專利名稱：無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成中通過添加微粒體膜的翻譯后修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成方法，特別涉及一種可以進行翻譯后修飾的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成方法。
背景技術(shù)：
為了解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)是不可缺少的技術(shù)。但是，使用以大腸桿菌為主的很多活細(xì)胞的表達(dá)系，事實上很難合成危及該生物的生命維持的蛋白質(zhì)，只能獲得/分析有限的蛋白質(zhì)。對此，無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成是在只取出蛋白質(zhì)合成中必要的裝置的人工蛋白質(zhì)合成中專用的系統(tǒng)，所以是可以解決活細(xì)胞的表達(dá)系所存在的問題點的方法。
另外，伴隨基因組解析的進展，旨在網(wǎng)羅闡明生物體內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)組(プロテオ一ム)解析正在進展之中。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中存在的游離核糖體上開始翻譯之后，幾乎都在翻譯中或翻譯后接受蛋白酶的加工或被稱為特定氨基酸殘基的修飾的翻譯后修飾。這些翻譯后修飾在很多情況下與蛋白質(zhì)的功能表達(dá)或其控制直接相關(guān)，所以這些解析在蛋白質(zhì)功能的闡明中不可缺少。
作為典型的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，可以舉出信號肽的切割或N-糖基化，已知這些反應(yīng)可以使用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系，在體外進行解析。在該解析系中，首先將目的基因(cDNA)亞克隆到轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用的載體中，使用RNA聚合酶，合成對應(yīng)的mRNA。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(狗胰腺微粒體膜；關(guān)于狗胰腺微粒體膜，參照Walter，P.and Blobel，G.，“酶學(xué)方法(MethodEnzymology)”，(美國)，1983年，第96卷，第84～93頁；Bulleid，N.J.etal.，“生物化學(xué)雜志(The Biochemical journal)”，(美國)，1990年，第268卷，第777～781頁；Paradis，G.et al.，“生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)(Biochemistry and cell biology)”，(加拿大)，1987年，第65卷，第921～924頁等)和RI標(biāo)記氨基酸存在下，用在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液或者小麥胚芽提取液中存在的核糖體使其翻譯。將其供給到SDS-PAGE、熒光顯影(fluorography)，根據(jù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜存在下、不存在下的分子量變化或?qū)Φ鞍酌柑幚淼拿舾行?，檢測翻譯后修飾。另外，還開發(fā)出分別從中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)制備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分、高爾基體組分、細(xì)胞膜組分后添加到兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液中的系統(tǒng)(例如，參照特開2002-238595號公報等)。
作為可以使用這樣的實驗系來解析蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系，迄今為止已知有兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液和小麥胚芽提取液，但除了這兩種以外，沒有其它報道可以解析蛋白質(zhì)翻譯后修飾的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系。
綜上所述，在無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成中，依然需要開發(fā)出通用性高的新翻譯后修飾方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是為了解決上述課題而進行的發(fā)明，其目的在于，提供一種在無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成中的新型翻譯后修飾方法以及使用該翻譯后修飾反應(yīng)的新型無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成方法。
本發(fā)明人等為了解決上述課題而進行了潛心研究，以至完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所述。
(1)本發(fā)明提供一種在使用無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成提取液的無細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)合成方法，所述無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成提取液含有節(jié)肢動物來源的提取物，其中，包括在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應(yīng)。
(2)根據(jù)上述(1)中記載的方法，其中，在mRNA濃度(μg/mL)與哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5的條件下，進行翻譯反應(yīng)。
(3)根據(jù)上述(2)中記載的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
(4)根據(jù)上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，哺乳動物來源的微粒體膜來源于狗胰腺。
(5)根據(jù)上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
(6)根據(jù)上述(5)中記載的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
(7)根據(jù)上述(6)中記載的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
(8)根據(jù)上述(1)～(3)中任意一項記載的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取的提取物。
(9)根據(jù)上述(8)中記載的方法，其中，昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為粉絲夜蛾(Trichoplusia ni)卵細(xì)胞來源或草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢細(xì)胞來源的培養(yǎng)細(xì)胞。
(10)本發(fā)明提供一種翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾方法，其中，在使用含有節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的無細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)合成中，包括在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應(yīng)。
(11)根據(jù)上述(10)中記載的方法，其中，在mRNA濃度(μg/mL)與哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5的條件下，進行翻譯反應(yīng)。
(12)根據(jù)上述(11)中記載的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
(13)根據(jù)上述(10)～(12)中任意一項記載的方法，其中，哺乳動物來源的微粒體膜為狗胰腺來源。
(14)根據(jù)上述(10)～(12)中任意一項記載的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
(15)根據(jù)上述(14)中記載的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
(16)根據(jù)上述(15)中記載的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
(17)根據(jù)上述(10)～(12)中任意一項記載的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取的提取物。
(18)根據(jù)上述(17)中記載的方法，其中，昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為粉絲夜蛾卵細(xì)胞來源或草地夜蛾卵巢細(xì)胞來源的培養(yǎng)細(xì)胞。
(19)根據(jù)上述(10)～(12)中任意一項記載的方法，其中，翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾為N-糖基化和/或信號序列的切除。
(20)本發(fā)明提供一種N-糖基化的蛋白質(zhì)，其中，是利用上述(1)～(3)中任意一項記載的蛋白質(zhì)合成方法得到的。
(21)本發(fā)明提供一種切除了信號序列的蛋白質(zhì)，其中，是利用上述(1)～(3)中任意一項記載的蛋白質(zhì)合成方法得到的。
通過本發(fā)明，能夠提供一種可以進行信號肽切割或N-糖基化等蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成方法。


圖1是表示使用含有節(jié)肢動物來源的提取物或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液，在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下或不存在下進行蛋白質(zhì)合成，檢查信號肽是否被切斷的結(jié)果的圖。
圖2是表示使用含有節(jié)肢動物來源的提取物(蠶來源、High Five來源、Sf21來源)的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液，在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下或不存在下進行蛋白質(zhì)合成，檢查是否進行了N-糖基化的結(jié)果的圖。
圖3是表示使用含有節(jié)肢動物來源的提取物或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液，在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下或不存在下進行蛋白質(zhì)合成，檢查是否進行了糖基化的結(jié)果的圖。
圖4是表示使用含有節(jié)肢動物來源的提取物(Sf21來源)的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液，在哺乳動物來源(CHO細(xì)胞來源)的微粒體膜的存在下或不存在下進行蛋白質(zhì)合成，檢查是否進行了N-糖基化的結(jié)果的圖。
具體實施例方式
以下，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
本發(fā)明是一種在使用含有節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的無細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)合成方法，其特征在于，在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應(yīng)。
無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成方法通常是在含有含作為翻譯裝置的核糖體等的生物體來源提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用反應(yīng)液中，添加轉(zhuǎn)錄模板或翻譯模板來進行的。作為翻譯模板，也可以是從模板DNA轉(zhuǎn)錄而得到的mRNA。在本發(fā)明中，作為生物體來源提取物，使用節(jié)肢動物來源的提取物。
在這里，“節(jié)肢動物”是后生動物的一個門，是指左右對稱、具有裂體腔的原口動物，可以屬于螯角亞門、有鄂亞門的任意一種，例如，包括屬于昆蟲綱、蜘蛛綱等的動物。其中，優(yōu)選屬于昆蟲綱或蜘蛛綱(特別是蜘蛛亞綱)的節(jié)肢動物，特別優(yōu)選屬于昆蟲綱的節(jié)肢動物。作為屬于昆蟲綱的節(jié)肢動物，例如可以舉出屬于鱗翅目(蝶目)、直翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、甲蟲目、脈翅目、半翅目等的動物，沒有特別限制，其中，優(yōu)選使用蠶蛾科、夜蛾科等屬于鱗翅目的動物。
在本發(fā)明中的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用反應(yīng)液中含有的上述提取物，如果來源于上述節(jié)肢動物，可以是從生長階段的任意階段的任何組織提取出來的提取物，另外，也可以是從節(jié)肢動物的任意組織來源的培養(yǎng)細(xì)胞提取的提取物。其中，特別優(yōu)選從蠶組織或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取的提取物。
“蠶”與屬于蠶蛾科的鱗翅目昆蟲(蠶蛾昆蟲)為相同的意思，是在其一生中經(jīng)歷“卵(胚)”(從剛剛產(chǎn)卵之后到即將孵化之前為止的期間)、“幼蟲”(從剛剛孵化之后開始到繭形成即將結(jié)束之前(分為1齡期～5齡期))、“蛹”(從繭形成即將結(jié)束之前到即將羽化之前為止的期間)以及“成蟲(蛾)”(從剛剛羽化之后到死亡為止的期間)的各狀態(tài)的動物，還包括其一生中所經(jīng)歷的任意形態(tài)。蠶在從卵孵化后的幼蟲狀態(tài)下，吃桑葉發(fā)育的時期(齡instar)和不吃桑葉而準(zhǔn)備蛻皮的時期(眠)交替重復(fù)。蠶的幼蟲在孵化后到第一次蛻皮稱為1齡期，從第一次蛻皮到第二次蛻皮稱為2齡期，通常蛻皮4次，在5齡期成熟(該成熟狀態(tài)的蠶幼蟲也稱為“熟蠶”)。蠶的幼蟲成為熟蠶時，身體變透明，吐絲，形成繭，蛹化。在蛹之后，羽化成為成蟲。
在無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用反應(yīng)液含有蠶組織來源的提取物時，作為組織，可以為蠶一生中的任何狀態(tài)(卵、幼蟲(1齡期～5齡期)、蛹、成蟲)的任意組織。另外，蠶組織不限于單一狀態(tài)下的單一組織(例如只有5齡期的蠶幼蟲中的后部絲腺)，也可以是單一狀態(tài)下的多種組織(例如5齡期的蠶幼蟲中的后部絲腺和脂肪體)，也可以是多種狀態(tài)下的單一組織(例如3齡期、4齡期、5齡期的各蠶幼蟲中的后部絲腺)。當(dāng)然也可以是多種狀態(tài)下的多種組織。其中，蠶組織不需要是整個蠶組織(例如整個后部絲腺)。
在這里，蠶組織的“絲腺”是指在蠶幼蟲的兩個體側(cè)，從位于頭部的下唇頂端的吐出口到盲管連接的一對管狀外分泌腺，大致可分為前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺。后部絲腺分泌成為絲的中心部的蠶絲蛋白。另外，中部絲腺分泌絲膠蛋白。蠶絲蛋白被蓄積在中部絲腺中，同時絲膠蛋白覆蓋其外周，成為凝膠狀絹物質(zhì)。該絹物質(zhì)通過前部絲腺從吐出口被排出，固化成絲。
另外，蠶組織的“脂肪體”是指在蠶幼蟲中，分布在體內(nèi)所有位置，白色柔軟的扁平帶狀、繩狀或者葉狀的組織。脂肪體類似于人的肝臟，起到營養(yǎng)、儲藏能源的作用，所以在細(xì)胞內(nèi)含有脂肪球、蛋白質(zhì)、糖原以及其它與新陳代謝有關(guān)的各種物質(zhì)。
另外，“胚”是指蠶的卵的狀態(tài)的組織。
另外，在含有蠶組織來源的提取物時，優(yōu)選為從蠶幼蟲的絲腺、脂肪體和蠶的胚中選擇的至少一種組織來源的提取物。當(dāng)從蠶幼蟲的絲腺(特別是后部絲腺)進行制備時，存在可以在短時間內(nèi)合成大量的蛋白質(zhì)的特別出色的優(yōu)點。另外，當(dāng)從蠶幼蟲的脂肪體制備提取液時，因為脂肪體是柔軟的組織，所以優(yōu)點是可以在短時間內(nèi)完成磨碎的操作，可以更容易地制備提取液。進而，當(dāng)從蠶的胚進行制備時，胚是一個個體，所以優(yōu)點是與其它組織不同，不需要摘取操作，可以更容易地制備提取液。
將蠶作為提取對象時，蠶只要是1齡期～5齡期的幼蟲即可，優(yōu)選5齡期的幼蟲。這是因為，蠶幼蟲隨著繭的形成期的臨近而組織變成熟，特別是在5齡期的蠶幼蟲中，其組織在1齡期～5齡期中是最成熟的，所以為了得到等量的提取物而需要的數(shù)目可以少。其中，如果含有來自5齡期的蠶幼蟲的絲腺或脂肪體(優(yōu)選5齡期的蠶幼蟲的后部絲腺，更優(yōu)選5齡期的3天～7天的蠶幼蟲的后部絲腺)的提取物，與其它齡期的組織相比，可以得到能夠在短時間內(nèi)合成大量蛋白質(zhì)的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用反應(yīng)液，所以特別優(yōu)選。
另外，如上所述，在無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用反應(yīng)液中含有的節(jié)肢動物來源的提取物，也可以是從來源于以往公知的節(jié)肢動物的培養(yǎng)細(xì)胞中得到的提取物。作為這種培養(yǎng)細(xì)胞，已經(jīng)建立了很多培養(yǎng)細(xì)胞株，另外，與很多哺乳動物系的培養(yǎng)細(xì)胞不同，不需要在二氧化碳環(huán)境下進行培養(yǎng)，即使在無血清培養(yǎng)基中也可以培養(yǎng)，所以優(yōu)選使用鱗翅目、半翅目等昆蟲來源的培養(yǎng)細(xì)胞(昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞)。昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞還可以是任何組織來源的細(xì)胞，例如可以沒有特別限制地使用血細(xì)胞、生殖腺來源細(xì)胞、脂肪體來源細(xì)胞、胚來源細(xì)胞、孵化幼蟲來源細(xì)胞等，其中，優(yōu)選使用蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力高的生殖腺來源的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞。特別是可以例示在細(xì)胞系中蛋白質(zhì)合成能力高且在無血清培養(yǎng)基中也可以培養(yǎng)的粉絲夜蛾(Trichoplusia ni)的卵細(xì)胞來源的細(xì)胞High Five(Invitrogen公司制)或草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢細(xì)胞來源的細(xì)胞Sf21(Invitrogen公司制)作為優(yōu)選的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞。
含有上述節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用反應(yīng)液，可以通過如下所述的過程來制備使用以往公知的適當(dāng)組成的提取用液，制備從節(jié)肢動物的組織或培養(yǎng)細(xì)胞進行提取操作而得到的提取液(無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液；提取液＝提取用液+提取物)，適當(dāng)添加如后所述的翻譯反應(yīng)所需要的成分，根據(jù)不同情況而適當(dāng)添加翻譯反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需要的成分。
作為用于從節(jié)肢動物進行提取操作的提取用液，沒有特別限制，但優(yōu)選至少含有蛋白酶抑制劑。如果使用含有蛋白酶抑制劑的提取用液，節(jié)肢動物來源的提取物中含有的蛋白酶的活性被抑制，可以防止由該蛋白酶導(dǎo)致的提取物中的活性蛋白出現(xiàn)不希望的分解，這樣可以有效地引導(dǎo)出節(jié)肢動物來源的提取物具有的蛋白質(zhì)合成能力。作為上述蛋白酶抑制劑，只要是可以抑制蛋白酶的活性的物質(zhì)，就沒有特別限制，例如可以使用甲苯磺酰氟(phenylmethane sulphonyl fluorid，下面有時稱為“PMSF”)、抑肽酶(aprotinin)、貝他定(bestatin)、亮肽素(leupeptin)、抑胃肽(pepstatin)A、E-64(L-轉(zhuǎn)環(huán)氧琥珀酰亮氨酰酰胺-4-胍基丁烷L-trans-epoxysuccinylleucylamide-4-guanidinobutane)、乙二胺四乙酸、磷酸阿米酮等，節(jié)肢動物來源的提取物中大多含有絲氨酸蛋白酶，所以上述中優(yōu)選使用作為對絲氨酸蛋白酶的特異性高的抑制劑而發(fā)揮作用的PMSF。另外，不僅可以使用一種蛋白酶抑制劑，也可以使用多種的混合物(蛋白酶抑制劑混合物)。
對該提取用液中的蛋白酶抑制劑的含量沒有特別限制，但從能夠很好地發(fā)揮在無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成中所必須的酶類的分解抑制能力的觀點出發(fā)，優(yōu)選含有1μM～50mM，更優(yōu)選含有0.01mM～5mM。這是因為，當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┎坏?μM時，有不能充分抑制蛋白酶的分解活性的趨勢，另外，當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┏^50mM時，則有抑制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的趨勢。
另外，用于本發(fā)明中的提取用液除了上述蛋白酶抑制劑以外，優(yōu)選至少含有鉀鹽、鎂鹽、DTT和緩沖劑。
作為上述鉀鹽，例如可以以醋酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氯化鉀、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二鉀、硫酸鉀、磷酸二氫鉀、碘化鉀、苯二甲酸鉀等通常的形態(tài)使用，其中，優(yōu)選使用醋酸鉀。鉀鹽起到蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的輔助因子的作用。
對該提取用液中的鉀鹽的含量沒有特別限制，但從保存穩(wěn)定性的觀點出發(fā)，例如在為醋酸鉀等1價鉀鹽的情況下，優(yōu)選含有10mM～500mM，更優(yōu)選為含有50mM～300mM。這是因為，鉀鹽如果不到10mM或超過500mM，則蛋白質(zhì)合成所必需的成分有變得不穩(wěn)定的趨勢。
作為上述鎂鹽，例如可以以醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂、檸檬酸鎂、磷酸氫鎂、碘化鎂、乳酸鎂、硝酸鎂、草酸鎂等通常的形態(tài)使用，其中，優(yōu)選使用醋酸鎂。鎂鹽也作為蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的輔助因子發(fā)揮作用。
對該提取用液中的鎂鹽的含量沒有特別限制，從保存穩(wěn)定性的觀點出發(fā)，例如在為醋酸鎂等2價鹽的情況下，優(yōu)選含有0.1mM～10mM，更優(yōu)選含有0.5mM～5mM。這是因為，如果鎂鹽不到0.1mM或超過10mM，蛋白質(zhì)合成所必需的成分有變得不穩(wěn)定的趨勢。
上述DTT是為了抗氧化而配合的，在該提取用液中優(yōu)選含有0.1mM～10mM，更優(yōu)選含有0.5mM～5mM。這是因為，如果DTT不到0.1mM或超過10mM，蛋白質(zhì)合成所必需的成分有變得不穩(wěn)定的趨勢。
上述緩沖劑是為了向提取用液賦予緩沖能力而防止如酸性或堿性物質(zhì)的添加等引起提取液pH急劇變化導(dǎo)致的提取物的變性而配合的。作為這樣的緩沖劑，沒有特別限制，例如可以使用HEPES-KOH、Tris-HCl、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。
緩沖劑優(yōu)選使用將得到的提取液的pH保持在4～10的緩沖劑，更優(yōu)選使用將pH保持在6.5～8.5的緩沖劑。這是因為，如果提取液的pH不到4或pH超過10，則本發(fā)明的反應(yīng)中必須的成分可能發(fā)生變性。從這樣的觀點出發(fā)，在上述中特別優(yōu)選使用HEPES-KOH(pH6.5～8.5)對該提取用液中的緩沖劑的含量沒有特別限制，但從保持適當(dāng)?shù)木彌_能力的觀點出發(fā)，優(yōu)選含有5mM～200mM，更優(yōu)選含有10mM～100mM。這是因為，如果緩沖劑不到5mM，酸性或堿性物質(zhì)的添加會引起pH的急劇變動，有提取物發(fā)生變性的趨勢，另外，如果緩沖劑超過200mM，則鹽濃度變得過高，蛋白質(zhì)合成所必需的成分有變得不穩(wěn)定的趨勢。
另外，在作為提取對象的節(jié)肢動物為昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞時，如果使用除了含有上述組成還含有氯化鈣和甘油而成的提取用液，可以得到蛋白質(zhì)合成能力被進一步提高的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取液，所以優(yōu)選。
在這種情況下，對氯化鈣的含量沒有特別限制，從能有效地發(fā)揮提高上述蛋白質(zhì)合成能力的效果的觀點出發(fā)，優(yōu)選0.1mM～10mM，更優(yōu)選0.5mM～5mM。另外，對甘油的添加量沒有特別限制，但從能有效地發(fā)揮提高上述蛋白質(zhì)合成能力的效果的觀點出發(fā)，優(yōu)選將其添加至5(v/v)％～80(v/v)％，更優(yōu)選添加至10(v/v)％～50(v/v)％。
對從節(jié)肢動物的組織或培養(yǎng)細(xì)胞提取出提取液的方法沒有特別限制，可以通過以往公知的適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行。
例如，作為節(jié)肢動物來源的提取物，當(dāng)使用蠶組織來源的提取物或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞來源的提取物時，優(yōu)選使用如上所述的組成的提取用液，按照本發(fā)明人等提出的提取方法制備提取液。
以下，分別對各情況進行詳述。
含有蠶組織來源的提取物的提取液的制備方法首先，按照常規(guī)方法，例如使用剪刀、鑷子、手術(shù)刀等器械，從蠶中摘取需要的組織。作為通過摘取得到的在后述的提取中使用的組織量，沒有特別限制，通常在1g～100g的范圍內(nèi)。
接著，將摘取出的組織用如液氮凍結(jié)之后，在-80℃下凍結(jié)的研缽中磨碎，向其中添加上述的提取用液，進行提取操作。
或者，添加上述提取用液之后，也使提取用液凍結(jié)，然后用藥匙邊攪拌邊溶解，直至變成果子露(sherbet)狀(具體地說，直至變成濕的黃色涼爽狀態(tài)的冰)。然后，重新用液氮完全凍結(jié)之后，然后用藥匙邊攪拌邊溶解，直至變成果子露狀(具體地說，直至變成濕的黃色涼爽狀態(tài)的冰)。通過這樣的方法，可以有效地提取與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的成分，而且可以使其穩(wěn)定化。
這樣，首先得到含有來自蠶組織的提取物的液狀物。
接著，離心分離在上述提取處理中得到的液狀物。該離心分離是在該領(lǐng)域中通常進行的條件(10,000×g～50,000×g、0℃～10℃、10分鐘～60分鐘)下進行的?？梢灾苯邮褂眠M行1次該離心分離之后的上清(上清A1)作為提取液，另外，可以在與上述相同的條件下對該上清A1進行再次離心分離，將得到的上清(上清A2)作為提取液。
另外，進一步使用上述提取用液從上述第一次離心分離之后的沉淀進行提取之后，在與上述相同的條件下進行離心分離得到上清(上清A3)，可以混合上述上清A1和上清A3，作為提取液進行制備。通過這樣混合上清A1和上清A3制備提取液，與將上清A1、上清A3單獨作為提取液的情況相比，蛋白質(zhì)合成效率提高。另外，也可以進一步混合上清A2和上清A3，制備提取液。這樣，上述效果進一步被增強。當(dāng)然也可以混合上述上清A1～上清A3，制備提取液。
在這種情況下，對制備的混合物(提取液)中的上清A1和/或上清A2(當(dāng)混合雙方時為其總量)與上清A3的混合比例沒有特別限制，但從蛋白質(zhì)的合成效率的觀點出發(fā)，體積比優(yōu)選為10∶90～90∶10，更優(yōu)選為20∶80～80∶20。
此外，也可以在如上所述分別進行制備之后，實施凝膠過濾，從凝膠過濾后的濾液中分取出在280nm下的吸光度最高的組分(fraction)附近，作為提取液進行制備。但是，從蛋白質(zhì)的合成效率的觀點出發(fā)，優(yōu)選不經(jīng)過該凝膠過濾和組分的分取(fractionation)而作為提取液進行制備。
此外，在實施了上述凝膠過濾并從凝膠過濾之后的濾液中分取出在280nm下的吸光度最高的組分附近的情況下，具體地說，可以按照下述的步驟進行。
例如，使用脫鹽柱PD-10(Amersham Biosciences公司制)，按照常規(guī)方法，在如下所述的條件下進行即，在用凝膠過濾緩沖液平衡化柱之后，供給樣品，用上述提取用液洗脫。上述凝膠過濾用緩沖液優(yōu)選向上述提取用液中進一步添加甘油而成的液體。通常添加甘油至5(v/v)％～40(v/v)％(優(yōu)選20(v/v)％)即可。像通常利用凝膠過濾進行的操作那樣，可以將凝膠過濾得到的濾液的0.1mL～1mL作為1個組分，從有效地分取出具有高蛋白質(zhì)合成能力的組分的觀點出發(fā)，優(yōu)選將0.4mL～0.6mL作為1個組分接著，從凝膠過濾后的濾液分取出在280nm下的吸光度為10以上的組分。該處理使用例如Ultrospec3300pro(Amersham Bioscience公司制)等儀器，對各組分在上述280nm下的吸光度進行測定，分取出其吸光度最高的組分附近，將其作為提取液。
含有昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞來源的提取物的提取液的制備方法在從昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞制備提取液的情況下，優(yōu)選通過本發(fā)明人等提出的、至少含有使懸浮在提取用液中的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞急劇凍結(jié)的工序的方法進行制備。在這里，“急劇地凍結(jié)”是指從交付凍結(jié)處理后的10秒以下、優(yōu)選2秒以下，使昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞凍結(jié)。另外，作為使昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞急劇凍結(jié)的溫度，通常為-80℃以下，優(yōu)選為-150℃以下。上述昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的急劇凍結(jié)，例如可以通過使用液氮或液氦等惰性氣體等來實現(xiàn)，優(yōu)選使用容易得到且廉價的液氮進行凍結(jié)。
通過利用該方法從昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進行提取，可以在溫和的狀態(tài)下破碎細(xì)胞，可以在不破壞無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成所必需的成分的情況下取出到細(xì)胞外，可以容易地制備蛋白質(zhì)的合成量比以往更高的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液。進而，還可以防止混入來自使用器具等的RNA酶(RNase)等，另外，在是使用了界面活性劑等試劑的細(xì)胞破碎法的情況下，不會帶入有可能抑制翻譯反應(yīng)之類的物質(zhì)。
在上述本發(fā)明人等提出的提取液的制備方法中，如果至少包括上述急劇凍結(jié)的工序，則對其它工序沒有特別限制。例如，可以通過在研缽中使用研杵磨碎的方法、使用杜恩斯勻漿器(Dounce homogenizer)的方法、使用玻璃珠(glass beads)的方法等在從大腸桿菌或小麥胚芽等得到無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液時一直應(yīng)用的各種手段，破碎昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，進行提取。其中，優(yōu)選通過急劇地凍結(jié)上述昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞之后，解凍，離心分離，來破碎昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞。
在對上述已急劇凍結(jié)的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進行解凍之后，進行離心分離時，解凍可以通過例如在-10℃～20℃的水浴或冰水浴中的解凍、在室溫(25℃)下的放置等實現(xiàn)，但為了防止蛋白質(zhì)合成所必需的成分失活，確實可靠地防止蛋白質(zhì)合成能力的降低，優(yōu)選在0℃～20℃(特別是4℃～10℃)的水浴或冰水浴中進行解凍。已解凍的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的離心分離可以在該區(qū)域通常進行的條件下(10,000×g～50,00×g、0℃～10℃、10分鐘～60分鐘)下進行。在該離心分離后的上清中含有需要的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的提取物。
細(xì)胞破碎之后，可以直接將上述離心分離之后的上清(上清B1)作為提取液，也可以將上清B1進一步離心分離(10,000×g～100,000×g、0℃～10℃、10分鐘～120分鐘)得到的上清(上清B2)作為提取液。進而，可以凝膠過濾上述上清B1或上清B2，從凝膠過濾后的濾液分取出280nm下的吸光度為10以上的組分(吸收大的組分)，將其作為提取液。在這種情況下，具體按照以下步驟進行。
首先，對上清B1或上清B2進行凝膠過濾，凝膠過濾可以適當(dāng)使用例如脫鹽柱PD-10(Amersham Bioscience公司制)，按照常規(guī)方法，在如下所述的條件下進行即可即，在用凝膠過濾用緩沖液平衡化柱之后，供給樣品，用上述凝膠過濾用緩沖液洗脫。作為上述凝膠過濾用緩沖液，可以沒有特別限制地使用以往公知的適當(dāng)組成的緩沖液，例如可以使用含有10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6.5～8.5)、50mM～300mM的醋酸鉀、0.5mM～5mM的醋酸鎂、0.5mM～5mM的DTT、0.01mM～5mM的PMSF的凝膠過濾用緩沖液。凝膠過濾得到的濾液，可以像用通常的凝膠過濾進行操作那樣，將0.1mL～1mL作為1個組分，從有效地分取具有高蛋白質(zhì)合成能力的組分的觀點出發(fā)，優(yōu)選將0.4mL～0.6mL作為1個組分。
接著，例如使用Ultrospec3300pro(Amersham Bioscience公司制)等儀器，從凝膠過濾后的濾液分取出280nm下的吸光度為30以上的組分(吸收大的組分)，將其作為提取液。
另外，也可以進一步離心分離在上述凝膠過濾中得到的吸收大的組分，將得到的上清(上清B3)作為提取液。從除去抑制翻譯反應(yīng)的不溶性的成分的理由出發(fā)，該凝膠過濾后的離心分離優(yōu)選在30,000×g～100,000×g、0℃～10℃、10分鐘～60分鐘的條件下進行。
此外，就供于本發(fā)明的制備方法的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞而言，為了避免帶入到在培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基的翻譯反應(yīng)液中，在進行上述急劇凍結(jié)之前，不含有蛋白酶抑制劑和甘油，除此之外，優(yōu)選預(yù)先用組成與上述昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞用的適當(dāng)提取用液相同的清洗液進行清洗。用清洗液的清洗是通過向昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中添加清洗液并對其進行離心分離(例如，700×g、10分鐘、4℃的條件)而進行的。為了完全地沖走培養(yǎng)基，清洗中使用的清洗液的量相對濕重1g的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選為5mL～100mL，更優(yōu)選10mL～50mL。清洗次數(shù)優(yōu)選進行1次～5次，更優(yōu)選進行2次～4次。
對本發(fā)明的提取液中的節(jié)肢動物來源的提取物的含量沒有特別限制，優(yōu)選以蛋白質(zhì)濃度計為1mg/mL～200mg/mL，其中，更優(yōu)選10mg/mL～100mg/mL。這是因為，該提取物的含量如果以蛋白質(zhì)濃度計不到1mg/mL，無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成所必需的成分的濃度變低，不能進行充分的合成反應(yīng)，另外，還因為該提取物的含量如果以蛋白質(zhì)濃度計超過200mg/mL，提取液自身具有高粘性，有可能難以操作。
此外，含有上述范圍的量的節(jié)肢動物來源的提取物的提取液，可以利用提取液的蛋白質(zhì)濃度測定來制備。如同在該領(lǐng)域中通常進行的那樣，該蛋白質(zhì)濃度測定例如按照如下步驟進行即，使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Protein assay Kit)(PIERCE公司制)，相對2mL反應(yīng)試劑，加入0.1mL樣品，在37℃下反應(yīng)30分鐘，測定562nm下的吸光度。使用分光光度計(Ultrospec3300pro，Amersham Bioscience公司制)，測定562nm下的吸光度。作為對照，通常使用牛血清白蛋白(BSA)。
在無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成方法中，例如使用如上所述制備而成的提取液，制備翻譯系用反應(yīng)液或轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液。在是翻譯系用反應(yīng)液、轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液的任何情況下，均優(yōu)選制備成含有上述提取液10(v/v)％～80(v/v)％、特別是30(v/v)％～60(v/v)％。即，在整個反應(yīng)液中，節(jié)肢動物來源的提取物的含量優(yōu)選被制備成以蛋白質(zhì)濃度計為0.1mg/mL～160mg/mL，更優(yōu)選制備成3mg/mL～60mg/mL。該提取物的含量如果以蛋白質(zhì)濃度計不到0.1mg/mL或超過160mg/mL，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
以下將使用含有節(jié)肢動物來源的提取物的提取液的情況作為例子，對(1)翻譯系用反應(yīng)液、(2)轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液，分別進行說明。
(1)翻譯系用反應(yīng)液作為除了上述節(jié)肢動物來源提取液以外的成分，翻譯系用反應(yīng)液優(yōu)選至少含有翻譯模板、鉀鹽、鎂鹽、DTT、三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分、RNA酶抑制劑、tRNA、緩沖劑，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的即蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，含有微粒體膜，更具體地說是含有哺乳動物來源的微粒體膜。通過使用該翻譯系用反應(yīng)液進行翻譯系合成反應(yīng)，可以在短時間內(nèi)合成大量的蛋白質(zhì)。
就在翻譯系用反應(yīng)液中含有的翻譯模板(mRNA)而言，對其堿基數(shù)沒有特別限制，只要可以合成目的蛋白質(zhì)，所有mRNA不是相同的堿基數(shù)也可以。另外，只要序列與可以合成目的蛋白質(zhì)的程度相同，各mRNA可以是缺失、置換、插入或附加幾個堿基的mRNA。mRNA可以用以往公知的適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)錄模板DNA(其制備如后所述)來制備，優(yōu)選通過本身公知的體外(in vitro)轉(zhuǎn)錄來轉(zhuǎn)錄并制備模板DNA。體外轉(zhuǎn)錄例如可以利用RiboMax大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)-T7(RiboMax Large Scale RNAproduction System-T7)(Promega公司制)等進行。mRNA在轉(zhuǎn)錄后利用本身公知的方法純化并分離，如后所述，可以作為無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用的翻譯模板用于翻譯系用反應(yīng)液中。
在翻譯系用反應(yīng)液中，從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，優(yōu)選含有翻譯模板1μg/mL～2000μg/mL，更優(yōu)選含有10μg/mL～1000μg/mL。如果mRNA不到1μg/mL或超過2000μg/mL，蛋白質(zhì)合成的速度有降低的趨勢。
在翻譯系用反應(yīng)液中，從蛋白質(zhì)的翻譯后的修飾效率的觀點出發(fā)，哺乳動物來源的微粒體膜在260nm的吸光度(以后稱為A260)為1～50(A260＝1～50)，優(yōu)選為2～15(A260＝2～15)。這是因為，當(dāng)微粒體膜在A260不到1時，翻譯后修飾有進行不充分的趨勢，如果超過50，有顯著抑制蛋白質(zhì)合成本身的趨勢。進而，從蛋白質(zhì)的翻譯后修飾效率的觀點出發(fā)，在翻譯反應(yīng)液中，最好mRNA濃度(μg/mL)與哺乳動物來源的微粒體膜濃度(A260)的比值為1∶0.1～5，優(yōu)選0.3～2.3。
在求得mRNA濃度(μg/mL)與哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值時的哺乳動物來源的微粒體膜的純度，通常為A260/A280＝1.3～2.0，優(yōu)選為1.4～1.8。該比值為1∶0.1～5(優(yōu)選為0.3～2.3)是指反應(yīng)液1mL中存在1μg mRNA時，微粒體膜的濃度在A260下為0.1～5(優(yōu)選為0.3～2.3)。
該微粒體膜優(yōu)選在翻譯開始時存在于反應(yīng)液中，也可以根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)節(jié)其添加時期。
作為哺乳動物來源的微粒體膜，除了市售的后述的狗胰腺來源微粒體膜以外，也可以從COS細(xì)胞(非洲綠猴來源)、CHO(中國倉鼠來源)、HeLa細(xì)胞(人來源)、L5178Y細(xì)胞(小鼠來源)、Shay細(xì)胞(人來源)等來制備。
具體地說，哺乳類來源的微粒體膜的制備可以基于非專利文獻1所述的方法等公知的手段進行。例如狗胰腺來源的微粒體膜可以從Promega公司獲得。
作為翻譯系用反應(yīng)液中的鉀鹽，可以使用上述各種鉀鹽、優(yōu)選醋酸鉀作為提取用液的成分。從與上述提取用液中的鉀鹽的情況相同的觀點出發(fā)，在該翻譯系用反應(yīng)液中，優(yōu)選含有鉀鹽10mM～500mM，更優(yōu)選含有50mM～150mM。
作為翻譯系用反應(yīng)液中的鎂鹽，可以優(yōu)選使用上述各種鎂鹽、優(yōu)選醋酸鎂作為提取用液的成分。從與上述提取用液中的鎂鹽的情況相同的觀點出發(fā)，在該翻譯系用反應(yīng)液中，優(yōu)選含有鎂鹽0.1mM～10mM，更優(yōu)選含有0.5mM～3mM。
從與上述提取用液中的DTT的情況相同的觀點出發(fā)，翻譯系用反應(yīng)液中的DTT優(yōu)選含有0.1mM～10mM，更優(yōu)選含有0.2mM～5mM。
從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，翻譯系用反應(yīng)液中的三磷酸腺苷(以下有時稱為“ATP”)優(yōu)選含有0.01mM～10mM，更優(yōu)選含有0.1mM～5mM。這是因為，ATP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質(zhì)合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，翻譯系用反應(yīng)液中的三磷酸鳥苷(以下有時稱為“GTP”)優(yōu)選含有0.01mM～10mM，更優(yōu)選含有0.1mM～5mM。這是因為，GTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質(zhì)合成的速度有降低的趨勢。
翻譯系反應(yīng)液中的磷酸肌酸是用于持續(xù)合成蛋白質(zhì)的成分，是為了再生ATP和GTP而配合的。從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，優(yōu)選在該反應(yīng)液中含有磷酸肌酸1mM～200mM，更優(yōu)選含有10mM～100mM。這是因為，磷酸肌酸如果不到1mM，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結(jié)果蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為磷酸肌酸如果超過200mM，起到抑制物質(zhì)的作用，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
翻譯系用反應(yīng)液中的肌酸激酶是用于持續(xù)合成蛋白質(zhì)的成分，其配合目的是與磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，優(yōu)選在該反應(yīng)液中含有肌酸激酶1μg/mL～1000μg/mL，更優(yōu)選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，肌酸激酶如果不到1μg/mL，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結(jié)果蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為肌酸激酶如果超過1000μg/mL，則起到抑制物質(zhì)的作用，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
翻譯系用反應(yīng)液中的氨基酸成分至少含有20種氨基酸，即纈氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸20種氨基酸。在該氨基酸中也含有放射性同位素標(biāo)記了的氨基酸。進而，根據(jù)需要，也可以含有修飾氨基酸。該氨基酸成分通常是以大致等量含有各種氨基酸而成的。
在本發(fā)明中，從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，在該反應(yīng)液中，優(yōu)選含有上述氨基酸成分1μM～1000μM，更優(yōu)選含有10μM～200μM。這是因為，氨基酸成分如果不到1μM或超過1000μM，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
翻譯系用反應(yīng)液的中RNA酶抑制劑，是為了防止提取液中混在的節(jié)肢動物來源的RNA酶在無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成時消化mRNA或tRNA而妨礙蛋白質(zhì)的合成而配合的，在該反應(yīng)液中優(yōu)選含有0.1U/μL～100U/μL，更優(yōu)選含有1U/μL～10U/μL。這是因為，RNA酶抑制劑如果不到0.1U/μL，有不能充分抑制RNA酶的分解活性的趨勢，另外，還因為RNA酶抑制劑如果超過100U/μL，有抑制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的趨勢。
翻譯系用反應(yīng)液中的tRNA是以大致等量含有與上述20種氨基酸的種類對應(yīng)的tRNA而成的。在本發(fā)明中，從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，在該反應(yīng)液中優(yōu)選含有1μg/mL～1000μg/mL，更優(yōu)選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，tRNA如果不到1μg/mL或超過1000μg/mL，蛋白質(zhì)合成的速度有降低的趨勢。
作為翻譯系用反應(yīng)液中含有的緩沖劑，可以適當(dāng)使用與上述用于提取用液的緩沖劑相同的緩沖劑，由于相同的原因，優(yōu)選使用HEPES-KOH(pH6～8)。另外，從與上述提取用液中的緩沖劑的情況相同的觀點出發(fā)，優(yōu)選含有緩沖劑5mM～200mM，更優(yōu)選含有10mM～50mM。
另外，翻譯系用反應(yīng)液更優(yōu)選進一步添加甘油。這是因為，如果添加甘油，在翻譯系合成反應(yīng)中，可以穩(wěn)定化蛋白質(zhì)合成所必需的成分。添加甘油時，通常添加到5(v/v)％～20(v/v)％。
進而，翻譯系用反應(yīng)液優(yōu)選含有乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四醋酸(以下有時稱為“EGTA”)。這是因為，如果含有EGTA，通過EGTA與提取液中的金屬離子形成螯合物而使核糖核酸酶、蛋白酶等失活，這樣可以抑制無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成所必需的成分發(fā)生分解。從能夠很好地發(fā)揮上述分解抑制能力的觀點出發(fā)，該EGTA在上述反應(yīng)液中優(yōu)選含有0.01mM～10mM，更優(yōu)選含有0.1mM～5mM。這是因為，EGTA如果不到0.01mM，則有不能充分抑制必須成分的分解活性的趨勢，還因為如果超過10mM，則有抑制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的趨勢。
即，作為翻譯系用反應(yīng)液，優(yōu)選在含有含節(jié)肢動物來源提取物的提取液30(v/v)％～60(v/v)％的同時，含有50mM～150mM的醋酸鉀、0.5mM～3mM的醋酸鎂、0.2mM～5mM的DTT、5(v/v)％～20(v/v)％的甘油、0.1mM～5mM的ATP、0.1mM～5mM的GTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～200μM的氨基酸成分、1U/μL～10U/μL的RNA酶抑制劑、10μg/mL～500μg/mL的tRNA、10μg/mL～100μg/mL的翻譯模板、翻譯系反應(yīng)液中在A260下為1～50的哺乳動物微粒體膜(與翻譯模板的濃度比為mRNA(μg/mL)∶微粒體膜濃度(A260)＝1∶0.1～5)、10mM～50mM的HEPES-KOH(pH6～8)而實現(xiàn)的。另外，除了上述，更優(yōu)選還含有0.1mM～5mM的EGTA而實現(xiàn)。
使用了上述翻譯系用反應(yīng)液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成反應(yīng)(翻譯系合成反應(yīng))，在以往公知的如低溫恒溫槽中進行。反應(yīng)溫度通常在10℃～40℃、優(yōu)選在20℃～30℃的范圍內(nèi)。這是因為，反應(yīng)溫度如果不到10℃，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為反應(yīng)溫度如果超過40℃，必需的成分有變性的趨勢。反應(yīng)的時間通常為1小時～72小時，優(yōu)選3小時～24小時。
(2)轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液作為除了上述提取液之外的成分，轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液優(yōu)選至少含有轉(zhuǎn)錄模板、RNA聚合酶、ATP、GTP、胞苷5’-三磷酸、尿苷5’-三磷酸、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分和tRNA，為了實現(xiàn)作為本發(fā)明的目的的對蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，含有微粒體膜，更具體地說含有哺乳動物來源的微粒體膜。通過使用該轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液進行轉(zhuǎn)錄/翻譯系合成反應(yīng)，可以在短時間內(nèi)合成大量的蛋白質(zhì)。
此外，轉(zhuǎn)錄模板(模板DNA)只要至少含有啟動子序列和編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，就可以是任意堿基序列、堿基數(shù)的模板。對結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)(包括肽)沒有特別限制，也可以具有對在活細(xì)胞中成為細(xì)胞毒的蛋白質(zhì)進行編碼的堿基序列，另外，也可以具有編碼糖蛋白質(zhì)的堿基序列。在模板DNA中，通常啟動子序列被配置在結(jié)構(gòu)基因的5’上游側(cè)。作為啟動子序列，例如可以舉出以往公知的T7啟動子序列、SP6啟動子序列、T3啟動子序列等。
另外，本發(fā)明的模板DNA優(yōu)選在結(jié)構(gòu)基因的3’下游側(cè)具有終止子(terminator)序列。作為上述終止子序列，例如可以舉出以往公知的T7終止子序列、SP6終止子序列、T3終止子序列等。另外，從已合成的mRNA的穩(wěn)定性等觀點出發(fā)，模板DNA也可以在結(jié)構(gòu)基因的3’下游側(cè)具有多聚A序列。
該模板DNA也可以通過至少含有(1)連接已預(yù)先被分隔成多個區(qū)域的模板DNA的工序、(2)利用PCR對連接后的DNA進行擴增的工序的方法來合成。在這里，就區(qū)域的數(shù)量而言，可以通過一系列的連接反應(yīng)和隨后的PCR被接合并擴增的區(qū)域為2個，為了進一步接合和擴增其它區(qū)域，必須進一步進行一系列的連接和PCR，所以優(yōu)選被分隔為盡可能少的區(qū)域。該區(qū)域數(shù)優(yōu)選為2個～5個，更優(yōu)選為2個～3個，特別優(yōu)選為2個。模板DNA被預(yù)先分隔，是為了在該模板DNA中不擴增區(qū)域內(nèi)沒有的堿基序列部分、或在各區(qū)域中彼此重復(fù)的堿基序列部分，換言之，接合整個區(qū)域而成為模板DNA。已分隔的各區(qū)域可以是質(zhì)粒DNA已被限制性酶切斷并制備而成的DNA，也可以是利用PCR擴增成的DNA，也可以是利用DNA合成機合成的DNA。
首先，在已預(yù)先分隔模板DNA的區(qū)域中，使彼此鄰接的區(qū)域連接。在進行連接反應(yīng)時，最好將DNA的末端制備成雙方的DNA可以順向連結(jié)。具體地說，將要接合的兩個DNA的末端制備成平滑末端?；蛘呤怯孟嗤南拗菩悦盖袛嗟钠瑪唷Ａ硗?，也可以通過T4多核苷酸激酶磷酸化一方DNA的末端，制備成可以有效連接的狀態(tài)。連接時使用的試劑或反應(yīng)條件可以按照在該領(lǐng)域通常實施的條件進行。例如，使用NEB公司制快速連接試劑盒(Quick Ligation Kit)，按照流程(protocol)，混合DNA、反應(yīng)緩沖液、快速T4連接酶，在25℃下孵育5分鐘即可。
接著，利用PCR擴增上述連接后的DNA。PCR可以沒有特別限制地使用市售的PCR用熱循環(huán)機(thermal cycler)等以往公知的裝置來進行。對PCR的條件沒有特別限制，在該領(lǐng)域中通常實施的條件下進行即可。例如使用東洋紡織公司制KOD plus，按照其流程即可。此時使用的引物使用以需要擴增的DNA的端部的序列為基礎(chǔ)制作的正義引物和反義引物。這樣，通過連接產(chǎn)生多種接合的DNA，但PCR只擴增需要的DNA。
進而，當(dāng)模板DNA被分為3個以上的區(qū)域時，使用在上述PCR中擴增了的DNA和進一步接合的DNA，進行連接、PCR，制備模板DNA。
另外，本發(fā)明中的模板DNA優(yōu)選進一步具有有促翻譯反應(yīng)活性的序列(以下有時稱為“促翻譯反應(yīng)序列”)。在此，“促翻譯反應(yīng)序列”是指通過使用具有該促翻譯反應(yīng)序列的模板DNA來進行無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成反應(yīng)，與使用沒有該促翻譯反應(yīng)序列的模板DNA進行無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的情況相比，翻譯效率被提高到1.2倍以上(優(yōu)選2倍以上)的序列。
作為該促翻譯反應(yīng)活性序列，可以適當(dāng)使用如上所述的具有促翻譯反應(yīng)活性的公知的序列，沒有特別限制。作為促翻譯反應(yīng)活性序列的具體例子，是蠶或桿狀病毒(baculovirus)中作為5’非翻譯區(qū)(5’UTR)公知的堿基序列。具體而言，可以舉出蠶的蠶絲蛋白L鏈基因的5’UTR的堿基序列、蠶的絲膠蛋白基因的5’UTR的堿基序列、AcNPV(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、BmCPV(家蠶胞質(zhì)型多角體病毒Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、EsCPV(Euxoa scandes胞質(zhì)型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、HcNPV(Hyphantria cunea核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、CrNPV(Choristoneura rosaceana核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、EoNPV(Ecotropis oblique核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、MnNPV(Malacosma neustria核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、SfNPV(草地夜蛾核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列、WsNPV(Wiseana signata核型多角體病毒)的多角體蛋白基因的5’UTR的堿基序列等。這些促翻譯反應(yīng)序列可以利用以往公知的任何方法得到。例如，可以使用公知的DNA合成機進行合成。
上述促翻譯反應(yīng)序列優(yōu)選在模板DNA中被一個或幾個結(jié)合(introduce into)到上述結(jié)構(gòu)基因的5’上游側(cè)。促翻譯反應(yīng)序列在結(jié)構(gòu)基因的5’上游側(cè)可以按照順向(5’→3’)結(jié)合，也可以按逆向(3’→5’)結(jié)合。另外，也可以結(jié)合兩個以上的促翻譯反應(yīng)序列，在這種情況下，結(jié)合的促翻譯反應(yīng)序列可以相同，也可以彼此不同。另外，當(dāng)結(jié)合兩個以上促翻譯反應(yīng)序列時，也可以不是全部促翻譯反應(yīng)序列向相同的方向結(jié)合。促翻譯反應(yīng)序列也可以在結(jié)構(gòu)基因的5’上游側(cè)被結(jié)合成為與結(jié)構(gòu)基因鄰接，也可以以與結(jié)構(gòu)基因之間存在一個堿基以上的堿基序列的狀態(tài)進行結(jié)合。
在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中優(yōu)選含有轉(zhuǎn)錄模板0.1μg/mL～8000μg/mL，更優(yōu)選含有3μg/mL～600μg/mL。這是因為，如果轉(zhuǎn)錄模板不到0.1μg/mL或超過8000μg/mL時，蛋白質(zhì)合成的速度有降低的趨勢。
在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中，從蛋白質(zhì)的翻譯后的修飾效率的觀點出發(fā)，哺乳動物來源的微粒體膜在A260下含有1～50(A260＝1～50)，優(yōu)選含有2～15(A260＝2～15)。這是因為，如果微粒體膜在A260下不到1，有不能充分進行翻譯后修飾的趨勢，如果超過50，會存在顯著抑制蛋白質(zhì)合成本身的趨勢。進而，從蛋白質(zhì)的翻譯后的修飾效率的觀點出發(fā)，在翻譯反應(yīng)液中，最好mRNA濃度(μg/mL)和哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5，優(yōu)選為0.3～2.3。
該微粒體膜可以在轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的開始時存在于反應(yīng)液中，也可以在翻譯開始的時點添加。根據(jù)需要可以適當(dāng)調(diào)節(jié)其添加時期。
作為哺乳類來源微粒體膜，與在上述翻譯系用反應(yīng)液中使用的相同，可以通過相同的制備方法利用。
在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中使用的RNA聚合酶，可以根據(jù)轉(zhuǎn)錄模板具有的啟動子序列適當(dāng)選擇。例如，當(dāng)轉(zhuǎn)錄模板具有T7啟動子序列時，優(yōu)選使用識別該序列的T7 RNA聚合酶。另外，當(dāng)轉(zhuǎn)錄模板具有SP6或T3啟動子序列時，優(yōu)選分別使用SP6 RNA聚合酶或T3 RNA聚合酶。
從mRNA合成的速度和蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中含有RNA聚合酶0.01U/μL～100U/μL，更優(yōu)選含有0.1U/μL～10U/μL。這是因為，當(dāng)RNA聚合酶不到0.01U/μL時，mRNA的合成量變少，結(jié)果蛋白質(zhì)合成的速度有降低的趨勢，另外，還因為當(dāng)RNA聚合酶超過100U/μL時，有抑制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的趨勢。
從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的ATP優(yōu)選含有0.01mM～10mM，更優(yōu)選含有0.1mM～5mM。這是因為，ATP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的GTP優(yōu)選含有0.01mM～10mM，更優(yōu)選含有0.1mM～5mM。這是因為，GTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的胞苷5’-三磷酸(下面有時稱為“CTP”)優(yōu)選含有0.01mM～10mM，更優(yōu)選含有0.1mM～5mM。這是因為，CTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的尿苷5’-三磷酸(下面有時稱為“UTP”)優(yōu)選含有0.01mM～10mM，更優(yōu)選含有0.1mM～5mM。這是因為，UTP如果不到0.01mM或超過10mM，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的磷酸肌酸是用于持續(xù)合成蛋白質(zhì)的成分，配合目的是再生ATP和GTP。從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中含有磷酸肌酸1mM～200mM，更優(yōu)選含有10mM～100mM。這是因為，磷酸肌酸如果不到1mM，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結(jié)果蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為磷酸肌酸如果超過200mM，則成為抑制物質(zhì)，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的肌酸激酶是用于持續(xù)合成蛋白質(zhì)的成分，配合目的是與磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中含有肌酸激酶1μg/mL～1000μg/mL，更優(yōu)選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，肌酸激酶如果不到1μg/mL，則難以再生足夠量的ATP和GTP，結(jié)果蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢，另外，還因為肌酸激酶如果超過1000μg/mL，則成為抑制物質(zhì)，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的氨基酸成分至少含有20種氨基酸，即纈氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸20種氨基酸。該氨基酸中也含有放射性同位素標(biāo)記的氨基酸。進而，根據(jù)需要，也可以含有修飾氨基酸。該氨基酸成分通常分別大致等量含有各種氨基酸而成。
從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中優(yōu)選含有上述氨基酸成分1μM～1000μM，更優(yōu)選含有10μM～500μM。這是因為，氨基酸成分如果不到1μM或超過1000μM，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢。
轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的tRNA是大致等量含有與上述20種氨基酸的種類對應(yīng)的tRNA而成的。從蛋白質(zhì)合成的速度的觀點出發(fā)，在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中tRNA優(yōu)選含有1μg/mL～1000μg/mL，更優(yōu)選含有10μg/mL～500μg/mL。這是因為，tRNA如果不到1μg/mL或超過1000μg/mL，蛋白質(zhì)合成的速度有降低的趨勢。
轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中優(yōu)選進一步含有鉀鹽、鎂鹽、DTT、RNA酶抑制劑、亞精胺和緩沖劑。
作為轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的鉀鹽，可以優(yōu)選使用上述各種鉀鹽、優(yōu)選醋酸鉀作為提取用液的成分。從與上述提取用液中鉀鹽的情況相同的觀點出發(fā)，在該轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中，優(yōu)選含有鉀鹽10mM～500mM，更優(yōu)選含有50mM～150mM。
作為轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的鎂鹽，可以優(yōu)選使用上述各種鎂鹽、優(yōu)選醋酸鎂作為提取用液的成分。從與上述提取用液中鎂鹽的情況相同的觀點出發(fā)，在該轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中，優(yōu)選含有鎂鹽0.1mM～10mM，更優(yōu)選含有0.5mM～3mM。
轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的DTT是為了防止氧化而配合的物質(zhì)，在該反應(yīng)液中優(yōu)選含有0.1mM～100mM，更優(yōu)選含有0.2mM～20mM。這是因為，DTT如果不到0.1mM或超過100mM，蛋白質(zhì)合成所必需的成分有變得不穩(wěn)定的趨勢。
轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中的RNA酶抑制劑是為了防止在提取液中混在的節(jié)肢動物來源的RNA酶在轉(zhuǎn)錄/翻譯系合成反應(yīng)時不希望地消化mRNA或tRNA而妨礙蛋白質(zhì)的合成而添加的，在該反應(yīng)液中優(yōu)選含有0.1U/μL～100U/μL，更優(yōu)選含有1U/μL～10U/μL。這是因為，RNA酶抑制劑如果不到0.1U/μL，有不能充分抑制RNA酶的分解活性的趨勢，另外，還因為RNA酶抑制劑如果超過100U/μL，有抑制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的趨勢。
上述亞精胺是為了促進在轉(zhuǎn)錄中的延伸反應(yīng)而添加的，在轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中優(yōu)選含有0.01mM～100mM，更優(yōu)選含有0.05mM～10mM。這是因為，亞精胺如果不到0.01mM，mRNA的合成速度有降低，生成的mRNA的量變少，結(jié)果蛋白質(zhì)合成的速度有降低的趨勢，另外，還因為亞精胺如果超過100mM，有抑制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的趨勢。
作為轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液中含有的緩沖劑，可以適當(dāng)使用與上述用于提取用液的緩沖劑相同的緩沖劑，由于相同的原因，優(yōu)選使用HEPES-KOH(pH6～8)。另外，從與上述提取用液中的緩沖劑的情況相同的觀點出發(fā)，優(yōu)選含有緩沖劑1mM～200mM，更優(yōu)選含有5mM～50mM。
另外，轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液更優(yōu)選進一步添加甘油。這是因為，如果添加甘油，在轉(zhuǎn)錄/翻譯系合成反應(yīng)中，存在可以穩(wěn)定化蛋白質(zhì)合成所必需的成分的優(yōu)點。添加甘油時，通常添加到5(v/v)％～20(v/v)％。
即，作為轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液，優(yōu)選在含有該提取液30(v/v)％～60(v/v)％的同時，還含有3μg/mL～600μg/mL的轉(zhuǎn)錄模板、轉(zhuǎn)錄/翻譯系反應(yīng)液中在A260下為1～50的哺乳動物微粒體膜(與翻譯模板的最終濃度比值為mRNA(μg/mL)∶微粒體膜濃度(A260)＝1∶0.1～0.5的量)、0.1U/μL～10U/μL的RNA聚合酶、0.1mM～5mM的ATP、0.1mM～5mM的GTP、0.1mM～5mM的CTP、0.1mM～5mM的UTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～500μM的氨基酸成分、10μg/mL～500μg/mL的tRNA。進而，優(yōu)選含有50mM～150mM的醋酸鉀、0.5mM～3mM的醋酸鎂、0.2mM～20mM的DTT、1U/μL～10U/μL的RNA酶抑制劑、0.05mM～10mM的亞精胺、5mM～50mM的HEPES-KOH(pH7.4)、5(v/v)％～20(v/v)％的甘油來實現(xiàn)。
對于使用了上述轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成反應(yīng)(轉(zhuǎn)錄/翻譯系合成反應(yīng))，與上述翻譯系用反應(yīng)液的情況相同，可以在以往公知的如低溫恒溫槽中進行。轉(zhuǎn)錄工序的反應(yīng)溫度通常在10℃～60℃、優(yōu)選在20℃～50℃的范圍內(nèi)。這是因為，轉(zhuǎn)錄工序的反應(yīng)溫度如果不到10℃，轉(zhuǎn)錄的速度有降低的趨勢，另外轉(zhuǎn)錄工序的反應(yīng)溫度如果超過60℃，反應(yīng)所必需的成分有變性的趨勢。另外，翻譯工序的溫度通常在10℃～40℃，優(yōu)選在20℃～30℃的范圍內(nèi)。這是因為，翻譯工序的反應(yīng)溫度如果不到10℃，蛋白質(zhì)的合成速度有降低的趨勢，另外翻譯工序的反應(yīng)溫度如果超過40℃，反應(yīng)所必需的成分有變性的趨勢。
在轉(zhuǎn)錄/翻譯系合成反應(yīng)中，從可以連續(xù)實施轉(zhuǎn)錄/翻譯工序的觀點出發(fā)，特別優(yōu)選以對兩個工序較適合的20℃～30℃的范圍進行反應(yīng)。整個工序加在一起的反應(yīng)的時間為1小時～72小時，優(yōu)選為3小時～24小時。
對可以使用上述翻譯系用反應(yīng)液、轉(zhuǎn)錄/翻譯系用反應(yīng)液合成的蛋白質(zhì)，沒有特別限制，鑒于本發(fā)明的目的，優(yōu)選進行翻譯后的修飾的蛋白質(zhì)。合成的蛋白質(zhì)的量可以通過酶的活性測定、SDS-PAGE、免疫檢測法等進行測定?？梢酝ㄟ^將已合成的蛋白質(zhì)供給到SDS-PAGE、熒光顯影，根據(jù)在微粒體膜存在下、不存在下的分子量的變化或?qū)Φ鞍酌柑幚淼拿舾行?，來判定是否恰?dāng)?shù)剡M行了翻譯后的修飾。
實施例下面利用實施例對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明，但這些實施例不對本發(fā)明有任何限定。
(實施例1)信號肽的切斷的檢測1.含有節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的制備(蠶提取液的制備)使用剪刀、鑷子、手術(shù)刀、刮勺，從15只5齡期第4天的蠶幼蟲摘取后部絲腺3.07g，將其在-80℃下凍結(jié)后，用研缽磨碎，使用下述組成的提取用液，進行抽提。
·20mM HEPES-KOH(pH7.4)·100mM 醋酸鉀·2mM醋酸鎂·2mMDTT·0.5mM PMSF提取后，用離心分離機(himacCR20B3(日立工機公司制))，在30，000×g、30分鐘、4℃的條件下，對得到的液狀物進行離心分離。
離心分離后，只分離上清，再次在30,000×g、10分鐘、4℃的條件下進行離心分離。離心分離后，只分離上清。加入含有20％甘油的提取用液，平衡化脫鹽柱PD-10(Amersham Bioscience公司制)之后，將上清供給到其中，通過用上述提取用液洗脫，進行凝膠過濾。
使用分光光度計(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，從凝膠過濾后的濾液的組分分取出在280nm下的吸光度為10以上的組分，得到5齡期的蠶幼蟲的后部絲腺來源的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液。
對于得到的提取液，使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒(PIERCE公司制)，測定蛋白質(zhì)濃度。首先，相對反應(yīng)試劑2mL加入樣品0.1mL，在37℃下反應(yīng)30分鐘，使用分光光度計(Ultrospec330pro、Amersham Bioscience公司制)，測定562nm下的吸光度。作為對照，使用BSA，制作校準(zhǔn)線。
提取液中的蠶幼蟲的后部絲腺的含量以蛋白質(zhì)濃度計為17.5mg/mL。
(昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取液的制備)(1)High Five來源提取液細(xì)胞數(shù)為2.1×107個的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞High Five(Invitrogen公司制)，在已放入添加了L-谷氨酰胺的Express Five無血清培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)的培養(yǎng)瓶(600cm2)內(nèi)，27℃培養(yǎng)6天。結(jié)果變?yōu)榧?xì)胞數(shù)1.0×108個、濕重1.21g。
接著，收集上述培養(yǎng)的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞，用下述組成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分鐘條件下離心分離)。
·60mM HEPES-KOH(pH7.9)·200mM 醋酸鉀·4mM醋酸鎂·4mMDTT向清洗后的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中加1mL下述組成的提取用液，懸浮。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀
·2mM 醋酸鎂·2mM 氯化鈣·20(v/v)％甘油·1mM DTT·1mm PMSF在液氮中急劇凍結(jié)該懸浮液。充分凍結(jié)后，在約4℃的冰水浴中解凍。完全解凍后，在30,000×g、4℃下離心分離10分鐘(himacCR20B3、日立工機公司制)，回收上清。將已回收的上清1.5mL上樣(apply)到用下述組成的凝膠過濾用緩沖液平衡化之后的PD-10脫鹽柱(AmershamBioscience公司制)。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·2mm醋酸鎂·1mMDTT·1mmPMSF上樣之后，用凝膠過濾用緩沖液4mL洗脫，使用分光光度計(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，回收在280nm處的吸光度為30以上的組分，作為昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取液。
(2)Sf21來源提取液同樣地，在放入Sf900-II無血清培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)的培養(yǎng)瓶(600cm2)內(nèi)，在27℃下，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)為6.1×105個的昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞Sf21(Invitrogen公司制)，培養(yǎng)6天，使用得到的細(xì)胞數(shù)為1.0×108個、濕重為3g的細(xì)胞，制備昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取液。
接著，收集上述培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，用下述組成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分鐘條件下離心分離)，然后，將其懸浮于3mL的下述組成的提取用液中。
·40mMHEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀
·2mM醋酸鎂·2mM氯化鈣·1mMDTT[提取用液的組成]·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM醋酸鉀·2mM 醋酸鎂·2mM 氯化鈣·20(v/v)％甘油·1mM DTT·0.5mMPMSF在液氮中急劇凍結(jié)該細(xì)胞懸浮液。充分凍結(jié)后，在約4℃的冰水浴中解凍。完全解凍后，在30,000×g、4℃下離心分離10分鐘(himacCR20B3、日立工機公司制)，回收上清1A。將回收后的上清1A進一步在45,000×g、4℃下離心分離(himacCR20B3、日立工機公司制)30分鐘，回收上清1B。將2.5mL已回收的上清1B上樣到用下述組成的凝膠過濾用緩沖液平衡化之后的PD-10脫鹽柱(Amersham Bioscience公司制)中。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·2mM醋酸鎂·1mMDTT·0.5mM PMSF上樣之后，用凝膠過濾用緩沖液3mL洗脫，使用分光光度計(Ultrospec3300pro、Amersham Bioscience公司制)，回收在280nm處吸光度為30以上的組分，將其作為昆蟲細(xì)胞提取液。
2.mRNA使用在Promega公司的狗胰腺微粒體膜附屬的β-內(nèi)酰胺酶mRNA(1μg/μl)。
3.翻譯反應(yīng)(蛋白質(zhì)合成)和信號肽切斷的檢測
3-1材料[A]翻譯系用反應(yīng)液的組成(不含微粒體膜)(10μl)50(v/v)％節(jié)肢動物來源提取液5.0μl1μg/μl mRNA 0.5μl預(yù)混合液(pre mix solution) 2.5μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸)0.4μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL)1.0μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水 0.6μl[B]翻譯系用反應(yīng)液的組成(含有微粒體膜)(10μl)50(v/v)％ 節(jié)肢動物來源提取液 5.0μl1μg/μlmRNA 0.5μl預(yù)混合液(pre mix solution) 2.5μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸)0.4μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL)1.0μl狗胰腺微粒體膜(A260＝50) 0.4μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水 0.2μl氨基酸混合物和狗胰腺微粒體膜使用Promega公司制的產(chǎn)品，[3H]亮氨酸使用Amersham Bioscience公司制的產(chǎn)品。
預(yù)混合物由如下所述的成分構(gòu)成(各成分的濃度是翻譯系用反應(yīng)液中的最終濃度)。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·2mM 醋酸鎂·2mM DTT·0.5mM ATP·0.25mMGTP·20mM 磷酸肌酸·200μg/mL 肌酸激酶·0.25mMEGTA·1U/μLRNA酶抑制劑(來源于人胚胎)
·200μg/mL tRNA分別使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、RNA酶抑制劑(寶酒造公司制)、tRNA(Roche Diagnostics公司制)。
3-2反應(yīng)制備上述[A]和[B]所示的組成的反應(yīng)混合液([A]為1個樣品、[B]為2個樣品)，在26℃下反應(yīng)4小時。
作為反應(yīng)裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。
對[A]、[B]各1個樣品，在反應(yīng)后，加入2μl PMSF(40mM)、20μl滅菌蒸餾水、15μL SDS-PAGE樣品緩沖液(×4)，在沸騰浴中處理3分鐘，SDS化。
對[B]的1個樣品，反應(yīng)后，加入1μl蛋白酶K(1mg/mL；Stratagene公司制)，緩慢地攪拌后，在冰上處理1小時后，用與上述樣品相同的方法，SDS化。
將這3個樣品各25μl供給到SDS-PAGE，用Amplify(AmershamBioscience公司制)處理之后，干燥，供給到熒光顯影。
4.結(jié)果將在使用High Five提取液(HFL)作為節(jié)肢動物來源的提取液時的結(jié)果，與作為參考的使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液(RRL)作為提取液的情況的結(jié)果一起，顯示在圖1。對于使用了RRL的反應(yīng)，在參考例1中描述。
在不存在狗胰腺微粒體膜的情況下，使用RRL翻譯在N-末端具有信號肽的β-內(nèi)酰胺酶mRNA時，如圖1所示，合成32kDa的前體蛋白質(zhì)。如果在存在狗胰腺微粒體膜的情況下進行相同的反應(yīng)，檢測出信號肽被切斷的29kDa的蛋白質(zhì)，進而，該29kDa的蛋白質(zhì)不被蛋白酶K處理所切斷。從這些結(jié)果可以確認(rèn)使用了RRL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，β-內(nèi)酰胺酶在狗胰腺微粒體膜的存在下伴隨蛋白質(zhì)合成而通過微粒體膜，同時信號肽被切斷。
在使用HFL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，也可以檢測出與使用RRL的情況完全相同的蛋白質(zhì)條帶，在不存在狗胰腺微粒體膜的情況下生成32kDa蛋白質(zhì)，在其存在的情況下生成29kDa蛋白質(zhì)。另外，與使用RRL的情況相同，蛋白酶K處理不切斷29kDa蛋白質(zhì)。
從以上結(jié)果可知，即使在使用了HFL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，與使用了RRL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系的情況相同，在狗胰腺微粒體膜的存在下，切斷信號肽。
(參考例1)如下所述，檢測使用了RRL的翻譯反應(yīng)(蛋白質(zhì)合成)和信號肽切斷。
制備下述[A’]和[B’]所示的組成的反應(yīng)混合液([A’]為1個樣品、[B’]為2個樣品)，在30℃下反應(yīng)90分鐘。
作為反應(yīng)裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。
對于[A’]、[B’]各1個樣品，在反應(yīng)后，加入2μl PMSF(40mM)、20μl滅菌蒸餾水、15μl SDS-PAGE樣品緩沖液(×4)，在沸騰浴中處理3分鐘，SDS化。
對[B’]的1個樣品，反應(yīng)后，加入1μl蛋白酶K(1mg/mL；Stratagene公司制)，緩慢地攪拌后，在冰上處理1小時后，用與上述的樣品相同的方法，SDS化。
將這3個樣品各25μl供給到SDS-PAGE，用Amplify(AmershamBioscience公司制)處理之后，干燥，供給到熒光顯影。
翻譯系用反應(yīng)液的組成(不含微粒體膜)(10μl)50(v/v)％ RRL 7.0μl1μg/μl mRNA 0.5μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸) 0.2μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL) 1.0μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水1.3μl[B’]翻譯系用反應(yīng)液的組成(含有微粒體膜) (10μl)50(v/v)RRL 7.0μl1μg/μl mRNA 0.5μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸) 0.2μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL) 1.0μl
狗胰腺微粒體膜(A260＝50) 0.5μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水 0.8μl兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液使用Promega公司制的產(chǎn)品。其它使用的產(chǎn)品與上述一樣。
(實施例2)N-糖基化的檢測(1)在翻譯后修飾中，將糖鏈修飾(N-糖基化)作為模型，使用已知產(chǎn)生糖鏈修飾的pro-TNF-GLC(在蛋白質(zhì)的成熟區(qū)域內(nèi)人為地導(dǎo)入N-糖基化部位的突變型人抗腫瘤因子)，嘗試該糖蛋白質(zhì)的體外合成。
(1)表達(dá)質(zhì)粒的制備另外，將使用的多角體蛋白5’-UTR的堿基序列表示為序列號1，將pro-TNF-GLC基因的全堿基序列表示為序列號2。
表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是通過將pTNT載體(Promega公司制)作為模板，使用在序列號3和序列號4所示的堿基序列的末端附加了BamHI位點的PCR引物，進行PCR，在BamHI消化后進行自身連接(selfligation)，由此在多克隆位點的XhoI位點的前方導(dǎo)入BamHI位點。進而，使用在序列號5和6顯示堿基序列的PCR引物，進行PCR，在HindIII消化后進行自身連接，由此將在pTNT載體中原本存在的緊鄰T7終止子序列后方的BamHI位點變?yōu)镠indIII位點。接著，利用PCR，從BamHI位點到T7啟動子進行擴增，將此間合成如上所述的多角體蛋白5’-UTR的正義鏈和反義鏈并使其退火后的產(chǎn)物作為插入片斷而使其連接，這樣，構(gòu)建改變(modified)型pTNT載體。退火的插入序列制備方法如下所述進行。利用T4多核苷酸激酶(TOYOBO公司制)對已合成的正義鏈、反義鏈進行5’末端磷酸化。反應(yīng)后，混合正義鏈和反義鏈，95℃、熱處理5分鐘。將其靜置直至達(dá)到室溫，進行退火。利用乙醇沉淀進行純化后，使其溶解于水中。利用SigmaSpin后反應(yīng)純化柱(SigmaSpin Post Reaction PurificationColumn)(Sigma公司制)，除去過剩的ATP之后，再次用乙醇沉淀進行純化。
接著，用BamHI-EcoRI消化該改變型pTNT載體，同樣用BamHI-EcoRI消化已在pBluescript載體的BamHI-EcoRI位點導(dǎo)入pro-TNFGLC cDNA的質(zhì)粒，得到約0.7Kb的DNA片斷(pro-TNF-GLC cDNA)，將該DNA片斷作為插入片斷與該改變型pTNT載體連接，構(gòu)建體外pro-TNF-GLC基因轉(zhuǎn)錄用質(zhì)粒-I。
全部PCR條件是使用KOD-plus(TOYOBO公司制)，在96℃下使模板DNA變性2分鐘，然后進行96℃15秒、50℃30秒、68℃5分鐘的循環(huán)反應(yīng)30次。
已構(gòu)建的質(zhì)粒的堿基序列是將DNA 250ng作為模板，使用大染料終止子循環(huán)測序FS快速反應(yīng)試劑盒(Big Dye Terminator Cycle Sequence FSReady Reaction Kit)(ABI公司制)，進行PCR(96℃10秒、50℃5秒、60℃4分鐘、25個循環(huán)反應(yīng))，用ABI PRISM310遺傳分析器(GeneticAnalyzer)(ABI公司制)對反應(yīng)液進行解析。
全部連接樣品在使用Ligation High(TOYOBO公司制)進行連接之后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO公司制)，利用堿-SDS法從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌制備質(zhì)粒，進行DNA堿基序列的解析。
(2)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和mRNA的純化用HindIII消化轉(zhuǎn)錄用質(zhì)粒-I之后，利用苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀進行純化。將得到的1μg DNA作為模板，使用RiboMax大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)-T7(Promega公司制)，以20μl體系(scale)，37℃、4小時合成mRNA。反應(yīng)后，添加1U的RQ1無RNA酶DNA酶(RNase Free DNase)(Promega公司制)，在37℃下孵育15分鐘，消化模板DNA。在利用苯酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)之后，進行乙醇沉淀。將得到的沉淀溶解于100μl滅菌水中，用NICK柱(Amersham公司制)進行純化，然后再次進行乙醇沉淀，用滅菌水溶解使其最終為A260/A280＝1.8～2.0、RNA濃度為2mg/mL。直接將這樣制備的mRNA用于無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成。
從轉(zhuǎn)錄用質(zhì)粒-I轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物稱為mRNA-I(pro-TNF GLCmRNA-1)(3)利用蠶、High Five和Sf21提取液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成使用pro-TNF GLC mRNA-1和各種濃度的狗胰腺微粒體膜(Promega公司制)，進行使用無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成，其中所述的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液含有節(jié)肢動物來源的提取物。作為提取液，使用含有在實施例1中制備的節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液(蠶提取液和昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞(HighFive和Sf21)提取液)。
(翻譯系用反應(yīng)液的組成)在此顯示的各成分的濃度為反應(yīng)液中的最終濃度。
蠶提取液的情況·狗胰腺微粒體膜(翻譯系反應(yīng)液1μl中A260＝0～50)·50(v/v)％節(jié)肢動物來源(蠶來源)提取液·160μg/mLmRNA·30mM HEPES-KOH(pH7.4)·100mM醋酸鉀·1.5mM醋酸鎂·0.5mMDTT·10(v/v)％甘油·0.75mM ATP·0.5mMGTP·0.25mM EGTA·25mM 磷酸肌酸·200μg/mL肌酸激酶·100μM 氨基酸(20種)·2U/μl RNA酶抑制劑·100μg/mLtRNA昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞(High Five)提取液的情況·狗胰腺微粒體膜(翻譯系反應(yīng)液1μl中A260＝0～50)·50(v/v)％節(jié)肢動物來源(High Five來源)提取液·320μg/mLmRNA·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM醋酸鉀·2mM 醋酸鎂·2mM DTT
·10(v/v)％ 甘油·0.5mM ATP·0.25mMGTP·0.25mMEGTA·20mM 磷酸肌酸·200μg/mL 肌酸激酶·80μM 氨基酸(20種)·1U/μlRNA酶抑制劑·200μg/mL tRNA昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞(Sf21)提取液的情況·狗胰腺微粒體膜(翻譯系反應(yīng)液1μl中A260＝0～50)·50(v/v)％ 節(jié)肢動物來源(Sf21來源)提取液·320μg/mL mRNA·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·1.5mM 醋酸鎂·2mM DTT·10(v/v)％ 甘油·0.25mMATP·0.1mM GTP·0.1mM EGTA·20mM 磷酸肌酸·200μg/mL 肌酸激酶·80μM 氨基酸(20種)·1U/μlRNA酶抑制劑·200μg/mL tRNA制備上述組成的反應(yīng)混合液，在25℃下反應(yīng)6小時。作為反應(yīng)裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。
(4)在(3)中合成的翻譯反應(yīng)產(chǎn)物的脫糖鏈為了確認(rèn)在上述(3)中調(diào)制的N-糖基化蛋白質(zhì)(pro-TNF GLC)是糖鏈修飾的糖蛋白質(zhì)，用N型糖鏈分解酶進行脫糖鏈化。作為N型糖鏈分解酶，使用糖肽酶(Glycopeptidase)F(Takara公司制)，在每10μl翻譯反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液中，添加1μl，在25℃下反應(yīng)2個小時。(5)N-糖基化蛋白質(zhì)的檢測通過利用抗TNF抗體(R&D公司制)的Western Blot法和基于ECL-plus(Amersham公司制)的化學(xué)發(fā)光來檢測N-糖基化蛋白質(zhì)。即，在翻譯反應(yīng)和脫糖鏈反應(yīng)結(jié)束后，加入等量×2樣品緩沖液溶液(SampleBuffer Soln.)(Wako公司制)以用于SDS化，在95℃下進行3分鐘熱處理，提供給SDS-PAGE。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜。用含有3％明膠的TTBS(20mM Tris、500mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.5)，在室溫下，緩慢振蕩轉(zhuǎn)印后的膜，進行封閉處理。封閉后，用TTBS振蕩10分鐘，清洗膜。在含有1/2000量的抗TNF抗體和1％明膠的TTBS中，緩慢反應(yīng)2小時～12小時。在TCBS(20mM citrate，500mM NaCl，0.05％Tween-20，pH5.5)中，對膜進行振蕩清洗5分鐘×2次。在每100mL含有1％明膠的TCBS中加入33μl的蛋白G-辣根過氧化物酶偶聯(lián)(Protein G-Horseradish Peroxidase Conjugate)(Bio Rad公司制)后，在該液體中緩慢振蕩膜2小時，使其發(fā)生反應(yīng)。在TTBS中振蕩清洗10分鐘之后，使用ECL-plus，進行化學(xué)發(fā)光，用x線膠卷(film)曝光后顯影。
(6)Western Blot的結(jié)果通過上述方法檢測的Western Blot結(jié)果顯示于圖2。
在圖2中，顯示了使用蠶后部絲腺來源提取液(BML)、昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞High Five提取液(HFL)、昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞Sf21細(xì)胞提取液(Sf21L)，在狗胰腺微粒體膜(CMM，Promega公司制)的存在下進行翻譯反應(yīng)的結(jié)果。
已明確在BML、HFL和Sf21L的全部提取液中，通過添加狗胰腺微粒體膜，可以產(chǎn)生N-糖基化。另外，該漂移帶(Shift band)在糖肽酶F消化下顯著減少，所以可以確認(rèn)為N型糖鏈附加蛋白質(zhì)。
(實施例3)N-糖基化的檢測(2)1.mRNA將亞克隆到pTNT載體(Promega公司制)中的糖基化TNF cDNA(作為增強子序列，使用pTNT載體來源的兔β-血紅蛋白前導(dǎo)序列)作為模板，使用T7RNA聚合酶，制作已附加poly-A尾而沒有被加帽(cap)化的糖基化TNF mRNA(3μg/μl)并使用。
2.翻譯反應(yīng)(蛋白質(zhì)合成)和N-糖基化的檢測2-1材料mRNA以外的各成分的具體情況與實施例1相同。
翻譯系用反應(yīng)液的組成(不含微粒體膜)(20μl)50(v/v)％ 節(jié)肢動物來源提取液 10.0μl3μg/μl mRNA 1.0μl預(yù)混合液(pre mix solution)5.0μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸) 0.8μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL) 2.0μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水 1.2μl[B]翻譯系用反應(yīng)液的組成(含有微粒體膜)(20μl)50(v/v)％ 節(jié)肢動物來源提取液 10.0μl3μg/μl mRNA 1.0μl預(yù)混合液(pre mix solution)5.0μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸) 0.8μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL) 2.0μl狗胰腺微粒體膜(A260＝50) 0.8μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水 0.4μl2-2反應(yīng)制備上述[A]和[B]所示的組成的反應(yīng)混合液，在26℃下反應(yīng)4小時。
作為反應(yīng)裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。
在反應(yīng)后，加入2μl的PMSF(40mM)、200μl的RIPA緩沖液(50mMTris-HCl PH7.5、150mM NaCl、1％諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40、0.5％脫氧膽酸鈉、0.1％SDS)、4μl的抗TNF抗體(1mg/mL，R&D公司制)，使用攪拌子，在4℃下攪拌1小時。在其中加入30μl的蛋白G-瓊脂糖凝膠(Sepharose)(50％，Amersham Bioscience公司制)，在4℃下進一步攪拌1小時。攪拌后，用RIPA緩沖液中對蛋白G-瓊脂糖凝膠清洗2次、用50mM Tris-HCl(pH8.0)清洗1次之后，加入30μl的SDS-PAGE樣品緩沖液(×2)，在沸騰浴中，處理3分鐘，SDS化。
將這些樣品各20μl供給到SDS-PAGE，Amplify處理后干燥，供給到熒光顯影。
3.結(jié)果將在使用High Five提取液(HFL)作為節(jié)肢動物來源的提取液時的結(jié)果，與作為參考的使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液(RRL)作為提取液的情況的結(jié)果一起，顯示在圖3。對于使用了RRL的反應(yīng)，在參考例2中描述。
在不存在狗胰腺微粒體膜的情況下，使用RRL，使已在成熟區(qū)域?qū)肓薔-糖基化部位的糖基化pro-TNF的mRNA進行翻譯，如圖3所示，合成26kDa的pro-TNF。在存在狗胰腺微粒體膜的情況下進行相同的反應(yīng)時，檢測出已產(chǎn)生N-糖基化的29kDa的蛋白質(zhì)。從這些結(jié)果可以確認(rèn)在使用了RRL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，糖基化pro-TNF在狗胰腺微粒體膜的存在下，隨著蛋白質(zhì)合成，其成熟區(qū)域通過微粒體膜，同時已導(dǎo)入到成熟區(qū)域的N-糖基化部位接受有效的N-糖基化。
另一方面，在作為本發(fā)明的實施方式的、使用HFL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，檢測出與使用RRL的情況完全相同的蛋白質(zhì)條帶，即狗胰腺微粒體膜的不存在下為26kDa蛋白質(zhì)，存在下為29kDa蛋白質(zhì)。
以上結(jié)果表明即使在使用HFL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，也與使用PPL的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系的情況相同，在狗胰腺微粒體膜的存在情況下，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的N-糖基化。
(參考例2)如下所述，檢測使用了RRL的翻譯反應(yīng)(蛋白質(zhì)合成)和N-糖基化。
制備下述[A’]和[B’]所示的組成的反應(yīng)混合液，在30℃下反應(yīng)90分鐘。
作為反應(yīng)裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。
在反應(yīng)后，加入2μL的PMSF(40mM)、200μL的RIPA緩沖液(50mMTris-HCl PH7.5、150mM的NaCl、1％諾代洗滌劑(Nonidet)P-40、0.5％脫氧膽酸鈉、0,1％SDS)、4μL的抗TNF抗體(1mg/mL)，使用攪拌子，在4℃下攪拌1小時。在其中加入30μL的蛋白G-瓊脂糖凝膠(50％，Amersham Bioscience公司制)，在4℃下進一步攪拌1小時。攪拌后，用RIPA緩沖液對蛋白G-瓊脂糖凝膠清洗2次，用50mM Tris-HCl(pH8.0)清洗1次之后，加入30μL的SDS-PAGE樣品緩沖液(×2)，在沸騰浴中，處理3分鐘，SDS化。
將這些樣品各20μL供給到SDS-PAGE，Amplify處理后干燥，供給到熒光顯影。
翻譯系用反應(yīng)液的組成(不含微粒體膜)(20μl)50(v/v)％RRL14.0μl3μg/μl mRNA 1.0μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸) 0.4μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL) 2.0μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水2.6μl[B’]翻譯系用反應(yīng)液的組成(含有微粒體膜) (20μl)50(v/v)％RRL14.0μl3μg/μl mRNA 1.0μl1mM氨基酸混合物(除了亮氨酸) 0.4μl1mM[3H]亮氨酸(1mCi/mL) 2.0μl狗胰腺微粒體膜(A260＝50)1.0μlDEPC(焦碳酸二乙酯)處理水1.6μl兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液使用Promega公司制的產(chǎn)品。其它使用的產(chǎn)品與上述一樣。
(實施例4)N-糖基化的檢測(3)
(1)動物培養(yǎng)細(xì)胞CHO的培養(yǎng)在5％CO2環(huán)境下，在37℃下，在已加入L-谷氨酰胺的CHO SERUM-FREE MEDIUM(SIGMA公司制)中培養(yǎng)動物培養(yǎng)細(xì)胞CHO。在125mL三角燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)基50mL中，在5％CO2環(huán)境下，在37℃、130rpm下，對每1mL培養(yǎng)基細(xì)胞數(shù)為5.0×105個的CHO進行懸浮培養(yǎng)8天，結(jié)果細(xì)胞數(shù)為1.0×107個，濕重0.5g。
(2)微粒體膜制備方法來自動物培養(yǎng)細(xì)胞CHO的微粒體膜的制備方法基本上是以Walter，P.and Blobel，G.(1983)，Enzymol.96，84-93的方法為基礎(chǔ)，通過基于蔗糖密度梯度的超速離心分離來制備。即，收集在上述(1)中培養(yǎng)的動物培養(yǎng)細(xì)胞，用下述提取用液清洗1次(700×g、4℃、10分鐘的離心條件)之后，將每1g培養(yǎng)細(xì)胞懸浮于4mL的提取用液中。
30mM HEPES-KOH(pH7.9)、100mM KOAc、2mM Mg(OAc)2、0.25mMEGTA、250mM蔗糖、2mM DTT、0.5mM PMSF懸浮后，通過將緊密安裝的杜恩斯勻漿器(Dounce homogenizer)來回20次，破碎細(xì)胞。破碎后，100×g、4℃、10分鐘離心分離，除去細(xì)胞殘渣，回收上清。通過利用蔗糖的密度梯度的超速離心分離，從該上清中分離出微粒體膜組分。在超速離心分離時，以1∶3的體積比(v/v)，從容器下方開始，按照順序，裝含有1.3M的蔗糖的提取用液和前面回收的上清。140000×g、4℃、2.5小時超速離心分離(使用HITACHI公司制超速離心分離機CP80MX和搖擺轉(zhuǎn)子(swing roter)P40ST)該樣品。超速離心分離后，棄去全部上清，每1g開始時的細(xì)胞濕重，用10μl的提取用液靜置懸浮沉淀，將其作為微粒體膜。該微粒體膜的A260/A280為1.4～1.5，A260約為150。
(3)無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成(3-1)表達(dá)質(zhì)粒的制備將使用的多角體蛋白5’-UTR的堿基序列表示為序列號1，將pro-TNF-GLC基因的全堿基序列表示為序列號2。
表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是通過將pTNT載體(Promega公司制)作為模板，使用在序列號3和4所示的堿基序列的末端附加了BamHI位點的PCR引物，進行PCR，在BamHI消化后進行自身連接(selfligation)，而在多克隆位點的XhoI位點的前方導(dǎo)入BamHI位點。進而，使用在序列號5和6所示的堿基序列的PCR引物，進行PCR，在HindIII消化后進行自身連接(selfligation)，由此將在pTNT載體中原本存在的緊鄰T7終止子序列后方的BamHI位點變?yōu)镠indIII位點。接著，利用PCR，從BamHI到T7啟動子進行擴增，將此間合成如上所述的多角體蛋白5’-UTR的正義鏈和反義鏈并使其退火后的產(chǎn)物作為插入片斷而使其連接，這樣，構(gòu)建改變(modified)型pTNT載體。退火的插入序列制備方法如下所述進行。利用T4多核苷酸激酶(TOYOBO公司制)對已合成的正義鏈、反義鏈進行5’末端磷酸化。反應(yīng)后，混合正義鏈和反義鏈，95℃、熱處理5分鐘。將其靜置直至達(dá)到室溫，進行退火。利用乙醇沉淀進行純化后，使其溶解于水中。利用SigmaSpin后反應(yīng)純化柱(SigmaSpin Post Reaction PurificationColumn)(Sigma公司制)，除去過剩的ATP之后，再次用乙醇沉淀進行純化。
接著，用BamHI-EcoRI消化該改變型pTNT載體，同樣用BamHI-EcoRI消化已在pBluescript載體的BamHI-EcoRI位點導(dǎo)入pro-TNFGLC cDNA的質(zhì)粒，得到約0.7Kb的DNA片斷(pro-TNF-GLC cDNA)，將該DNA片斷作為插入片斷與該改變型pTNT載體連接，構(gòu)建體外pro-TNF-GLC基因轉(zhuǎn)錄用質(zhì)粒-I。
全部PCR條件是使用KOD-plus(TOYOBO公司制)，96℃下使模板DNA變性2分鐘，然后進行96℃15秒、50℃30秒、68℃5分鐘的循環(huán)反應(yīng)30次。
已構(gòu)建的質(zhì)粒的堿基序列是將DNA 250ng作為模板，使用大染料終止子循環(huán)序列FS快速反應(yīng)試劑盒(ABI公司制)，進行PCR(96℃10秒、50℃5秒、60℃4分鐘、25個循環(huán)反應(yīng))，用ABI PRISM310遺傳分析器(ABI公司制)對反應(yīng)液進行解析。
全部連接樣品在使用Ligation High(TOYOBO公司制)進行連接之后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(TOYOBO公司制)，利用堿-SDS法從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌制備質(zhì)粒，進行DNA堿基序列的解析。
(3-2)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和mRNA的純化用HindIII消化轉(zhuǎn)錄用質(zhì)粒-I之后，利用苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀進行純化。將得到的1μg DNA作為模板，使用RiboMax大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)-T7(Promega公司制)，以20μL體系(scale)，37℃、4小時合成mRNA。反應(yīng)后，添加1U的RQ1無RNA酶DNA酶(RNase Free DNase)(Promega公司制)，在37℃下孵育15分鐘，消化模板DNA。在利用苯酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)之后，進行乙醇沉淀。將得到的沉淀溶解于100μl滅菌水中，用NICK柱(Amersham公司制)進行純化，然后再次進行乙醇沉淀，用滅菌水溶解使其最終為A260/A280＝1.8～2.0、RNA濃度為2mg/mL。直接將這樣制備的mRNA用于無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成。
從轉(zhuǎn)錄用質(zhì)粒-I轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物稱為mRNA-I(pro-TNF GLCmRNA-I)。
(3-3)利用Sf21提取液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成使用在上述(3-2)中制備的pro-TNF GLC mRNA-I和在上述(2)中制備的CHO細(xì)胞來源的微粒體膜，進行用無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成。作為Sf21提取液，使用含有在實施例1中制備的節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液(昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞Sf21提取液)。
(翻譯系用反應(yīng)液的組成)在此顯示的各成分的濃度為反應(yīng)液中的最終濃度。
·CHO微粒體膜(翻譯系反應(yīng)液1μl中A260＝0～50)·50(v/v)％ 節(jié)肢動物來源(Sf21來源)提取液·320μg/mL mRNA·40mMHEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸鉀·1.5mM 醋酸鎂·2mM DTT·10(v/v)％ 甘油·0.25mM ATP·0.1mM GTP
·0.1mM EGTA·20mM磷酸肌酸·200μg/mL 肌酸激酶·80μM 氨基酸(20種)·1U/μl RNA酶抑制劑·200μg/mL tRNA制備上述組成的反應(yīng)混合液，在25℃下反應(yīng)6小時。作為反應(yīng)裝置，使用低溫鋁封閉(aluminum block)恒溫槽MG-1000(東京理化器械公司制)。
(4)N-糖基化蛋白質(zhì)的檢測通過利用抗TNF抗體(R&D公司制)的Western Blot法和基于ECL-plus(Amersham公司制)的化學(xué)發(fā)光來檢測N-糖基化蛋白質(zhì)。即，在翻譯反應(yīng)和脫糖鏈反應(yīng)結(jié)束后，加入等量×2樣品緩沖液溶液(SampleBuffer Soln.)(Wako公司制)以用于SDS化，在95℃下進行3分鐘熱處理，提供給SDS-PAGE。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜。用含有3％明膠的TTBS(20mM Tris、500mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.5)，在室溫下，緩慢振蕩轉(zhuǎn)印后的膜，進行封閉處理。封閉后，用TTBS振蕩10分鐘，清洗膜。在含有1/2000量的抗TNF抗體和1％明膠的TTBS中，緩慢反應(yīng)2小時～12小時。在TCBS(20mM citrate，500mMNaCl，0.05％Tween-20，pH5.5)中，對膜進行振蕩清洗5分鐘×2次。在每100mL含有1％明膠的TCBS中加入33μl的蛋白G-辣根過氧化物酶偶聯(lián)(Protein G-Horseradish Peroxidase Conjugate)(Bio Rad公司制)后，在該液體中緩慢振蕩膜2小時，使其發(fā)生反應(yīng)。在TTBS中振蕩清洗10分鐘之后，使用ECL-plus，進行化學(xué)發(fā)光，用X線膠卷(film)曝光后顯影。
(5)Western Blot的結(jié)果通過上述方法檢測的Western Blot結(jié)果顯示于圖4。
在圖4中，顯示了使用昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞Sf21細(xì)胞提取液(Sf21L)，在狗胰腺微粒體膜(CMM，Promega公司制)和CHO微粒體膜(CHOMM)的存在下進行翻譯反應(yīng)的結(jié)果。
已明確在Sf21L中，通過添加狗胰腺微粒體膜，與狗胰腺微粒體膜一樣，可以產(chǎn)生N-糖基化。
此外，在說明序列表中的人工序列(Artificial Sequence)的文本(freetext)項目<223>中，序列號1表示EoNPV(桿狀病毒)多角體蛋白基因基因5’UTR的堿基序列；序列號2表示pro-TNF GLC cDNA的堿基序列；序列號3表示PCR引物；序列號4表示PCR引物；以及序列號5表示PCR引物。
序列表<110>國立大學(xué)法人山口大學(xué)、株式會社島津制作所<120>無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成中通過添加微粒體膜的翻譯后修飾方法<130>G104091WO<150>JP2003-385538<151>2003-11-14<160>5<210>1<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(EoNPV多角體蛋白基因)<400>1agtattgtag tcctttcgta attgtttgtg aaatctaaaa tacaccgta 49<210>2<211>702<212>DNA<213>人<220>
<223>pro-TNF GLC<400>2atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag60acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180gaagagtccc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct240tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg300cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga360gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc420aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc480gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag540accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc600
cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt660gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3ttggatcctg caaaaagaac20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4gttcttggat ccctcgagaa t21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5cccaagctta aaaaacccct c 2權(quán)利要求
1.一種在使用含有節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的無細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)合成方法，其中，包括在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在mRNA濃度(μg/mL)與哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)的比值為1∶0.1～5的條件下進行翻譯反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，哺乳動物來源的微粒體膜為狗胰腺來源。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，哺乳動物來源的微粒體膜為哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞來源。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞來源的培養(yǎng)細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取的提取物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為粉絲夜蛾卵細(xì)胞來源或草地夜蛾卵巢細(xì)胞來源的培養(yǎng)細(xì)胞。
12.一種翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾方法，其中，在使用含有節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的無細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)合成中，包括在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應(yīng)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，在mRNA濃度(μg/mL)與哺乳動物來源的微粒體膜的濃度(A260)之間的比值為1∶0.1～5的條件下進行翻譯反應(yīng)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，該比值為1∶0.3～2.3。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，哺乳動物來源的微粒體膜為狗胰腺來源。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，哺乳動物來源的微粒體膜來源于哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞來源的培養(yǎng)細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲組織提取的提取物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，昆蟲組織為蠶組織。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，蠶組織至少包括蠶幼蟲的后部絲腺。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，節(jié)肢動物來源的提取物為從昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞提取的提取物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞為粉絲夜蛾卵細(xì)胞來源或草地夜蛾卵巢細(xì)胞來源的培養(yǎng)細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾為N一糖基化和/或信號序列的切除。
24.一種N-糖基化的蛋白質(zhì)，其中，是利用權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)合成方法得到的。
25.一種切除了信號序列的蛋白質(zhì)，其中，是利用權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)合成方法得到的。
全文摘要
本發(fā)明提供無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成中的新型翻譯后修飾方法以及利用該翻譯后修飾反應(yīng)的新型無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成方法。是一種在使用含有節(jié)肢動物來源的提取物的無細(xì)胞系蛋白質(zhì)合成用提取液的無細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)合成方法，其特征在于，在哺乳動物來源的微粒體膜的存在下進行翻譯反應(yīng)。
文檔編號C07K14/00GK1878870SQ200480033468
公開日2006年12月13日 申請日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者內(nèi)?？? 遠(yuǎn)藤幸喜, 伊東昌章 申請人:國立大學(xué)法人山口大學(xué), 株式會社島津制作所