專利名稱：用于分離和純化核酸的核酸吸附性多孔膜以及用于分離純化核酸的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分離和純化核酸的核酸吸附性多孔膜以及一種使用該多孔膜的核酸分離純化裝置。更具體地說，本發(fā)明涉及這樣這樣一種核酸吸附性膜，其用于通過使用含有核酸的樣品溶液并使用核酸分離純化柱，而從含有核酸的樣品中分離和純化核酸，所述核酸分離純化柱具有設(shè)在容器中的核酸吸附性多孔膜，所述容器具有至少兩個(gè)開口并具有壓力產(chǎn)生裝置，本發(fā)明還涉及一種使用該多孔膜的核酸分離純化裝置。
背景技術(shù)：
各種形式的核酸應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。例如，在重組核酸技術(shù)領(lǐng)域中，核酸以探針、基因組核酸和質(zhì)粒核酸的形式使用。
在診斷領(lǐng)域中，核酸以各種方法使用。例如，在檢測和診斷人類病原體時(shí)，常常使用核酸探針。同樣，核酸也用于檢測遺傳性病癥。核酸還用于檢測食品污染物。此外，基于從繪制基因圖譜到克隆和重組表達(dá)的各種原因，也常常用核酸對(duì)所關(guān)心的核酸進(jìn)行定位、識(shí)別和分離。
在許多情況下，只有極微量的核酸可以利用，因此分離和純化過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。這些經(jīng)常費(fèi)時(shí)費(fèi)力的操作可能會(huì)導(dǎo)致核酸損失。在從來自于血清、尿和細(xì)菌培養(yǎng)物的樣品中純化核酸時(shí)，會(huì)碰到污染和假陽性結(jié)果的問題。
一種廣為人知的純化方法是把核酸吸附到固相(例如二氧化硅、二氧化硅聚合物或硅酸鎂)的表面，隨后進(jìn)行例如洗滌和解吸附操作，以進(jìn)行純化(例如，參見專利文獻(xiàn)1JP-B-7-51065)。該方法表現(xiàn)出良好的分離能力。但是，該方法在操作簡單性、快速性、自動(dòng)操作適應(yīng)性和尺寸縮小適應(yīng)性方面存在不足之處，并且在工業(yè)上很難批量生產(chǎn)出性能相同的吸附劑。此外，該方法還有其它缺點(diǎn)，例如操作不方便并且難以加工成各種形狀。
此外，作為簡單高效的分離和純化核酸的方法，已描述有這樣一種方法使用一種用來在固相上吸附核酸的溶液和一種用來使核酸從固相解吸附的溶液，使核酸吸附到固相上，然后再使核酸從固相解吸附，所述固相在其表面上含有帶羥基的有機(jī)聚合物(參見專利文獻(xiàn)2JP-A-2003-128691)。
另一方面，還有離心法、使用磁珠的方法和使用濾膜的方法作為分離和純化核酸的常規(guī)方法。例如，作為使用濾膜的核酸分離純化裝置，人們提出了一種機(jī)構(gòu)，其中把若干帶有濾膜的濾管固定在臺(tái)架上，把含有核酸的樣品溶液注入濾管中，在該裝置內(nèi)，使用氣囊通過密封件形成減壓環(huán)境，所述密封件位于臺(tái)架底部周圍，由此從排出側(cè)抽吸所有濾管，使樣品溶液從濾管中通過，從而使核酸吸附到濾膜上，然后依次注入洗滌液和回收液，隨后以相同方式生成減壓環(huán)境以進(jìn)行抽吸、洗滌和解吸附(例如，參見專利文獻(xiàn)3日本專利No.2,832,586)。
但是，常規(guī)的分離和純化方法在收率和純度方面仍然存在不足之處，還需要進(jìn)一步改善。此外，常規(guī)的自動(dòng)裝置尺寸很大，適用于分析多種樣品，但具有如下問題這種裝置價(jià)格昂貴，并且不適用于樣品數(shù)少且分析頻率低的情況，這樣會(huì)使處理效率降低。特別是，在樣品溶液彼此具有不同性能(例如收集的是全血樣品)的情況下，如專利文獻(xiàn)3(日本專利No.2,832,586)所述的裝置(其中同時(shí)抽吸所有的管子)，具有如下問題當(dāng)部分濾管結(jié)束抽吸并因此使抽吸阻力減小時(shí)，其它濾管受到的減壓力會(huì)變小，從而可能使得對(duì)高粘度樣品溶液的處理不夠完全。增大減壓容積會(huì)造成在減小裝置尺寸方面的問題，并且大的減壓容積需要一定的時(shí)間來實(shí)施減壓。此外，難以檢測溶液是否完全排放，并會(huì)使預(yù)定的分析時(shí)間延長，從而使操作效率受損。此外，對(duì)于低粘度樣品溶液來說，溶液被過于有力而迅速地從濾管排出，使得泡沫噴濺而落到相鄰的濾管和臺(tái)架上，從而導(dǎo)致污染，因而使分析準(zhǔn)確性降低。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是要提供一種核酸吸附性固相，其適用于高收率和高純度地分離和純化樣品中所含的核酸。
本發(fā)明的另一目的是要提供一種核酸吸附性固相，該固相具有優(yōu)異的分離能力和良好的洗滌效率，可進(jìn)行高速簡單操作，具有優(yōu)異的自動(dòng)操作適應(yīng)性和尺寸減小適應(yīng)性，并且可以批量生產(chǎn)出分離能力基本上相同的這樣的固相。
本發(fā)明的另一目的是要提供一種核酸分離純化裝置，該裝置可以在短時(shí)間內(nèi)高效操作，而不會(huì)產(chǎn)生污染且其尺寸可以減小。
作為為解決上述問題而進(jìn)行的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在分離和純化核酸的方法中，采用使核酸吸附到多孔膜并從多孔膜解吸附的步驟是有效的。因此，本發(fā)明提供了一種適用于該方法的核酸吸附性多孔膜。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在分離和純化核酸的方法中，通過使用使核酸吸附于其上的多孔膜(核酸通過相互作用吸附于其上，其中離子鍵不參與作用)來作為所述的多孔膜，可以使核酸從含有核酸的樣品溶液中高收率、高純度地分離出來。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而完成。
也就是說，本發(fā)明具有以下內(nèi)容。
1.一種用于分離和純化核酸的核酸吸附性多孔膜，該膜具有在分離和純化核酸的方法中所使用的核酸吸附性固相，該固相吸附所述的核酸，所述方法包括以下步驟(1)通過使含有核酸的樣品溶液與所述的核酸吸附性固相接觸，使得所述核酸吸附到所述固相上；(2)通過使洗滌液與所述固相接觸來洗滌該固相，在此期間所述核酸仍吸附在該固相上；以及(3)通過使回收液與所述固相接觸，使得所述核酸從該固相解吸附。
2.如第1項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其厚度為10μm到500μm。
3.如第1至2項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其平均孔徑為0.9μm到5.0μm。
4.如第1至3項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其具有彼此不對(duì)稱的前表面和后表面。
5.如第4項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中最大孔徑和最小孔徑之比為2或2以上。
6.如第1至5項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其空隙容積為50％到95％。
7.如第1至6項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其泡點(diǎn)為0.1kgf/cm2到10kgf/cm2。
8.如第1至7項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其壓力損失為0.1kPa到100kPa。
9.如第1至8項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，在25℃的溫度和1kg/cm2的壓力下，水可以1mL/分鐘到5000mL/分鐘的量通過所述的膜。
10.如第1至9項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中每毫克的所述多孔膜吸附0.1μg或更多量的所述核酸。
11.如第1至10項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，所述多孔膜通過該多孔膜和所述核酸之間的基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸。
12.如第11項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜包含具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物。
13.如第12項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的吸附所述核酸并包含具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物的多孔膜是乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物。
14.如第13項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。
15.如第14項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量計(jì)，所述混合物中三醋酸纖維素/二醋酸纖維素的混合比為99∶1到1∶99。
16.如第13項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。
17.如第13項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。
18.如第13項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。
19.如第12項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含具有多糖結(jié)構(gòu)的聚合物的多孔膜是這樣的多孔膜，其包含通過皂化一種或多種醋酸纖維素而得到的有機(jī)材料。
20.如第19項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的一種或多種醋酸纖維素的皂化率為5％或更高。
21.如第20項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含通過皂化所述的一種或多種醋酸纖維素而得到的有機(jī)材料的多孔膜是這樣的多孔膜，其包含通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料。
22.如第21項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物的皂化率為5％或更高。
23.如第21或22項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是三醋酸纖維素和二醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
24.如第23項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量計(jì)，所述三醋酸纖維素/所述二醋酸纖維素的混合比為99∶1到1∶99。
25.如第21或22項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是三醋酸纖維素和單醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
26.如第21或22項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
27.如第21或22項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是二醋酸纖維素和單醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
28.如第19至27項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中皂化后的所述平均孔徑小于皂化前的所述平均孔徑。
29.如第28項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的皂化后的平均孔徑與所述的皂化前的平均孔徑之比為0.8或更低。
30.如第12項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物是再生纖維素。
31.如第11項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過對(duì)不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜進(jìn)行處理、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
32.如第31項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中對(duì)所述的不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜所進(jìn)行的處理包括把接枝聚合物鏈連接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物鏈在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)。
33.如第11項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過用具有親水性基團(tuán)的材料來涂覆不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
34.如第33項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有親水性基團(tuán)的材料是有機(jī)聚合物，該有機(jī)聚合物在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)。
35.如第11項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是無機(jī)材料，其中用于形成多孔膜的材料本身具有親水性基團(tuán)。
36.如第11項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過對(duì)不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜進(jìn)行處理、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
37.如第36項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中把所述親水性基團(tuán)引入所述的不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料中的處理包括把接枝聚合物鏈連接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物鏈在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)。
38.如第11項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過用具有親水性基團(tuán)的材料來涂覆不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
39.如第38項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中具有親水性基團(tuán)的材料是在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)的有機(jī)聚合物。
40.如第31至39項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述親水性基團(tuán)是羥基。
41.如第1至40項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別在所述的步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中，在壓力下通過所述核酸吸附性多孔膜。
42.如第41項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，其用于所述的分離和純化核酸的方法中，其中所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別在所述的步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中，通過核酸分離純化柱的第一開口注入，其中所述柱具有至少兩個(gè)開口，該至少兩個(gè)開口包括所述第一開口和第二開口；以及用連接到所述第一開口的壓力差產(chǎn)生裝置在所述柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別通過所述多孔膜并使所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別從所述第二開口排出。
43.一種核酸分離純化柱，該柱包括具有至少兩個(gè)開口的容器，所述的至少兩個(gè)開口包括第一開口和第二開口；以及第1至42項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜，該多孔膜被容納(或被設(shè)置)在所述容器中。
44.如第43項(xiàng)所述的核酸分離純化柱，其中作為壓力差產(chǎn)生裝置的泵以可拆裝的方式連接到所述核酸分離純化柱的所述第一開口。
45.一種成套用，具包括核酸分離純化柱，該柱容納了第1至42項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜；以及試劑。
46.一種核酸分離純化裝置，該裝置使用第1至42項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸吸附性多孔膜。
47.如第46項(xiàng)所述的核酸分離純化裝置，該裝置是自動(dòng)實(shí)施核酸分離和純化步驟的自動(dòng)裝置，所述步驟包括通過在壓力下，把含有核酸的樣品溶液注入到具有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱中，使所述樣品溶液中的所述核酸吸附到該核酸吸附性多孔膜上；在壓力下，把洗滌液注入到所述的核酸分離純化柱中，以除去除所述核酸以外的其它成分，在此期間所述核酸仍吸附在所述核酸吸附性多孔膜上；以及在壓力下，把回收液注入到所述的核酸分離純化柱中，使吸附到所述核酸吸附性多孔膜上的所述核酸解吸附，并連同所述回收液回收所述核酸；其中所述裝置包括支承機(jī)構(gòu)，其用于支承所述的核酸分離純化柱、用于容納所述樣品溶液的排放液和所述洗滌液的排放液的廢液容器、用于容納含有所述核酸的所述回收液的回收容器；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，其用于把壓縮空氣供給到所述的核酸分離純化柱；以及分注機(jī)構(gòu)，其用于分別把所述洗滌液和所述回收液注入到所述的核酸分離純化柱中。
48.如第47項(xiàng)所述的核酸分離純化裝置，其中所述支承機(jī)構(gòu)包括立架，其安裝在所述裝置的主體上；柱支架，其可垂直移動(dòng)地承載于所述立架上，并支承所述的核酸分離純化柱；以及用于支承所述廢液容器和所述回收容器的支架，該支架位于所述柱支架下面的某一位置上，該支架與所述核酸分離純化柱的相對(duì)位置可以改變。
49.如第47或48項(xiàng)所述的核酸分離純化裝置，其中所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)包括氣嘴，用于從其下緣部噴射壓縮空氣；壓頭，用于承載所述氣嘴，并用于使所述氣嘴相對(duì)于被支承在所述柱支架中的所述核酸分離純化柱垂直移動(dòng)；以及定位裝置，其設(shè)置在所述壓頭上，并用于定位在所述支承機(jī)構(gòu)的臺(tái)架中的所述核酸分離純化柱。
50.如第47至49項(xiàng)中任意一項(xiàng)所述的核酸分離純化裝置，其中所述的分注機(jī)構(gòu)包括洗滌液注入嘴，其用于注入所述洗滌液；回收液注入嘴，其用于注入回收液；注入嘴移動(dòng)架，其用于支承所述的洗滌液注入嘴和所述的回收液注入嘴，并能夠在所述的核酸分離純化柱上依次移動(dòng)，所述的核酸分離純化柱由所述支承機(jī)構(gòu)支承；洗滌液供給泵，其用于從含有所述洗滌液的瓶子中抽吸所述洗滌液，并把該洗滌液供給到所述的洗滌液注入嘴；以及回收液供給泵，其用于從含有所述回收液的瓶子中抽吸所述回收液，并把該回收液供給到所述的回收液注入嘴。
通過使用本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜、把樣品中含有的核酸吸附到多孔膜上、洗滌多孔膜、再使核酸解吸附，可以高效、高純度地分離和純化核酸。此外，使用本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜以分離和純化核酸的方法在實(shí)施時(shí)，分離能力優(yōu)異、相當(dāng)方便并且快速高效，該方法具有優(yōu)異的自動(dòng)操作適應(yīng)性和尺寸縮小適應(yīng)性，并且可以批量生產(chǎn)出分離能力基本上相同的多孔膜。
此外，本發(fā)明可以提供一種核酸分離純化裝置，該裝置使人可以在短時(shí)間內(nèi)高效實(shí)施所述分離純化過程，而不會(huì)造成污染，并且該裝置可以被制成較小的尺寸。


圖1是其蓋子已被移去的本發(fā)明的核酸分離純化裝置的一個(gè)實(shí)施方案的立體圖。
圖2是自動(dòng)裝置的示意圖。
圖3是支承機(jī)構(gòu)中的臺(tái)架的立體圖。
圖4是操作時(shí)的臺(tái)架的立體圖。
圖5是分離和純化核酸的各階段的流程圖。
圖6是核酸分離純化柱的立體圖。
圖7是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案從含有核酸的樣品溶液中分離和純化出的核酸的電泳結(jié)果照片。
圖8是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案從含有核酸的樣品溶液中分離和純化出的核酸的電泳結(jié)果照片。
圖9是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案從含有核酸的樣品溶液中分離和純化出的核酸的電泳結(jié)果照片。
在圖中，1表示自動(dòng)裝置，2表示裝置主體，3表示支承機(jī)構(gòu)，4表示壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，5表示溶液注入機(jī)構(gòu)或分注機(jī)構(gòu)，6表示臺(tái)架，11表示核酸分離純化柱，11b表示核酸吸附性多孔膜，12表示廢液容器，13表示回收容器，40表示壓頭，41表示氣嘴，43表示氣泵，45表示開關(guān)閥，46表示壓力傳感器，49表示壓銷(定位裝置)，50表示注入嘴移動(dòng)架，51w或51r表示注入嘴，52w或52r表示供給泵，56w或56r表示瓶子，61表示立架，62表示柱支架，63表示容器支架，S表示樣品溶液，W表示洗滌液，R表示回收液。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式使用本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜以分離和純化核酸的方法至少包括以下步驟(1)使含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜，把核酸吸附到該核酸吸附性多孔膜上；(2)洗滌其上吸附有核酸的所述的核酸吸附性多孔膜；以及(3)使回收液通過所述的核酸吸附性多孔膜，使得核酸從該核酸吸附性多孔膜解吸附。
優(yōu)選的是，在步驟(1)、(2)和(3)中，所述的含有核酸的樣品溶液、洗滌液和回收液在壓力下通過所述的核酸吸附性多孔膜。
更優(yōu)選的是，在步驟(1)、(2)和(3)中，將所述的含有核酸的樣品溶液、洗滌液和回收液分別注入核酸分離純化柱的第一個(gè)開口中，該柱包含具有至少兩個(gè)開口的容器并包含核酸吸附性多孔膜，并且用壓力差產(chǎn)生裝置在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的所述第一個(gè)開口相連，從而使各注入溶液通過并從另一個(gè)開口排出。通過使含有核酸的樣品溶液、洗滌液和回收液在壓力下通過多孔膜，可以使裝置以緊湊的形式自動(dòng)操作，因此這種技術(shù)是優(yōu)選的。要施加的壓力優(yōu)選為約10到約200kPa，更優(yōu)選為約40到約100kPa。
在上述分離和純化步驟中，從注入含有核酸的樣品溶液的第一步到在核酸分離純化柱外得到核酸的步驟為止，過程可以在10分鐘之內(nèi)完成，或者在優(yōu)選條件下，可以在2分鐘之內(nèi)完成。此外，上述分離和純化核酸的步驟可以使得到的核酸的收率為占樣品中含有的全部核酸的50重量％或以上，或者在優(yōu)選條件下，收率為90重量％或更高。
此外，上述分離和純化核酸的步驟可以回收分子量在1kbp到200kbp、特別是20kbp到140kbp的寬范圍內(nèi)的核酸。即，與常規(guī)采用的使用玻璃濾膜的離心柱方法相比，本方法可以回收分子鏈更長的核酸。
此外，根據(jù)UV一可見光分光光度計(jì)所測得的值(260nm/280nm)來看，上述分離和純化核酸的步驟可使回收的核酸在為DNA時(shí)純度為1.6到2.0，在為RNA時(shí)純度為1.8到2.2。因此，可以穩(wěn)定地得到具有較少污染物的高純度核酸。此外，根據(jù)UV一可見光分光光度計(jì)所測得的值(260nm/280nm)，可回收得到約為1.8的高純度DNA和約為2.0的高純度RNA。
在上述步驟中使用的壓力差產(chǎn)生裝置的實(shí)例包括注射器、移液管、產(chǎn)生加壓的泵(例如Perista泵)，以及減壓生成裝置(例如蒸發(fā)器)。其中，注射器適用于手動(dòng)操作，而泵適用于自動(dòng)化操作。此外，移液管具有可以單手操作的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的是，壓力差產(chǎn)生裝置可拆裝地與核酸分離純化柱的一個(gè)開口相連。
雖然對(duì)本發(fā)明可使用的樣品沒有任何限制，但是其在診斷領(lǐng)域中的實(shí)例包括作為樣品收集的體液，例如全血、血漿、血清、尿、大便、精液和唾液，或者植物(或其一部分)、動(dòng)物(或其一部分)、細(xì)菌、病毒、培養(yǎng)的細(xì)胞以及由生物材料(例如上述樣品的裂解產(chǎn)物和勻漿)制成的溶液。
首先，將這些樣品用含有試劑的水溶液處理，所述試劑使細(xì)胞膜裂解并使核酸溶解(核酸溶解試劑)。這樣就使細(xì)胞膜和核膜分解，并使核酸分散到水溶液中，由此得到含有核酸的樣品溶液。
為了裂解細(xì)胞膜并使核酸溶解，例如，當(dāng)樣品為全血時(shí)，必需進(jìn)行以下步驟(1)除去紅血球，(2)除去各種蛋白質(zhì)，以及(3)裂解白血球和核膜。所必需進(jìn)行的步驟(1)除去紅血球以及(2)除去各種蛋白質(zhì)是為防止它們非特定地吸附到多孔膜上并堵塞多孔膜，以及所必需進(jìn)行的步驟(3)裂解白血球和核膜是為使要提取的核酸溶解。特別是，步驟(3)裂解白血球和核膜是一個(gè)重要的步驟，并且在本發(fā)明方法中，要求核酸在此步驟中溶解。
含有核酸的樣品可以是含有單獨(dú)一種核酸的樣品，或者可以是含有多種不同核酸的樣品。要回收的核酸不受種類的限制，可以是DNA或RNA，可以是單鏈的或雙鏈的以及直鏈的或環(huán)狀的。樣品數(shù)可以為一個(gè)或多個(gè)(使用多個(gè)容器平行處理多個(gè)樣品)。也沒有特別限定要回收的核酸的長度，例如，可以使用長度在幾個(gè)bp到幾個(gè)Mbp之間的任何核酸。為了使操作方便，預(yù)被回收的核酸的長度通常為約幾個(gè)bp到約幾百個(gè)kbp。與常規(guī)用于分離和純化核酸的簡單方法所得到的核酸相比，本發(fā)明用于分離和純化核酸的方法可以迅速回收較長的核酸，并且可以用來回收長度優(yōu)選為50kbp或更長、更優(yōu)選為70kbp或更長、進(jìn)一步優(yōu)選為100kbp或更長的核酸。為了回收較長的DNA，優(yōu)選進(jìn)行溫和的攪拌和吸液。
通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟將在下文描述。在本發(fā)明中，核酸溶解試劑通過使細(xì)胞膜和核膜裂解，而用來使核酸溶解，核酸溶解試劑的實(shí)例包括含有離液鹽(chaotropic salt)、表面活性劑或蛋白酶的溶液。
在此例舉了一種方法，用來作為通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的方法，該方法包括以下步驟(I)把含有細(xì)胞或病毒的樣品注入容器中；(II)把含有離液鹽或表面活性劑的核酸溶解試劑溶液加入容器中，并混合樣品和該核酸溶解試劑溶液；(III)溫育混合而成的溶液；以及(IV)把水溶性有機(jī)溶劑加入經(jīng)溫育的混合溶液中。
在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，通過均質(zhì)處理樣品可提高其對(duì)自動(dòng)化處理的適應(yīng)性。例如，這種均質(zhì)處理可通過超聲波處理、使用尖銳突出物處理、高速攪拌處理、通過細(xì)孔擠出處理或使用玻璃珠處理來實(shí)施。
此外，在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，通過使用含有蛋白酶的核酸溶解試劑，可提高核酸的回收量和回收率，從而可使含有核酸的樣品的用量減少并使分析加速成為可能。
可優(yōu)選使用至少一種選自絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶等中的蛋白酶作為這種蛋白酶。此外，可優(yōu)選使用多種蛋白酶的混合物。
沒有特別限定絲氨酸蛋白酶，例如，可優(yōu)選使用蛋白酶K。沒有特別限定半胱氨酸蛋白酶，例如，可優(yōu)選使用木瓜蛋白酶和組織蛋白酶。
沒有特別限定金屬蛋白酶，例如，可優(yōu)選使用羧肽酶。
蛋白酶的使用量可以優(yōu)選為在添加后達(dá)到每毫升全部反應(yīng)體系有0.001IU到10IU、更優(yōu)選為0.01IU到1IU的蛋白酶。
此外，可優(yōu)選使用不含核酸酶的蛋白酶作為這種蛋白酶。此外，可優(yōu)選使用含有穩(wěn)定劑的蛋白酶?？蓛?yōu)選使用金屬離子作為穩(wěn)定劑。具體地說，優(yōu)選鎂離子，例如，可以以氯化鎂的形式添加。在蛋白酶中加入穩(wěn)定劑可以使回收核酸所需的蛋白酶的量降至微量，從而減少核酸回收所需的費(fèi)用。基于反應(yīng)體系的總量，蛋白酶所用穩(wěn)定劑的量優(yōu)選為1到1000mM、更優(yōu)選為10到100mM。
蛋白酶通過預(yù)先與其它試劑(例如離液鹽和表面活性劑)混合，可以作為一種試劑使用，而用于回收核酸。
或者，蛋白酶可以與其它試劑(例如離液鹽和表面活性劑)分開使用。
在后一情況下，樣品首先與含有蛋白酶的試劑混合，然后把混合物與含有離液鹽和表面活性劑的試劑混合?；蛘撸谑紫劝褬悠放c含有離液酸(chaotropic acid)和表面活性劑的試劑混合后，再混入蛋白酶。
此外，可以從容納蛋白酶的容器逐滴直接加入到樣品或樣品與含有離液鹽和表面活性劑的試劑形成的混合物中，就像滴眼藥水一樣。在此情況下，可簡化操作。
核酸溶解試劑還可以優(yōu)選為以干燥態(tài)供給。此外，例如，可以使用預(yù)先通過冷凍-干燥而得到含有干燥態(tài)蛋白酶的容器。還可以通過同時(shí)使用以干燥態(tài)供給的核酸溶解試劑和預(yù)先含有干燥蛋白酶的容器，得到一種含有核酸的樣品溶液。
在通過上述方法得到含有核酸的樣品溶液的情況下，核酸溶解試劑和蛋白酶具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，并且可以簡化操作，而不會(huì)改變核酸的收率。
對(duì)混合樣品和核酸溶解試劑溶液的方法沒有特別限定。
混合時(shí)，優(yōu)選使用攪拌器在30到3000rpm下混合3分鐘，由此可以提高所分離和純化的核酸的收率。此外，還優(yōu)選用上下翻轉(zhuǎn)(end-over-end)的混合操作方式混合5到30分鐘。此外，還可以通過反復(fù)吸液操作10到50次來實(shí)施混合。在此情況下，通過簡單操作可以提高經(jīng)分離和純化的核酸的收率。
通過在蛋白酶的最佳溫度下以最佳反應(yīng)時(shí)間來溫育樣品和核酸溶解試劑溶液的混合物，可以提高經(jīng)分離和純化的核酸的收率。溫育溫度通常為20℃到70℃，這優(yōu)選為蛋白酶的最佳溫度，溫育時(shí)間通常為1到90分鐘，這優(yōu)選為蛋白酶的最佳溫育時(shí)間。對(duì)溫育方法沒有特別限定，并且可以用浸入熱浴或放入加熱室的方式來實(shí)施。
在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，核酸溶解試劑溶液的pH值優(yōu)選為5到10，更優(yōu)選為6到9，進(jìn)一步優(yōu)選為7到8。
此外，在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，離液鹽在核酸溶解試劑溶液中的濃度優(yōu)選為0.5M或更高，更優(yōu)選為0.5M到4M，進(jìn)一步優(yōu)選為1M到3M。關(guān)于離液鹽，優(yōu)選為鹽酸胍，但是也可以使用其它離液鹽(例如，異硫氰酸胍和硫氰酸胍)。除了離液鹽，還可以使用脲作為離液性物質(zhì)。可以單獨(dú)使用上述鹽或者結(jié)合使用兩種或多種上述鹽。
核酸溶解試劑溶液可以含有水溶性有機(jī)溶劑。優(yōu)選以醇作為水溶性有機(jī)溶劑。醇可以是任何伯醇、仲醇和叔醇?？蓛?yōu)選使用甲醇、乙醇、丙醇及其異構(gòu)體、以及丁醇及其異構(gòu)體作為醇。可以單獨(dú)使用上述水溶性有機(jī)溶劑或者結(jié)合使用兩種或多種上述水溶性有機(jī)溶劑。水溶性有機(jī)溶劑在核酸溶解試劑溶液中的濃度優(yōu)選為1重量％到20重量％。
此外，在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，與樣品混合的表面活性劑的實(shí)例包括非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和兩性表面活性劑。
在本發(fā)明中，可優(yōu)選使用非離子表面活性劑?？梢允褂镁垩鮼喴一榛交杨惐砻婊钚詣?、聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑和脂肪酸烷基酰胺作為非離子表面活性劑，其中優(yōu)選使用聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑。更優(yōu)選的是選自POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亞烷基癸醚、POE失水山梨醇單月桂酸酯、POE脫水山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇的聚氧亞乙基烴基醚類表面活性劑。
此外，也可以優(yōu)選使用陽離子表面活性劑。更優(yōu)選的陽離子表面活性劑是選自溴化十六烷基三甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨和氯化十六烷基吡啶中的陽離子表面活性劑?？梢詥为?dú)使用上述表面活性劑或者結(jié)合使用兩種或多種上述表面活性劑。
表面活性劑在核酸溶解試劑溶液中的濃度優(yōu)選為0.1重量％到20重量％。
在回收除RNA以外的其它核酸(例如DNA)的情況下，在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，優(yōu)選把RNA-分解酶加入核酸溶解試劑溶液中。這樣，可以減少RNA的干擾，否則RNA會(huì)共同出現(xiàn)在回收核酸中。還優(yōu)選添加DNA-分解酶抑制劑。
另一方面，在回收除DNA以外的其它核酸(例如RNA)的情況下，優(yōu)選把DNA-分解酶加入核酸溶解試劑溶液中。這樣，可以減少DNA的干擾，否則DNA會(huì)共同出現(xiàn)在回收核酸中。還優(yōu)選添加RNA-分解酶抑制劑。優(yōu)選以那些專門抑制RNA-分解酶的抑制劑作為所述的RNA-分解酶抑制劑。
對(duì)RNA分解酶沒有特別限定，可以優(yōu)選使用能夠?qū)ｉT分解RNA(例如核糖核酸酶H(RNase H))的酶。
對(duì)DNA分解酶沒有特別限定，可以優(yōu)選使用能夠?qū)ｉT分解DNA的酶(例如DNase I)。
對(duì)核酸酶以及核酸酶抑制劑可以以通常所用的濃度來使用。此外，可實(shí)施熱處理。優(yōu)選在用蛋白酶處理的同時(shí)，實(shí)施這種熱處理。
在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，含有核酸的樣品溶液可優(yōu)選含有消泡劑。消泡劑的優(yōu)選實(shí)例包括兩類，分別為含硅消泡劑和醇類消泡劑。優(yōu)選以炔二醇類表面活性劑作為醇類消泡劑。
消泡劑的具體實(shí)例包括含硅消泡劑(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有機(jī)硅乳液、改性聚硅氧烷和有機(jī)硅復(fù)合物)、醇類消泡劑(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亞烷基二醇)、醚類消泡劑(例如，庚基溶纖劑和壬基溶纖劑-3-庚基山梨糖醇)、脂肪和油類消泡劑(例如，動(dòng)物油和植物油)、脂肪酸類消泡劑(例如，硬脂酸、油酸和棕櫚酸)、金屬皂類消泡劑(例如，硬脂酸鋁和硬脂酸鈣)、脂肪酸酯類消泡劑(例如，天然蠟和磷酸三丁酯)、磷酸鹽類消泡劑(例如，辛基磷酸鈉)、胺類消泡劑(例如，二戊基胺)、酰胺類消泡劑(例如，硬脂酸酰胺)和其它消泡劑(例如，硫酸鐵和礬土)。特別優(yōu)選的是，可以使用含硅消泡劑和醇類消泡劑的組合物作為消泡劑。此外，可優(yōu)選使用炔二醇類消泡劑作為醇類消泡劑。
此外，在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，所得到的含有核酸的樣品溶液的表面張力優(yōu)選為0.050J/m2或更低，其粘度優(yōu)選為1到10000mPa，其比重優(yōu)選為0.8到1.2。
在通過裂解細(xì)胞膜和核膜而使核酸溶解、從而由樣品得到含有核酸的樣品溶液的步驟中，優(yōu)選使用醇作為水溶性有機(jī)溶劑，將其加入所溫育的混合溶液中。可優(yōu)選使用任何伯醇、仲醇和叔醇作為醇?？蓛?yōu)選使用甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及其異構(gòu)體。水溶性有機(jī)溶劑在含有核酸的樣品溶液中的最終濃度優(yōu)選為5重量％到90重量％。
下文要描述本發(fā)明所用的核酸吸附性多孔膜以及吸附步驟。
本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜使溶液可以通過其內(nèi)部。在此，術(shù)語“使溶液可以通過其內(nèi)部”是指當(dāng)在與膜的一面相接觸的空間和與膜的另一面相接觸的空間之間產(chǎn)生壓力差時(shí)，溶液可以從高壓空間通過膜的內(nèi)部到達(dá)低壓空間，或者是指當(dāng)對(duì)膜施加離心力時(shí)，溶液可以以離心方向通過膜的內(nèi)部。
本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜優(yōu)選為以基本上不涉及離子鍵的相互作用而吸附核酸的多孔膜。這意味著在使用多孔膜的條件下，沒有發(fā)生離子化，并且可以推測由于周圍極性改變，核酸和多孔膜相互吸引。因此，可以以優(yōu)異的分離性能和優(yōu)良的洗滌效率來分離和純化核酸。優(yōu)選的是，核酸吸附性多孔膜是具有親水性基團(tuán)的多孔膜，并且可以推測當(dāng)周圍極性改變時(shí)，核酸的親水性基團(tuán)和多孔膜的親水性基團(tuán)相互吸引。在此，術(shù)語“具有親水性基團(tuán)的多孔膜”是指這樣的多孔膜，其中構(gòu)成多孔膜本身的材料具有親水性基團(tuán)，或者是這樣的多孔膜，為了在多孔膜中引入親水性基團(tuán)，通過對(duì)多孔膜構(gòu)成材料進(jìn)行處理或涂覆而得到該多孔膜。多孔膜構(gòu)成材料可以是有機(jī)或無機(jī)材料。例如，可以使用這樣的多孔膜，其中多孔膜構(gòu)成材料本身是具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料；可以使用這樣的多孔膜，為了將親水性基團(tuán)引入其中，通過處理由不含親水性基團(tuán)的有機(jī)材料所制成的多孔膜而得到該多孔膜；可以使用這樣的多孔膜，其中通過用具有親水性基團(tuán)的材料涂覆由不含親水性基團(tuán)的有機(jī)材料所制成的多孔膜，由此引入親水性基團(tuán)而得到該多孔膜；可以使用這樣的多孔膜，其中多孔膜構(gòu)成材料本身是具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料；可以使用這樣的多孔膜，其中為了將親水性基團(tuán)引入其中，通過處理由不含親水性基團(tuán)的無機(jī)材料所制成的多孔膜而得到該多孔膜；并且可以使用這樣的多孔膜，其中通過用具有親水性基團(tuán)的材料涂覆由不含親水性基團(tuán)的無機(jī)材料所制成的多孔膜，由此引入親水性基團(tuán)而得到該多孔膜。為了處理方便，優(yōu)選使用有機(jī)材料(例如有機(jī)聚合物)作為構(gòu)成多孔膜的材料。
親水性基團(tuán)是指能與水發(fā)生相互作用的極性基團(tuán)(原子)，包括所有參與吸附核酸的基團(tuán)(原子)。作為親水性基團(tuán)，優(yōu)選那些與水表現(xiàn)出約為中等水平的相互作用的親水性基團(tuán)(參見由共立出版株式會(huì)社出版的《化學(xué)大詞典》中所述的關(guān)于“親水性基團(tuán)”中的“親水性不太強(qiáng)的基團(tuán)”)，其實(shí)例包括羥基、羧基、氰基和羥乙基，優(yōu)選羥基。
具有羥基的有機(jī)材料多孔膜的實(shí)例包括由下列物質(zhì)形成的多孔膜聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、醋酸纖維素、或者乙酰值不同的醋酸纖維素的混合物。特別是，可優(yōu)選使用具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料多孔膜。
可優(yōu)選使用纖維素、半纖維素、葡聚糖、淀粉酶、淀粉精、淀粉、糖原、支鏈淀粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣淀粉、異地衣淀粉、昆布糖、角叉菜膠、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明質(zhì)酸、軟骨素、甲殼素和殼聚糖作為具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)材料。但是，對(duì)此沒有限制，并可以使用任何具有多糖結(jié)構(gòu)或其衍生物的有機(jī)材料。此外，可優(yōu)選使用任何上述多糖的酯衍生物。此外，可優(yōu)選使用任何上述多糖的酯衍生物的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用選自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯中的一種或多種作為任何上述多糖的酯衍生物的酯。此外，更優(yōu)選使用羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用選自烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯的一種或多種作為任何上述多糖的羧酸酯。此外，更優(yōu)選使用任何上述多糖的烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用選自乙?；⒈；?、丁酰基、戊酰基、庚?；⑿刘；?、癸?；⑹轷；?、十三烷?；?、十六烷酰基和十八烷?；械囊环N或多種作為任何上述多糖的烷基羰基酯的酯基。此外，更優(yōu)選使用具有一個(gè)或多個(gè)選自乙?；⒈；?、丁?；?、戊?；⒏；⑿刘；?、癸?；⑹轷；?、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷?；械孽セ娜魏紊鲜龆嗵堑脑砘a(chǎn)物。
優(yōu)選使用一種或多種丙烯?；图谆；鳛槿魏紊鲜龆嗵堑南┗驶サ孽セ?。此外，更優(yōu)選使用具有一個(gè)或多個(gè)選自丙烯?；图谆；械孽セ娜魏紊鲜龆嗵堑脑砘a(chǎn)物。
優(yōu)選使用一種或多種苯?；洼刘；?naphthaloyl)作為任何上述多糖的芳香基羰基酯的酯基。此外，更優(yōu)選使用具有一個(gè)或多個(gè)含苯?；洼刘；孽セ娜魏紊鲜龆嗵堑脑砘a(chǎn)物。
優(yōu)選使用硝酸纖維素、硝酸半纖維素、硝酸葡聚糖、硝酸瓊脂糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支鏈淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸異地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜膠、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明質(zhì)酸、硝酸軟骨素、硝酸甲殼素和硝酸殼聚糖作為任何多糖的硝酸酯。
此外，更優(yōu)選使用硝酸纖維素、硝酸半纖維素、硝酸葡聚糖、硝酸瓊脂糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支鏈淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸異地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜膠、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明質(zhì)酸、硝酸軟骨素、硝酸甲殼素和硝酸殼聚糖的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用硫酸纖維素、硫酸半纖維素、硫酸葡聚糖、硫酸瓊脂糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支鏈淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸異地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜膠、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸甲殼素和硫酸殼聚糖作為任何多糖的硫酸酯。
此外，更優(yōu)選使用硫酸纖維素、硫酸半纖維素、硫酸葡聚糖、硫酸瓊脂糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支鏈淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸異地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜膠、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸甲殼素和硫酸殼聚糖的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選選自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯中的一種或多種作為任何上述多糖的磺酸酯。此外，更優(yōu)選使用任何上述多糖的烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用磷酸纖維素、磷酸半纖維素、磷酸葡聚糖、磷酸瓊脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支鏈淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸異地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜膠、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明質(zhì)酸、磷酸軟骨素、磷酸甲殼素和磷酸殼聚糖作為任何上述多糖的磷酸酯。
此外，更優(yōu)選使用磷酸纖維素、磷酸半纖維素、磷酸葡聚糖、磷酸瓊脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支鏈淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸異地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜膠、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明質(zhì)酸、磷酸軟骨素、磷酸甲殼素和磷酸殼聚糖的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用膦酸纖維素、膦酸半纖維素、膦酸葡聚糖、膦酸瓊脂糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支鏈淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸異地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜膠、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明質(zhì)酸、膦酸軟骨素、膦酸甲殼素和膦酸殼聚糖作為任何上述多糖的膦酸酯。
此外，更優(yōu)選使用膦酸纖維素、膦酸半纖維素、膦酸葡聚糖、膦酸瓊脂糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支鏈淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸異地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜膠、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明質(zhì)酸、膦酸軟骨素、膦酸甲殼素和膦酸殼聚糖的各自的皂化產(chǎn)物。
優(yōu)選使用焦磷酸纖維素、焦磷酸半纖維素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸瓊脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支鏈淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸異地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜膠、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明質(zhì)酸、焦磷酸軟骨素、焦磷酸甲殼素和焦磷酸殼聚糖作為任何上述多糖的焦磷酸酯。
此外，更優(yōu)選使用焦磷酸纖維素、焦磷酸半纖維素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸瓊脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支鏈淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸異地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜膠、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明質(zhì)酸、焦磷酸軟骨素、焦磷酸甲殼素和焦磷酸殼聚糖的各自的皂化產(chǎn)物。
可以使用甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧乙基纖維素、羧乙基-氨基甲酰乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基甲基纖維素、氰乙基纖維素和氨基甲酰乙基纖維素作為任何上述多糖的醚類衍生物，但是其醚類衍生物并不限定于此。優(yōu)選使用羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。
還可以優(yōu)選使用其中的羥基被以任意程度鹵化取代的任何多糖。
作為包含具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物的多孔膜，其優(yōu)選實(shí)例為醋酸纖維素。還可以使用這樣的有機(jī)聚合物的多孔膜，其中所述有機(jī)聚合物包含乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物?？蓛?yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物、三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物、三醋酸纖維素和二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物作為乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物。特別是，可優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合比(以重量計(jì))優(yōu)選為99∶1到1∶99，更優(yōu)選為90∶10到50∶50。
在專利文獻(xiàn)JP-A-2003-128691中例舉了一種包含表面皂化的醋酸纖維素的多孔膜來作為特別優(yōu)選的包含醋酸纖維素的多孔膜。表面皂化的醋酸纖維素是對(duì)乙酰值不同的醋酸纖維素的混合物進(jìn)行皂化處理而得到的產(chǎn)物，還可以優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物、三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物、三醋酸纖維素和二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物以及二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物。更優(yōu)選使用三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物。三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合比(以重量計(jì))優(yōu)選為99∶1到1∶99，更優(yōu)選為90∶10到50∶50。在此情況下，可通過調(diào)節(jié)皂化處理的程度(皂化率)來控制固相表面上羥基的量(密度)。為了提高分離核酸的效率，優(yōu)選使羥基的量(密度)更高。由皂化處理得到的多孔膜的皂化率(表面皂化率)優(yōu)選為5％到100％，更優(yōu)選為10％到100％。
多孔膜優(yōu)選為皂化處理后平均孔徑小于皂化處理前平均孔徑的多孔膜。優(yōu)選這樣的多孔膜，其皂化處理后的平均孔徑與皂化處理前的平均孔徑之比為0.8或更低，更優(yōu)選該比值為0.5或更低的多孔膜。
皂化處理是指使醋酸纖維素與皂化處理液(例如，氫氧化鈉水溶液)接觸。與皂化處理液接觸的部分醋酸纖維素轉(zhuǎn)化成再生纖維素，由此引入羥基。如此制備的再生纖維素在結(jié)晶形態(tài)等方面與初始纖維素不同。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用再生纖維素的多孔膜作為多孔膜。
此外，為了改變?cè)砘?，通過改變氫氧化鈉濃度來實(shí)施皂化處理是足夠的。通過NMR、IR或XPS，很容易測得皂化率(例如，通過羰基峰減弱的程度來測定)。
作為把羥基引入不含羥基的多孔膜中的方法，可以把在其聚合物主鏈或側(cè)鏈上具有羥基的接枝聚合物連接到多孔膜上。
有兩種方法可作為把接枝聚合物鏈連接到有機(jī)材料多孔膜的方法一種方法是把多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)連接；另一種方法是使具有可聚合的雙鍵的化合物從多孔膜開始聚合，以形成接枝聚合物鏈。
首先，在把多孔膜和聚合物鏈化學(xué)連接的方法中，聚合物在其末端或側(cè)鏈上具有能與多孔膜反應(yīng)的官能團(tuán)，該官能團(tuán)與多孔膜的官能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，由此形成接枝。對(duì)于可與多孔膜反應(yīng)的官能團(tuán)沒有特別限定，只要其可以與多孔膜的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)即可，其實(shí)例包括硅烷偶聯(lián)基(例如烷氧基硅烷)、異氰酸基、氨基、羥基、羧基、磺酸基、磷酸基、環(huán)氧基、烯丙基、甲基丙烯?；捅；?。
特別有用的在聚合物末端或側(cè)鏈上具有反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物的實(shí)例包括在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有環(huán)氧基的聚合物以及在其末端具有異氰酸基的聚合物。對(duì)在此使用的聚合物沒有特別限定，只要其具有參與吸附核酸的親水性基團(tuán)即可，具體實(shí)例包括聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯及其鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽以及聚氧乙烯。
通過使具有可聚合雙鍵的化合物從多孔膜開始聚合以形成接枝聚合物鏈的方法通常被稱為表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是這樣一種方法其中通過用等離子體或光輻射或通過加熱，在基材的表面上形成活性部位，將具有可聚合雙鍵的化合物與多孔膜接觸放置，該化合物從活性部位開始聚合，由此連接到多孔膜上。
用于形成與基材相連的接枝聚合物鏈的化合物必須具有可聚合的雙鍵和參與吸附核酸的親水性基團(tuán)?？梢允褂萌魏尉哂杏H水性基團(tuán)的聚合物、具有親水性基團(tuán)的低聚物和具有親水性基團(tuán)的單體作為這種化合物，只要在其分子內(nèi)具有雙鍵即可。特別有用的化合物是具有親水性基團(tuán)的單體。
可以使用下列單體作為具有親水性基團(tuán)的單體的特別有用的具體實(shí)例。例如，可以特別優(yōu)選使用具有羥基的單體，例如丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯和單甲基丙烯酸甘油酯。此外，可優(yōu)選使用具有羧基的單體，例如丙烯酸和甲基丙烯酸，或者其堿金屬鹽和胺鹽。
作為另一種把親水性基團(tuán)引入到包含不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料的多孔膜中的方法，可以用具有親水性基團(tuán)的材料進(jìn)行涂覆。對(duì)用于涂覆的材料沒有特別限定，只要其具有參與吸附核酸的親水性基團(tuán)即可。為了使操作簡單，優(yōu)選為有機(jī)材料聚合物。聚合物的實(shí)例包括聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯及其鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽、聚氧化亞乙基、醋酸纖維素以及乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物，其中優(yōu)選具有多糖結(jié)構(gòu)的聚合物。
此外，在把醋酸纖維素或乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物涂覆到不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜上之后，可對(duì)所涂覆的醋酸纖維素或乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物進(jìn)行皂化處理。在此情況下，皂化率優(yōu)選為約5％或更高，更優(yōu)選為約10％或更高。
可以例舉一種含有二氧化硅化合物的多孔膜作為包含具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料的多孔膜。含有二氧化硅化合物的多孔膜的實(shí)例包括如日本專利3,058,342所述的玻璃濾膜和二氧化硅多孔薄膜。這種二氧化硅多孔薄膜可以如此形成把能夠形成雙分子膜的陽離子兩性物質(zhì)的溶液分散到基材上，除去基材上液體膜的溶劑以形成兩性物質(zhì)的多層雙分子薄膜，使該多層雙分子薄膜與含有二氧化硅化合物的溶液接觸，然后取下多層雙分子薄膜。
有兩種方法可作為把親水性基團(tuán)引入不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料中的方法一種方法是把多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)連接；另一種方法是使用單體從多孔膜開始形成接枝聚合物鏈，所述單體的分子內(nèi)具有可聚合的雙鍵。
在把多孔膜和聚合物鏈化學(xué)連接的方法中，把可以和接枝聚合物的末端官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)引入無機(jī)材料中，并且使接枝聚合物與引入無機(jī)材料中的官能團(tuán)化學(xué)連接。此外，在使用分子內(nèi)具有雙鍵并具有親水性基團(tuán)的單體、并且使該單體從多孔膜開始聚合從而形成接枝聚合物鏈的情況下，把官能團(tuán)引入無機(jī)材料中，該官能團(tuán)在具有雙鍵的化合物發(fā)生聚合時(shí)發(fā)揮起點(diǎn)的作用。可優(yōu)選使用在談到使多孔膜和接枝聚合物鏈化學(xué)結(jié)合的時(shí)候所例舉的那些具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物和那些分子內(nèi)具有雙鍵并具有親水性基團(tuán)的單體，來作為具有親水性基團(tuán)的接枝聚合物和分子內(nèi)具有雙鍵并具有親水性基團(tuán)的單體。
作為另一種把親水性基團(tuán)引入到包含不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料的多孔膜中的方法，可以用具有親水性基團(tuán)的材料進(jìn)行涂覆。對(duì)用于涂覆的材料沒有特別限定，只要其具有參與吸附核酸的親水性基團(tuán)即可。為了使操作簡單，優(yōu)選為有機(jī)材料聚合物。聚合物的實(shí)例包括聚丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯及其鹽、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其鹽、聚氧化亞乙基、醋酸纖維素以及乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物。
此外，在把醋酸纖維素或乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物涂覆到不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜上之后，可對(duì)所涂覆的醋酸纖維素或乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物進(jìn)行皂化處理。在此情況下，皂化率優(yōu)選為約5％或更高，更優(yōu)選為約10％或更高。
包含不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料的多孔膜的實(shí)例包括由金屬(例如鋁)、玻璃、水泥、陶瓷(例如陶)、新型陶瓷、硅或活性炭加工而成的多孔膜。
可以使用厚度為10μm到500μm的多孔膜作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜。更優(yōu)選的是，可以使用厚度為50μm到250μm的多孔膜。為了使洗滌方便，多孔膜最好具有較薄的厚度。
此外，優(yōu)選使用平均孔徑為0.9μm到5.0μm的多孔膜作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜。更優(yōu)選的是，使用平均孔徑為1.5到3.5μm的多孔膜。這種孔徑大小提供了充足的吸附核酸的表面積并減少了堵塞，因此是優(yōu)選的?？筛鶕?jù)泡點(diǎn)法(以ASTMF316-86和JISK3832為基礎(chǔ))確定溶液可從中通過的多孔膜的平均孔徑大小。
溶液可從中通過的固相可以是其前表面和后表面彼此對(duì)稱的多孔膜，但優(yōu)選為前表面和后表面彼此不對(duì)稱的多孔膜。在本文中使用的術(shù)語“前表面和后表面彼此不對(duì)稱”是指從多孔膜的一面到其另一面，膜的物理及/或化學(xué)性能發(fā)生變化。物理性能的實(shí)例是平均孔徑大小。此外，化學(xué)性能的實(shí)例是皂化度。在使用其前表面和后表面在平均孔徑大小方面彼此不對(duì)稱的多孔膜的情況下，優(yōu)選進(jìn)行調(diào)節(jié)，使平均孔徑沿著溶液通過膜的方向，從較大尺寸變?yōu)檩^小尺寸。優(yōu)選使用最大孔徑/最小孔徑之比為2或2以上的多孔膜。最大孔徑/最小孔徑之比更優(yōu)選為5或5以上。由此可以得到充足的吸附核酸的表面積，并且很難發(fā)生堵塞。
此外，可以使用空隙容積為50％到95％的多孔膜作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜。更優(yōu)選的是，可以使用空隙容積為65到80％的多孔膜。此外，可以使用泡點(diǎn)為0.1kgf/cm2到10kgf/cm2的多孔膜作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜。更優(yōu)選的是，可以使用泡點(diǎn)為0.2到4kgf/cm2的多孔膜。
此外，優(yōu)選使用壓力損失為0.1kPa到100kPa的多孔膜作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜。通過施加壓力，這種膜可達(dá)到均勻的壓力，因此是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是，可以使用壓力損失為0.5到50kPa的多孔膜。在本文所用的術(shù)語“壓力損失”是指水每通過100μm的膜厚所需要的最小壓力。
此外，可以使用當(dāng)在25℃下施加1kg/cm2的壓力時(shí)水以每分鐘1到5000mL/cm2的量通過的多孔膜作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜。更優(yōu)選的是，可以使用當(dāng)在25℃下施加1kg/cm2的壓力時(shí)水以每分鐘5到1000mL/cm2的量通過的多孔膜。
此外，優(yōu)選使用每毫克膜的核酸吸附量為0.1μg或更高的多孔膜作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜。更優(yōu)選的是，可以使用每毫克膜的核酸吸附量為0.9μg或更高的多孔膜。
此外，作為溶液可從中通過的上述核酸吸附性多孔膜，優(yōu)選使用的多孔膜為，當(dāng)將5×5mm的正方形的該膜樣品浸入5mL三氟醋酸中時(shí)，在1小時(shí)內(nèi)不溶解，但在48小時(shí)內(nèi)溶解。此外，可優(yōu)選使用包含纖維素衍生物的多孔膜，當(dāng)將5×5mm的正方形的該膜樣品浸入5mL三氟醋酸中時(shí)，在1小時(shí)內(nèi)溶解，但是當(dāng)浸入5mL二氯甲烷中時(shí)，在48小時(shí)內(nèi)不溶解。
在使含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜的情況下，為了使溶液與多孔膜均勻接觸，優(yōu)選使樣品溶液從膜的一面通過而到達(dá)另一面。在使含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜的情況下，為了減少堵塞，優(yōu)選使樣品溶液從孔徑較大的一側(cè)通過而到達(dá)孔徑較小的一側(cè)。
在使含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜的情況下，為了使溶液和多孔膜達(dá)到適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間，流速優(yōu)選為2到1500μL/秒/cm2膜面積。如果溶液和多孔膜的接觸時(shí)間太短，則不能達(dá)到充分分離和純化的效果，而從操作方面來說，接觸時(shí)間太長是不利的。此外，流速更優(yōu)選為5到700μL/秒/cm2膜面積。
此外，所用溶液可從中通過的核酸吸附性多孔膜的數(shù)目可以是一個(gè)，但是也可以使用多個(gè)膜。多個(gè)核酸吸附性多孔膜可以彼此相同或彼此不同。
可以使用這樣的核酸分離純化柱，其中上述的溶液可從中通過的核酸吸附性多孔膜由具有至少兩個(gè)開口的容器所容納。此外，可優(yōu)選使用這樣的核酸分離純化柱，其中上述的溶液可從中通過的多個(gè)核酸吸附性多孔膜由具有至少兩個(gè)開口的容器所容納。在此情況下，由具有至少兩個(gè)開口的容器所容納的多個(gè)核酸吸附性多孔膜可以彼此相同或彼此不同。
多個(gè)核酸吸附性多孔膜可以是包含無機(jī)材料的核酸吸附性多孔膜和包含有機(jī)材料的核酸吸附性多孔膜的組合。例如，在此例舉一種玻璃濾膜和再生纖維素多孔膜的組合。此外，多個(gè)核酸吸附性多孔膜可以是包含無機(jī)材料的核酸吸附性多孔膜和包含有機(jī)材料的核酸吸附性多孔膜的組合。例如，在此例舉一種玻璃濾膜和尼龍或聚砜多孔膜的組合。
核酸分離純化柱優(yōu)選為裝在具有至少兩個(gè)開口的容器中，除了容納上述的溶液可從中通過的核酸吸附性多孔膜以外，不容納其它膜。可以使用塑料(例如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯)作為容器材料。此外，還可以使用可生物降解的材料。容器可以是透明的或有顏色的。
可以使用配有識(shí)別各柱的裝置的核酸分離純化柱作為上述的核酸分離純化柱。識(shí)別各個(gè)核酸分離純化柱的裝置的實(shí)例包括條形碼和磁帶。
此外，可以使用這樣的核酸分離純化柱，該柱所具有的結(jié)構(gòu)可以使核酸吸附性多孔膜很容易從具有至少兩個(gè)開口的容器中取出。
可以使用上述的核酸分離純化柱通過以下步驟分離和純化核酸，其中該柱具有核酸吸附性多孔膜，各溶液可通過該膜。
上述步驟為(a)把含有核酸的樣品溶液注入到核酸分離純化柱的第一個(gè)開口中，該柱包含具有至少兩個(gè)開口的容器，并且具有核酸吸附性多孔膜，所述樣品溶液可通過該膜；(b)使用壓力差產(chǎn)生裝置在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口相連，從而使注入的含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，由此使核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；(c)把洗滌液注入到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口中；(d)使用壓力差產(chǎn)生裝置在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口相連，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，由此洗滌核酸吸附性多孔膜，而保持核酸仍被吸附；(e)把回收液注入到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口中；以及(f)使用壓力差產(chǎn)生裝置在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口相連，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，從而使核酸從核酸吸附性多孔膜解吸附并從核酸分離純化柱的容器中排出。
在另一實(shí)施方案中，可以進(jìn)行以下步驟(a)把含有核酸的樣品溶液注入到核酸分離純化柱的第一個(gè)開口中，該柱包含具有至少兩個(gè)開口的容器，并且具有核酸吸附性多孔膜，所述樣品溶液可通過該膜；(b)使用壓力差產(chǎn)生裝置在核酸分離純化柱中形成減壓環(huán)境，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的另一個(gè)開口相連，從而使注入的含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，由此使核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；(c)把洗滌液注入到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口中；(d)使用壓力差產(chǎn)生裝置在核酸分離純化柱中形成減壓環(huán)境，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的另一個(gè)開口相連，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，由此洗滌核酸吸附性多孔膜，而保持核酸仍被吸附；(e)把回收液注入到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口中；以及(f)使用壓力差產(chǎn)生裝置在核酸分離純化柱中形成減壓環(huán)境，該壓力差產(chǎn)生裝置與核酸分離純化柱的另一個(gè)開口相連，或者把離心力施加到核酸分離純化柱上，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，從而使核酸從核酸吸附性多孔膜解吸附并從核酸分離純化柱的容器中排出。
在另一種實(shí)施方案中，可以進(jìn)行以下步驟(a)把含有核酸的樣品溶液注入到核酸分離純化柱的第一個(gè)開口中，該柱包含具有至少兩個(gè)開口的容器，并且具有核酸吸附性多孔膜，所述樣品溶液可通過該膜；(b)把離心力施加到核酸分離純化柱上，從而使注入的含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，由此使核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；(c)把洗滌液注入到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口中；(d)把離心力施加到核酸分離純化柱上，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，由此洗滌核酸吸附性多孔膜，而保持核酸仍被吸附；(e)把回收液注入到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口中；以及(f)把離心力施加到核酸分離純化柱上，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，從而使核酸從核酸吸附性多孔膜解吸附并從核酸分離純化柱的容器中排出。
洗滌步驟如下所述。洗滌操作用于提高核酸的回收量和回收純度并使含有核酸的樣品必需量減少。此外，通過自動(dòng)進(jìn)行洗滌和回收操作，可以使該操作更加方便快捷。為快速完成操作可以只進(jìn)行一次洗滌步驟，而在純度更加重要的情況下，優(yōu)選重復(fù)進(jìn)行幾次洗滌操作。
在洗滌步驟中，使用管子、移液管或自動(dòng)注入裝置或功能與上述各裝置相同的設(shè)備，把洗滌液送入核酸分離純化柱中，該柱中有核酸吸附性多孔膜。由此送入的洗滌液通過核酸分離純化柱的一個(gè)開口(含有核酸的樣品溶液已通過該開口注入)，并使用壓力差產(chǎn)生裝置(例如，滴液管、注射器、泵或電動(dòng)移液管)在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使洗滌液通過核酸吸附性多孔膜并從核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。此外，還可以使洗滌液由一個(gè)開口送入并由同一開口排出。此外，還可以使洗滌液由核酸分離純化柱的一個(gè)開口送入，該開口與送入含有核酸的樣品溶液所用的開口不同。但是，一種方法是由核酸分離純化柱的一個(gè)開口送入洗滌液，使洗滌液通過核酸吸附性多孔膜并由一個(gè)與送入洗滌液的開口不同的開口排出，這種方法的洗滌效率很好，因此是優(yōu)選的。
在洗滌步驟中，洗滌液的用量優(yōu)選為2μl/mm2或更多。如果洗滌液用量大，則會(huì)提高洗滌效率。為了保持良好的可操作性并防止樣品經(jīng)洗滌損失，其用量優(yōu)選為200μl/mm2或更少。
在洗滌步驟中，洗滌液通過核酸吸附性多孔膜的流速對(duì)于每平方厘米(cm2)的柱中膜面積優(yōu)選為2到1500μL/秒，更優(yōu)選為5到700μL/秒。當(dāng)降低流速以延長洗滌時(shí)，洗滌效率會(huì)大大提高。但是，加速進(jìn)行分離和純化核酸的操作也很重要，因此選擇上述范圍。
在洗滌步驟中，洗滌液的溫度優(yōu)選為4到70℃。更優(yōu)選的是，洗滌液的溫度為室溫。
此外，在洗滌步驟中，還可以在進(jìn)行洗滌的同時(shí)，通過對(duì)核酸分離純化柱進(jìn)行機(jī)械振動(dòng)或施加超聲波而攪拌，或者可以通過離心進(jìn)行洗滌。
在洗滌步驟中，一般不把酶(例如核酸酶)加入洗滌液中，但是可以加入能分解雜質(zhì)(例如蛋白質(zhì))的酶。此外，在某些情況下，可以加入DNA-分解酶或RNA-分解酶。通過使用含有DNA-分解酶的洗滌液，樣品中僅RNA被選擇性回收。相反，通過使用含有RNA-分解酶的洗滌液，樣品中僅DNA被選擇性回收。
在洗滌步驟中，洗滌液優(yōu)選為含有水溶性有機(jī)溶劑及/或水溶性鹽的溶液。要求洗滌液發(fā)揮以下功能要洗去與核酸一起吸附到核酸吸附性多孔膜上的樣品溶液中所含的雜質(zhì)。因此，洗滌液必須具有這樣的組成物，其僅使雜質(zhì)從核酸吸附性多孔膜解吸附，而不會(huì)使核酸解吸附。為此，水溶性有機(jī)溶劑(例如醇)適用于使核酸以外的其它成分解吸附，因?yàn)楹怂嵩谶@種溶劑中是微溶的，所以核酸仍留在多孔膜上。此外，添加水溶性鹽可增強(qiáng)核酸的吸附效果，因此會(huì)使選擇性除去不必要成分的能力增強(qiáng)。
可優(yōu)選使用甲醇、乙醇、異丙醇、正-異丙醇、丁醇和丙酮作為加入洗滌液中的水溶性有機(jī)溶劑。其中，優(yōu)選使用乙醇。洗滌液中水溶性有機(jī)溶劑的添加量優(yōu)選為20重量％到100重量％，更優(yōu)選為40重量％到80重量％。
另一方面，加入洗滌液中的水溶性鹽優(yōu)選為鹵鹽，其中優(yōu)選氯化物。此外，水溶性鹽優(yōu)選為一價(jià)陽離子或二價(jià)陽離子的鹽，特別優(yōu)選堿性金屬鹽或堿土金屬鹽。其中，優(yōu)選鈉鹽和鉀鹽，最優(yōu)選鈉鹽。
在洗滌液中加入水溶性鹽的情況下，其濃度優(yōu)選為10mM/L或更高。沒有特別限定該濃度的上限，該濃度上限可以在不損害雜質(zhì)溶解性的范圍內(nèi)變化。但是，該濃度優(yōu)選為1M/L或更低，更優(yōu)選為0.1M/L或更低。
水溶性鹽特別優(yōu)選氯化鈉，其濃度特別優(yōu)選為20mM/L或更高。
優(yōu)選不含任何離液性物質(zhì)的洗滌液，這樣可以減小把離液性物質(zhì)帶入在洗滌步驟之后的回收步驟的可能性。如果把離液性物質(zhì)帶入回收步驟，則通常會(huì)抑制酶反應(yīng)(例如PCR)。因此，考慮到隨后的酶反應(yīng)，最好是洗滌液中不含離液性物質(zhì)。此外，因?yàn)殡x液性物質(zhì)具有腐蝕性和危害性，所以為了測試操作的安全性，不需要離液性物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員極為有利。
如前所述，離液性物質(zhì)是脲、胍鹽、異氰酸鈉、碘化鈉、碘化鉀等。
此前，在分離和純化核酸過程的洗滌步驟中，因?yàn)槿芤簩?duì)容器的潤濕性能，所以洗滌液通常殘留在容器(例如柱)中。因?yàn)橄礈煲罕粠朐谙礈觳襟E之后的回收步驟，所以這是所得核酸純度降低的原因或者是隨后步驟的反應(yīng)性降低的原因。因此，在使用容器(例如柱)來實(shí)施核酸吸附和解吸附的情況下，最重要的是吸附或洗滌所用的溶液(特別是洗滌液)不應(yīng)殘留在核酸分離純化柱內(nèi)，以避免對(duì)隨后的步驟造成有害影響。
因此，為了防止把洗滌步驟所用的洗滌液帶入隨后的回收液中并使核酸分離純化柱內(nèi)洗滌液的殘留量達(dá)到最小，洗滌液的表面張力優(yōu)選為0.035J/m2或更低。通過降低洗滌液的表面張力，可改善洗滌液和核酸分離純化柱之間的潤濕性能，因此溶液殘留量會(huì)降低。
反之，為了降低核酸分離純化柱內(nèi)洗滌液的殘留量，洗滌液的表面張力可調(diào)節(jié)到0.035J/m2或更高，從而使抗水性增強(qiáng)，以形成向下流動(dòng)的液滴。根據(jù)多孔膜(其具有吸附于其上的核酸)、回收液和洗滌液的組合情況來選擇合適的表面張力。
使用本發(fā)明的核酸吸附性多孔膜可以簡化洗滌步驟。即，(1)洗滌液通過核酸吸附性多孔膜的次數(shù)可以為一次，(2)洗滌步驟可在室溫下進(jìn)行，(3)洗滌后，可立即把回收液注入核酸分離純化柱中，以及(4)可以進(jìn)行一次或多次的步驟(1)、(2)和(3)。在常規(guī)方法中，為了快速除去洗滌液中所含的有機(jī)溶劑，通常需要干燥步驟。但是，因?yàn)楸景l(fā)明的核酸吸附性多孔膜厚度很薄，所以不需要干燥步驟。
在分離和純化核酸的過程中，洗滌步驟存在以下問題洗滌液經(jīng)常四散并落到其它部位上，因此會(huì)造成樣品污染。通過合理設(shè)計(jì)核酸分離純化柱的形狀和廢液容器的形狀，可以避免這種在洗滌步驟中受到的污染，所述柱包含具有兩個(gè)開口的容器并且具有核酸吸附性膜。
下文描述核酸從核酸吸附性膜解吸附以回收核酸的步驟。
在回收步驟中，使用管子、移液管或自動(dòng)注入裝置或功能與上述各裝置相同的設(shè)備，把回收液送入核酸分離純化柱中，該柱中配有核酸吸附性多孔膜。回收液通過核酸分離純化柱的一個(gè)開口送入(含有核酸的樣品溶液已通過該開口注入)，并使用壓力差產(chǎn)生裝置(例如，滴液管、注射器、泵或電動(dòng)移液管)在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使回收液通過核酸吸附性多孔膜并從不同于上述開口的另一個(gè)開口排出。此外，還可以使回收液由一個(gè)開口送入并由同一開口排出。此外，還可以使回收液由核酸分離純化柱的一個(gè)開口送入，該開口與送入含有核酸的樣品溶液的開口不同。但是，一種方法是由核酸分離純化柱的一個(gè)開口送入回收液，使回收液通過核酸吸附性多孔膜并由一個(gè)與送入該回收液的開口不同的開口排出，這種方法的回收效率很好，因此是優(yōu)選的。
可以基于含有核酸并由樣品制成的樣品溶液的體積來調(diào)節(jié)回收液的體積，實(shí)施核酸解吸附。含有經(jīng)分離和純化的核酸的回收液的量根據(jù)所用樣品的量而變化。回收液的通常用量一般為數(shù)十微升到數(shù)百微升。但是，當(dāng)樣品量極小，或與此相反，當(dāng)需要分離和純化大量核酸時(shí)，回收液的量可以在1μl到數(shù)十毫升的范圍內(nèi)變化。
可以使用純化的蒸餾水或緩沖水溶液(例如Tris/EDTA緩沖溶液)作為回收液。此外，在用回收的核酸進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的情況下，可以使用PCR反應(yīng)所用的緩沖溶液(例如，含有最終濃度為50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-Cl以及1.5mmol/L的MgCl2的水溶液)。
回收液的pH值優(yōu)選為2到11，更優(yōu)選為5到9?；厥找褐械碾x子濃度和鹽的濃度對(duì)所吸附的核酸的洗脫有影響?；厥找旱碾x子濃度優(yōu)選為290mmol/L或更低，鹽的濃度優(yōu)選為90mmol/L或更低。用這種回收液可提高核酸的回收率，從而回收更多核酸。要回收的核酸可以是任何DNA、RNA、單鏈核酸、雙鏈核酸、直鏈核酸和環(huán)狀核酸。
通過使用體積小于含有核酸的初始樣品溶液的體積的回收液，可以得到含有濃縮核酸的回收液?；厥找后w積與樣品溶液體積之比可優(yōu)選為1∶100到99∶100，更優(yōu)選為1∶10到9∶10，由此很容易使核酸濃縮，而不用在分離和純化核酸的步驟之后，實(shí)施任何濃縮操作。因此，可以提供這樣的方法，通過該方法可得到其核酸濃度大于樣品中的核酸濃度的核酸溶液。
作為另一種方法，通過在下述條件下使核酸解吸附，可以得到含有所需濃度核酸的回收液，該條件是回收液的體積大于含有核酸的初始樣品溶液的體積。因此，可以得到含有核酸的回收液，其濃度適合于隨后的步驟(例如，PCR)?；厥找后w積與樣品溶液體積之比可優(yōu)選為1∶1到50∶1，更優(yōu)選為1∶1到5∶1，從而提供如下優(yōu)點(diǎn)在分離和純化核酸之后，可取消麻煩的濃度調(diào)節(jié)操作。此外，使用足夠體積的回收液可提高從多孔膜回收的核酸的回收率。
此外，通過改變回收液的溫度，很容易回收核酸。例如，使用溫度為0到10℃的回收液使核酸從多孔膜解吸附，可降低核酸酶的作用，而不用任何試劑或任何特別操作來避免由核酸酶造成的分解，因此可避免核酸分解并且簡單高效地得到核酸溶液。
此外，當(dāng)回收液的溫度調(diào)節(jié)到10到35℃時(shí)，可在室溫回收核酸，因此不用采取復(fù)雜步驟使核酸解吸附、分離和純化。
在另一種方法中，通過把回收液的溫度調(diào)節(jié)到更高溫度(例如35到70℃)，可容易地以高回收率使核酸從多孔膜解吸附，而不用任何復(fù)雜操作。
回收液注入的次數(shù)不受限制，注入次數(shù)可以為一次或多次。通常，在需要方便快捷地分離和純化核酸的情況下，進(jìn)行一次注入。但是，例如在需要回收大量核酸的情況下，在某些情況下回收液要注入多次。
在回收步驟中，可以調(diào)整用于回收核酸的回收液的組成，從而使之在后續(xù)步驟中可以照樣使用。如此分離和純化的核酸通常用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法擴(kuò)增。在此情況下，經(jīng)分離和純化的含有核酸的溶液必須用適合于PCR方法的緩沖溶液稀釋。在本發(fā)明的回收步驟中，使用適合于PCR方法的緩沖溶液作為回收液，可以使溶液方便快捷地用于隨后的PCR步驟。
此外，在回收步驟中，可以把穩(wěn)定劑加入核酸回收液中。要添加的穩(wěn)定劑的實(shí)例包括抗微生物劑、抗真菌劑和核酸分解抑制劑。在此例舉EDTA作為核酸酶抑制劑。作為另一個(gè)實(shí)施方案，穩(wěn)定劑可以預(yù)先加入回收容器中。
對(duì)回收步驟中所用的回收容器沒有特別限定，可以使用由不吸收260nm的光的材料制成的回收容器。用該容器可以測定核酸溶液的濃度，而不用把溶液轉(zhuǎn)移到其它容器中。不吸收260nm的光的材料實(shí)例包括石英玻璃等，但是材料并不限定于此。
使用核酸分離純化柱和壓力差產(chǎn)生裝置從含有核酸的樣品中分離和純化核酸的步驟優(yōu)選使用自動(dòng)裝置來實(shí)施，其中各步驟是自動(dòng)實(shí)施的，該柱包含具有兩個(gè)開口的容器并且具有核酸吸附性多孔膜。該裝置使操作方便快捷，并且不管操作人員能力如何，都可以提供具有特定質(zhì)量水平的核酸。
一個(gè)自動(dòng)裝置的實(shí)施方案是其中從含有核酸的樣品中分離和純化核酸的步驟是使用核酸分離純化柱和壓力產(chǎn)生器自動(dòng)實(shí)施的，所述柱包含具有至少兩個(gè)開口的容器，并且具有核酸吸附性多孔膜。但是，自動(dòng)裝置并不僅限于此。
本發(fā)明的自動(dòng)裝置是用于自動(dòng)地分離純化核酸的裝置，其中把含有核酸的樣品溶液注入具有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱中，形成加壓環(huán)境使樣品溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，把洗滌液注入核酸分離純化柱中，形成加壓環(huán)境以除去雜質(zhì)，把回收液注入核酸分離純化柱中，使吸附到核酸吸附性多孔膜上的核酸解吸附，并把核酸和回收液一起回收。該自動(dòng)裝置包括支承機(jī)構(gòu)，其用于支承核酸分離純化柱；被排放樣品溶液和被排放洗滌液所用的廢液容器，以及容納含有核酸的回收液的回收容器；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，其用于把壓縮空氣引入核酸分離純化柱中；以及分注機(jī)構(gòu)，其用于分別把洗滌液和回收液注入核酸分離純化柱中。
所述支承機(jī)構(gòu)優(yōu)選為這樣的機(jī)構(gòu)，其具有在裝置主體上安裝的立架；承載于立架上可垂直移動(dòng)的柱支架，該柱支架支承著核酸分離純化柱；以及用于支承廢液容器和回收容器的支架，該支架位于柱支架的下面的某一位置上，從而使其與核酸分離純化柱的相對(duì)位置可以改變。
所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)優(yōu)選為這樣的機(jī)構(gòu)，其具有從下緣部噴射壓縮空氣的氣嘴；壓頭，用于承載氣嘴并用于使氣嘴可以相對(duì)于由柱支架支承的核酸分離純化柱垂直移動(dòng)；以及位于壓頭上的定位裝置，該定位裝置用于定位在支承機(jī)構(gòu)的臺(tái)架中的核酸分離純化柱。
此外，所述的分注機(jī)構(gòu)優(yōu)選為這樣的機(jī)構(gòu)，其具有用于注入洗滌液的洗滌液注入嘴；用于注入回收液的回收液注入嘴；支承洗滌液注入嘴和回收液注入嘴的注入嘴移動(dòng)架，該移動(dòng)架能夠在由支承機(jī)構(gòu)支承的核酸分離純化柱上依次移動(dòng)；用于從含有洗滌液的瓶子中抽吸洗滌液并把洗滌液供給洗滌液注入嘴的洗滌液供給泵；以及用于從含有回收液的瓶子中抽吸回收液并把回收液供給回收液注入嘴的回收液供給泵。
根據(jù)如上所述的自動(dòng)裝置，可以緊湊構(gòu)造一種機(jī)構(gòu)，其裝有支承著核酸分離純化柱、廢液容器和回收容器的支承機(jī)構(gòu)；把壓縮空氣引入核酸分離純化柱中的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)；以及分別把洗滌液和回收液注入核酸分離純化柱中的機(jī)構(gòu)，其中分離和純化核酸的步驟在短時(shí)間內(nèi)高效、自動(dòng)地實(shí)施，實(shí)施方式為把含有核酸的樣品溶液注入具有核酸吸附性膜的核酸分離純化柱中，形成加壓環(huán)境使樣品溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，把洗滌液注入核酸分離純化柱中，形成加壓環(huán)境以洗掉雜質(zhì)，把回收液注入核酸分離純化柱中，使吸附到核酸吸附性多孔膜上的核酸解吸附，并將其回收。
當(dāng)把支承機(jī)構(gòu)構(gòu)造成具有立架、柱支架(該柱支架可垂直移動(dòng)地承載于立架上，并支承著核酸分離純化柱)以及可交換地支承廢液容器和回收容器的支架時(shí)，就可使核酸分離純化柱和兩個(gè)容器很容易地固定，并可使廢液容器和回收容器很容易地互換。
此外，當(dāng)把壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)構(gòu)造成具有氣嘴、用于垂直移動(dòng)氣嘴的壓頭以及用于定位核酸分離純化柱的定位裝置時(shí)，通過簡單的機(jī)構(gòu)就保證了壓縮空氣的供給。
此外，當(dāng)把分注機(jī)構(gòu)構(gòu)造成具有用于注入洗滌液的洗滌液注入嘴、用于注入回收液的回收液注入嘴、能夠在核酸分離純化柱上依次移動(dòng)的注入嘴移動(dòng)架、用于從含有洗滌液的瓶子中抽吸洗滌液并把洗滌液供給洗滌液注入嘴的洗滌液供給泵，以及用于從含有回收液的瓶子中抽吸回收液并把回收液供給回收液注入嘴的回收液供給泵時(shí)，就可以通過簡單機(jī)構(gòu)依次注入洗滌液和回收液。
自動(dòng)裝置的實(shí)施方案參照

如下。圖1是其蓋子已被移走的本發(fā)明核酸提取裝置的一個(gè)實(shí)施方案的立體圖。圖2是自動(dòng)裝置的略圖。圖3是支承機(jī)構(gòu)中的臺(tái)架的立體圖。圖4是使用條件下的臺(tái)架狀態(tài)的立體圖。圖5是顯示操作過程的圖。圖6是核酸分離純化柱的立體圖。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的自動(dòng)裝置1是一種使用核酸分離純化柱11(如圖6(具有核酸吸附性多孔膜的柱)所示)從含有核酸的樣品溶液中提取核酸的裝置。在核酸分離純化柱11中，核酸吸附性多孔膜11b裝在柱體11a的底部，柱體11a的上端有開口，柱體11a低于核酸吸附性多孔膜11b的部分形成漏斗狀的形式，排放部分11c是在下端中心以預(yù)定長度突出形成的細(xì)管口的形狀，而縱向突出體11d在柱體11a的兩側(cè)上形成。下文要描述的樣品溶液、洗滌液和回收液通過上端開口相繼注入，壓縮空氣通過上端開口引入，各種溶液向下流動(dòng)通過核酸吸附性多孔膜11b，并從排放部分11c排放到廢液容器12或回收容器13中。此外，在該圖中，柱體11a具有上部和下部互相接合的結(jié)構(gòu)。
在自動(dòng)裝置1中，核酸的分離和純化按照如圖5(a)到(g)所示的核酸分離和純化過程來實(shí)施。首先，在圖5的步驟(a)中，把經(jīng)過溶解處理的樣品溶液S注入位于廢液容器12之上的核酸分離純化柱11中。然后，在圖5的步驟(b)中，把壓縮空氣引入核酸分離純化柱11中，以施加壓力并使樣品溶液S通過核酸吸附性多孔膜11b，從而把核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，而通過的液體成分被排放到廢液容器12中。
然后，在圖5的步驟(c)中，將洗滌液W自動(dòng)注入核酸分離純化柱11中，在步驟(d)中，把壓縮空氣引入核酸分離純化柱中，以洗掉其它雜質(zhì)，而使核酸保持在吸附于核酸吸附性多孔膜11b上的狀態(tài)，把通過多孔膜的洗滌液W排放到廢液容器12中。步驟(c)和步驟(d)可以重復(fù)多次。
此后，在步驟(e)中，把位于核酸分離純化柱11之下的廢液容器12換成回收容器13，在步驟(f)中，將回收液R自動(dòng)注入核酸分離純化柱11中，在步驟(g)中，把壓縮空氣引入核酸分離純化柱11中，使得核酸吸附性多孔膜11b和核酸之間的結(jié)合力減小，并使核酸解吸附，把含有核酸的回收液R排放到回收容器13中以進(jìn)行回收。
如圖1和2所示，自動(dòng)裝置1包括裝有支承機(jī)構(gòu)3的主體2，該支承機(jī)構(gòu)3支承多個(gè)核酸分離純化柱11、廢液容器12和回收容器13；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4，該壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4把壓縮空氣引入核酸分離純化柱11中；以及分注機(jī)構(gòu)5，該分注機(jī)構(gòu)5用于相繼注入洗滌液W和回收液R。機(jī)構(gòu)3到5分別詳細(xì)描述如下。
<支承機(jī)構(gòu)>
在裝置主體的前面且較低的部位，支承機(jī)構(gòu)3具有安裝臺(tái)21，安裝臺(tái)上裝有臺(tái)架6，臺(tái)架6支承多個(gè)核酸分離純化柱11、廢液容器12和回收容器13。圖3還示出，臺(tái)架6具有立架61、柱支架62和容器支架63。立架61使柱支架62可垂直移動(dòng)地支承在兩側(cè)的支柱61a中，并且在底板61b上，立架61使容器支架63可前后移動(dòng)地支承在支柱61a之間的較低部分。
柱支架62由兩塊互相連接的板件構(gòu)成，并且具有在縱向延伸的支撐腿62b，支撐腿62b位于橫向延伸的支承部62a的兩端。支撐腿62b以可垂直移動(dòng)的方式插入滑槽61c中，滑槽61c分別在立架61的各支柱61a中形成。支撐腿62b通過推動(dòng)元件(未示出)向上推，該推動(dòng)元件包含在立架61中。在支承部62a中，并列設(shè)置多個(gè)支承孔62c，核酸分離純化柱11從上面插入，突出體11d(參見圖6)在各個(gè)核酸分離純化柱11的柱體11a的兩側(cè)上形成，突出體11d的下端與柱支架62內(nèi)的配合件(未示出)配合，以支承核酸分離純化柱。配合件可以移動(dòng)，并且在移動(dòng)后，會(huì)解除與突出體11d的配合，從而使所有核酸分離純化柱11同時(shí)落下，以將其扔掉。
該柱支架62在上表面的兩側(cè)具有銷孔62d，操作時(shí)，如下文所述，壓銷49(參見圖1)的端部49a發(fā)揮定位裝置的作用，端部49a與各個(gè)銷孔62d配合，把柱支架62向下壓。該機(jī)構(gòu)如此設(shè)計(jì)，使得當(dāng)柱支架62在如圖3所示的上提位置時(shí)，核酸分離純化柱11的排放部分11c的下端位于廢液容器12和回收容器13之上，其中廢液容器12和回收容器13固定在容器支架63中，但是當(dāng)柱支架62向下移動(dòng)到如圖4所示的低位時(shí)，核酸分離純化柱11的排放部分11c以預(yù)定程度插入廢液容器12或回收容器13的內(nèi)部。
容器支架63具有廢液容器支承孔63a和回收容器支承孔63b，63a和63b在橫向平行排列成兩排，多個(gè)廢液容器12被支承在后側(cè)的廢液容器支承孔63a的那一排中，而多個(gè)回收容器13被支承在前側(cè)的回收容器支承孔63b的那一排中。廢液容器支承孔63a的孔距和回收容器支承孔63b的孔距與柱支架62的核酸分離純化柱支承孔62c的孔距相同，并把廢液容器12和回收容器13如此定位，使得它們分別位于各個(gè)被支承孔62c在柱支架62中的核酸分離純化柱11之下。為了避免把廢液容器12和回收容器13混淆，例如，優(yōu)選使它們的尺寸或形狀互不相同。
通過施壓部件(未示出)把容器支架63向前壓，施壓部件包含在立架61中。通過使安裝臺(tái)21內(nèi)的動(dòng)作部件31(參見圖2)透過立架61的底板61b中形成的開口，與容器支架63的底部中的配合孔(未示出)配合，使得容器支架63移動(dòng)以交換容器(前后移動(dòng))。隨著容器交換馬達(dá)32(直流馬達(dá))的驅(qū)動(dòng)，容器支架63隨著動(dòng)作部件31的移動(dòng)操作而成比例地向后移動(dòng)，從而使回收容器13到達(dá)柱支架62之下。當(dāng)不動(dòng)作時(shí)，通過圖中未示出的施壓部件，把廢液容器12壓到柱支架62之下?；诙ㄎ粋鞲衅?3a和33b發(fā)出的檢測到的信號(hào)，來控制容器交換馬達(dá)32的操作。
<壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)>
如圖1和2所示，壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4具有相對(duì)于支承機(jī)構(gòu)3的臺(tái)架6可垂直移動(dòng)的壓頭40、在壓頭40中排列成行的多個(gè)氣嘴41(在圖1或2中為8個(gè)氣嘴)、產(chǎn)生壓縮空氣的氣泵43、安全閥44、為各個(gè)氣嘴41裝設(shè)的可單獨(dú)操作的開關(guān)閥45和為各個(gè)氣嘴41裝設(shè)的壓力傳感器46，壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4連續(xù)為核酸分離純化柱11提供壓縮空氣。
導(dǎo)桿24所支承的壓頭40可垂直移動(dòng)，導(dǎo)桿24垂直設(shè)置在裝置主體2的中間框架22和上框架23之間。同樣，滾珠螺母組件40a設(shè)置在壓頭40中，把滾珠螺母組件40a旋到設(shè)置在垂直方向的滾珠絲杠副25上，根據(jù)壓力傳感器48a到48c檢測的信號(hào)，由垂直移動(dòng)的馬達(dá)47(脈沖馬達(dá))驅(qū)動(dòng)，通過同步皮帶和皮帶輪使?jié)L珠絲杠副25旋轉(zhuǎn)，從而使壓頭40垂直移動(dòng)。壓頭40的兩側(cè)都有壓銷49，通過彈簧49b向下推動(dòng)，可使壓銷49垂直移動(dòng)，其端部49a與柱支架62上表面上的銷孔62d配合，從而壓緊定位。
設(shè)置壓銷49，使得在加壓操作下，柱支架62前側(cè)受壓，而不會(huì)干擾下文所述的洗滌液注入嘴51w和回收液注入嘴51r的橫向移動(dòng)。
壓頭40中的氣嘴41受到向下壓力時(shí)，可以垂直移動(dòng)，片狀密封件42具有與氣嘴41相對(duì)應(yīng)的通孔42a(參見圖2)，片狀密封件42位于氣嘴41之下，壓頭40向下移動(dòng)時(shí)，各個(gè)氣嘴41的端部通過密封件42擠壓固定在柱支架中的核酸分離純化柱11的上端開口，從而密封核酸分離純化柱11，由此可以使壓力通過通孔42a施加于核酸分離純化柱11中。
把安全閥44打開通向大氣，由此排放位于氣泵43和開關(guān)閥45之間的通道中的空氣。構(gòu)造空氣環(huán)路，使得開關(guān)閥45選擇性開啟，從而把壓縮空氣從氣泵43通過各氣嘴41而引入對(duì)應(yīng)的核酸分離純化柱中。為了分別檢測核酸分離純化柱11的內(nèi)壓，為每個(gè)氣嘴41都設(shè)置了壓力傳感器46。該機(jī)構(gòu)如此控制，使得當(dāng)檢測到的壓力達(dá)到預(yù)定水平(例如，100kPa)時(shí)，關(guān)閉相應(yīng)的開關(guān)閥45以停止供應(yīng)壓縮空氣，或者當(dāng)檢測到的壓力已降到預(yù)定水平或低于該水平時(shí)，可判斷出溶液已完全排放了。
<分注機(jī)構(gòu)>
分注機(jī)構(gòu)5具有可以在臺(tái)架6上橫向移動(dòng)的設(shè)置于注入嘴移動(dòng)架50中的洗滌液注入嘴51w和回收液注入嘴51r、用于把洗滌液瓶56w中含有的洗滌液W送入洗滌液注入嘴51w的洗滌液供給泵52w、用于把回收液瓶56r中含有的回收液R送入回收液注入嘴51r的回收液供給泵52r以及裝在支承臺(tái)21上的廢液瓶57。
注入嘴移動(dòng)架50由導(dǎo)軌27支承，可以橫向移動(dòng)，導(dǎo)軌27設(shè)置于該裝置主體2的垂直壁的水平方向上，注入嘴移動(dòng)架50的移動(dòng)由圖中未示出的注入嘴移動(dòng)馬達(dá)(脈沖馬達(dá))控制，從而使各注入嘴依次停在各核酸分離純化柱11上，而在復(fù)位狀態(tài)下，注入嘴移動(dòng)架50停在廢液瓶57之上。洗滌液注入嘴51w和回收液注入嘴51r的末端向下彎曲，洗滌液注入嘴51w通過活頁閥55w連接到洗滌液供給泵52w，洗滌液供給泵52w通過活頁閥55w連接到洗滌液瓶56w，而回收液注入嘴51r通過活頁閥55r連接到回收液供給泵52r，回收液供給泵52r通過活頁閥55r連接到回收液瓶56r。洗滌液供給泵52w和回收液供給泵52r由注射泵構(gòu)成，并且各泵的活塞部件由泵馬達(dá)53w或53r(脈沖馬達(dá))可控地驅(qū)動(dòng)，從而根據(jù)傳感器54w或54r檢測的位置，注入預(yù)定量的洗滌液W或回收液R。
也就是說，在注入洗滌液W或回收液R的情況下，把活頁閥55w或55r轉(zhuǎn)到洗滌液瓶56w那一側(cè)或回收液瓶56r那一側(cè)，驅(qū)動(dòng)泵馬達(dá)53w或53r以使洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r的活塞部件向后移動(dòng)，從而把洗滌液W或回收液R抽到洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r的內(nèi)部，隨后，把活頁閥55w或55r轉(zhuǎn)到洗滌液注入嘴51w那一側(cè)或回收液注入嘴51r那一側(cè)，驅(qū)動(dòng)泵馬達(dá)53w或53r，以使洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r的活塞部件向前推進(jìn)，從而通過洗滌液注入嘴51w或回收液注入嘴51r，把洗滌液或回收液放出，直到通向廢液瓶57的通道內(nèi)的空氣被排出，然后停止驅(qū)動(dòng)洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r。之后，把洗滌液注入嘴51w或回收液注入嘴51r移到核酸分離純化柱11之上，控制洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r的驅(qū)動(dòng)量，以把預(yù)定量的洗滌液W或回收液R注入核酸分離純化柱11中。
洗滌液瓶56w和回收液瓶56r分別具有其自身的容器56wb或56rb以及瓶蓋56wu或56ru。對(duì)瓶蓋56wu和56ru分別設(shè)置有細(xì)管狀的吸管58w和58r，各吸管58w和58r的下端開口接近容器56wb或56rb的底部，從而隨著洗滌液供給泵52w或回收液供給泵52r的操作，分別抽吸洗滌液W或回收液R。此外，為了隨著抽吸操作而引入空氣，瓶蓋56wu和56ru具有管(或開口)，這在圖中未示出。此外，因?yàn)橄礈煲旱挠昧看笥诨厥找旱挠昧?，所以洗滌液?6w的容器56wb的高度大于回收液瓶56r的容器56rb的高度，因此，吸管58w比吸管58r長。與瓶蓋56wu對(duì)應(yīng)的瓶子頂端的螺紋和與瓶蓋56ru對(duì)應(yīng)的瓶子頂端的螺紋具有相同直徑。
通過分別使用限制器28和28，分別把瓶蓋56wu和56ru固定到主體2的中間框架22上，分別把吸管58w和58r安裝到瓶蓋上，從而把瓶子56w和56r安裝到裝置主體2上。容器56wb或56rb分別從安裝好的瓶蓋56wu和56ru下面旋進(jìn)瓶蓋中，而吸管58w和58r分別插入瓶蓋的頂部。采用這種結(jié)構(gòu)是為了避免這樣的結(jié)果當(dāng)將分別具有吸管58w和58r的瓶蓋56wu和56ru從容器56wb或56rb移走，以補(bǔ)充洗滌液W或回收液R，并且把瓶蓋56wu和56ru放在桌子等物的上面時(shí)，會(huì)有物質(zhì)粘到吸管58w和58r的頂部，而污染洗滌液W或回收液R。
特別是，對(duì)于高度很高的洗滌瓶56w來說，把容器56wb移走后，吸管58w的下端和用于放置裝置主體2的臺(tái)面之間的距離H被設(shè)計(jì)成大于容器56wb的高度h。即，瓶蓋56wu必須由限制器28安裝在離開臺(tái)面的高度至少是容器56wb的高度h的兩倍的位置上。這種結(jié)構(gòu)使得容器56wb容易換位并補(bǔ)充溶液，而不用考慮裝有吸管58w的固定瓶蓋56wu。上述內(nèi)容同樣適用于回收液瓶56r。
接著，基于圖中未示出的協(xié)調(diào)控制單元所包含的程序，使上述機(jī)構(gòu)3到5響應(yīng)控制板7的輸入操作而運(yùn)轉(zhuǎn)，該控制板7位于裝置主體2的上部。
下文具體描述使用上述核酸分離純化裝置1來分離和純化核酸的操作。首先，把核酸分離純化柱11固定在柱支架62中，該支架在支承機(jī)構(gòu)3的臺(tái)架6中，把廢液容器12和回收容器13固定在容器支架63中，把臺(tái)架6安裝在裝置主體2的支承臺(tái)21上。然后，把經(jīng)過溶解處理的樣品溶液S依次注入各核酸分離純化柱11中。此外，可以在把核酸分離純化柱11插入未安裝到裝置1上的臺(tái)架6中之后或之前，把樣品溶液預(yù)先注入核酸分離純化柱11中。
然后，使用控制板7操縱該裝置。驅(qū)動(dòng)壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)4的垂直移動(dòng)的馬達(dá)47使壓頭40向下移動(dòng)，壓銷49的前端49a與柱支架62的銷孔62d配合而限定位置，同時(shí)，如圖4所示，位于核酸分離純化柱11的下端的排放部分11c以預(yù)定程度插入廢液容器12中，以免排放液四散而造成污染。然后，使壓頭40進(jìn)一步向下移動(dòng)，以使得各個(gè)氣嘴41的下端通過密封件42擠壓核酸分離純化柱11的上端開口。因?yàn)閴轰N49限定了柱支架62的位置，各個(gè)氣嘴41準(zhǔn)確地?cái)D壓核酸分離純化柱11，所以可保證充分密封。
隨后，充入壓縮空氣。關(guān)閉所有的開關(guān)閥45，驅(qū)動(dòng)氣泵43，然后打開第一開關(guān)閥45。壓縮空氣由氣泵43通過第一氣嘴41充入第一個(gè)核酸分離純化柱11中，當(dāng)經(jīng)過壓力傳感器46檢測到壓力已提高到預(yù)定水平時(shí)，關(guān)閉第一開關(guān)閥。隨后，打開第二開關(guān)閥45，壓縮空氣通過第二氣嘴41充入第二個(gè)核酸分離純化柱11中。依次重復(fù)上述操作，直到把壓力施加到所有核酸分離純化柱11上。受壓樣品溶液S通過核酸吸附性多孔膜11b，從而使核酸吸附到膜11上，并通過位于下部的排放部分11c，把其它成分排放到廢液容器12中。當(dāng)所有樣品溶液S都通過了核酸吸附性多孔膜11b時(shí)，壓力減小到溶液排放結(jié)束時(shí)的壓力水平，或低于該水平，當(dāng)經(jīng)過各個(gè)壓力傳感器46檢測到核酸已完全附著在所有核酸分離純化柱11中時(shí)，壓頭向上移動(dòng)。
然后，轉(zhuǎn)換到洗滌處理階段。當(dāng)氣嘴41與核酸分離純化柱11分開，并移動(dòng)到注入嘴移動(dòng)架允許移動(dòng)的高度時(shí)，壓頭在充入空氣后的向上移動(dòng)停止。壓銷49擠壓柱支架62，并如圖4所示，核酸分離純化柱11的下端插入廢液容器12中。保持這種狀態(tài)來進(jìn)行洗滌處理。移動(dòng)注入嘴移動(dòng)架50，然后停止，以使得洗滌液注入嘴51w抵達(dá)第一個(gè)核酸分離純化柱11之上的位置，然后注入預(yù)定量的洗滌液W。然后把注入嘴移動(dòng)架移動(dòng)到下一個(gè)核酸分離純化柱11上，并且依次注入洗滌液W。當(dāng)洗滌液W已注入到所有核酸分離純化柱11中時(shí)，使壓頭40向下移動(dòng)，使各個(gè)氣嘴41的下端通過密封件42擠壓各個(gè)核酸分離純化柱11的上端開口。然后，和前述步驟一樣，開關(guān)閥45相繼打開，把壓縮空氣充入各個(gè)核酸分離純化柱11中。受壓洗滌液W通過核酸吸附性多孔膜11b，以洗掉除核酸以外的雜質(zhì)，并通過位于下部的排放部分11c，排放到廢液容器12中。當(dāng)所有洗滌液W都通過位于各個(gè)核酸分離純化柱11中的核酸吸附性多孔膜11b而排出時(shí)，壓頭40向上移動(dòng)到初始位置。在進(jìn)行多次洗滌處理時(shí)，重復(fù)上述過程。
然后，轉(zhuǎn)換到回收處理階段。首先，通過壓頭40在洗滌處理結(jié)束后的向上移動(dòng)，使壓銷49沿著臺(tái)架6中的柱支架62向上移動(dòng)，并且使位于核酸分離純化柱下部的排放部分11c移動(dòng)到廢液容器12以上，在此之后，操縱支承機(jī)構(gòu)3的動(dòng)作部件31，使容器支架向后移動(dòng)，從而把回收容器13定位到核酸分離純化柱11之下，由此使容器交換。
隨后，使壓頭40向下移動(dòng)，并使壓銷49的前端與柱支架62的銷孔62d配合以擠壓支架，從而使核酸分離純化柱11的下端保持插入回收容器13中的狀態(tài)。然后，移動(dòng)注入嘴移動(dòng)架50，然后停止，以使回收液注入嘴51r抵達(dá)第一個(gè)核酸分離純化柱11之上的位置。把預(yù)定量的回收液R注入第一個(gè)柱中，然后把注入嘴移動(dòng)架50移動(dòng)到下一個(gè)核酸分離純化柱11上，并且依次注入回收液R。當(dāng)回收液R已注入到所有核酸分離純化柱11中時(shí)，與此前所述的一樣，使壓頭40再向下移動(dòng)，且各個(gè)氣嘴41的下端通過密封件42擠壓各個(gè)核酸分離純化柱11的上端開口。然后，開關(guān)閥45相繼打開，把壓縮空氣充入各個(gè)核酸分離純化柱11中。受壓回收液R通過核酸吸附性多孔膜11b，以使吸附到膜11b的核酸解吸附，并通過位于下部的排放部分11c排放到回收容13中。當(dāng)核酸分離純化柱11中所有的回收液R都排出時(shí)，壓頭40向上移動(dòng)，由此完成系列操作。
在分離和純化結(jié)束后，把臺(tái)架6從安裝臺(tái)21上拆下來，并從柱支架62和容器支架63上分別取下核酸分離純化柱11以及廢液容器12，將其扔掉。另一方面，從容器支架63上取下回收容器13，如果需要，就把蓋子蓋到各個(gè)容器上，然后，例如，再接受后續(xù)的核酸分析處理。
此外，在本實(shí)施方案中，使用多個(gè)核酸分離純化柱11，但本發(fā)明并不僅限于此，可僅對(duì)一個(gè)核酸分離純化柱11進(jìn)行處理。
以下由實(shí)施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1(1)制備核酸分離純化柱核酸分離純化柱所用的容器由高抗沖聚苯乙烯制成，該容器具有用于容納核酸吸附性多孔膜的部分，且該容器內(nèi)徑為7mm。將混合比為6∶4的三醋酸纖維素和二醋酸纖維素混合物的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔徑＝1.2μm)作為乙酰值各不相同的醋酸纖維素混合物的核酸吸附性多孔膜，裝在核酸分離純化柱的容器的適合容納該核酸吸附性多孔膜的所述部分中，從而制成核酸分離純化柱。
(2)制備核酸溶解試劑(用于RNA)和洗滌液制備具有表1所示配方的核酸溶解試劑溶液和洗滌液。
表1(核酸溶解試劑溶液)

(洗滌液)

(3)分離和純化核酸的過程制備人骨髓瘤細(xì)胞(HL60)的培養(yǎng)液。所收集的培養(yǎng)液含有1×106個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過5分鐘的離心處理使細(xì)胞沉淀，隨后除去上層清液以得到細(xì)胞。把200μg的RNA-溶解試劑溶液加入HL60細(xì)胞(1×106個(gè))中，然后攪拌。隨后，加入200μl乙醇，并攪拌所得混合物，從而制備出含有RNA的樣品溶液。把含有RNA的樣品溶液由含有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱的一個(gè)開口注入柱中，所述核酸吸附性多孔膜由乙?；潭雀鞑幌嗤拇姿崂w維素的混合物制成。然后，把壓力產(chǎn)生器連接到該開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的含有RNA的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜，并使樣品溶液與核酸吸附性多孔膜接觸，接著，所述樣品溶液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把洗滌液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入柱中，把壓力產(chǎn)生器連接到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜，接著，所述洗滌液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把回收液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入，把壓力產(chǎn)生器連接到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜，接著，所述回收液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，以回收溶液。
(4)分離和純化的RNA的確認(rèn)對(duì)回收液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果示于圖7(圖7中的分子量標(biāo)記為READY-LOAD(商標(biāo))；1kb Plus NA梯帶)。從圖7所示結(jié)果可見，通過使用含有核酸吸附性多孔膜和壓力產(chǎn)生器的核酸分離純化柱，其中所述核酸吸附性多孔膜包含乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物，則可以以高回收效率分離和純化RNA。
實(shí)施例2(1)制備核酸分離純化柱通過對(duì)由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)得到的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔徑＝50μm)進(jìn)行皂化處理，得到核酸吸附性多孔膜，用該核酸吸附性多孔膜作為由乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物制得的多孔膜經(jīng)皂化處理而得到的核酸吸附性多孔膜，并將其裝在實(shí)施例1所制備的核酸分離純化柱的容器的部分中，所述容器的內(nèi)徑為7mm并具有用于容納核酸吸附性多孔膜的部分，從而制成核酸分離純化柱。
把三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜在2N的氫氧化鈉水溶液中浸泡20分鐘，來實(shí)施上述皂化處理。處理后，多孔膜的平均孔徑從5.0μm降到2.5μm。
(2)分離和純化核酸的過程把200μl實(shí)施例1中制備的核酸溶解試劑和20μl蛋白酶(得自SIGMA公司；細(xì)菌“蛋白酶”XXIV型)溶液加入200μl人全血樣品中，將該混合物在60℃下溫育10分鐘。溫育后，加入200μl乙醇并攪拌混合物，以制備含有核酸的樣品溶液。把含有核酸的樣品溶液由核酸分離純化柱的第一個(gè)開口注入在上述步驟(1)中制備的核酸分離純化柱中，該柱中含有核酸吸附性多孔膜，該核酸吸附性多孔膜由乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物制成。隨后，把壓力產(chǎn)生器連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜，由此使樣品溶液與核酸吸附性多孔膜接觸。然后，所述樣品溶液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把實(shí)施例1中制備的洗滌液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入柱中，把壓力產(chǎn)生器連接到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜，接著，所述洗滌液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把回收液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入。然后，把壓力產(chǎn)生器連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜，并且所述回收液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，以回收溶液。
(3)分離和純化的核酸的確認(rèn)對(duì)回收液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果示于圖8(分子量標(biāo)記與圖7相同)?？梢?，通過使用含有核酸吸附性多孔膜和壓力產(chǎn)生器的核酸分離純化柱，該核酸吸附性多孔膜包含乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物，則可以以高回收效率分離和純化核酸。
實(shí)施例3(1)制備核酸分離純化柱核酸分離純化柱所用的容器由高抗沖聚苯乙烯制成，該容器具有用于容納核酸吸附性多孔膜的部分，且該容器內(nèi)徑為7mm。
使用由三醋酸纖維素多孔膜經(jīng)皂化處理而得到的多孔膜作為用于分離和純化核酸的核酸吸附性多孔膜，并將其裝在步驟(1)所制備的核酸分離純化柱的容器部分中。
通過把三醋酸纖維素多孔膜在2N的氫氧化鈉水溶液中浸泡20分鐘，來實(shí)施上述皂化處理。處理后，多孔膜的平均孔徑從5.0μm降到2.5μm。
(2)制備核酸溶解試劑溶液和洗滌液表2(核酸溶解試劑溶液)

(洗滌液)

(3)分離和純化核酸的過程把200μl核酸溶解試劑和20μl蛋白酶(得自SIGMA公司；細(xì)菌“蛋白酶”XXIV型)溶液加入200μl人全血樣品中，將該混合物在60℃下溫育10分鐘。攪拌后，把溶液由在步驟(1)中制備的核酸分離純化柱的第一個(gè)開口注入柱中，該柱中含有70μm厚的核酸吸附性多孔膜。隨后，把壓力差產(chǎn)生裝置連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜，由此使樣品溶液與核酸吸附性多孔膜接觸。然后，所述樣品溶液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把洗滌液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入柱中。然后，把壓力差產(chǎn)生裝置連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜，注入的洗滌液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把回收液由上述第一個(gè)開口注入核酸分離純化柱中。然后，把壓力差產(chǎn)生裝置連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜，所述回收液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，以回收溶液。
對(duì)比例1實(shí)施與實(shí)施例3相同的過程，但是使用600μm厚的多孔膜代替70μm厚的多孔膜，來作為核酸吸附性多孔膜。
(4)測定核酸純化操作所需的時(shí)間實(shí)施例3和對(duì)比例1的實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。把分離和純化步驟所需時(shí)間加以平均，把各平均時(shí)間與使用70μm厚的多孔膜所需的時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，并把后者的時(shí)間取作1。由此得到的結(jié)果示于表3。
表3

由表3明顯可見，采用本發(fā)明方法可以快速回收和純化核酸。
實(shí)施例4實(shí)施與實(shí)施例3相同的過程，但是使用70μm厚的、最大孔徑與最小孔徑之比為2或2以上的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
對(duì)比例2實(shí)施與實(shí)施例4相同的過程，但是使用粒徑為0.2μm的聚合物珠代替70μm厚的、最大孔徑與最小孔徑之比為2或2以上的多孔膜。
(1)測定核酸純化操作所需的時(shí)間實(shí)施例4和對(duì)比例2的實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。在分離和純化核酸的方法中，肉眼判斷是否使樣品溶液通過而回收了核酸，或者是否由于堵塞而不可能純化。由此得到的結(jié)果示于表4。
表4

○溶液通過，回收了核酸。
×發(fā)生堵塞由表4結(jié)果明顯可見，采用本發(fā)明方法，可以快速回收和純化核酸，而不會(huì)造成堵塞。
實(shí)施例5實(shí)施與實(shí)施例3相同的過程，但是使用70μm厚的、空隙容積為70％的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
對(duì)比例3實(shí)施與實(shí)施例5相同的過程，但是使用70μm厚的、空隙容積為58％或80％的多孔膜代替70μm厚的、空隙容積為70％的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
(1)核酸回收量的測定實(shí)施例5和對(duì)比例3的實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。把作為純化步驟結(jié)果的核酸回收量加以平均，把回收量進(jìn)行互比，并把使用空隙容積為70％的多孔膜所回收的核酸量取作1。結(jié)果示于表5。
此外，多孔膜的空隙容積用多孔膜的空隙容積率表示，以多孔膜的假定重量和實(shí)際重量相比作為多孔膜的空隙容積率，所述假定重量為由切開的多孔膜的橫截面及其厚度所決定的體積與多孔膜構(gòu)成物質(zhì)的密度的乘積。
表5

由表5結(jié)果明顯可見，采用本發(fā)明方法，可以高效回收和純化核酸。
實(shí)施例6實(shí)施與實(shí)施例3相同的過程，但是使用70μm厚的、泡點(diǎn)為4.5kgf/cm2的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
對(duì)比例4實(shí)施與實(shí)施例6相同的過程，但是使用70μm厚的、泡點(diǎn)為5.5kgf/cm2或2.0kgf/cm2的多孔膜代替70μm厚的、泡點(diǎn)為4.5kgf/cm2的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
(1)測定核酸純化操作所需的時(shí)間實(shí)施例6和對(duì)比例4的實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。把純化步驟所需時(shí)間加以平均，把平均時(shí)間進(jìn)行相對(duì)比較，并把泡點(diǎn)為4.5kgf/cm2的多孔膜所需的時(shí)間取作1。由此得到的結(jié)果示于表6。
表6

由表6結(jié)果明顯可見，采用本發(fā)明方法，可以快速回收和純化核酸。
實(shí)施例7實(shí)施與實(shí)施例3相同的過程，但是使用70μm厚的、壓力損失為75kPa的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
對(duì)比例5實(shí)施與實(shí)施例7相同的過程，但是使用70μm厚的、壓力損失為90kPa或20kPa的多孔膜代替70μm厚的、壓力損失為75kPa的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
(1)測定核酸純化操作所需的時(shí)間實(shí)施例7和對(duì)比例5的實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。把純化步驟所需時(shí)間加以平均，把平均時(shí)間進(jìn)行相對(duì)比較，并把壓力損失為75kPa的多孔膜所需的時(shí)間取作1。由此得到的結(jié)果示于表7。
此外，所述壓力損失是在把干燥狀態(tài)的多孔膜通過水一次，用水充分潤濕之后測得的。
表7

由表7結(jié)果明顯可見，采用本發(fā)明方法，可以快速回收和純化核酸。
實(shí)施例8實(shí)施與實(shí)施例3相同的過程，但是使用當(dāng)在1kg/cm2的壓力和25℃下使水通過時(shí)透水量為60mL/分鐘/cm2的70μm厚的多孔膜，來代替所用的70μm厚的多孔膜，以作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
對(duì)比例6實(shí)施與實(shí)施例8相同的過程，但是使用當(dāng)在1kg/cm2的壓力和25℃下使水通過時(shí)透水量為80或30mL/分鐘/cm2的70μm厚的多孔膜，來代替同樣條件下透水量為60mL/分鐘/cm2的70μm厚的多孔膜，以作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
(1)測定核酸純化操作所需的時(shí)間實(shí)施例8和對(duì)比例6的實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。把純化步驟所需時(shí)間加以平均，把平均時(shí)間進(jìn)行相對(duì)比較，并把當(dāng)在1kg/cm2的壓力和25℃下使水通過時(shí)透水量為60mL/分鐘/cm2的多孔膜所需的時(shí)間取作1。由此得到的結(jié)果示于表8。
此外，所述多孔膜的透水量是在把干燥狀態(tài)的多孔膜通過水一次，用水充分潤濕之后測得的。溫度為25℃，壓力為1kg/cm2。
表8

由表8結(jié)果明顯可見，采用本發(fā)明方法，可以快速回收和純化核酸。
實(shí)施例9實(shí)施與實(shí)施例3相同的過程，但是使用70μm厚的、核酸吸附量為0.9μg/毫克膜重的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
對(duì)比例7
實(shí)施與實(shí)施例9相同的過程，但是使用70μm厚的、核酸吸附量為0.5μg/毫克膜重的多孔膜代替70μm厚的、核酸吸附量為0.9μg/毫克膜重的多孔膜，來作為用于分離和純化核酸的多孔膜。
(1)比較當(dāng)使用重量相同的膜時(shí)核酸的回收量根據(jù)本發(fā)明方法和對(duì)比例方法(實(shí)施例9和對(duì)比例7)，從含有核酸的樣品溶液中純化核酸，核酸的電泳結(jié)果示于圖9。此外，所用的分子量標(biāo)記是λDNA/經(jīng)HindIII酶切。
由圖9結(jié)果明顯可見，采用本發(fā)明方法，可以從等量樣品溶液中，高收率地回收和純化核酸。
實(shí)施例10(1)制備用于純化核酸的柱核酸分離純化柱所用的容器由高抗沖聚苯乙烯制成，該容器具有用于容納核酸吸附性多孔膜的部分，且該容器內(nèi)徑為7mm。含有混合比為6∶4的三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔徑＝5.0μm)，作為含乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物的核酸吸附性多孔膜，并將其裝在核酸分離純化柱的用于容納核酸吸附性多孔膜的容器的所述部分中，從而制成核酸分離純化柱。
把三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜在2N的氫氧化鈉水溶液中浸泡20分鐘，以實(shí)施上述皂化處理。處理后，多孔膜的平均孔徑從5.0μm降到2.5μm。
(2)制備核酸溶解試劑和洗滌液制備具有表9所示配方的核酸溶解試劑溶液和洗滌液。
表9(核酸溶解試劑溶液)

(洗滌液)

(3)分離和純化DNA的過程把200μl實(shí)施例10中制備的核酸溶解試劑和20μl蛋白酶(得自SIGMA公司；細(xì)菌“蛋白酶”XXIV型)溶液加入200μl人全血樣品中，將該混合物在60℃下溫育10分鐘。溫育后，把200μl乙醇加入溶液中，攪拌該混合物，以制備含有核酸的樣品溶液。把最終得到的含有核酸的樣品溶液由含有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱的第一個(gè)開口注入柱中，所述核酸吸附性多孔膜包含乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物。隨后，把壓力產(chǎn)生器連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的含有核酸的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜，由此使樣品溶液與核酸吸附性多孔膜接觸。然后，所述樣品溶液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。在此情況下，測定樣品溶液通過多孔膜所需的時(shí)間。隨后，把實(shí)施例10中制備的洗滌液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入柱中。然后，把壓力產(chǎn)生器連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗滌液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把回收液由上述第一個(gè)開口注入核酸分離純化柱中。然后，把壓力產(chǎn)生器連接到上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜，并且所述回收液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，以回收溶液。
(4)DNA回收量的確認(rèn)對(duì)回收液進(jìn)行UV檢測。基于260nm處的吸收度，測定回收液中DNA的含量。
實(shí)施例11
實(shí)施與實(shí)施例10相同的過程，但是使用由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)得到的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔徑＝3.0μm)經(jīng)過皂化處理而得到的多孔膜，并測定樣品溶液通過多孔膜所需的時(shí)間以及回收溶液中DNA的量。
把三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜在2N的氫氧化鈉水溶液中浸泡20分鐘，來實(shí)施上述皂化處理。處理后，多孔膜的平均孔徑從3.0μm降到1.2μm。
對(duì)比例8實(shí)施與實(shí)施例10相同的過程，但是使用由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔徑＝0.8μm)經(jīng)過皂化處理而得到的多孔膜，并測定樣品溶液通過多孔膜所需的時(shí)間以及回收溶液中DNA的量。
對(duì)比例9實(shí)施與實(shí)施例10相同的過程，但是使用由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔徑＝5.6μm)經(jīng)過皂化處理而得到的多孔膜，并測定樣品溶液通過多孔膜所需的時(shí)間以及回收溶液中DNA的量。
由實(shí)施例10和11以及對(duì)比例8和9得到的測定值示于表10中。
表10

由表10可見，在本發(fā)明的實(shí)施例10和11中，樣品溶液可以在短時(shí)間內(nèi)通過多孔膜，并回收足夠量的DNA。
另一方面，在對(duì)比例8中，多孔膜被樣品溶液所含的成分堵塞，使樣品溶液不能通過多孔膜，因此不能回收DNA。此外，在對(duì)比例9中，雖然樣品溶液可以在短時(shí)間內(nèi)通過多孔膜，但是DNA的回收量不夠。
實(shí)施例12(1)制備用于純化核酸的核酸分離純化柱核酸分離純化柱所用的容器由高抗沖聚苯乙烯制成，該容器具有用于容納核酸吸附性多孔膜的部分，且該容器內(nèi)徑為7mm。將含有混合比為6∶4的三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔徑＝5.0μm)作為含乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物的皂化產(chǎn)物的核酸吸附性多孔膜，并將其裝在核酸分離純化柱的適合容納核酸吸附性多孔膜的容器的所述部分中，從而制成核酸分離純化柱。
把三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜在2N的氫氧化鈉水溶液中浸泡20分鐘，來實(shí)施上述皂化處理。處理后，多孔膜的平均孔徑從5.0μm降到2.5μm。
(2)制備RNA溶解試劑和洗滌液制備具有表11所示配方的RNA溶解試劑溶液和洗滌液。
表11(RNA溶解試劑溶液)

(洗滌液)

(3)分離和純化RNA的過程制備人骨髓瘤細(xì)胞(HL60)的培養(yǎng)液。所收集的培養(yǎng)液含有1×106個(gè)細(xì)胞，并經(jīng)過5分鐘的離心處理使細(xì)胞沉淀，隨后除去上層清液以得到細(xì)胞。把200μg的RNA-溶解試劑溶液加入HL60細(xì)胞(1×106個(gè))中，然后攪拌。隨后，加入200μl乙醇，并攪拌所得混合物，從而制備出含有RNA的樣品溶液。把含有RNA的樣品溶液由在上述步驟(1)中制備的含有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱的第一個(gè)開口注入柱中，所述核酸吸附性多孔膜由乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物制成。然后，把壓力產(chǎn)生器連接到該開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的含有RNA的樣品溶液通過核酸吸附性多孔膜，并使樣品溶液與核酸吸附性多孔膜接觸，接著，所述樣品溶液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。在此情況下，測定樣品溶液通過多孔膜所需的時(shí)間。隨后，把洗滌液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入柱中，把壓力產(chǎn)生器連接到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的洗滌液通過核酸吸附性多孔膜，接著，所述洗滌液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出。隨后，把回收液由核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口注入，把壓力產(chǎn)生器連接到核酸分離純化柱的上述第一個(gè)開口，并在核酸分離純化柱中形成加壓環(huán)境，從而使注入的回收液通過核酸吸附性多孔膜，接著，所述回收液由核酸分離純化柱的另一個(gè)開口排出，以回收溶液。
(4)RNA回收量的確認(rèn)對(duì)回收液進(jìn)行UV檢測。由260nm處的吸收度(OD)，測定回收液中RNA的含量。
對(duì)比例10實(shí)施與實(shí)施例12相同的過程，但是使用由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔徑＝0.8μm)經(jīng)過皂化處理而得到的多孔膜，并測定樣品溶液通過多孔膜所需的時(shí)間以及回收溶液中RNA的量。
對(duì)比例11實(shí)施與實(shí)施例12相同的過程，但是使用由三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔徑＝5.6μm)經(jīng)過皂化處理而得到的多孔膜，并測定樣品溶液通過多孔膜所需的時(shí)間以及回收溶液中RNA的量。
由實(shí)施例12及對(duì)比例10和11得到的測定值示于表12中。
表12

由表12可見，在本發(fā)明的實(shí)施例12中，樣品溶液可以在短時(shí)間內(nèi)通過多孔膜，并回收足夠量的RNA。另一方面，在對(duì)比例10中，多孔膜被樣品溶液所含的成分堵塞，使樣品溶液不能通過多孔膜，因此不能回收RNA。
此外，在對(duì)比例11中，雖然樣品溶液可以在短時(shí)間內(nèi)通過多孔膜，但是RNA的回收量不夠。
權(quán)利要求
1.一種用于分離和純化核酸的核酸吸附性多孔膜，該膜具有在分離和純化核酸的方法中所使用的核酸吸附性固相，該固相吸附所述的核酸，所述方法包括以下步驟(1)通過使含有核酸的樣品溶液與所述的核酸吸附性固相接觸，使得所述核酸吸附到所述固相上；(2)通過使洗滌液與所述固相接觸來洗滌該固相，在此期間所述核酸仍吸附在該固相上；以及(3)通過使回收液與所述固相接觸，使得所述核酸從該固相解吸附。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸吸附性多孔膜，其厚度為10μm到500μm。
3.如權(quán)利要求1至2中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其平均孔徑為0.9μm到5.0μm。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其具有彼此不對(duì)稱的前表面和后表面。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸吸附性多孔膜，其中最大孔徑和最小孔徑之比為2或2以上。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其空隙容積為50％到95％。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其泡點(diǎn)為0.1kgf/cm2到10kgf/cm2。
8.如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其壓力損失為0.1kPa到100kPa。
9.如權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，在25℃的溫度和1kg/cm2的壓力下，水可以1mL/分鐘到5000mL/分鐘的量通過所述的膜。
10.如權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中每毫克的所述多孔膜吸附0.1μg或更多量的所述核酸。
11.如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，所述多孔膜通過該多孔膜和所述核酸之間的基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜包含具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物。
13.如權(quán)利要求12所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的吸附所述核酸并包含具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物的多孔膜是乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物。
14.如權(quán)利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是三醋酸纖維素和二醋酸纖維素的混合物。
15.如權(quán)利要求14所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量計(jì)，所述混合物中三醋酸纖維素/二醋酸纖維素的混合比為99∶1到1∶99。
16.如權(quán)利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是三醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。
17.如權(quán)利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。
18.如權(quán)利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物是二醋酸纖維素和單醋酸纖維素的混合物。
19.如權(quán)利要求12所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含具有多糖結(jié)構(gòu)的聚合物的多孔膜是這樣的多孔膜，其包含通過皂化一種或多種醋酸纖維素而得到的有機(jī)材料。
20.如權(quán)利要求19所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的一種或多種醋酸纖維素的皂化率為5％或更高。
21.如權(quán)利要求20所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含通過皂化所述的一種或多種醋酸纖維素而得到的有機(jī)材料的多孔膜是這樣的多孔膜，其包含通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料。
22.如權(quán)利要求21所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物的皂化率為5％或更高。
23.如權(quán)利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是三醋酸纖維素和二醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
24.如權(quán)利要求23所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量計(jì)，所述三醋酸纖維素/所述二醋酸纖維素的混合比為99∶1到1∶99。
25.如權(quán)利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是三醋酸纖維素和單醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
26.如權(quán)利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是三醋酸纖維素、二醋酸纖維素和單醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
27.如權(quán)利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過皂化乙酰值各不相同的醋酸纖維素的混合物而得到的有機(jī)材料是二醋酸纖維素和單醋酸纖維素混合物的皂化產(chǎn)物。
28.如權(quán)利要求19至27中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中皂化后的所述平均孔徑小于皂化前的所述平均孔徑。
29.如權(quán)利要求28所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的皂化后的平均孔徑與所述的皂化前的平均孔徑之比為0.8或更低。
30.如權(quán)利要求12所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有多糖結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物是再生纖維素。
31.如權(quán)利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過對(duì)不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜進(jìn)行處理、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
32.如權(quán)利要求31所述的核酸吸附性多孔膜，其中對(duì)所述的不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜所進(jìn)行的處理包括把接枝聚合物鏈連接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物鏈在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)。
33.如權(quán)利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過用具有親水性基團(tuán)的材料來涂覆不具有親水性基團(tuán)的有機(jī)材料多孔膜、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
34.如權(quán)利要求33所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有親水性基團(tuán)的材料是有機(jī)聚合物，該有機(jī)聚合物在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)。
35.如權(quán)利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是無機(jī)材料，其中用于形成多孔膜的材料本身具有親水性基團(tuán)。
36.如權(quán)利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過對(duì)不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜進(jìn)行處理、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
37.如權(quán)利要求36所述的核酸吸附性多孔膜，其中把所述親水性基團(tuán)引入所述的不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料中的處理包括把接枝聚合物鏈連接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物鏈在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)。
38.如權(quán)利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通過基本上不涉及離子鍵的相互作用來吸附所述核酸的多孔膜是通過用具有親水性基團(tuán)的材料來涂覆不具有親水性基團(tuán)的無機(jī)材料多孔膜、從而把親水性基團(tuán)引入該多孔膜中而得到的多孔膜。
39.如權(quán)利要求38所述的核酸吸附性多孔膜，其中具有親水性基團(tuán)的材料是在其聚合物主鏈或其側(cè)鏈上具有親水性基團(tuán)的有機(jī)聚合物。
40.如權(quán)利要求31至39中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述親水性基團(tuán)是羥基。
41.如權(quán)利要求1至40中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別在所述的步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中，在壓力下通過所述核酸吸附性多孔膜。
42.如權(quán)利要求41所述的核酸吸附性多孔膜，其用于所述的分離和純化核酸的方法中，其中所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別在所述的步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中，通過核酸分離純化柱的第一開口注入，其中所述柱具有至少兩個(gè)開口，該至少兩個(gè)開口包括所述第一開口和第二開口；以及用連接到所述第一開口的壓力差產(chǎn)生裝置在所述柱的內(nèi)部形成加壓狀態(tài)，從而使所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別通過所述多孔膜并使所述的含有核酸的樣品溶液、所述洗滌液和所述回收液分別從所述第二開口排出。
43.一種核酸分離純化柱，該柱包括具有至少兩個(gè)開口的容器，所述的至少兩個(gè)開口包括第一開口和第二開口；以及權(quán)利要求1至42中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜，該多孔膜被容納在所述容器中。
44.如權(quán)利要求43所述的核酸分離純化柱，其中作為壓力差產(chǎn)生裝置的泵以可拆裝的方式連接到所述核酸分離純化柱的所述第一開口。
45.一種成套用具，其包括核酸分離純化柱，該柱具有權(quán)利要求1至42中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜；以及試劑。
46.一種核酸分離純化裝置，該裝置使用權(quán)利要求1至42中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸吸附性多孔膜。
47.如權(quán)利要求46所述的核酸分離純化裝置，該裝置是自動(dòng)實(shí)施核酸分離和純化步驟的自動(dòng)裝置，所述步驟包括通過在壓力下，把含有核酸的樣品溶液注入到具有核酸吸附性多孔膜的核酸分離純化柱中，使所述樣品溶液中的所述核酸吸附到該核酸吸附性多孔膜上；在壓力下，把洗滌液注入到所述的核酸分離純化柱中以除去除所述核酸以外的其它成分，在此期間所述核酸仍吸附在所述核酸吸附性多孔膜上；以及在壓力下，把回收液注入到所述的核酸分離純化柱中，使吸附到所述核酸吸附性多孔膜上的所述核酸解吸附，并連同所述回收液回收所述核酸；其中所述裝置包括支承機(jī)構(gòu)，其用于支承所述的核酸分離純化柱、用于容納所述樣品溶液的排放液和所述洗滌液的排放液的廢液容器、用于容納含有所述核酸的所述回收液的回收容器；壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)，其用于把壓縮空氣供給到所述的核酸分離純化柱；以及分注機(jī)構(gòu)，其用于分別把所述洗滌液和所述回收液注入到所述的核酸分離純化柱中。
48.如權(quán)利要求47所述的核酸分離純化裝置，其中所述支承機(jī)構(gòu)包括立架，其安裝在所述裝置的主體上；柱支架，其可垂直移動(dòng)地承載于所述立架上，并支承所述的核酸分離純化柱；以及用于支承所述廢液容器和所述回收容器的支架，該支架位于所述柱支架下面的某一位置上，該支架與所述核酸分離純化柱的相對(duì)位置可以改變。
49.如權(quán)利要求47或48所述的核酸分離純化裝置，其中所述的壓縮空氣供給機(jī)構(gòu)包括氣嘴，用于從其下緣部噴射壓縮空氣；壓頭，用于承載所述氣嘴，并用于使所述氣嘴相對(duì)于被支承在所述柱支架中的所述核酸分離純化柱垂直移動(dòng)；以及定位裝置，其設(shè)置在所述壓頭上，并用于定位在所述支承機(jī)構(gòu)的臺(tái)架中的所述核酸分離純化柱。
50.如權(quán)利要求47至49中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸分離純化裝置，其中所述的分注機(jī)構(gòu)包括洗滌液注入嘴，其用于注入所述洗滌液；回收液注入嘴，其用于注入回收液；注入嘴移動(dòng)架，其用于支承所述的洗滌液注入嘴和所述的回收液注入嘴，并能夠在所述的核酸分離純化柱上依次移動(dòng)，所述的核酸分離純化柱由所述支承機(jī)構(gòu)支承；洗滌液供給泵，其用于從含有所述洗滌液的瓶子中抽吸所述洗滌液，并把該洗滌液供給到所述的洗滌液注入嘴；以及回收液供給泵，其用于從含有所述回收液的瓶子中抽吸所述回收液，并把該回收液供給到所述的回收液注入嘴。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核酸吸附性多孔膜以及一種使用該膜的裝置，該膜具有優(yōu)異的分離能力、良好的洗滌效率，可以使操作過程方便快捷，并具有自動(dòng)操作適應(yīng)性和尺寸減小適應(yīng)性，可以批量生產(chǎn)分離能力基本上相同的這種膜，并且該膜適用于分離和純化核酸的方法；用于分離和純化核酸的核酸吸附性多孔膜具有核酸吸附性固相，該核酸吸附性固相用在分離和純化核酸的方法中，該固相吸附核酸，該方法包括以下步驟(1)通過使含有核酸的樣品溶液與核酸吸附性固相接觸，使得所述核酸吸附到所述固相上；(2)通過使洗滌液與所述固相接觸來洗滌該固相，在此期間所述核酸仍吸附在所述固相上；以及(3)通過使回收液與所述固相接觸，使得所述核酸從所述固相解吸附。
文檔編號(hào)C07H21/02GK1871348SQ20048003100
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月20日
發(fā)明者境野佳樹, 牧野快彥, 森壽弘 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社