制肽在pH8-9的水中通過空氣氧化而再折疊，以產生折疊的肽此還原的肽溶解在水中，由加入稀釋的水合NH3和固體NH4Ac而將攪拌溶液調節(jié)到pH8.0。在室溫下持續(xù)攪拌，由HPLC監(jiān)控反應。用于分析的HPLC的樣品在注射前用醋酸酸化，且在不同時間點取樣。HPLC分析表示，再折疊反應在18小時后完成(數據未顯示)。在18小時后的反應樣進行Ellman-Test表示沒有游離的硫醇存在。人NRG2(l-32)即hNRG2(l-32):序列IDNO:184(來自序列IDNO:74)GHARKCNETAKSYCVNGGVCYYIEGINQLSCK-OH4吏用市售的預載Tentagel-Lys(Boc)-Fmoc樹月旨(RappPolymere，Germany)以固相Fmoc技術合成還原的hNRG2肽。使用2或3個當量的氨基酸合成的肽序列用于與DIPCDI偶聯，開始于偶聯#14(Fmoc-Val-OH)HOBt另外地添加到每個偶聯步驟。當需要時，使用TBTU/DIPEA與2個當量的氨基酸進行再偶聯。氨基酸(從N-末端)#2、6、13、14、15、21、24、27、29、31被再偶聯。從帶有King's混合物(cocktail)的樹脂裂解產生粗制的肽。此粗產物的MS分析表示存在WPPL185的還原形式(數據未顯示)。二硫鍵寡聚物與DDT的還原反應減少不導致還原肽的純度增力口。還原的肽樣品溶解在水中，由加入稀釋的水合NHb和固體NH4Ac而將攪拌溶液調節(jié)到pH8.5。在室溫下持續(xù)攪拌，由HPLC監(jiān)控反應。用于分析的HPLC的樣品在注射前用醋酸酸化。在2.5小時后和21小時后反應樣品的比較表明，反應在幾小時內完成。在21小時后的反應樣品進行Ellman-Test表示沒有游離的硫醇存在。即使延長反應時間也對二硫鍵形成的效率和質量沒有影響。在48小時后的樣品表示存在一種副產物，在tR29.2分鐘為第二個新峰。因此，對這個反應系統，大約12-16小時的反應時間是有利的。小鼠EGF(l-32):序列IDNO:185:(與人SEQIDNO:183同源的小鼠序列)NSYPGCPSSYDGYCLNGGVCMHIESLDSYTCK-OH使用區(qū)域選擇性二硫合成方案來合成此肽由如上所述的連續(xù)流動Fmoc-固相合成作用在O.lmmol規(guī)模上裝配(Dawson，等人，(1999)J.PeptideRes.53,542-547)。固體支撐是Fmoc-Lys(Boc)-PAC-PEG-PS(PerseptiveBiosystems,USA)，整個過程中使用4倍摩爾過量的HBTU-活化的Fmoc-氨基酸。Na-Fmoc脫保護是在帶有20%哌啶的DMF中。氨基酸支鏈保護由以下提供Asn和Gln、Trt;Asp和Glu、But;His、Trt;Tyr、But;Lys、Boc;Ser和Thr、But;和Cys(6,20)、Trt;和Cys(14,31)、Acm。所64有衍生物都購自Auspep(Mdbourne，Australia)。不進行重復氨基酸偶聯。在裝配的末尾，從固體支撐和支鏈脫保護的分離由在存在苯酚、硫代苯曱醚(thioanisole)、乙基二石克醇(ethanedithiol)和Jc(82.5/5/5/2.5/5,v/v)時以三氟醋酸(TFA)處理肽樹脂3.5h而得到。粗制S-硫醇(6,20)、S-Acm(14，31)肽的等分試樣由RP-HPLC在VydacC18柱上使用含有0.1。/。TFA的乙腈的梯度而純化。然后，以在pH8.5緩沖液中的2-二硫吡咬處理純化的肽的等分試樣(50mg)2小時，從而在Cys6和20之間形成二硫鍵。把它置于準備的反相高效液相層析(RP-HPLC)，在VydacC18柱(Hesperia,USA)上，使用在0.1%含水TFA中的1%/min梯度CH3CN,以得到7.2mgs。然后，把產物在室溫下以水冷醋酸中的多爽處理30分鐘，從而在Cysl4和31之間形成第二個二硫鍵。雙二硫mEGF(l-32)如前述的以HPLC純化，以得到2.5mgs的高度同源的肽，它具有期望的分子量，如MALDI-TOFMS評定的(下迷)。^化和存浙f^炎的MiLD/提供合成肽mEGF(l-32)和hNRG2(l-32)的含水溶液(lmg/ml)用于分析。每種溶液的l.OpL樣品滴到PerspectiveBiosystems10*10MALDI靶。lOmg/mLa-氰-4-幾基苯基-2-丙烯酸(a-cyano-4勿droxylcinnamicacid)(Sigma-AldrichPty.Ltd,Sydney,Australia)溶液，已經由從含水乙醇再結晶而純化，在使用前制備于60%含水乙腈、0.1。/。TFA中，向點在靶上的各樣品加入0.5pL此溶液。樣品在室溫下空氣干燥。使用裝有一個oMALDIII源的QSTARPulsari質鐠儀(AppliedBiosystems，U.S.A)得到TOF-MS數據。使用337nm波長的氮激光以脈沖率29Hz和功率級14.8^J進行電離。使用來自[Glu!]-血纖肽B(AuspepPtyLtd,Melbourne,Australia)的數據用于TOF校準。在TOF-MS模式的質量精確度好于35ppm。肽的理論的單同位素分子量用亞洲-太平洋網站(http:〃jpsUudwig.edu.au/)的ProteinProspector(l)計算。再折疊的肽hEGF(l-32)的分子量獨立地由不同裝置確定，但通過使用類似的MALDI質譜方法。結果概述于表7。表7:對再折疊的合成的I類肽的質譜測量值<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>所有再折疊的肽產物表現為相當純，只檢測到除了報告的MH+以外的少量峰。觀察到的質量對應于這些肽的完全氧化形式。檢測到hNRG2(1-32)的一些次要缺失產物，但是它們的強度比報告的主要[M十1]低。觀察到的質量對應于這些肽的完全氧化形式。確定合成肽中二硫健的形成最初假定的，從許多ErbB配體EGF域確定的結構，(對全長域)其編碼的6個半胱氨酸以如下構造形成二硫鍵Cl-C3、C2-C4、C5-C6(Harari等人.2000)。因此期望變異的I類肽將形成Cl-C3、C2-C4構造。對mEGF(l-32)的情況，它是由區(qū)域選擇性的二硫合成方案得到的，期望的二硫鍵順序將由肽合成中的缺省值引導。然而，hEGF(l-32)和hNRG2(l-32)由氧化而再折疊，沒有確定二硫鍵形成的順序。進行了兩種方法以確定這兩種配體的二硫鍵序型；對肽的蛋白酶剪接，然后質鐠法、和NMR確定。用蛋白酶V8剪接肽hEGF(l-32)和hNRG2(l-32)以lmg/ml懸浮在100mM重碳酸鹽緩沖液中，然后在室溫下以lpgV8蛋白酶(內蛋白酶(Endoproteinase)Glu-C;RocheDiagnosticsGmbH)過夜消化，目的是產生谷氨酸和天東氨酸殘基的C-末端肽鍵的剪接。如果完全消化了，這種剪接方式將理想地導致在hEGF(l-32)的所有肽鍵之間形成肽片段。然后對hNRG2(l-32)的情況，以V8剪接產生較少的切口，導致產生包含C1、C4和Cys(2nd+3"組合)的獨立片段。然后測量束縳片段的分子質量，目標是確定這些空氣-氧化的肽的Cys-Cys結合分布。hEGF(1-32)以V8切割導致形成新的帶，分子量[M+1]為1282.7Da和1522.72Da,其十分類似于Cl-C4和C2-C3的二硫鍵方式(表8)。也檢測了3577.549Da的主要峰，其相當于全長的未切割的hEGF的期望分子質量+2Da,這表明在V8裂解緩沖液中培育期后有2個氫原子結合到此肽上。這些數據符合大多數肽在消化后保持未切割的可能性。以V8和10%乙腈重復對hEGF消化未能提高完全消化的片段的產量(數據未顯示)。hNRG2(l-32)V8蛋白酶培育NRG2導致分子質量的形成與Cl-C4和C2-C3的二硫鍵形成相符(表8)。沒有檢測到對應于可替換的二硫鍵構造的形成的其它峰的跡象；也沒有未裂解的肽的跡象。因此，對檢測的結論，這個實驗表明空氣氧化的hNRG2(l-32)包含Cl-C4和C2-C3的同源結構，這并非最初可預見的結果。質譜結果的解釋這里提供的數據表明在由上述方法空氣氧化后，合成的肽hNRG2(l-32)和可能的hEGF(1-32)已經形成了如下的二硫鍵結構Cl-C4、C2-C3，這與期望的鍵形式Cl-C3、C2-C4相反。如果質譜數據的解釋是正確的，那么基于二疏鍵的序型，I類變體可以折疊為不同的構造，這些構造是由已知EGF域結構(具有6個半胱氨酸)推斷從而預期的結構?？商鎿Q地，這個種未割的片段表現一種可替換的折疊種類在技術上是可能的。需要注意的是，盡管假定在V8消化后hEGF(l-32)的大片段保持未切割，為了獨立地證明這些發(fā)現，進行了對肽的NMR分析(見以下)。表8:再折疊的合成的I類肽的預測值與測量值。這些預測值和結果以單同位素質量測定[M+H給出。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>注意ND-未抬r測。調整了預測質量以給出每個二硫鍵MW減少2Da。而且，所有肽保持理論的分子質量[M+1],不管由二硫鍵系留的片段數量。*作為hNRG2(l-32)以V8切割的方式的結果，C2和C3在切割后保持為單個片段。這將導致不能分離片斷，此片斷是在三種可能排列中的兩種，其中如上述的形成兩對Cys-Cys鍵。核磁共振(NMR)光謙分析合成的I類配體由NMR分析。所有1HNMR光語都記錄在裝有z-梯度單元的BrukerARX500分光計上。肽濃度范圍在l-3mM之間。1HNMR實驗包括混合時間為350ms的NOESY和混合時間為65ms的TOCSY。所有光譜都在303K記錄。光語超過6024Hz,帶有4K數據點、400-600FIDs、16(TOCSY)或64(NOESY),掃描和循環(huán)延遲為ls。促有絲分裂測定活性配體刺激有絲分裂在確定I類變異配體的抑制活性之前，重要的是首先測試這些配體是否顯示活化有絲分裂的潛力。用EGFR轉染的BaF/3細胞(BaF/3-EGFR;Walker等人，GrowthFactors16:53-67，1998)洗滌3次以除去殘留的IL-3,并重懸浮于RPMI1640+10%FCS。然后在每200微升2x104細胞，使用Biomek2000(Beckman)把細胞接種于96孔板中，然后在37°C10%CO2中培養(yǎng)4h。為了確定帶有陽性對照的這個系統的效力，細胞首先僅與滴定濃度的活化配體EGF生長，以確定對這些細胞達到最大或亞-最大受體-介導的有絲分裂所需配體的最小量。從小鼠唾液腺純化的EGF(Burgess等人,ProcNatlAcadSciUSA.79:5753-7(1982))濃度為大約200pM,典型地在誘導這些細胞的亞-最大至最大促有絲分裂響應。ErbB變異配體的滴定濃度添加到這些細胞以測試它們促有絲分裂的潛力。以類似的方式，表達一個范圍的ErbB受體的、能夠對ErbB配體刺激提供促有絲分裂響應的BaF/3或不同的細胞，用于測試這些和其它變異配體的活性配體刺激有絲分裂(例子見Harari等人，1999)。初步結果表示，配體mEGF(l-32)和hNRG2(l-32)不加強BaF/3-EGFR細胞的有絲分裂(數據未顯示)。抑制有絲分裂試驗在連續(xù)稀釋中，滴定濃度的變異ErbB配體添加到BaF/3-EGFR細胞中，這些細胞接種到帶有復制的+-小鼠EGF的96孔板中(一般在200pM數量級內)。在一個系列的實驗中，在加入小鼠EGF之前，變異配體與BaF/3-EGFR細胞預培養(yǎng)半小時。在的另一個系列的實驗中，在把配體混合物加入細胞之前，變異配體與小鼠EGF或其它活性ErbB配體預培養(yǎng)半小時。在收獲細胞之前，以3-H胸苷(1微Ci/孔)將板培養(yǎng)18小時(Filtermate,Packard),細胞收集到Unifilter96GF/C板(Packard)上。這些板干燥1小時，然后向各孔添加Microscint20(Packard)scintillationcocktai1(20微升)。使用TopCountNXT卩計數器(Packard)確定3H-胸苷結合。以類似的方式，表達某一范圍的ErbB受體的、能夠對ErbB配體刺激提供促有絲分裂響應的BaF/3或不同的細胞，用于測試這些和其它變異配體的抑制配體誘導有絲分裂的能力(例子見Harari等人，1999)。對hNRG2fl-32)&mEGFfl-32)的BIAcoreTM分析-受體結合測定使用BIAcoreTM3000進行生物傳感器分析。CM-5(研究級)傳感芯片與分別在流動室(flowcell)2、3和4上的可溶的EGFR(氨基酸1-501)、可溶的EGFR(氨基酸1-621)、和可溶的ErbB2(氨基酸1-509)固定化。使用胺偶聯化學在pH4.2的10mM醋酸鈉中進行固定化作用。不同濃度(1.25|iM、2.5pM、5hM和10mM)的肽以流動率為5pl/min注射(30pl)到HBS電泳緩沖液(10mMHEPES、3.4mMEDTA、0.15MNaCl、0.005%Tween20、pH7.4)中的傳感器表面上。然后通過以流動率為20jil/min注射10^110mMNaOH而再生表面。所得到的傳感器曲線減去空白通道(流動室1)以產生特異響應。對hNRG2a-32)&mEGRl-32)測量配體間相互作用的BIAcoreTM分析-使用BIAcoreTM3000進行生物傳感器分析。CM-5(研究級)傳感芯片與在流動室2、3和4上的重組的人或牛EGF、TGF-a和P纖維素分別固定化。使用胺偶聯化學在pH4.2的lOmM醋酸鈉中進行固定化作用。不同濃度(0.3拜、0.6pM、1.25pM、2.5pM、5(iM、10,[以及在一些情況中的50拜])的hNRG2(l-32)、mEGF(l-32)和hEGF(l-32)以流動率為5pl/min注射(30pl)到HBS電泳緩沖液(10mMHEPES、3.4mMEDTA、0.15MNaCl、0.005%Tween20、pH7.4)中的傳感器表面上。然后通過以流動率為20jxl/min注射10^110mMNaOH而再生表面。所得到的傳感器曲線減去空白通道(流動室1)以產生特異響應。Biacore結果I類ErbB配體變體-ErbB受體相互作用71肽hNRG2(l-32)和mEGF(l-32)，當添加到濃度達到lOpM時，未能證明具有可測量的結合于固定化的可溶的ErbBl、和ErbB2(數據未顯示)。II類ErbB配體變體-ErbB受體相互作用在最初的實驗中，hNRG2(l-32)、mEGF(l-32)和hEGF(l-32)單獨地添加到固定化的激動物P纖維素中。對hNRG2(l-32)和mEGF(l-32)，被注意到微弱的結合于P纖維素(圖6)。然而，沒有檢測到hEGF(l-32)肽結合固定化的P纖維素(數據未表示)。已經根據特定的優(yōu)選實施方式和實施例描述了本發(fā)明。本領域中技術人員將認識到的是，在本發(fā)明范圍內的許多可能替換將顯而易見的，且本發(fā)明的范圍不是由本文所列舉的特定實施方式而限定，而是由隨后的權利要求限定。參考文獻Altschul，S.F"Madden,T.L"Schaffer,A.A"Zh旭g，J"Zhang,Z"固er，W.andLipmatuD.J.Gai^dBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograira.^ci必及&y25，3389-402，1997,Barbacci,E.G.;Guarino，B.C.;S加hjJ.G.;Singleton,D.H.;Rosnack,K丄；Moyer,J.D,;油dAndrews,G.C.Thestructuralbasisforthespecificityofepidermalgrowthfactorandheregulinbinding.J歷o/CA柳，270(16):9585-9589,1995.C咖pioruS凡，andNiyogi，S.K.Interactionofepidermalgrowthfactorwithitsreceptor.尸rog油c/eic爿cirf及es她/胸/，49:353-383，1994.Carpenter,G.，andCohen,S.Epidermalgrowthfactor.J丑w/.CAe加.，265:7709-7712，l柳.Chenna^It,Sugawara^H"Koike,T"Lopez^R"Gibson,T.J"Higgins，D.G.andThomp幼n,J.D.Multiplesequ節(jié)cealignmentwiththeClustalseriesofprograms.Wwc/eicJc/ds及m31，3497-3500，2003.Crovello，C.S.;Lai，C.;Cantley，L,C.;andCaxraway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C-環(huán)的截短的ErbB-受體調節(jié)EGF域。16.根據權利要求15所述的多核普酸，其中所述變體包括截短的受體-調節(jié)EGF域，此EGF域只包括完整EGF域中發(fā)現的6個保守半胱氨酸中的前4個。17.根據權利要求16所述的多核苦酸，其中所述截短ErbB受體調節(jié)EGF域的所述第4個保守的半胱氨酸是在多肽的C末端的倒數第二位氨基酸。18.才艮據權利要求17所述的多核苷酸，其具有SEQIDNOS:128-139的任一序列。19.根據權利要求17所述的多核苷酸，其具有SEQIDNOS:148-165的任一序列。20.根據權利要求16所述的多核苷酸，其中所述編碼的剪接變體包括受體調節(jié)EGF域，此EGF域只包括在完整EGF域中發(fā)現的6個保守半胱氨酸中的所述前4個，還包括由可選擇外顯子編碼的氨基酸序列，所述外顯子不同于編碼完整ErbB受體調節(jié)EGF域的第5和第6個保守半胱氨酸的第二外顯子。21.根據權利要求20所述的多核苷酸，其具有SEQIDNOS:166-182的任一序列。22.根據權利要求16所述的多核苦酸，其中所述剪接變體包括受體調節(jié)EGF域，此EGF域只包括在完整EGF域中發(fā)現的所述6個保守半胱氨酸中的所述前4個，其中所述剪接變體具有與在半胱氨酸1和半胱氨酸4之間的已知ErbB配體的EGF域的相片段的比對氨基酸序列至少卯％的同源性。23.根據權利要求21所述的多核苷酸，其具有與在半胱氨酸1和半胱氨酸4之間的已知ErbB配體的EGF域的相同片段的比對氨基酸序列至少95%的同源性。24.根據權利要求21或22所述的多核苷酸，其中在所述半胱氨酸l之前的所述編碼的N末端側翼序列是與已知ErbB配體的所述EGF域的所述相同序列至少90%同源的。25.根據權利要求15至21中任一項所述的多核苷酸，其中所述剪接變體對所述ErbB/EGF受體家族的至少一個成員施加抑制活性。26.根據權利要求25所述的多核苷酸，其編碼一種多肽，與等摩爾濃度的至少一種已知激動物比較，所述多肽對受體細胞施加抑制活性而顯著降低其生物活性。27.—種反義寡核苷酸，其能夠特異性地抑制根據權利要求1-14任何之一所述多肽的所述表達。28.—種多核芬酸構建體，其包括編碼根據權利要求1-14任何之一所述剪接變體的分離的多核苷酸。29.—種載體，其包括編碼根據權利要求1-14任何之一所述剪接變體分離的多核苷酸。30.—種宿主細胞，用編碼根據權利要求1-14任何之一所述剪接變體的多核苷酸轉化。31.—種宿主細胞，用根據權利要求15-26任何之一所述的多核苷酸的轉化。32.—種藥用組合物，其包括作為活性成分的根據權利要求1-14任何之一所述的多肽。33.—種藥用組合物，其包括作為活性成分的根據權利要求15-26任何之一所述的多核苷酸。34.—種藥用組合物，其包括作為活性成分的根據權利要求27的一種反義寡核苷酸。35.—種在需要的個體中治療涉及ErbB受體疾病或紊亂的方法，包括向個體施用有效治療量的根據權利要求i_i4任何之一所述的多肽。36.根據權利要求35所述的方法，其中所述疾病或紊亂選自肺瘤疾病、過增殖紊亂、血管發(fā)生、再狹窄、創(chuàng)傷愈合、精神紊亂、神經學紊亂和神經損傷組成的組。37.—種涉及至少一種ErbB受體的病理學活性的疾病的治療方法，包括施用有效治療量的根據權利要求15-26任何之一所述的多核苷酸。38.根據權利要求37所述的方法，其中所述疾病或紊亂選自腫瘤疾病、過增殖紊亂、血管發(fā)生、再狹窄、創(chuàng)傷愈合、精神紊亂、神經學紊亂和神經損傷組成的組。39.—種選擇性地增強或促進表達ErbB受體的干細胞的增殖或分化的方法，包括把所述干細胞暴露于根據權利要求l-14任何之一所述的ErbB配體剪接變體中。40.根據權利要求39所述的方法，其中所述干細胞是神經的、心臟的或胰腺的謙系。全文摘要本發(fā)明涉及此前未知的ErbB配體的核酸和氨基酸序列，這種配體是之前已知ErbB配體的剪接變體，還涉及包括這些序列的組合物，以及其在診斷、治療和預防ErbB受體介導疾病和受體介導紊亂中的用途。本發(fā)明尤其涉及缺少完整EGF域C-環(huán)的剪接變體。文檔編號C07K14/71GK101309930SQ200480030851公開日2008年11月19日申請日期2004年8月19日優(yōu)先權日2003年8月19日發(fā)明者丹尼爾·哈拉里申請人:阿戈斯生物科技有限公司