專利名稱：融合多肽及其在抗血管腫瘤治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括至少兩個(gè)肽的融合多肽。一個(gè)肽包括3至30個(gè)氨基酸并且容許該融合多肽選擇性地結(jié)合腫瘤血管中的內(nèi)皮細(xì)胞。另一個(gè)肽由組織因子(TF)或其片段組成，該組織因子和片段的特征在于當(dāng)融合多肽結(jié)合腫瘤血管中的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)它們能夠活化血液凝固。該肽可直接連接在一起或通過(guò)具有至多15個(gè)氨基酸的接頭(Linker)連接在一起。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些融合多肽在腫瘤疾病的抗血管治療中的用途及其在制備用于治療腫瘤疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
足夠的新血管形成是進(jìn)行性腫瘤生長(zhǎng)的先決條件(1)。新血管生成對(duì)于維持?jǐn)U張的腫瘤生長(zhǎng)是特別需要的，因?yàn)橹挥凶銐虻难鹾献饔脤⒈ＷC為腫瘤供給養(yǎng)分并從腫瘤除去腫瘤降解作用的產(chǎn)物。
在針對(duì)腫瘤治療的現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)開發(fā)了抗血管治療性策略，其目標(biāo)在于破壞腫瘤血管和使相關(guān)腫瘤梗死，此外開發(fā)了侵襲血管生長(zhǎng)和分化的復(fù)雜過(guò)程的抗血管生成治療性策略。
這些策略的先決條件是鑒定腫瘤血管內(nèi)皮中、但不存在于正常組織靜息內(nèi)皮細(xì)胞上的靶結(jié)構(gòu)。為了將細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和某些毒素以相對(duì)于腫瘤細(xì)胞本身較少的程度施用于腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞而使用這些特異的靶結(jié)構(gòu)。可用于這個(gè)目的的靶結(jié)構(gòu)是bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)和VEGFR-2(VEGF受體2)、內(nèi)皮糖蛋白、內(nèi)皮唾液酸蛋白、纖粘連蛋白同工型(ED-B結(jié)構(gòu)域)、整合素αvβ3、αvβ5、α1β1和α1β2、氨基肽酶N、NG2蛋白多糖和基質(zhì)金屬蛋白酶2和9(MMP 2和9)(2-13)。例如，Arap等(8)將特異結(jié)合α1-整合素的肽與用于現(xiàn)有化療(阿霉素)領(lǐng)域的活性物質(zhì)偶聯(lián)。在動(dòng)物模型中證明可通過(guò)與該肽偶聯(lián)而增加阿霉素的抗腫瘤效果。
備選的抗血管治療方法包括腫瘤血管中血液凝固的選擇性活化以誘導(dǎo)腫瘤壞死。例如，生產(chǎn)雙特異的F(ab’)2抗體片段，其指向截短的組織因子(tTF)和MHC II類抗原。腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中抗原的實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)后，可通過(guò)在鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型中施用抗體證明抗血管治療(14)。在相同團(tuán)隊(duì)的第二研究中，使用使tTF選擇性地偶聯(lián)于腫瘤血管內(nèi)皮的天然存在標(biāo)記物，VCAM-1(血管細(xì)胞粘附分子-1)的免疫共軛物(15)。
在非常相似的方法中，將特異于癌胚ED-B結(jié)構(gòu)域的抗體片段(scFv)與tTF融合。在小鼠模型中產(chǎn)生的該融合蛋白，ScFv-tTF導(dǎo)致多種腫瘤中完全的和選擇性的梗死(16)。
備選地，將tTF偶聯(lián)于前列腺-特異的膜抗原的抑制劑(17)。靜脈內(nèi)給藥后這種融合蛋白在大鼠前列腺模型中誘導(dǎo)選擇性的梗塞壞死。這種融合多肽與細(xì)胞毒性物質(zhì)(阿霉素)組合低劑量給藥導(dǎo)致大塊腫瘤退化，甚至完全的腫瘤消除(17)。最近已經(jīng)描述了由針對(duì)VEGFR、內(nèi)皮糖蛋白和VCAM-1的抗體片段組成的其他tTF融合蛋白(18)。
然而現(xiàn)有技術(shù)中為了抗血管腫瘤治療而生產(chǎn)的分子具有缺陷。特別地必須假定這些分子由于其大小而產(chǎn)生免疫原性。因此用這些分子治療哺乳動(dòng)物將觸發(fā)針對(duì)這些分子的免疫反應(yīng)，所以重復(fù)施用這些分子變得不可行。
借助于可活化血液凝固的肽部分的偶聯(lián)配偶體尺寸將用于腫瘤組織，可進(jìn)一步對(duì)血液凝固而言重要的大分子因子VIIa/FX酶-底物復(fù)合物的形成導(dǎo)致空間阻礙。當(dāng)能夠活化血液凝固的肽由于相對(duì)大的融合配偶體而具有改變的構(gòu)象時(shí)也可妨礙該復(fù)合物的形成。
現(xiàn)有技術(shù)中(WO 03/035688)，使已知具有選擇性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合多肽與組織因子多肽的N-末端偶聯(lián)，其中選擇性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)槔缋w粘連蛋白的結(jié)構(gòu)域，其結(jié)合例如包括RGD肽，或結(jié)合PSMA(前列腺特異的膜抗原)的D-β-E二肽的整合素。盡管該構(gòu)建體在體外證明了酰胺分解和蛋白水解效果，即使與因子VIIa組合，在體內(nèi)只顯示了極弱的抗腫瘤作用。只在與強(qiáng)力霉素組合中動(dòng)物存活較長(zhǎng)。
Hu等(46)描述了多種融合蛋白及其在腫瘤血管中產(chǎn)生血栓的用途，包括來(lái)自偶聯(lián)于截短形式的組織因子的、含有RGD序列的、具有9個(gè)氨基酸的寡肽的融合蛋白。再次將RGD肽與tTF的N-末端連接以獲得RGD-tTF。功能分析顯示含有RGD的融合蛋白對(duì)腫瘤生長(zhǎng)不產(chǎn)生任何顯著的抑制。
因此構(gòu)建現(xiàn)有技術(shù)中已知的構(gòu)建體以使得選擇性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與組織因子多肽的N-末端連接。甚至強(qiáng)調(diào)必須選擇這種結(jié)構(gòu)，因?yàn)檎J(rèn)為結(jié)構(gòu)模型基礎(chǔ)上的N-末端是特別有利于連接的位點(diǎn)，其不會(huì)抑制血栓形成的起始。
發(fā)明概述鑒于這種現(xiàn)有技術(shù)，因此問(wèn)題在于提供在體內(nèi)可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的備選血栓形成物質(zhì)。
現(xiàn)在通過(guò)融合多肽解決了這個(gè)問(wèn)題，該融合多肽包括容許該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3-30個(gè)氨基酸的肽，和組織因子(TF)或其片段，該組織因子和片段的特征在于當(dāng)融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮時(shí)它們能夠活化血液凝固，這些肽相互直接偶聯(lián)，或通過(guò)具有至多15個(gè)氨基酸的接頭相互偶聯(lián)。將能夠使融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽與當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)可活化血液凝固的肽的C-末端偶聯(lián)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有相應(yīng)融合多肽的藥物組合物及其用于治療腫瘤的用途。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示tTF-RGD和tTF-NGR融合蛋白結(jié)合αvβ3和CD13的圖解。由于RGD序列對(duì)αvβ3-整合素和NGR序列對(duì)CD13(氨基肽酶N)的特異性而獲得腫瘤的選擇性。在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上以高密度選擇性地和特異地表達(dá)這些受體，但不在正常組織的靜息內(nèi)皮細(xì)胞(除了一些例外之外)上表達(dá)。融合蛋白的表示是高度示意性的并且不提供關(guān)于基本序列的任何信息。
圖2重組tTF1-218和tTF融合蛋白的SDS-PAGE和Western印跡分析。通過(guò)在從大腸桿菌(Ecoli)(BL21 DE3)提取和經(jīng)線性尿素梯度(6M-1M)再折疊后進(jìn)行SDS-PAGE并用考馬斯藍(lán)染色來(lái)檢驗(yàn)tTF和tTF融合蛋白的純度。利用單克隆抗-組織-因子抗體(clone V1C7American Diagnostics)通過(guò)Western印跡驗(yàn)證蛋白質(zhì)的鑒定。加樣到單獨(dú)的泳道中1＝tTF；2＝tTF-RGD；3＝tTF-NGR；4＝tTF-環(huán)形NGR1；5＝tTF-環(huán)形NGR2；6＝tTF-環(huán)形NGR3；7＝tTF-GALNGRSHAG；M＝分子量標(biāo)記。
圖3FVIIa/tTF1-218或FVIIa/tTF1-218融合蛋白活化FX的Michaelis常數(shù)(Km)的測(cè)定。利用Ruf(45)描述的方法計(jì)算Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)的參數(shù)。
圖4tTF、tTF-RGD和tTF-NGR與整合素αvβ3的結(jié)合。在ELISA中用針對(duì)人TF(American Diagnostica)的多克隆抗體定量0.1μMtTF、tTF-RGD和tTF-NGR與固定的αvβ3的結(jié)合。結(jié)果表示為中值和四分值的范圍。tTF-RGD和tTF之間或tTF-NGR和tTF之間結(jié)合的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＜0.001，Mann-Whitney測(cè)試)。
圖5tTF-RGD結(jié)合整合素αvβ3的特異性。通過(guò)用合成肽GRGDSP(1-10μM)競(jìng)爭(zhēng)性抑制來(lái)顯著抑制tTF-RGD(0.1μM)與固定的αvβ3的結(jié)合(對(duì)于兩個(gè)RGD肽濃度的Mann-Whitney測(cè)試，p＜0.001)。
圖6tTF和tTF-RGD與人內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。AFACS分析用0.1μMtTF(2)或用0.1μMtTF-RGD(3)在4℃培養(yǎng)60min的內(nèi)皮細(xì)胞。B通過(guò)用1μM GRGDSP(4)競(jìng)爭(zhēng)性抑制tTF-RGD融合蛋白證明75％的結(jié)合減少。A和B中的曲線1顯示陰性對(duì)照。
圖7與用生理鹽水溶液(NaCl，n＝8)或tTF(n＝1)灌注的腫瘤生長(zhǎng)相比，通過(guò)用tTF融合蛋白(tTF-RGD，n＝6；tTF-NGR，n＝6)靜脈內(nèi)治療對(duì)在無(wú)胸腺的裸鼠中作為異種移植物生長(zhǎng)的人肺癌(CCL185)的抑制。垂直箭頭表示用各物質(zhì)注射的時(shí)間點(diǎn)。
圖8與用生理鹽水溶液(NaCl，n＝4)或tTF(n＝4)灌注的腫瘤生長(zhǎng)相比，通過(guò)用tTF融合蛋白(tTF-RGD，n＝3；tTF-NGR，n＝3)靜脈內(nèi)治療對(duì)在無(wú)胸腺的裸鼠中作為異種移植物生長(zhǎng)的人惡性黑色素瘤(M21)的抑制和部分緩和。垂直箭頭表示用注射各種物質(zhì)的時(shí)間點(diǎn)。
圖9注射tTF-NGR融合蛋白(A，圖片的左半側(cè))或NaCl(A，圖片的右半側(cè))后20min的患有腫瘤小鼠的體內(nèi)肉眼照片。注射tTF-NGR后腫瘤的用藍(lán)-青著色的肉眼圖片指示了腫瘤壞死。60min后，使兩只小鼠放血，完全切下腫瘤，并進(jìn)行組織學(xué)檢查。在B中，我們可看到用tTF-NGR處理的腫瘤的出血性吸脹，這是作為初始腫瘤壞死的結(jié)果的次級(jí)出血跡象。相比之下，NaCl處理的腫瘤看來(lái)是活的(C)。
圖10在患有腫瘤的裸鼠的尾靜脈中靜脈內(nèi)注射tTF-RGD(A和B)、tTF-NGR(C和D)和普通鹽(E和F)后1小時(shí)黑色素瘤的組織學(xué)。在用tTF融合蛋白處理的腫瘤中，血管看起來(lái)是血栓溶解閉塞的(箭頭)。在由血液凝塊閉塞的血管的供給區(qū)域中可觀察到廣泛的腫瘤壞死(A-D)。照片是腫瘤的代表性區(qū)域(A、C和E200×放大，B、D和F 400×放大；HE染色(例如，在H.C.Burck，HistologischeTechnik-Leitfaden für die Herstellung mikroskopischer Prparate inUnterricht und Praxis，第5版，Thieme Verlag，Stuttgart 1982，109頁(yè)及以下中描述的染色)。
圖11注射4mg/kg BW tTF-NGR后1小時(shí)，心(A)、腎(B)、肝(C)和肺(D)的代表性組織學(xué)。在任何的這些器官中顯微鏡術(shù)沒有檢測(cè)到形成血栓或壞死。(HE染色；200×放大)。
圖12人組織因子(TF)的氨基酸序列。
圖13截短的人組織因子tTF1-218的氨基酸序列(在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)也指定簡(jiǎn)稱為tTF)。
圖14融合多肽tTF-GRGDSP的氨基酸序列(也縮寫為tTF-RGD)。
圖15融合多肽tTF-GNGRAHA的氨基酸序列(也縮寫為tTF-NGR)。
圖16融合多肽tTF-GALNGRSHAG的氨基酸序列。
圖17融合多肽tTF-GCNGRCG的氨基酸序列(也縮寫為tTF-環(huán)形NGR1)。
圖18融合多肽tTF-GCNGRCVSGCAGRC的氨基酸序列(也縮寫為tTF-環(huán)形NGR2)。
圖19融合多肽tTF-GCVLNGRMEC的氨基酸序列(也縮寫為tTF-環(huán)形NGR3)。
圖20截短的人組織因子tTF1-218的核苷酸序列(在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)也指定簡(jiǎn)稱為tTF)。
圖21融合多肽tTF-GRGDSP的核苷酸序列(也縮寫為tTF-RGD)。
圖22融合多肽tTF-GNGRAHA的核苷酸序列(也縮寫為tTF-NGR)。
圖23融合多肽tTF-GALNGRSHAG的核苷酸序列。
圖24融合多肽tTF-GCNGRCG的核苷酸序列(也縮寫為tTF-環(huán)形NGR1)。
圖25融合多肽tTF-GCNGRCVSGCAGRC的核苷酸序列(也縮寫為tTF-環(huán)形NGR2)。
圖26融合多肽tTF-GCVLNGRMEC的核苷酸序列(也縮寫為tTF-環(huán)形NGR3)。
圖27用于產(chǎn)生tTF1-218的寡核苷酸的核苷酸序列。
A5’-引物；B3’-引物。
圖28用于產(chǎn)生tTF-GRGDSP的寡核苷酸的核苷酸序列。
A5’-引物；B3’-引物。
圖29用于產(chǎn)生tTF-GNGRAHA的寡核苷酸的核苷酸序列。
A5’-引物；B3’-引物。
圖30用于產(chǎn)生tTF-GCNGRCG的寡核苷酸的核苷酸序列。
A5’-引物；B3’-引物。
圖31用于產(chǎn)生tTF-GCNGRCVSGCAGRC的寡核苷酸的核苷酸序列。A5’-引物；B3’-引物。
圖32用于產(chǎn)生tTF-GCVLNGRMEC的寡核苷酸的核苷酸序列。
A5’-引物；B3’-引物。
圖33用于產(chǎn)生tTF-GALNGRSHAG的寡核苷酸的核苷酸序列。
A5’-引物；B3’-引物。
圖34a與用生理鹽水溶液(NaCl，n＝9)或tTF(n＝11)灌注的腫瘤生長(zhǎng)相比，通過(guò)用tTF融合蛋白(tTF-RGD，n＝7)靜脈內(nèi)治療對(duì)在無(wú)胸腺的裸鼠中作為異種移植物生長(zhǎng)的人惡性黑色素瘤(M21)的抑制和部分緩和。垂直箭頭表示注射各種物質(zhì)的時(shí)間點(diǎn)。
b與用生理鹽水溶液(NaCl，n＝15)或tTF(n＝14)灌注的腫瘤生長(zhǎng)相比，通過(guò)用tTF融合蛋白(tTF-RGD，n＝12)靜脈內(nèi)治療對(duì)在無(wú)胸腺的裸鼠中作為異種移植物生長(zhǎng)的人纖維肉瘤(HT1080)的抑制。垂直箭頭表示注射各種物質(zhì)的時(shí)間點(diǎn)。
c與用生理鹽水溶液(NaCl，n＝10)或tTF(n＝5)灌注的腫瘤生長(zhǎng)相比，通過(guò)用tTF融合蛋白(tTF-RGD，n＝11)靜脈內(nèi)治療對(duì)在無(wú)胸腺的裸鼠中作為異種移植物生長(zhǎng)的人肺癌(CCL185)的抑制。垂直箭頭表示注射各種物質(zhì)的時(shí)間點(diǎn)。在各個(gè)情況中對(duì)于獨(dú)立的組用Mann-Whitney測(cè)試研究統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，p值在0.05以下認(rèn)為是顯著的，*顯示tTF-RGD和緩沖液之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著性。
圖35用tTF-RGD融合蛋白(A、C)或NaCl(B、D)處理結(jié)束時(shí)(第7天)，患有M21腫瘤小鼠的肉眼照片。與外觀上活的對(duì)照腫瘤相比，顯示明顯壞死跡象的tTF-RGD-處理腫瘤的大小差異和外觀差異是可容易辨別的。
圖36用tTF-RGD和生理鹽水溶液處理的小鼠腫瘤和器官的H-E染色在用tTF-RGD處理的動(dòng)物中觀察到腫瘤細(xì)胞的嚴(yán)重血栓形成和壞死(A200倍，B400倍)。箭頭顯示腫瘤血管中形成血栓的實(shí)例。在用鹽水處理的動(dòng)物中沒有觀察到明顯的血栓形成或壞死(C200倍，D400倍)。箭頭顯示具有一些紅血球的完整腫瘤血管。用tTF-RGD處理的動(dòng)物的心(E)、肺(F)、肝(G)和腎沒有顯示任何可見的形成血栓或壞死。
圖37tTF-NGR在纖維肉瘤模型中的作用沒有(tTF-NGR前)和靜脈注射給藥tTF-NGR后6小時(shí)(tTF-NGR后)通過(guò)磁共振成像(MRI)研究患有纖維肉瘤(HT1080)的小鼠。顯示了高或低的血管體積分?jǐn)?shù)。
發(fā)明詳述現(xiàn)在通過(guò)包括下列肽的融合多肽克服現(xiàn)有技術(shù)中觀察到的問(wèn)題a)能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3至30個(gè)氨基酸的肽；和b)組織因子(TF)或其片段，該組織因子和片段的特征在于當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，它們能夠活化血液凝固，其中肽a)和b)直接相互偶聯(lián)或通過(guò)具有至多15個(gè)氨基酸的接頭相互偶聯(lián)，其特征在于能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽與當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化血液凝固的肽之C末端偶聯(lián)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有相應(yīng)融合蛋白的藥物及其用于治療腫瘤的用途。
除序列a)和b)外，本發(fā)明所述的融合多肽可包括附加的序列，只要這些序列對(duì)融合多肽的空間構(gòu)象沒有不良影響，并且不會(huì)妨礙形成觸發(fā)血液凝固的酶-底物復(fù)合物。本發(fā)明所述的融合多肽可例如包含簡(jiǎn)化肽的重組表達(dá)和純化的His-Tag序列(參考實(shí)施例)。然而這些序列的存在不是必須的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，融合多肽因此包括a)能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3至30個(gè)氨基酸的肽；和b)組織因子(TF)或其片段，該組織因子和片段的特征在于當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，它們能夠活化血液凝固，其中肽a)和b)直接相互偶聯(lián)或通過(guò)具有至多15個(gè)氨基酸的接頭相互偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，融合多肽包括a)能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3至30個(gè)氨基酸的肽；和b)組織因子(TF)或其片段，該組織因子和片段的特征在于當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，它們能夠活化血液凝固，其中肽a)和b)相互偶聯(lián)。
根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝地顯示，來(lái)自能夠使融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的特別小的肽的融合多肽，和當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化血液凝固的肽對(duì)于抗血管腫瘤治療是特別有利的。容許結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的小尺寸多肽改善了融合蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞磷脂膜的定向。為血液凝固所必需的酶/底物復(fù)合物的形成沒有受到空間位阻，并且可活化血液凝固的組織因子TF沒有經(jīng)受構(gòu)象變化。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，當(dāng)融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化血液凝固的肽是具有如SEQ ID NO1(圖12)所示氨基酸序列的組織因子TF。本發(fā)明進(jìn)一步包括與SEQ ID NO1(圖12)具有至少70％或至少80％氨基酸同源性的組織因子序列，具有至少95％同源性的序列是特別優(yōu)選的。通過(guò)上下書寫兩個(gè)序列，為了獲得待比較序列最大可能的一致，可使100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度上有4個(gè)缺口來(lái)確定同源性的程度(參考Dayhoff，Atlas of Protein Sequence and Structure，5，124，1972)。然后確定兩個(gè)氨基酸鏈中較短鏈的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，這與另一鏈上的相同氨基酸殘基相對(duì)。
此外當(dāng)融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化腫瘤血管中血液凝固的肽可以是組織因子TF的片段或TF同源序列的片段。優(yōu)選該片段具有如SEQ ID NO2(圖13)所示的序列。如SEQ ID NO2(圖13)所示的序列(tTF1-218或簡(jiǎn)稱tTF)包括TF的N-末端218個(gè)氨基酸。此外，根據(jù)本發(fā)明，也可能使用相對(duì)于tTF在N-末端或C-末端缺少幾個(gè)氨基酸的tTF片段。例如，可能使用在N-末端缺少至多10個(gè)氨基酸的片段(tTF11-218)。另外，可使用在C-末端缺少至多8個(gè)氨基酸的片段(tTF1-210)，例如(tTF1-214)。
本發(fā)明涉及融合多肽，其中能夠選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽偶聯(lián)于能夠活化血液凝固的肽的C-末端。根據(jù)本發(fā)明，使用術(shù)語(yǔ)“腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞”和術(shù)語(yǔ)“腫瘤血管中的內(nèi)皮細(xì)胞”來(lái)指覆蓋腫瘤血管的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明證實(shí)上述排列保證融合蛋白垂直于內(nèi)皮細(xì)胞磷脂膜的方向，這對(duì)于觸發(fā)血液凝固是特別有利的。這個(gè)方向相應(yīng)于誘導(dǎo)血液凝固期間TF的天然方向。如圖3所示，對(duì)于以這種方式產(chǎn)生的所有構(gòu)建體，關(guān)于由FVIIa/tTF1-218或FVIIa/tTF1-218融合蛋白活化的因子X發(fā)現(xiàn)了非常相似的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)。在現(xiàn)有技術(shù)中，相比之下活化血凝塊的肽偶聯(lián)于靶分子的C-末端(參考(16))。因此本發(fā)明所述的融合多肽在根本上不同于現(xiàn)有技術(shù)中所使用的肽。
能夠使融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽可以是長(zhǎng)度為3-30個(gè)氨基酸并且以高特異性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的任何肽?？赏ㄟ^(guò)現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法從肽文庫(kù)分離相應(yīng)的肽。根據(jù)所選擇的肽文庫(kù)，它們可具有線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，容許融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽包括氨基酸序列RGD或NGR?，F(xiàn)有技術(shù)中已知兩個(gè)序列特異結(jié)合整合素，特別是αvβ3和αvβ5整合素(RGD肽)，以及細(xì)胞粘附模體(NGR肽)(參考(8))。根據(jù)本發(fā)明令人驚訝地顯示這些肽特別適于是融合多肽的部分，而該融合多肽的另外部分是當(dāng)融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化血液凝固的肽。
使用序列GRGDSP、GNGRAHA和GALNGRSHAG的線性肽以及序列GCNGRCG、GCNGRCVSGCAGRC和GCVLNGRMEC的環(huán)狀肽獲得特別有利的效果。證明包括這些序列和人TF的最初218個(gè)氨基酸序列的融合多肽高度適于抗血管腫瘤治療。特別地，顯示這些融合多肽導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制或腫瘤尺寸減小(參見圖7和8)。所觀察到的腫瘤部分緩和的誘導(dǎo)(參考圖8)指向基于小鼠模型高度預(yù)測(cè)功效的人腫瘤治療中的陽(yáng)性結(jié)果預(yù)期(42、43、44)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括具有環(huán)狀RGD肽的融合蛋白，因?yàn)榄h(huán)化提高了對(duì)整合素的親合力(例如如參考文獻(xiàn)21中所描述的)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有如SEQ ID NO3-8(圖14-19)所示序列之一的融合多肽。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及編碼如上所述的融合多肽的核酸。相應(yīng)的核酸可例如具有如SEQ ID NO10-15(圖21-26)所示的序列之一。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括前述核酸之一的載體。相應(yīng)的載體通常也包括核酸的表達(dá)調(diào)控序列。在現(xiàn)有技術(shù)中全面描述了所述的載體，并且可從大量的公司商業(yè)獲得這種載體。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括上述核酸或載體之一的細(xì)胞。該細(xì)胞一般用于表達(dá)核酸和重組生產(chǎn)本發(fā)明所述的融合多肽。為此目的，可發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞的應(yīng)用，包括大腸桿菌(E.coli)、酵母細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞系，例如CHO-或COS-細(xì)胞。在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛描述了適當(dāng)?shù)募?xì)胞及其用途。
可進(jìn)一步通過(guò)其他合適的方法，例如通過(guò)個(gè)別肽的化學(xué)偶聯(lián)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的本發(fā)明的多肽。因此可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法，例如通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)異源表達(dá)來(lái)生產(chǎn)個(gè)別的肽，然后通過(guò)偶聯(lián)連接在一起。
最后，本發(fā)明也涉及包括上述融合多肽、核酸、載體或細(xì)胞的藥物組合物。該藥物組合物可進(jìn)一步包括藥物學(xué)上可接受的相容載體、賦形劑或佐劑。此外，所述藥物組合物中的多肽可以修飾的狀態(tài)，例如peg化(pegyliert)，即與聚乙二醇分子偶聯(lián)的狀態(tài)存在。
本發(fā)明所述的融合多肽或包含這些融合多肽的藥物組合物可用于治療腫瘤疾病，特別用于抗血管腫瘤治療。被認(rèn)為可用本發(fā)明所述的融合多肽或包含這些融合多肽的藥物組合物輔助治療的腫瘤疾病包括例如支氣管肺癌和胸腔及縱隔腔的其他腫瘤、乳腺癌和其他婦科腫瘤、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌和胃腸道的其他腫瘤、惡性黑色素瘤和其他皮膚腫瘤、頭頸區(qū)中的腫瘤、前列腺癌和其他泌尿生殖器腫瘤、肉瘤、內(nèi)分泌活化的腫瘤、白血病和脊髓發(fā)育不良綜合癥和霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤以及非霍奇金淋巴瘤。
此外，也可治療良性腫瘤，例如血管瘤，和糖尿病性視網(wǎng)膜病中的新血管化作用。
除靜脈內(nèi)給藥外，皮下和腹膜內(nèi)施用融合多肽或藥物組合物也是可行的。通過(guò)包裝在防止融合多肽在胃腸道中斷裂的藥物載體中，也可口服給藥該融合多肽或藥物組合物。
進(jìn)一步的，與其它的治療途徑，例如與細(xì)胞毒的化療或放射組合施用本發(fā)明所述的融合多肽可能是有益的。具有其他活性物質(zhì)的組合物，例如具有因子VIIa或強(qiáng)力霉素的組合物也是可行的，但優(yōu)選本發(fā)明所述的多肽與因子VIIa或強(qiáng)力霉素的組合物不是必須的。
基于下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例1tTF和tTF融合蛋白的表達(dá)和純化利用SEQ ID NO16和SEQ ID NO17(圖27)所示的引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成編碼組織因子TF(下文標(biāo)明為tTF)N-末端218個(gè)氨基酸的cDNA，并克隆到表達(dá)載體pET-30a(+)(Novagen)中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(BL21)中，表達(dá)并純化(Qiagen PlasmidKit)。
沿著截短的組織因子tTF，構(gòu)建tTF肽融合蛋白，其中靶向肽首先結(jié)合可溶組織因子tTF的羧基末端。構(gòu)建下列線性融合蛋白tTF-GRGDSP(SEQ ID NO3；圖14；下文標(biāo)明為tTF-RGD；使用PCR引物SEQ ID NO18和SEQ ID NO19(圖28))；tTF-GNGRAHA(SEQ ID NO4；圖15；下文標(biāo)明為tTF-NGR；使用PCR引物SEQ ID NO20和SEQ ID NO21(圖29))；tTF-GALNGRSHAG(SEQ ID NO5；圖16；使用PCR引物SEQID NO28和SEQ ID NO29(圖33))；另外，合成下列環(huán)狀融合蛋白tTF-GCNGRCG(SEQ ID NO6；圖17；下文標(biāo)明為tTF-環(huán)狀NGR1；使用PCR引物SEQ ID NO22和SEQ ID NO23(圖30))；tTF-GCNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO7；圖18；下文標(biāo)明為tTF-環(huán)狀NGR2；使用PCR引物SEQ ID NO24和SEQ ID NO25(圖31))；tTF-GCVLNGRMEC(SEQ ID NO8；圖19；下文標(biāo)明為tTF-環(huán)狀NGR3；使用PCR引物SEQ ID NO26和SEQ ID NO27(圖32))在介導(dǎo)附加表達(dá)6個(gè)組氨酸殘基的N-末端親合標(biāo)記和一些載體編碼氨基酸的pET30a(+)載體中表達(dá)所有的構(gòu)建體(包括tTF)。在該親合標(biāo)記的幫助下，可通過(guò)鎳-次氮基三乙酸柱(Ni-NTA，Novagen)上的親合層析純化構(gòu)建體。親合標(biāo)記顯示在SEQ ID NO30中。作為實(shí)施例，SEQ ID NO31和SEQ ID NO32顯示了具有親合標(biāo)記的tTF-GRGDSP和tTF-GNGRAHA的完整氨基酸序列。
選擇構(gòu)建體以使得根據(jù)tTFFVIIa復(fù)合物的已知X-射線晶體結(jié)構(gòu)(19)，保證tTF融合蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞磷脂膜的垂直方向，這相應(yīng)于天然TF的方向。進(jìn)一步考慮所選擇的結(jié)構(gòu)不會(huì)導(dǎo)致tTF產(chǎn)生對(duì)FVIIa和大分子底物FX相互作用的任何空間位阻。由于RGD序列對(duì)αvβ3整合素和NGR序列對(duì)CD13(氨基肽酶N)的特異性，獲得腫瘤選擇性，正如在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上以高密度選擇性地和特異地表達(dá)這些受體，但除了一些例外之外，不在正常組織的靜止內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)(參見圖1)。
在大腸桿菌(BL21)中借助pET30a(+)轉(zhuǎn)化和表達(dá)tTF和描述為tTF-RGD、tTF-NGR、tTF-GALNGRSHAG和tTF-環(huán)狀NGR1-3的融合蛋白。離心轉(zhuǎn)化的、IPTG-誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21DE3，將每g沉淀顆粒吸入5-7ml的裂解緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.5；150mMNaCl；1mM MgCl2；10μg/ml抑肽酶；2mg/ml溶菌酶)，并加入20μl Benzonase(Novagen)。室溫(RT)下孵育90min后，于4℃以12,000g離心20min，將沉淀顆粒重懸在洗滌緩沖液(10mM Tris/HCl，pH7.5；1mM EDTA；3％Triton X-100)中并通過(guò)超聲波處理勻質(zhì)化。在每g沉淀顆粒2-4ml變性緩沖液(6M鹽酸胍，0.5M NaCl，20mMNaH2PO4，1mM DTT)中于室溫溶解包涵體過(guò)夜。用0.22μg的濾器過(guò)濾來(lái)自離心(5000g，30min，4℃)的上清液。純化構(gòu)建體直到借助于另外導(dǎo)入的構(gòu)建體His-Tag序列在鎳-次氮基三乙酸柱(Ni-NTA，Novagen)上均勻化。用His結(jié)合緩沖液試劑盒(Novagen)進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化和折疊。然后用TBS緩沖液(20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4)透析。
通過(guò)SDS-PAGE、Western印跡和質(zhì)譜鑒定該蛋白質(zhì)(參見圖2)。
實(shí)施例2tTF和tTF融合蛋白的功能特性關(guān)于因子X借助因子VIIa活化為因子Xa中的輔助因子活性，通過(guò)Michaelis-Menten分析體外證明這些融合蛋白的功能活性。在由Ruf描述的(45)略微改進(jìn)的方法中確定tTF和tTF融合蛋白在存在磷脂時(shí)，借助FVIIa強(qiáng)化FX的特異蛋白水解活化的能力。為此，在微滴定板中吸入20μl下列各種試劑(a)在TBS-BSA中的50nM重組FVIIa(Novo-Nordisk)；(b)在TBS-BSA中的0.16nM-1.6μM tTF/tTF融合多肽；(c)25mM CaCl2和500μM磷脂泡囊(卵磷脂/磷脂酰絲氨酸，70/30，M/M；Sigma)。在室溫孵育10min后，加入5μM濃度的20μl天然底物FX(Enzyme Research Laboratories)。然后以1分鐘間隔用移液管吸取樣品，并通過(guò)加入100mM EDTA溶液終止反應(yīng)。通過(guò)加入生色底物Spectrozyme FXa，在微平板閱讀儀中測(cè)定405nm處吸光值的變化來(lái)測(cè)量形成的FXa數(shù)量，通過(guò)Ruf描述的方法分析Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)的參數(shù)。結(jié)果顯示tTF和tTF融合多肽在這些條件下都是功能性活化的(圖3)。發(fā)現(xiàn)融合多肽的Michaelis常數(shù)(Km)在0.12-1.2nM的范圍中(圖3)，并且如此在為tTF公開的較低范圍中。可因此推測(cè)功能性活性不受tTF與肽融合的影響。
實(shí)施例3tTF融合蛋白與αvβ3的體外和體內(nèi)結(jié)合通過(guò)將純化的αvβ3固定在微滴定平板上，在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)中證明tTF-RGD和tTF-NGR結(jié)合αvβ3整合素(參見圖4)。通過(guò)具有序列GRGDSP的合成肽(來(lái)自Gibco公司)在這個(gè)測(cè)試系統(tǒng)中競(jìng)爭(zhēng)性抑制tTF-RGD結(jié)合αvβ3的事實(shí)強(qiáng)調(diào)了tTF-RGD結(jié)合αvβ3的特異性(參見圖5)。
然后評(píng)估tTF-RGD特異性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上的αvβ3。為此，通過(guò)FACS(熒光激活細(xì)胞分揀法)分析懸浮物中生物素酰化的tTF和tTF-RGD與內(nèi)皮細(xì)胞的差異結(jié)合。在實(shí)驗(yàn)中利用組織培養(yǎng)中保持的所有內(nèi)皮細(xì)胞被活化，即表達(dá)αvβ3分子的事實(shí)。這可通過(guò)多種免疫組化學(xué)方法檢測(cè)。從而使培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)于其αvβ3的表達(dá)模式方面與腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)應(yīng)。因此培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞可用作底物特異結(jié)合腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的模型系統(tǒng)，并且也容許作出關(guān)于所期望毒性的預(yù)測(cè)。
使用鏈霉抗生物素-藻紅蛋白作為檢測(cè)方法。測(cè)量的tTF-RGD熒光強(qiáng)度比tTF高出8倍(圖6A)。此外，通過(guò)施用1μM的合成肽GRGDSP競(jìng)爭(zhēng)性降低0.1μM tTF-RGD與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的75％(圖6B)。這強(qiáng)調(diào)了tTF-RGD結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面上類似于αvβ3的RGD-結(jié)合受體的特異性。
實(shí)施例4動(dòng)物模型中tTF融合蛋白的抗腫瘤效果在無(wú)胸腺的裸鼠中評(píng)估tTF-RGD和tTF-NGR融合蛋白對(duì)人腫瘤異種移植物的效果和不良影響。對(duì)此使用我們實(shí)驗(yàn)室已建立的模型(33，34)。將細(xì)胞系CCL185(人肺腺癌)和M-21(人黑色素瘤)皮下注射到雄性BALB/c裸鼠(9-12周齡)的側(cè)腹。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到大約50-100mm3(CCL185)或400-600mm3(M-21)時(shí)，將小鼠隨機(jī)分配為4組。第1組只接受生理鹽水溶液(NaCl)，第2組tTF，第3組tTF-RGD，以及第4組tTF-NGR(在每個(gè)情況中，每kg體重(BW)1.5-2.0mg的蛋白質(zhì))。間隔1-3天(取決于特定細(xì)胞系的生長(zhǎng)速率)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行尾靜脈注射。觀察到相當(dāng)可觀的融合蛋白治療活性。用tTF-RGD和tTF-NGR融合蛋白處理的小鼠的腫瘤與tTF和NaCl相比較，其生長(zhǎng)受到顯著抑制或尺寸減小直到部分緩和(參見圖7和8)。
為了驗(yàn)證腫瘤血管中形成血栓誘導(dǎo)的作用機(jī)制，進(jìn)行下列試驗(yàn)將人黑色素瘤細(xì)胞系注射到2只雄性BALB/c裸鼠的側(cè)腹。當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到大約500mm3時(shí)，尾靜脈注射2.0mg/kg BW的tTF-NGR或NaCl。圖9A顯示了注射tTF-NGR融合蛋白(圖片左半部分)或NaCl(圖片右半部分)20min后的患有腫瘤小鼠的體內(nèi)內(nèi)眼圖。注射tTF-NGR后腫瘤的用藍(lán)-青著色的肉眼圖片指示了腫瘤壞死。60min后，使兩只小鼠放血，完全切下腫瘤，并進(jìn)行組織學(xué)研究。圖9B顯示了tTF-NGR處理的腫瘤的出血性吸脹，這是作為初始腫瘤壞死的結(jié)果的次級(jí)出血跡象。相比之下，NaCl處理的腫瘤看來(lái)是活的(圖9C)。
黑色素腫瘤的組織學(xué)分析顯示血管中顯微鏡下可見的血栓形成(圖10A-D)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了tTF-NGR的抗腫瘤效果的暗含機(jī)制，即誘導(dǎo)血管中的血栓。通過(guò)在正常的組織，例如心、腎、肝和肺中組織學(xué)上檢測(cè)不到凝固和壞死證明tTF-NGR對(duì)腫瘤血管的高度選擇性(圖11A-D)。甚至重復(fù)高劑量的tTF-NGR(4mg/kg BW)也不能產(chǎn)生任何可見的凝固形成或器官毒性。
實(shí)施例5HT1080腫瘤動(dòng)物模型中tTF融合蛋白的抗腫瘤效果也用纖維肉瘤(HT1080)在BALB/c裸鼠中研究了tTF-RGD融合蛋白的抗腫瘤活性。這些腫瘤快速生長(zhǎng)并且可很好地形成血管。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在表2和圖34中。第二次注射tTF-RGD后，與對(duì)照組相比，觀察到HT1080腫瘤生長(zhǎng)的明顯抑制。持續(xù)這種作用直到第7天實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P＝0.021，tTF-RGD相對(duì)于緩沖液對(duì)照(生理鹽水溶液)；P＝0.005，tTF-RGD相對(duì)于tTF)。在更早期的實(shí)驗(yàn)中，在這個(gè)模型中觀察到腫瘤體積的部分衰退。
表1tTF-RGD對(duì)小鼠中M21腫瘤生長(zhǎng)的影響
ns非顯著表2tTF-RGD對(duì)小鼠中HT1080腫瘤生長(zhǎng)的影響
ns非顯著表3tTF-RGD對(duì)小鼠中CCL185腫瘤生長(zhǎng)的影響
ns非顯著本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容構(gòu)建其他的tTF融合蛋白而沒有任何問(wèn)題。潛在的候選物是結(jié)合NG2，人黑色素瘤蛋白多糖的鼠同系物的肽TAASGVRSMH和LTLRWVGLMS(12)。NG2的表達(dá)限于腫瘤細(xì)胞和腫瘤生成血管的血管(35)。另一個(gè)候選物是產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的選擇性和潛在抑制的合成肽TTHWGFTL(13)。因?yàn)檎纤卅羦β3也以RGD非依賴的方式明顯結(jié)合MMP-2，這意味著活化的酶位于生成血管的血管表面(36)。由tTF和該MMP-2抑制肽組成的構(gòu)建體可相似的介導(dǎo)tTF1-218選擇性結(jié)合腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞膜。
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<221>人TF的氨基酸序列<400>1Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr yal Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile210 215 220Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile225 230 235 240Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu245 250 255Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser260<210>2<211>2<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>tTF1-218的氨基酸序列<400>2Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Va1 Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg210 215<210>3<211>224<212>PRT<213>人工<220>
<221>tTF-GRGDSP的氨基酸序列<400>3Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Arg Gly Asp Ser Asp210 215 220
<210>4<211>225<212>PRT<213>人工<220>
<221>tTF-GNGRAHA的氨基酸序列<400>4Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Asn Gly Arg Ala His210 215 220Ala225
<210>5<211>228<212>PRT<213>人工<220>
<221>tTF-GALNGRSHAG的氨基酸序列<400>5Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Ala Leu Asn Gly Arg210 215 220Ser His Ala Gly225
<210>6<211>225<212>PRT<213>人工<220>
<221>tTF-GCNGRCG的氨基酸序列<400>6Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Cys Asn Gly Arg Cys210 215 220Gly225
<210>7<211>232<212>PRT<213>人工<220>
<221>tTF-GCNGRCVSGCAGRC的氨基酸序列<400>7Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Cys Asn Gly Arg Cys210 215 220Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys225 230
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<221>tTF-GCVLNGRMEC的氨基酸序列<400>8Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Cys Val Leu Asn Gly210 215 220Arg Met Glu Cys225
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<221>tTF1-218的核苷酸序列<400>9tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact 120aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc 180gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca 240gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc 300acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga 360acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc 420ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct 480tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat 540aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg 600aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt caga654<210>10<211>672<212>DNA<213>人工<220>
<221>tTF-GRGDSP的核苷酸序列<400>10tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact 120aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc 180gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtottctc ctacccggca 240gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc 300acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga 360acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc 420ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct 480tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat 540aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg 600
aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt cagaggaaga660ggtgattctc ca 672<210>11<211>675<212>DNA<213>人工<220>
<221>tTF-GNGRAHA的核苷酸序列<400>11tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact120aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc180gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca240gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc300acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga360acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc420ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct480tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat540aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg600aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt cagaggtaac660ggaagagcac atgca 675<210>12<211>684<212>DNA<213>人工<220>
<221>tTF-GALNGRSHAG的核苷酸序列<400>12tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact120aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc180gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca240gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc300acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga360
acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc420ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct480tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat540aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg600aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt cagaggtgct660ttaaatggaa gatctcacgc tggt 684<210>13<211>675<212>DNA<213>人工<220>
<221>tTF-GCNGRCG的核苷酸序列<400>13tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact120aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc180gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca240gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc300acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga360acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc420ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct480tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat540aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg600aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt cagaggctgc660aacggtagat gtggt 675<210>14<211>696<212>DNA<213>人工<220>
<221>tTF-GCNGRCVSGCAGRC的核苷酸序列<400>14tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60
acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact120aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc180gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca240gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc300acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga360acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc420ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cRctttatta ttggaaatct480tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat540aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg600aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt cagaggttgt660aatggaagat gtgtttctgg atgtgcagga cgatgt 696<210>15<211>684<212>DNA<213>人工<220>
<221>tTF-GCVLNGRMEC的核苷酸序列<400>15tcaggcacta caaatactgt ggcagcatat aatttaactt ggaaatcaac taatttcaag 60acaattttgg agtgggaacc caaacccgtc aatcaagtct acactgttca aataagcact120aagtcaggag attggaaaag caaatgcttt tacacaacag acacagagtg tgacctcacc180gacgagattg tgaaggatgt gaagcagacg tacttggcac gggtcttctc ctacccggca240gggaatgtgg agagcaccgg ttctgctggg gagcctctgt atgagaactc cccagagttc300acaccttacc tggagacaaa cctcggacag ccaacaattc agagttttga acaggtggga360acaaaagtga atgtgaccgt agaagatgaa cggactttag tcagaaggaa caacactttc420ctaagcctcc gggatgtttt tggcaaggac ttaatttata cactttatta ttggaaatct480tcaagttcag gaaagaaaac agccaaaaca aacactaatg agtttttgat tgatgtggat540aaaggagaaa actactgttt cagtgttcaa gcagtgattc cctcccgaac agttaaccgg600aagagtacag acagcccggt agagtgtatg ggccaggaga aaggggaatt cagaggatgc660gtcttaaatg gtaggatgga atgc 684
<210>16<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF1-218的5′寡核苷酸引物<400>16catgccatgg gatcaggcac tacaaatact gtggcagcat ataat 45<210>17<211>40<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF1-218的3′寡核苷酸引物<400>17cgggatccta ttatctgaat tcccctttct cctggcccat40<210>18<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GRGDSP的5′寡核苷酸引物<400>18catgccatgg gatcaggcac tacaaatact gtggcagcat ataat 45<210>19<211>43<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GRGDSP的3′寡核苷酸引物<400>19cgggatccta ttatggagaa tcacotcttc ctctgaattc coc43<210>20<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GNGRAHA的5′寡核苷酸引物<400>20catgccatgg gatcaggcac tacaaatact gtggcagcat ataat 45
<210>21<211>46<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GNGRAHA的3′寡核苷酸引物<400>21cgggatccta ttatgcatgt gctcttccgt tacctctgaa ttcccc 46<210>22<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GCNGRCG的5′寡核苷酸引物<400>22catgccatgg gatcaggcac tacaaatact gtggcagcat ataat 45<210>23<211>46<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GCNGRCG的3′寡核苷酸引物<400>23cgggatccta ttaaccacat ctaccgttgc agcctctgaa ttcccc 46<210>24<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GCNGRCVSGCAGRC的5′寡核苷酸引物<400>24catgccatgg gatcaggcac tacaaatact gtggcagcat ataat 45<210>25<211>67<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GCNGRCVSGCAGRC的3′寡核苷酸引物<400>25cgggatccta ttaacatcgt cctgcacatc cagaaacaca tcttccatta caacctctga60
attcccc67<210>26<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GCVLNGRMEC的5′寡核苷酸引物<400>26catgccatgg gatcaggcac tacaaatact gtggcagcat ataat 45<210>27<211>55<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GCVLNGRMEC的3′寡核苷酸引物<400>27cgggatccta ttagcattcc atcctaccat ttaagacgca tcctctgaat tcccc 55<210>28<211>45<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GALNGRSHAG的5′寡核苷酸引物<400>28catgccatgg gatcaggcac tacaaatact gtggcagcat ataat 45<210>29<211>55<212>DNA<213>人工<220>
<221>用于制備tTF-GALNGRSHAG的3′寡核苷酸引物<400>29cgggatccta ttaaccagcg tgagatcttc catttaaagc acctctgaat tcccc 55<210>30<211>45<212>PRT
<213>人工<220>
<221>親和標(biāo)記的氨基酸序列<400>30His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly1 5 10 15Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser20 25 30Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Gly35 40 45<210>31<211>269<212>PRT<213>人工<220>
<221>具有N-末端親和標(biāo)記的tTF-GRGDSP的氨基酸序列<400>31His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly1 5 10 15Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser20 25 30Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Gly Ser Gly Thr35 40 45Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe50 55 60Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr65 70 75 80Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr85 90 95Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val100 105 110Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val115 120 125Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu130 135 140Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser145 150 155 160Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg165 170 175Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe180 185 190
Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser195 200 205Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val210 215 220Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser225 230 235 240Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly245 250 255Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Arg Gly Asp Ser Asp260 265<210>32<211>270<212>PRT<213>人工<220>
<221>具有N-末端親和標(biāo)記的tTF-GNGRAHA的氨基酸序列<400>32His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly1 5 10 15Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser20 25 30Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Gly Ser Gly Thr35 40 45Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe50 55 60Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr65 70 75 80Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr85 90 95Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val100 105 110Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val115 120 125Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu130 135 140Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser145 150 155 160Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg165 170 175Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe180 185 190
Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser195 200 205Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val210 215 220Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser225 230 235 240Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly245 250 255Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Gly Asn Gly Arg Ala His Ala260 265 270
權(quán)利要求
1.融合多肽，包括a)能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3至30個(gè)氨基酸的肽，和b)組織因子(TF)或其片段，該組織因子和片段的特征在于當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，它們能夠活化血液凝固，其中肽a)和b)直接相互偶聯(lián)或通過(guò)具有至多15個(gè)氨基酸的接頭相互偶聯(lián)，其特征在于能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽與當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化血液凝固的肽之C末端偶聯(lián)。
2.權(quán)利要求1所述的融合多肽，由肽a)和b)以及具有至多15個(gè)氨基酸的接頭組成。
3.權(quán)利要求1所述的融合多肽，其中肽a)和b)直接相互偶聯(lián)。
4.權(quán)利要求1至3之一項(xiàng)所述的融合多肽，其特征在于當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化血液凝固的肽是組織因子TF，其具有如SEQ ID NO1所示的序列。
5.權(quán)利要求1至3之一項(xiàng)所述的融合多肽，其特征在于當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化血液凝固的肽是組織因子TF的片段，其優(yōu)選具有如SEQ ID NO2所示的序列。
6.權(quán)利要求1至5之一項(xiàng)所述的融合多肽，其特征在于能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3至30個(gè)氨基酸的肽具有線性或環(huán)狀的結(jié)構(gòu)。
7.權(quán)利要求1至6之一項(xiàng)所述的融合多肽，其特征在于能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3至30個(gè)氨基酸的肽包括氨基酸序列RGD或NGR。
8.權(quán)利要求7所述的融合多肽，其特征在于能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽選自GRGDSP和GNGRAHA。
9.權(quán)利要求7所述的融合多肽，其特征在于能夠使該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽選自GCNGRCG、GCNGRCVSGCAGRC、GCVLNGRMEC和GALNGRSHAG。
10.權(quán)利要求1至9所述的融合多肽，其特征在于它具有SEQ IDNO3-8所示序列之一。
11.編碼權(quán)利要求1至10之一項(xiàng)所述融合多肽的核酸。
12.權(quán)利要求11所述的核酸，其特征在于它具有SEQ ID NO10-15所示序列之一。
13.包括權(quán)利要求11或12所述核酸的載體。
14.包括權(quán)利要求11或12所述核酸或權(quán)利要求14所述載體的細(xì)胞。
15.包括權(quán)利要求1至10之一項(xiàng)所述融合多肽、權(quán)利要求11或12所述核酸、權(quán)利要求13所述載體或權(quán)利要求14所述細(xì)胞的藥物組合物。
16.權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包括藥物學(xué)上可接受的載體、賦形劑或佐劑。
17.權(quán)利要求15或16所述的藥物組合物用于治療腫瘤疾病的用途。
18.權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于腫瘤疾病選自支氣管肺癌和胸腔及縱隔腔的其他腫瘤、乳腺癌和其他婦科腫瘤、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌和胃腸道的其他腫瘤、惡性黑色素瘤和皮膚的其他腫瘤、頭頸區(qū)中的腫瘤、前列腺癌和其他泌尿生殖器腫瘤、肉瘤、內(nèi)分泌活化的腫瘤、白血病和脊髓發(fā)育不良綜合癥和霍奇金淋巴瘤以及非霍奇金淋巴瘤。
全文摘要
公開了融合的多肽，包括a)容許該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的3至30個(gè)氨基酸的肽，和b)組織因子TF或其片段，該組織因子和片段的特征在于當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化凝血。肽a)和b)直接相互偶聯(lián)或通過(guò)包括至多15個(gè)氨基酸的接頭相互偶聯(lián)，同時(shí)容許該融合多肽選擇性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的肽與當(dāng)該融合多肽結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)能夠活化凝血的肽之C末端偶聯(lián)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1871258SQ200480031384
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者沃爾夫?qū)·伯德爾, R·M·梅斯特斯 申請(qǐng)人:沃爾夫?qū)·伯德爾, 翁科科學(xué)股份公司, 阿里·E·比茲米斯