專利名稱：自我組裝脫落熒光蛋白系統(tǒng)的制作方法
聲明本發(fā)明的權(quán)利項是在聯(lián)邦政府資助下進行研究和發(fā)展取得的成果。
本發(fā)明是加利福尼亞大學(xué)董事會在政府支持下，得到來自美國能源部門的DE-FG02-98ER62647資助項目的資助，同時還得到美國能源部門的W-7405-ENG-36合同項目的資助而完成的。政府對本發(fā)明擁有一定的所有權(quán)。
相關(guān)申請本專利申請主張美國臨時專利申請?zhí)枮镹o.60/514,363的申請日的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
獲得足夠量的既可溶解又正確折疊的重組蛋白，以應(yīng)用于下游，這對許多應(yīng)用蛋白表達技術(shù)領(lǐng)域，仍是一個重大的瓶頸(Makrides 1996；Baneyx 1999；Fahnert，Lilieet al.2004)，這里包括結(jié)構(gòu)基因組項目(Yokoyama 2003；Goh，Lan et al.2004；Terwilliger 2004)。目前，使可溶性蛋白最佳化的方法包括篩選大量的蛋白突變體(突變異種、片段、融合標(biāo)簽、折疊伴侶)并檢測許多表達或折疊的條件(Armstrong，de Lencastre et al.1999；Fahnert，Lilie et 2004)。最近已有方法能篩選可溶性表達蛋白(Waldo 2003)，包括免疫印跡法檢測多聚組氨酸標(biāo)簽蛋白的抗體(Knaustand Nordlund 2001)，但這些方法需要多重步驟，且不能在體內(nèi)實現(xiàn)。蛋白用lacZα片段標(biāo)簽，再與lacZΩ進行結(jié)構(gòu)互補后能被檢測到(Ullmann，Jacob et al.1967；Nixon and Benkovic 2000；Wigley，Stidham et al.2001；Wehrman，Kleaveland etal.2002)，但是lacZα片段相對較大(52個氨基酸)(Wigley，Stidham et al.2001)，且關(guān)于它對融合蛋白的折疊和溶解性能的影響，還沒有作出詳細(xì)研究。利用一種敏感的熒光底物(Kelemen，Klink et al.1999)((FretWorks，Novagen，Madison，WI)與S蛋白(Richards and Vithayathil 1959)互補后，15個氨基酸的S肽標(biāo)記的蛋白(Kim and Raines 1993)在體外能被定量檢測，但這種檢測方法不能用于估計大腸桿菌體內(nèi)表達的可溶性蛋白。
GFP和它的許多相關(guān)熒光蛋白目前被廣泛用來作為蛋白標(biāo)簽劑(參見Verkhusha等2003，珊瑚綱類GFP類似熒光蛋白和生色蛋白；在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)特性和功能的紛繁復(fù)雜，Ch.18，pp.405-439，Research Signpost，Kerala，India)。此外，GFP已經(jīng)被用作一種末端與試驗蛋白融合的可溶性報告蛋白(Waldo et 1999，Nat.17691-695；U.S.Patent No.6,448,087，發(fā)明名稱為“確定和改變蛋白或肽溶解性的方法”)。GFP類似蛋白是一個同源的、且具有一個保守的β11鏈桶狀結(jié)構(gòu)的25-30kDa多肽的擴大家族。該GFP類似蛋白家族現(xiàn)在包含約100個成員，它們是從各種珊瑚綱和水螅綱動物中克隆得到的，且該蛋白家族目前包括紅、黃、綠熒光蛋白及多種非熒光生色蛋白(Verkhusha et supra)。各種各樣商業(yè)上可利用的熒光蛋白標(biāo)簽的檢驗和試劑盒包含GFP光譜變異體和GFP類似熒光蛋白的較寬光譜，它包括紅熒光蛋白(DsRed)和其他紅色熒光蛋白(Clontech，Palo Alto，CA；Amersham，Piscataway，NJ.)。
各種改進GFP和相關(guān)蛋白可溶性的策略已備有證明文件，且已產(chǎn)生許多具有改良的折疊、可溶性和擾動耐受特性的突變體。Stemmer和他的同事將人工定向進化方法應(yīng)用于篩選在大腸桿菌中能增加熒光和折疊域的GFP蛋白的突變體或變異體(Crameriet al.，Nat.Biotechnol.143315-319，1996)。他們確定了一種能增加折疊能力的突變體。該種GFP，稱為cycle-3或GFP3，其含有突變位點F99S、M153T和V163A。GFP3對表達環(huán)境相對不敏感，且它在各種宿主細(xì)胞包括大腸桿菌中都能很好折疊。GFP3在27℃和37℃條件下能一樣正確折疊。因此，GFP3的突變也消除了野生型GFP在折疊過程中可能會出現(xiàn)的溫度敏感折疊中間狀態(tài)。
GFP3可能由于和另一個較差折疊的多肽組成的融合蛋白的表達而被錯誤折疊。GFP3已被用于報告在大腸桿菌中表達的N-末端融合蛋白的“折疊旺盛”(Waldo等1999，見上文)。在這種方法中，報告蛋白的序列，如GFP3結(jié)構(gòu)域，仍然保持連續(xù)，且一個較差折疊的上游結(jié)構(gòu)域被突變。X結(jié)構(gòu)域較好折疊的變異體通過增加的熒光被確定。
現(xiàn)有的蛋白標(biāo)簽和檢測平臺是有效的，但也有缺點。脫落蛋白標(biāo)簽可能會擾亂蛋白溶解性(Ullmann，Jacob et 1967；Nixon and Benkovic 2000；Fox，Kapust et al.2001；Wigley，Stidham et al.2001；Wehrman，et al.2002)或者在活細(xì)胞中不工作(Richards and Vithayathil 1959；Kim and Raines 1993；Kelemen，Klink et al.1999)。綠色熒光蛋白的融合蛋白可能會錯誤折疊(Waldo，Standish et 1999)或出現(xiàn)改變的過程(Bertens，Heijne et al.2003)。雙砷化合物FlaSH或ReASH(Adams，Campbell et al.2002)的熒光底物克服了許多這樣的限制，但需要一個聚半胱氨酸標(biāo)簽?zāi)ｓw、一個還原環(huán)境以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染或通透狀態(tài)(Adams，Campbell et 2002)。
GFP片段重組系統(tǒng)已被描述過，主要是為檢定蛋白與蛋白的相互作用，但沒有一個能獨力自我組裝成正確折疊、可溶的熒光重組GFP，且從這些方法中也沒有出現(xiàn)全面的脫落GFP折疊報告蛋白系統(tǒng)。例如，Ghosh等在2000年報道，兩個GFP片段，分別是GFP結(jié)構(gòu)的1-157位氨基酸和158-238位氨基酸，當(dāng)該兩個獨立的片段與能夠形成反向平行亮氨酸拉鏈的螺旋序列融合時，其能在體外或通過大腸桿菌(E.coli)中共表達被重組產(chǎn)生一熒光產(chǎn)物(Ghosh et 2000，反向平行亮氨酸拉鏈定向蛋白重組應(yīng)用于綠色熒光蛋白.J.Am.Chem.Soc.1225658-5659)。同樣地，美國專利No.6,780,599描述了能夠形成反向平行亮氨酸拉鏈的螺旋結(jié)構(gòu)加入GFP分子脫落片段的用途。該專利說明書確定GFP片段上不附有互補的螺旋結(jié)構(gòu)，就不可能發(fā)生重組。尤其是，說明書指出在對照實驗中，沒有亮氨酸拉鏈對的GFP片段“不能顯示任何綠色克隆，因此強調(diào)需要NZ和CZ亮氨酸拉鏈的同時存在，以介導(dǎo)GFP在體內(nèi)和體外組裝”。
同樣地，Hu等在2002年表明相互作用的蛋白bZIP和Rel，在與GFP的兩個片段發(fā)生融合時，能通過它們之間的相互作用介導(dǎo)GFP重組(Hu等2002，利用雙分子熒光互補呈現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)bZIP和Rel家族蛋白之間的相互作用Mol.Cell 9789-798)。Nagai等在2001年說明黃色熒光蛋白(YFP)片段與鈣調(diào)素和M13融合后能在有鈣的條件下介導(dǎo)YFP重組(Nagai等2001，設(shè)計循環(huán)序列改變的綠色熒光蛋白來檢測Ca2+Proc.Acad.Sci.USA 983197-3202)。作為這種方法的一種變化形式，Ozawa等通過自我剪接內(nèi)含多肽序列將鈣調(diào)素和M13與兩個GFP片段融合，從而在有鈣的條件下介導(dǎo)GFP片段共價重組(Ozawa等2001，基于蛋白剪接檢測體內(nèi)蛋白與蛋白之間相互作用的熒光指示劑Anal.Chem.725151-5157；Ozawa等2002，監(jiān)控細(xì)菌內(nèi)蛋白與蛋白之間相互作用的脫落綠色熒光蛋白的基于剪接的蛋白重組改良的敏感性及簡化的篩選次數(shù)Anal.Chem.735866-5874)。這些研究者中有一位隨后報道將基于剪接的GFP重組系統(tǒng)應(yīng)用于培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中(Umezawa，2003，Chem.Rec.322-28)。最近，Zhang等在2004年表明上文中Ghosh et al.，2000的螺旋狀結(jié)構(gòu)剪接GFP系統(tǒng)在線蟲C.elegans中共表達時能被用于重組GFP(YFP和CFP也可以)熒光，且證明該系統(tǒng)在體內(nèi)的有效共表達的用途(Zhang et al.，2004，與重組的熒光蛋白組合標(biāo)記的細(xì)胞和細(xì)胞器官Cell 119137-144)。
雖然上述GFP重組系統(tǒng)優(yōu)于兩個明顯不同的熒光蛋白標(biāo)簽的使用，但是它們受到以下限制片段大小和相對差的折疊特性(Ghosh et al.，Hu et al.，supra)，需要化學(xué)連接或融合相互作用的伴侶多肽以促使重組(Ghosh et al.，2000，supra；Ozawaet al.，2001，2002supra；Zhang et al.，2004，supra)，共表達或共再折疊以產(chǎn)生可檢測的折疊和熒光的GFP(Ghosh et al.，2000；Hu et al.，2001，supra)。較差的折疊特性限制了這些片段用于一起同時表達或同時重折疊的情況。這樣的片段不適用于體外檢驗，因為它要求各片段在互補之前具有長時間的穩(wěn)定性和可溶性。這種脫落蛋白片段不適用的例子是，標(biāo)簽有一對脫落蛋白片段之一的多肽的定量，然后再通過加入互補片段被檢測。
一種理想的蛋白標(biāo)簽應(yīng)該是遺傳編碼的，并在體內(nèi)體外都能工作，且能提供一個靈敏的分析信號，而不需要外在試劑或底物。然而，至今還沒有一種脫落熒光蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)的描述，該種系統(tǒng)不依賴于使用融合異源多肽結(jié)構(gòu)域去驅(qū)使熒光報告蛋白活性的重建。在本發(fā)明要求和提出的一種脫落熒光蛋白標(biāo)簽系統(tǒng)中，片段不需要融合的相互作用蛋白的結(jié)構(gòu)域就能自發(fā)地進行自我聯(lián)結(jié)，并在聯(lián)結(jié)前能保持可溶狀態(tài)，且不改變?nèi)诤夏繕?biāo)蛋白的可溶性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種基于熒光蛋白和生色蛋白自行互補片段的蛋白標(biāo)簽和檢測系統(tǒng)。本發(fā)明的系統(tǒng)以來源于水母(aequorea victoria)的綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein GFP)的自行互補片段的各種結(jié)合為例，所述片段可被用于以多種檢驗形式檢測和定量體內(nèi)和體外蛋白的溶解性。
在一個特別實施方式中，試驗蛋白與GFP的一個16個氨基酸的片段(β11鏈，氨基酸215-230)融合，并用遺傳工程方法使融合蛋白的可溶性不受破壞。當(dāng)加入GFP互補片段(β1-10鏈，氨基酸1-214)，GFP片段的自發(fā)結(jié)合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)互補、折疊，從而伴隨產(chǎn)生GFP熒光。
脫落GFP系統(tǒng)是非常簡單的，它不需要外在試劑，并提供一個直接與標(biāo)簽蛋白量成比例的靈敏分析信號，在不到15分鐘時間內(nèi)就能定量工作臺上典型相遇的蛋白，也能報告可溶或不可溶蛋白，且在體內(nèi)和體外都能工作。目前還沒有別的蛋白標(biāo)簽和檢測系統(tǒng)能結(jié)合上述這些功能。如以下實施例所詳細(xì)描述的，脫落GFP系統(tǒng)已被用于定量多孔板內(nèi)的蛋白，并被用于監(jiān)控活的大腸桿菌內(nèi)蛋白的表達和溶解性。
本發(fā)明的脫落GFP系統(tǒng)對于檢驗蛋白溶解性、定量蛋白以及對報告蛋白的檢驗是特別有用的，所述報告蛋白檢驗可監(jiān)控目的在于改進特殊多肽或蛋白的折疊和溶解性的人工定向進化方法是否成功。此外，本發(fā)明的系統(tǒng)可被用于檢測抑制和/或促進蛋白不正確折疊的因素，尤其是在高通量藥物發(fā)展模式中。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生報告蛋白自行互補片段的方法。這些方法以產(chǎn)生GFP基因工程片段為例，且這些方法可被用于創(chuàng)造其他GFP類似熒光和非熒光蛋白的自行互補片段。
附圖的簡要說明

圖1A是pTET-SpecR質(zhì)粒的示意圖，它是來自Clontech(Palo Alto，CA)的pPROTet.6*HN載體的修飾形式。氯霉素抗性基因在pPRolar抗性標(biāo)記的卡那霉素啟動子的控制下被奇放線菌素抗性標(biāo)記所取代(pPROlar來自Clontech，Palo Alto，CA)。在T0轉(zhuǎn)錄終止序列的上游，相同的順反子上編碼了四環(huán)素抑制基因。抑制基因翻譯的量由在Sacl下游的一個弱的Shine-Delgarno序列調(diào)節(jié)。
圖1B展示了設(shè)計的pTET-SpecR質(zhì)粒的不同元件。粗體表示的序列＝側(cè)面與NcolCCATGG和KphlGGTACC相接的，表達在tet啟動子下基因的v1克隆盒。灰色序列＝SpecR-tetR順反子的T0轉(zhuǎn)錄終止子；綠色序列＝tetR抑制基因；黃色序列＝控制tetR翻譯的RBS；品紅色序列＝奇放線菌素(SpecR)基因；青色序列＝來自PROlAR載體(Clontech，Palo Alto，CA)的卡那霉素啟動子元件。
圖2顯示了脫落GFP互補的原理。目的蛋白(X)通過一個可伸縮的接頭(L)與一個小的GFP片段(β-鏈11，215-230個殘基)融合。互補的GFP片段(β1-10鏈，1-214個殘基)被分開表達。兩片段在單獨的情況下均無熒光。當(dāng)兩片段混合時，大小GFP片段會自發(fā)結(jié)合，發(fā)生GFP折疊和形成熒光團。使得小的GFP標(biāo)簽片段難以接近的過程，如錯誤折疊或聚集，都會阻止片段互補的發(fā)生。
圖3為11個β-鏈GFP家族成員的拓?fù)涠壗Y(jié)構(gòu)示意圖。(A)氨基酸的鏈和編號。被圈起來的數(shù)字標(biāo)記了鏈之間的轉(zhuǎn)角(是蛋白剪接的優(yōu)選位點)，黑色的圓圈是折疊的報告突變，白色的圓圈是超折疊的GFP突變。(B)顯示了11條β-鏈的編號慣例。(C)顯示了通過用一個短的可伸縮的接頭連接N末端和C末端而生成的環(huán)形GFP突變體，它在173位氨基酸處產(chǎn)生了一個新的起始密碼子，在172位氨基酸后產(chǎn)生了終止密碼子。
圖4顯示了在位置157或172處進行GFP片段剪接(如1-156+157-238片段和1-171+172-238片段)，然后在培養(yǎng)皿上的大腸桿菌克隆中兼容的質(zhì)粒共表達兩片段，最后在體內(nèi)互補產(chǎn)生的熒光圖像。左列顯示了來自于折疊報告蛋白GFP的片段，右列顯示了來自于超折疊的GFP的相同片段。和預(yù)想的一樣，跟折疊報告蛋白GFP相比，超折疊片段的效果更好并且能產(chǎn)生更亮的克隆，被改進的超折疊GFP的折疊也有相同效果。
圖5顯示了體外GFP1-10變異體的互補效率。在加入180μl含有1mg/ml與野生型GFP11融合的可溶性亞硫酸還原酶的緩沖液后，20μl的1mg/ml重折疊的超折疊GFP1-10(較低的曲線)或相同量的可溶的最優(yōu)化的GFP1-10 OPT片段(較高的曲線)與其進行互補產(chǎn)生的熒光增強曲線。插圖顯示了體內(nèi)GFP1-10變異體的互補，是在硝化纖維膜上共表達與野生型GFP S11融合的亞硫酸還原酶和來自超折疊GFP(上部)，或折疊報告GFP(下部)的GFP1-10片段的大腸桿菌BL21(DE3)克隆的熒光圖像。
圖6顯示了單獨表達己酮糖磷酸鹽合酶蛋白(HPS)或表達HPS的N末端與野生型GFP S11融合的蛋白(WT)，或表達與三個GFP S11最優(yōu)變異體(M1，M2，M3)融合的HPS的大腸桿菌細(xì)胞在可溶部分和沉淀部分的SDS聚丙烯酰胺凝膠圖譜。結(jié)果表明HPS-GFP S11野生型融合蛋白是不可溶的，而單獨的HPS是60％可溶。
圖7顯示了組織培養(yǎng)皿上的體外實驗中，在加入過量GFP1-10 OPT(800pmol)后，三個與亞硫酸還原酶融合的GFPS11變異體M1，M2和M3(50pmol)的熒光互補動力曲線。每個檢測的最終體積為200μl。
圖8顯示了運用三個不同的GFP 1-10構(gòu)體進行連續(xù)誘導(dǎo)(左列)或聯(lián)合誘導(dǎo)操作(右列)的效果。圖為三排表達了具有更好效果和溶解性的GFP 1-10構(gòu)體的大腸桿菌克隆的熒光圖像折疊報告蛋白(FR，第一排)，超折疊蛋白(SF，第二排)，或最優(yōu)化的GFP 1-10變異體(OPT，第三排)。超折疊GFP 1-10單獨表達時是不溶的。第一列在表達亞硫酸還原酶-GFP S11融合蛋白后GFP 1-10的瞬時表達。第二列與亞硫酸還原酶-GFP S11野生型融合蛋白共表達GFP 1-10。超折疊GFP 1-10是不溶的，在進行瞬時誘導(dǎo)操作后細(xì)胞出現(xiàn)微弱的熒光，很可能因為超折疊GFP 1-10可以在表達亞硫酸還原酶-GFP S11野生型融合蛋白之前聚集，從而削弱了互補的效率。共表達產(chǎn)生了發(fā)光的細(xì)胞很可能因為在超折疊GFP 1-10和亞硫酸還原酶-GFP S11融合蛋白之間可發(fā)生迅速的結(jié)合和互補，從而挽救了GFP 1-10，避免其發(fā)生錯誤折疊和聚集。相反地，不論這些構(gòu)造是連續(xù)表達還是共表達，部分可溶的GFP 1-10 OPT細(xì)胞都能發(fā)出熒光。
圖9顯示了運用GFP S11 M3標(biāo)簽片段和GFP1-10 OPT檢測片段進行脫落GFP互補的靈敏度。含有0.1-200pmol亞硫酸還原酶-GFP S11 M3融合蛋白片段的20μl等量樣本與含有800pmolGFP1-10 OPT片段的180μl等量樣本進行混合互補。(A)在加入GFP1-10 OPT片段后15分鐘每份溶液的熒光測量值。(B)在加入GFP1-10 OPT片段后1小時每份溶液的熒光測量值。
圖10顯示了50，25，12.5，6.25，3.13，和1.56pmol亞硫酸還原酶與GFP S11M3融合蛋白樣本的互補進程曲線。通過減去一個小的常數(shù)并應(yīng)用一個縮放比例因素(參見圖10中插入的表)得出適合50pmol的進程曲線的數(shù)據(jù)，再應(yīng)用EXCEL數(shù)據(jù)分析工具求解器(微軟公司)進行非線性最小平方計算。極好的重疊說明了進程曲線的形狀并不依賴于標(biāo)簽蛋白的濃度或未連接的GFP1-10 OPT片段層的缺失。
圖11顯示了C末端GFP S11 M3標(biāo)簽的折疊報告蛋白與結(jié)合Talon樹脂的6HIS GFP1-10 OPT的結(jié)合和互補情況。(1)結(jié)合Talon樹脂的6HIS GFP 1-10 OPT，(2)與C末端融合有GFP S11 M3的折疊報告GFP的結(jié)合小珠熒光迅速增強，(3)基于互補的緩慢的熒光生成。
圖12顯示了尿素濃度對互補反應(yīng)的影響。2M以上的尿素會使反應(yīng)結(jié)束。
圖13顯示了pH值對互補反應(yīng)的影響。(A)在加入GFP 1-10 OPT后的6小時亞硫酸還原酶-GFP S11 M3融合蛋白的最終熒光具有pH值依賴性。(B)在加入GFP 1-10OPT后的6小時人工合成肽GFP S11的最終熒光具有pH值依賴性。在pH值小于6.5時，熒光互補反應(yīng)不能有效進行。
圖14的柱狀圖顯示了體外應(yīng)用脫落GFP系統(tǒng)，對帶有C末端GFP S11 M3標(biāo)簽的18個試驗蛋白(參看之前的表3)的蛋白定量。應(yīng)用GFP 1-10 OPT與GFP片段互補可檢測可溶部分(黑色柱)和非折疊的沉淀部分(灰色柱)的熒光。SDS聚丙烯酰胺凝膠圖顯示了相應(yīng)的可溶部分(S)，和沉淀部分(P)。應(yīng)指出，#8蛋白，酒石酸脫水酶β-亞基在ca.13kD處有另一條較低的條帶。
圖15顯示了應(yīng)用脫落GFP檢測系統(tǒng)進行體內(nèi)蛋白溶解性和表達篩選。來自tet-啟動子質(zhì)粒的N末端6HIS片段和C末端GFP S11 M3片段標(biāo)簽的18個Pyrobaculum試驗蛋白(參看之前表3)被克隆入一個大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達，同時該菌株還含有表達GFP 1-10 OPT片段的pET質(zhì)粒。對帶有標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)和GFP 1-10 OPT進行聯(lián)合誘導(dǎo)表達后(上部)，或在瞬時表達標(biāo)簽結(jié)構(gòu)后再表達GFP 1-10 OPT(連續(xù)誘導(dǎo)，中部)，然后觀察平板培養(yǎng)基上克隆的熒光圖像，以及在液體培養(yǎng)基中連續(xù)誘導(dǎo)的細(xì)胞的Talon樹脂結(jié)合小珠的可溶部分(B)和沉淀部分(P)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠圖像(下部)。箭頭指示為偶然結(jié)合的GFP 1-10 OPT(易可見分子量為ca.29kD)。需要注意的是核苷二磷酸激酶(蛋白#7)是部分可溶的(在Talon樹脂結(jié)合部分GFP1-10 OPT的相應(yīng)條帶略微下面可看見一條帶)。多硫還原酶-GFP S11 M3融合物(參看之前表3)產(chǎn)生出顏色很深的紅色克隆。它吸收488納米的激發(fā)光，并在共表達兩片段時削弱整個細(xì)胞的熒光，盡管蛋白能夠很好表達。
圖16顯示了應(yīng)用GFP S10-11 OPT標(biāo)簽片段和GFP 1-9 OPT檢測片段進行脫落GFP互補的靈敏度。含有亞硫酸還原酶-GFP S10-11 OPT融合蛋白的20μl等量樣本與含有250μM GFP1-9 OPT片段的180μl等量樣本進行混合互補。加入GFP1-10 OPT后6小時每份溶液測量熒光值。由于GFP1-9 OPT的濃度是受限的，在亞硫酸還原酶-GFPS10-11大于約250μM時，熒光值達到平穩(wěn)狀態(tài)。
圖17顯示了三明治標(biāo)簽形式的原理，其中試驗蛋白X是作為兩個GFP結(jié)構(gòu)域(鏈10和鏈11)之間的融合蛋白表達，并由第三個GFP結(jié)構(gòu)域(GFP1-9 OPT)檢測。(a)當(dāng)標(biāo)簽鏈均被完整的目標(biāo)蛋白X連接時，互補反應(yīng)有效發(fā)生。(b)如果標(biāo)簽鏈分離，則互補反應(yīng)不能有效進行。
圖18(A)顯示了來自用GFP 1-9 OPT作為互補目標(biāo)的(GFP S10)-L1-Ndel::GGGSGSGG::BamH1-L2-(GFP S11)改進的六個最適結(jié)構(gòu)的序列，該序列后接有起始序列(底部序列)。GFP S10和GFP S11用藍色區(qū)域進行了強調(diào)。相對于起始序列的六個最適結(jié)構(gòu)的突變以黃色區(qū)域顯示。優(yōu)選第五個最適結(jié)構(gòu)，被稱作(GFP S10SM5)-L1-Nde-1::X::BamH1-L2-(GFP S11 SM5)，其中X作為目標(biāo)蛋白。(B)顯示了十四個誘導(dǎo)突變的變性引物，用于在GFP S10的目標(biāo)位點誘導(dǎo)突變。
圖19顯示了參考序列(GFP S10)-L1-Ndel::GGGSGSGG::BamH1-L2-(GFP S11)，來自圖18A(GFP S10 SM5)-L1-Nde-1::X::BamH1-L2-(GFP S11 SM5)的最適序列，以及八個最適結(jié)構(gòu)(GFP S10)-L1-Nde-1::HPS::BamH1-L2-(GFP S11 SM5)的序列。在目標(biāo)鏈GFP S10中的，可增加起始序列(GFP S10SM5)-L1-Nde-1::HPS::BamH1-L2-(GFP S11 SM5)的溶解度的突變用紅色強調(diào)顯示。這八個最適結(jié)構(gòu)序列的每個序列后面都接有可伸縮的連接序列和GFP S11 SM5(參看列表中第二個序列的末端)，通過HPS編碼序列繼續(xù)延伸，并在BamH1位點重新開始。
圖20顯示了體外和體內(nèi)十八個Pyrobaculum控制蛋白X的互補檢測，它們被克隆到一個帶有(GFP S10 A10)-GGGS-Ndel-X-BamHI-GGGS-(GFP S11 SM5)的pTET載體的Ndel/BamHI克隆位點，然后轉(zhuǎn)化到一個BL21(DE3)菌株中，該菌株在以p15為起始點的pET 28載體上含有GFP 1-9 OPT。對于體外檢測，液體培養(yǎng)液只能通過AnTET誘導(dǎo)。(a)用GFP 1-10 OPT進行的20μl可溶等量樣本的檢測。(b)用GFP 1-10OPT進行的10μl尿素增溶的沉淀等量樣本的檢測。(c)用GFP 1-9 OPT進行的20μl可溶等量樣本的檢測。(d)用GFP 1-9 OPT進行的10μl尿素增溶的沉淀等量樣本的檢測。(e)用AnTET試劑瞬時誘導(dǎo)來自pTET的三明治標(biāo)簽結(jié)構(gòu)，然后用IPTG對GFP1-9進行誘導(dǎo)，之后觀察大腸桿菌的熒光圖像。
圖21顯示了用GFP 1-10 A4對可溶的亞硫酸還原酶-S11 H7融合蛋白進行互補的靈敏度圖像。該檢測顯示了皮摩爾的靈敏度。在該實驗中，不使用0.5％的牛血清(BSA)溶液封閉96孔板。低濃度下(插圖)標(biāo)準(zhǔn)曲線的非線性化可能是因為孔板表面的吸收導(dǎo)致標(biāo)簽蛋白的損失。
圖22顯示了折疊報告蛋白GFP-(GFP-S11 H7)融合蛋白和N6HIS-折疊報告蛋白GFP融合蛋白的粗提液和純化片段的SDS-聚丙烯酰胺凝膠染色圖。
圖23是在不同咪唑濃度下，N6-HIS-GFP，折疊報告蛋白GFP-(GFP S11 H7)和折疊報告蛋白GFP-(GFP S11 H9)與Talon樹脂小珠結(jié)合后被洗脫的片段的熒光強度柱狀圖。與結(jié)合更緊密的(GFP S11 H9)相比，(GFP S11 H7)標(biāo)簽物在更低濃度的咪唑下開始洗脫。而信號強度是與被釋放到上清液中的蛋白量相關(guān)，信號越強，在指定咪唑濃度下蛋白與樹脂的結(jié)合越不緊密。
圖24顯示了幾個試驗蛋白的小規(guī)模純化，該些試驗蛋白來自Pyrobaculum并在C末端帶有(GFP S11 H9)標(biāo)簽，且用Talon樹脂進行純化。該圖為在TNG緩沖液中加入150mM咪唑的裂解液的可溶部分(S)，不結(jié)合的部分(U)和被洗脫的蛋白(E)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠圖像。
發(fā)明的詳細(xì)描述定義除了其他特殊說明外，所有在此運用的技術(shù)、符號及其他科學(xué)術(shù)語所指的含義都是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍能理解接受的含義。其中，為了充分清楚地闡述或作為現(xiàn)成的參考，有時會給出一些普遍被理解接受術(shù)語的定義，而這些定義所包含的內(nèi)容與該技術(shù)領(lǐng)域通常理解的含義沒有實質(zhì)上的區(qū)別。本領(lǐng)域技術(shù)人員一般都能明確理解在此被描述或引用的技術(shù)方法和步驟，并能用常規(guī)的方法實施應(yīng)用。例如，在Sambrook等分子克隆中描述的已被廣泛應(yīng)用的分子克隆方法紐約Cold Spring Harbor(冷泉港)的Cold Spring Harbor實驗室出版的第三版(2001年)實驗操作手冊和通用分子生物操作規(guī)程(2001年John&Sons公司出版)。除其他特殊說明外，合適的情況下，大體可按商業(yè)上直接可用的試劑盒和試劑所提供的操作規(guī)程和/或參數(shù)進行實驗操作。
本發(fā)明提到的“熒光蛋白”是指一種水母綠色熒光蛋白(GFP)，GFP的結(jié)構(gòu)變異體(如環(huán)形突變體，單節(jié)顯性的變體)，GFP的折疊變異體(如高可溶性，超折疊性變異體)，GFP的光學(xué)變異體(如YFP，CFP)，以及GFP類似熒光蛋白(如DsRed)。術(shù)語“GFP類似熒光蛋白”是指擁有β11鏈“管式”結(jié)構(gòu)的珊瑚類動物熒光蛋白，GFP的結(jié)構(gòu)變異體、折疊變異體及光學(xué)變異體也都擁有β11鏈“管式”結(jié)構(gòu)。術(shù)語“GFP類似非熒光蛋白”和“GFP類似生色蛋白”(簡稱“生色蛋白”或“色(素)蛋白”)是指珊瑚和水螅綱類動物的生色蛋白，它們含有GFP的β11鏈“管式”結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)變異體、折疊變異體和光學(xué)變異體。GFP類似蛋白都擁有共有的結(jié)構(gòu)和功能特征，除了氧分子，不需要附加的輔因子、外加酶催化劑或底物就能無限形成內(nèi)在生色蛋白。
一種熒光蛋白的“變異體”來源于一種“母體”熒光蛋白，它保留了β11鏈的管式結(jié)構(gòu)和內(nèi)在的熒光性，它還包括氨基酸替代、剔除或插入的結(jié)構(gòu)，該種結(jié)構(gòu)可能會賦予該蛋白新的或改良的生物特性(如更好的穩(wěn)定性、提高的溶解性，改善的折疊程度與散發(fā)或激發(fā)光譜中的遷移，減少或消除多聚體的形成等)，同時還包括具有被修飾過的N末端和C末端的結(jié)構(gòu)(如環(huán)形突變體)。
當(dāng)涉及報告多肽時使用術(shù)語“互補片段”或“補充片段”，它是指獨自無活性的多肽片段(如不表達該報告多肽的表型)，其中互補片段的結(jié)合能恢復(fù)報告多肽活性。術(shù)語“自行互補”，“自我組裝”和“自發(fā)結(jié)合”在描述兩個或更多的熒光(或生色)蛋白片段時，是指在單個片段可溶的情況下，這些片段能夠重新組成一個完整的熒光(或生色)蛋白。
本發(fā)明中的″MMDB Id5742結(jié)構(gòu)″是指在分子建模數(shù)據(jù)庫(MMDB)中被Ormo和Remington公開的MMDB編號為5742 GFP蛋白結(jié)構(gòu)。PDB編號1EMA PDB作者M.Ormo和S.J.Remington PDB證明書1-Aug-96 PDB分類熒光蛋白PDB題目來自水母的綠色熒光蛋白。蛋白數(shù)據(jù)庫編號參考是PDB編號1EMA PDB作者M.Ormo和S.J.Remington PDB證明書1-Aug-96 PDB分類熒光蛋白PDB題目來自水母的綠色熒光蛋白。(參看Ormo等.“水母綠色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)”，科學(xué)，1996年九月第六期；273(5280)；Yang等，“綠色熒光蛋白的分子結(jié)構(gòu)”，自然生物技術(shù)，1996年十月；14(10)1246-51)。
″均方根差″(″RMSD″)是指在埃單位下平方均值疊加的平方根的剩余值。該數(shù)在兩個結(jié)構(gòu)的最佳疊加后計算得出，作為等價α碳原子間距離的平方平均值的平方根。
當(dāng)涉及一個核酸的一部分時會使用術(shù)語″異源的″，它是指這個核酸由兩個或更多個在自然界中未被發(fā)現(xiàn)的彼此同一相關(guān)的亞序列組成。例如，代表性地重組合成一個核酸，該核酸具有兩個或更多的來自不相關(guān)基因的序列重組形成了一個新的功能性核酸，一個核酸序列編碼一種來源的熒光蛋白，另一個核酸則為編碼不同來源的另一個多肽序列。同樣地，一個異源蛋白指它由兩個或更多個在自然界中沒有被發(fā)現(xiàn)彼此同一相關(guān)的亞序列組成(如融合蛋白)。
在上下文中兩個或多個核酸或多肽序列的“同一性的”或“同一性”百分比是指兩個或多個序列相同或有特定百分比的氨基酸殘基或核苷是相同的(例如，在通過一個比較窗口比較和線性化求最大相關(guān)性時的特定區(qū)域內(nèi)，或應(yīng)用一個以下缺省參數(shù)描述的BLAST或BLAST 2.0序列比對運算法則或通過手工校正和觀察來測定的指定區(qū)域內(nèi)，序列大概是70％同一性，優(yōu)選75％，80％，85％，90％，或95％的同一性。這種序列就被認(rèn)為是“實質(zhì)上相同的”。這種序列定義也涉及到一個測試序列的優(yōu)化。優(yōu)選一個區(qū)域的相同在長度上最好至少是大約22個氨基酸或核苷，而30，40或50-100個氨基酸或核苷則更優(yōu)選。
對序列比對來說，通常需要就相對被測試序列列出一個相應(yīng)的參考序列。當(dāng)運用一個序列比對算法時，被測序列和參考序列都被輸入到電腦中，必要時需指定匹配的亞序列，并且指定序列比對算法程序中的參數(shù)。可以使用缺省的程序參數(shù)，也可指定其他的參數(shù)值。然后序列比對算法會基于本程序的參數(shù)計算出被測序列相對于參考序列的序列同一性百分比。
這里所用的“比對窗口”，包括涉及一種從序列中選取的，具有從20到600，通常為50到200左右，更常見的為100到150之間的任何長度的連續(xù)位點的片段。該片段序列可與具有相同長度連續(xù)位點的參考序列比較，此比較通常在兩序列都被線性優(yōu)化后進行。在該技術(shù)領(lǐng)域中比對序列的線性化方法已廣為人知。比對序列的線性優(yōu)化方法可采用如Smith和Waterman發(fā)表在1981年Adv.Appl.Math.2482上的局部同源性運算法則，Needleman和Wunsch在1970年J.Mol.Biol.48443中報道的同源性優(yōu)化運算法則，Pearson和Lipman在1988年P(guān)roc.Acad.Sci.USA中852444發(fā)表的相似性方法的探尋中的運算法則等，以及這些勻速阿法則的計算機化(在Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，遺傳學(xué)計算機組，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過手工線性化和視覺觀察(參看，分子生物學(xué)中的通用規(guī)程(Ausubel等，eds.1995年，附注))。
在序列同一性百分比的測定中一個合適的首選運算法則為BLAST和BLAST 2.0運算法則，兩種方法分別在1997年的Nuc.Acids Res.253389-3402和1990的J.Mol.Biol.215403-410中被Altschul等人所闡述。BLAST和BLAST 2.0用于測定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列同一性百分比，測定中通常使用本發(fā)明描述的缺省參數(shù)。進行BLAST分析的軟件是由國家生物技術(shù)信息中心提供的公眾可用軟件。該運算法則包括通過鑒定在可疑序列中W長度的短字來第一次確定高分值序列對(HSPs)，當(dāng)用一個數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的短字線性化時，它匹配或滿足某個正估計閾值T。T是作為鄰近字符的分值閾值而言的(Altschul等，見上文)。這些初始的鄰近字符的采樣被作為樣源，從而可開始搜尋包括這些字符的更長的HSP。這些字符樣從每個序列的兩個方向延伸，因為其累積線性的分值是可以增加的。對于核苷酸序列來說，累積的分值用參數(shù)M(一對匹配殘基的正反饋分值；通常＞0)和N(不配對殘基的負(fù)反饋分值；通常＜0)來計算。對于氨基酸序列來說，用一個分值矩陣來計算其累積分值。以下情況出現(xiàn)時字符樣沿兩個方向的延伸停止由X的量來反映的累積線性分值從它能達到的最大值下落時；因為一個或更多負(fù)分值殘基的線性的累加，累積分值下落到零或者負(fù)值時；或者是因為已經(jīng)達到了其中一個序列的末端時。BLAST的算法參數(shù)W，T，和X決定了線性化的靈敏度和速度。BLASTN程序(對核苷酸序列來說)使用的缺省參數(shù)是一個為11的字符長度(W)，一個為10的期望值，M＝5，N＝-4以及兩條鏈的比對。對氨基酸序列來說，使用的缺省參數(shù)是一個為3的字符長度(W)和為10的期望值，以及50的BLOSUM62分值矩陣線性化參數(shù)(B)(參看Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))，10的期望值，M＝5，N＝-4以及兩條鏈的比對。
BLAST運算法則也可用于進行兩序列間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參看范例Karlin&Altschul，1993，Proc.Acad.Sci.USA 905873-5787)。通過BLAST算法進行的一個相似性測量的標(biāo)準(zhǔn)是測定最小加和概率(P(N))，可指示兩核苷酸序列或氨基酸序列之間偶然匹配的概率。比如，在一個被測核苷酸序列和參考核苷酸序列的比對中，如果最小加和概率的可能性小于0.2，更佳的小于0.01，最佳的小于0.001，就認(rèn)為該被測核苷酸序列和參考序列相似。
本發(fā)明中當(dāng)涉及到一個SEQ ID NO參考時，術(shù)語“通過最大相關(guān)性決定”指一個序列運用一種算法時，如帶有缺省參數(shù)的BLAST算法，在參考序列的長度上最大程度地與參考SEQ ID NO一致。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易做此決定。
本發(fā)明中“連接”是既指物理上的連接，也指在生物微粒如噬菌體、細(xì)菌、酵母或其他真核細(xì)胞中共存而發(fā)生的連接。
“物理連接”是指在該領(lǐng)域中已知的連接兩個分子的任何方法(被稱為“物理地連接”)，包括無限制的連接，帶有或不帶有干擾結(jié)構(gòu)域的重組融合，切除肽-介導(dǎo)的融合，非共價鍵結(jié)合，共價鍵結(jié)合(如雙硫鍵結(jié)合和其他共價鍵結(jié)合)，氫鍵結(jié)合；靜電的鍵合連接以及構(gòu)象的鍵合連接，如抗體-抗原，生物素-抗生物素蛋白結(jié)合。
“融合”是指通過共價鍵結(jié)合的連接。
本發(fā)明中“接頭”或“間隔團”是指連接兩個分子如一個熒光連接配體和一個顯示蛋白或核苷酸的一個分子或分子基團，通過把兩個分子放在首選的構(gòu)型上起作用。
本發(fā)明中交替提到的術(shù)語“多肽”，“肽”和“蛋白”指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語可用于描述其中有一個或多個氨基酸殘基是與天然存在的氨基酸相應(yīng)的人造化學(xué)模仿的氨基酸聚合物，也指天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
術(shù)語“氨基酸”是指天然存在和人工合成的氨基酸，也指氨基酸的類似物和在功能上與天然存在的氨基酸相似的氨基酸模仿物。天然存在的氨基酸包括由遺傳密碼子編碼的氨基酸和后來被修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和o-磷酸化絲氨酸。氨基酸類似物是指那些與天然氨基酸有著相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即一個α碳原子與一個氫原子，一個羧基、一個氨基和一個R基團如高絲氨酸，己氨酸，甲硫氨酸亞砜，甲硫氨酸甲基锍等相連。這些類似物擁有修飾的R基團(如己氨酸)或修飾的多肽骨架，但仍保持天然氨基酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模仿物是指結(jié)構(gòu)上與氨基酸的常規(guī)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但功能上與天然氨基酸相似的一類化合物。
本發(fā)明的氨基酸可能是用通常已知的三字母代號或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母代號表示。同樣地，核苷酸也可能用已普遍接受的單字母編碼表示。
熟語“核苷酸”是指脫氧核糖核酸或核糖核酸以及它們單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非特別限制說明，該術(shù)語還包括那些與天然的參考核苷酸有著相似結(jié)合特性的，并在代謝形式上與天然核苷酸相似的天然核苷酸的類似物。除非其他說明，一個特殊的核苷酸序列也包括其保守修飾的變異體(如簡并密碼子取代物)、互補的序列以及明確指明的序列。特別說明的是，簡并密碼子取代物可能通過將一個或多個選定的(或所有的)密碼子的第三個位置的堿基用一個混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代而得到(參看Batzer等，1991，Nucleic Acid Res.195081；Ohtsuka等，1985，J.Biol.Chem.2602605-2608；Cassol等，1992；Rossolini等，1994，Mol.Cell.Probes 891-98)。術(shù)語核苷酸會與基因，cDNA，和基因編碼的mRNA交替使用。
“保守修飾的變異體”既可用于氨基酸序列也可用于核苷酸序列。至于特殊的核苷酸序列，其保守修飾的變異體是指那些編碼相同或基本上相同氨基酸序列的核苷酸，或?qū)τ诨旧舷嗤男蛄胁痪幋a氨基酸序列的核苷酸。由于遺傳密碼子的簡并性，很多功能上相同的核苷酸編碼一個特定的蛋白。比如，密碼子GCA，GCC，GCG和GCU都編碼丙氨酸。這樣，每個由一個特定的密碼子編碼的丙氨酸的地方，密碼子都能轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的不改變被編碼多肽的密碼子。這種核苷酸的變化為“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本發(fā)明編碼一個多肽的每個核苷酸序列也用于描述這個核苷酸的每種可能的沉默變異體。一種技術(shù)能夠辨認(rèn)出一個核苷酸中的每個密碼子(AUG除外，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，以及TGG也除外，它通常是色氨酸的唯一密碼子)能被修飾成一個功能上完全相同的分子。相應(yīng)地，每個編碼一個多肽的核苷酸的沉默變異體都默認(rèn)包括在每個被描述的序列中。
對于氨基酸序列來說，一種技術(shù)能夠辨認(rèn)出一個核酸，肽，多肽或蛋白質(zhì)序列的個別替代，缺失或增加會導(dǎo)致氨基酸被一個化學(xué)上相似的氨基酸替代的“保守修飾的變異體”，這些變化為單個氨基酸或編碼序列氨基酸一小部分的改變，增加或缺失。提供功能上相似氨基酸的保守替代表是這個領(lǐng)域中廣為人知的。這些保守修飾的變異體包括了本發(fā)明的多形態(tài)的變異體、種間同源體和等位基因。
以下八個組每組包含相互保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬酰胺氨酸(D)，谷胱酰胺氨酸(E)；3)天冬氨酸(N)，谷氨酸(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參看Creighton，蛋白質(zhì)(1984))。
像多肽結(jié)構(gòu)這種大分子結(jié)構(gòu)可以用不同的組織水平來描述。關(guān)于這種組織的常規(guī)討論參看Alberts等著，細(xì)胞的分子生物學(xué)(1994年第三版)和Cantor和Schimmel著，生物物理化學(xué)第一部分生物大分子的構(gòu)象(1980)?！耙患壗Y(jié)構(gòu)”是指一個特定多肽的氨基酸序列?！岸壗Y(jié)構(gòu)”是指在一個多肽中局部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是一個多肽的一部分，它能夠形成該多肽的緊密單元，通常長度約為25到500個氨基酸。典型結(jié)構(gòu)域由較小的組織結(jié)構(gòu)如β-折疊和α-螺旋的扭曲所組成?！叭壗Y(jié)構(gòu)”是指一個多肽單體的完整的三維結(jié)構(gòu)。“四級結(jié)構(gòu)”是指由獨立的三級結(jié)構(gòu)單元以非共價鍵的結(jié)合方式形成的三維結(jié)構(gòu)。各向異性項也被稱為能量項。
術(shù)語“分離的”和“純化的”是指能充分地或必要地從一個組分中直接得到的物質(zhì)，該組分通常在天然狀態(tài)下即含有此物質(zhì)。不過，“分離的”并不指在一塊電泳膠或其他分離介質(zhì)中存在的組分。一個分離的組分是與這些分離介質(zhì)脫離的，并將在其他方面應(yīng)用或已經(jīng)在新的環(huán)境應(yīng)用。
脫落熒光和生色蛋白系統(tǒng)本發(fā)明的一個方面是提供可溶的熒光或生色蛋白的自行互補的片段。這些片段并不分別地顯示出熒光或發(fā)色的“報告”表型。當(dāng)物理空間上最接近時，這些片段自發(fā)地進行互補，從而重新組成它們所來源的那個蛋白質(zhì)，重新恢復(fù)報告表型。這種互補片段的集合被定義為“脫落熒光”或“脫落生色”蛋白系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可由GFP，GFP類似熒光蛋白，GFP類似非熒光蛋白和它們的變異體產(chǎn)生，可有效標(biāo)記和檢測活細(xì)胞、細(xì)胞裂解液，或其他體外分析形式中的可溶或不溶蛋白。同時也對本發(fā)明的脫落熒光和脫落生色系統(tǒng)的其他多種不同用途進行了展望。
本發(fā)明的脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)使用簡單，而且不需要用于檢測報告表型的外源試劑。在一些具體實施方式
中，這些片段不會改變與之融合的試驗蛋白的溶解特性。在另一些具體實施方式
中，一個片段可能會擾亂與之融合的試驗蛋白的溶解性，但這樣該片段即可用于蛋白質(zhì)的溶解性篩選。
為舉例說明本發(fā)明的這個方面，一個溶解性增強的GFP(美國專利申請No.10/423,688WO 03/095610)的多個自行互補片段被構(gòu)建，并應(yīng)用于一系列蛋白的檢測、定量分析及純化方法，下文中的例6，9，10有進一步的描述。這些“脫落GFP”蛋白檢測系統(tǒng)展示了可靠的體內(nèi)和體外可溶性、不溶性和/或總蛋白含量的定量檢測(例如，來自活細(xì)胞、未加工的裂解液及在純化和下游處理中的任何樣品中的可溶性表達蛋白)。
任何GFP，GFP類似熒光蛋白，GFP類似生色蛋白均可在本發(fā)明的實際應(yīng)用中使用(參看下文中在副標(biāo)題熒光和生色蛋白下該家族蛋白的描述)。除此之外，本發(fā)明的內(nèi)容可延伸到其他脫落報告蛋白系統(tǒng)的生成，這些系統(tǒng)中使用任何帶有可檢測表型的蛋白，例如β內(nèi)酰胺酶，β半乳糖苷酶((Ullmann，Jacob等.1967；Welply，F(xiàn)owler等.1981；Worrall and Goss 1989；Jappelli，Luzzago等.1992；Rossi，Blakely等.2000；Wigley，Stidham等.2001；Lopes Ferreira and Alix 2002))，二氫葉酸還原酶(Gegg，Bowers等.1997；lwakura和Nakamura 1998；Pelletier，Campbell-Valois等.1998；Pelletier，Arndt等.1999；Nakamura等.2000；Smith andMatthews 2001；Arai，Maki等.2003)，以及抗氯霉素蛋白。
脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)可以實現(xiàn)許多蛋白的檢測和定量化分析。相比常規(guī)的蛋白檢測和定量化技術(shù)，如SDS-聚丙烯酰胺凝膠，dot-blots以及類似的方法均耗時且難以自動化，該系統(tǒng)的分析具有更大的優(yōu)點。。例如，用本發(fā)明的脫落GFP系統(tǒng)進行的蛋白檢測和定量具有高靈敏度，可用于活細(xì)胞中或未加工的細(xì)胞裂解液中的蛋白檢測(參看下文范例9和10)。另外，此分析系統(tǒng)耐用性好(如對變性劑、pH條件和輔助劑的耐受度，見下文例8)，容許將展開的沉淀進行蛋白定量，因此提供了一種總體蛋白表達量的定量方法和一種在篩選蛋白重折疊劑中評估可溶蛋白復(fù)原的方法。
以下簡要舉例說明本發(fā)明的脫落熒光蛋白系統(tǒng)的設(shè)計。該蛋白檢測系統(tǒng)的設(shè)計包括該領(lǐng)域技術(shù)人員所知的相同的步驟和原理。第一，目為了確定生成單獨片段的合適切割位點，目標(biāo)熒光蛋白被進行結(jié)構(gòu)分析。該領(lǐng)域的技術(shù)人員都明白，這可通過在與GFP晶體結(jié)構(gòu)或其他熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)重疊或不重疊的情況下，參考該熒光蛋白的已知晶體結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)，也可通過與GFP一級序列線性化來實現(xiàn)，還可通過預(yù)測性的結(jié)構(gòu)建模(參考一個已知的熒光蛋白結(jié)構(gòu)，如GFP)等來實現(xiàn)。
合適的剪切(或“分裂”)位點存在于β-折疊，特別是成環(huán)和旋轉(zhuǎn)模體的序列中(見圖3A，3B)。在一個簡單的兩片段系統(tǒng)設(shè)計中，一個熒光蛋白可在連續(xù)的β-鏈中(比如在β-鏈的成環(huán)和旋轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)中)的分子內(nèi)的任何位點被裂分成兩個片段，從而生成一個相應(yīng)于連續(xù)的β-鏈第一部分的第一個片段和相應(yīng)于連續(xù)的β-鏈第二部分的第二個片段。兩個片段結(jié)合部分包含β-鏈所有的互補。例如，可將熒光蛋白裂分為對應(yīng)于鏈1-9和10-11的片段或?qū)?yīng)于鏈1-10和11的片段。在片段結(jié)合后，熒光(或發(fā)色)蛋白的所有的11條β-鏈都存在。需要注意的是，也可通過將原有的N末端和C末端連起來并引入新的起始和終止密碼子也可以創(chuàng)建一個熒光蛋白的環(huán)形突變體，然后根據(jù)相應(yīng)的連續(xù)的β-鏈進行片段剪接(如相應(yīng)裂分為環(huán)形突變體的前體鏈9-1和2-8的片段)(圖3C)?？煞滦У膬善蚊撀銰FP系統(tǒng)在實施例2，11，13中進行了描述。
同樣的，如當(dāng)這個熒光蛋白被相應(yīng)的剪接為β-鏈1-9，10和11片段時，就產(chǎn)生了一個三片段系統(tǒng)。可仿效的三片段脫落GFP系統(tǒng)在實施例12中進行了描述。
一旦完成片段設(shè)計，即可運用該領(lǐng)域公知的克隆方法構(gòu)建編碼這些片段的核苷酸(如參見實施例1和實施例2)。
另一種可選擇的方法則以互補性的經(jīng)驗為主來評估相同或相關(guān)熒光蛋白的不同片段。如實施例2中所描述的，幾對GFP片段能在可共存于大腸桿菌的質(zhì)粒中共表達，并用于互補性和相對熒光的評估。該方法可實現(xiàn)對來自一組熒光蛋白變異體進行有希望片段的初始快速篩選(參看實施例2中的超折疊GFP和環(huán)3GFP)。接著，篩選得到的單個片段可在增加溶解性和削弱試驗蛋白的溶解性擾動方面做進一步改進(參看下文中副標(biāo)題脫落蛋白片段設(shè)計和實施例3，4)。
使用本發(fā)明的脫落熒光或生色蛋白系統(tǒng)檢測蛋白需遵循以下應(yīng)用原則。簡要地說，該熒光(或生色)蛋白的一個片段(“標(biāo)簽”片段)要與試驗蛋白融合表達。如果試驗蛋白是可溶的，那么融合蛋白也可溶，于是可與該報告蛋白的其他片段(“檢測”片段)進行互補。通過如在相同細(xì)胞中表達此檢測片段，或在表達融合蛋白的細(xì)胞溶解液中加入此檢測片段等方式來實現(xiàn)該試驗蛋白和標(biāo)簽片段的融合蛋白的檢測。相反地，如果試驗蛋白不可溶，或僅僅部分可溶，這些試驗蛋白將會聚集，從而把被融合的標(biāo)簽片段“包埋”起來，使得試驗蛋白和標(biāo)簽片段的融合蛋白不可溶并且不能與檢測片段互補。如果互補發(fā)生，就會激活可檢測到的報告表型。比如，當(dāng)用一個熒光蛋白作為報告蛋白時，單獨表達片段的自行互補會重建特有的β-管式結(jié)構(gòu)，形成發(fā)色團，發(fā)出可檢測到的熒光。圖2顯示了一個脫落GFP系統(tǒng)怎樣運作的示意圖。
脫落熒光蛋白片段可以在應(yīng)用的特殊分析環(huán)境中折疊和溶解。在優(yōu)選的具體實施方式
中，檢測并改進這些單獨片段的折疊性/溶解性，以分離出一個可溶的“標(biāo)簽”片段和一個可溶的“檢測”片段。在優(yōu)選的溶解性檢測應(yīng)用中，標(biāo)簽片段在β1和3鏈之間，在最優(yōu)選的應(yīng)用中，標(biāo)簽片段為一個單獨的β鏈。然后試驗蛋白與標(biāo)簽片段融合，而在與試驗蛋白融合時，標(biāo)簽片段最好是完全不干擾試驗蛋白。即，單獨存在的試驗蛋白的溶解性和折疊性應(yīng)當(dāng)和與標(biāo)簽片段融合的試驗蛋白的溶解性和折疊性相似。
基于應(yīng)用脫落GFP系統(tǒng)(參看實施例2)的實驗結(jié)果，溶解性檢測中的最優(yōu)化形式是通過應(yīng)用一個相對大的檢測片段(例如約8-10個連續(xù)β鏈)和一個相對小的能與試驗蛋白融合的標(biāo)簽片斷(例如約1-3個連續(xù)β鏈)獲得，其中，檢測片段是可溶的，且可與標(biāo)簽片段-試驗蛋白融合蛋白互補，并且標(biāo)簽片段不干擾試驗蛋白的溶解性。對于多數(shù)應(yīng)用的理想情況是，試驗蛋白單獨存在時的溶解性和與標(biāo)簽片段融合后試驗蛋白的溶解性大致相同。檢測片段最好是單節(jié)顯性的，且不會自發(fā)聚集或發(fā)生錯誤折疊。
盡管在很多應(yīng)用中，優(yōu)選使用不干擾試驗蛋白的標(biāo)簽片段，但倘若熒光量和溶解性之間存在固定的比例關(guān)系(不必是直接的比例關(guān)系)，標(biāo)簽片段不過是影響試驗蛋白溶解性，它在溶解性篩選分析中仍可使用。在一些具體實施方式
中，使用一個或多個干擾性的標(biāo)簽片段實際上是需要的(參看下文中三明治-形式檢測的闡述)，例如為篩選高溶解性的蛋白質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)用干擾性標(biāo)記片段可在所有蛋白中有效地選出溶解性最好的蛋白或翻譯產(chǎn)物。此外，這些應(yīng)用中的檢測片段應(yīng)是可溶的，因為不溶的翻譯產(chǎn)物將不能與可溶的試驗蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白互補。
本發(fā)明還提供了熒光蛋白片段最優(yōu)化處理的改進方法，在下文脫落蛋白片段設(shè)計中有闡述，并在實施例3和4中進行了舉例說明。這些方法也可同樣地應(yīng)用于生色蛋白，以及帶有可檢測表型的任何蛋白，以生成具有本發(fā)明所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)特性的脫落蛋白系統(tǒng)。
當(dāng)使用本發(fā)明的脫落熒光蛋白和脫落生色蛋白系統(tǒng)時，可運用多種檢測分析形式來檢測和定量蛋白。下文進一步闡述了一些用于蛋白檢測和定量的典型分析。此外，下面實施例部分已對大部分檢測分析作了實驗證明。
本發(fā)明的脫落熒光蛋白和脫落生色蛋白系統(tǒng)在蛋白溶解性篩選，蛋白檢測和定量，蛋白純化，蛋白的折疊和聚集，提高蛋白溶解性和產(chǎn)量的人工定向進化方法等方面中有多種應(yīng)用?，F(xiàn)在簡要地描述一下這些應(yīng)用，在下面的實施例部分也能找到這些應(yīng)用的實施例。
蛋白質(zhì)檢測及定量分析本發(fā)明的脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)可以用來在體內(nèi)或體外檢測和定量蛋白，下面的實施例對此進行了詳細(xì)的描述。在本發(fā)明的這一方面，提供可溶的或不可溶的蛋白的檢測分析，以及提供可溶的、不可溶的或總的蛋白表達的定量分析。在檢測和定量分析中，使用上文描述的脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)。下文將概述作為本發(fā)明一方面的利用脫落熒光系統(tǒng)的各種具體實施方式
。然而，應(yīng)當(dāng)理解為類似的具體實施方式
同樣存在于脫落生色蛋白系統(tǒng)中。
體外檢測分析在一個具體實施方式
中，提供了一個檢測可溶解蛋白的快速體外分析，其包括裂解細(xì)菌(或其它)細(xì)胞，該細(xì)胞表達第一個熒光蛋白標(biāo)簽片段和試驗蛋白X(例如X-GFPS11或GFP S11-X)的融合蛋白，其將裂解產(chǎn)物與第二互補熒光蛋白質(zhì)檢測片段接觸，并篩選可檢測的熒光。分析中可檢測熒光的存在顯示試驗蛋白是可溶的。該檢測系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)服從能高通過量地從變異體文庫中篩選一個蛋白質(zhì)的可溶解變異體，且能快速辨認(rèn)那些顯示改良的溶解性特征的變異體，允許快速辨別最優(yōu)化特征，該優(yōu)化特征可以被進一步改進。如下文實施例9中所述，該檢測分析可以直接在液體細(xì)胞培養(yǎng)物的天然裂解產(chǎn)物中進行。
下面將簡要描述利用一個兩片段脫落GFP系統(tǒng)在體外檢測可溶解蛋白。試驗蛋白被融合于GFP標(biāo)簽片段(例如，X-GFP S11)的N末端，且在大腸桿菌中表達，細(xì)胞裂解后的過量的互補GFP檢測片段(如GFP 1-10)與裂解產(chǎn)物或裂解產(chǎn)物的樣品結(jié)合。可檢測的熒光表明檢測片段和試驗蛋白與標(biāo)簽片段的融合蛋白之間的互補，從而顯示試驗蛋白是可溶解的。此外，如果所用標(biāo)簽片段沒有干擾試驗蛋白的溶解性，那么所獲熒光信號的強度對于可溶解試驗蛋白的數(shù)量是直接成比例的。因此，在本系統(tǒng)中，熒光的程度提供了裂解產(chǎn)物樣品中的可溶解試驗蛋白的精確定量(參考校準(zhǔn)的蛋白數(shù)量曲線，見下文實施例6)。確實，甚至如果標(biāo)簽片段干擾了試驗蛋白的溶解性，那么試驗蛋白量和熒光強度之間成比例關(guān)系。完全或?qū)嵸|(zhì)上沒有可檢測的熒光表明標(biāo)簽片段與試驗蛋白的融合蛋白是不可溶的，或者實質(zhì)上是不可溶的，因此不能與可溶的大片段互補，從而表明試驗蛋白本身在大腸桿菌中是不可溶的。
在所述的脫落-GFP系統(tǒng)中，試驗蛋白的溶解性決定融合蛋白的標(biāo)簽GFP片段成分是否能與其補體結(jié)合。如果試驗蛋白能正確折疊且是可溶解的，那么融合蛋白也是可溶解的，從而能與可溶的試驗片段互補。然而，如果試驗蛋白是不可溶的，它會聚集起來，遮蔽或包埋標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域，造成融合蛋白不可溶解。通常，試驗蛋白與標(biāo)簽片段(試驗蛋白-標(biāo)簽)的N末端融合。C末端融合蛋白(標(biāo)簽-試驗蛋白)也可以被使用，但在此應(yīng)用中，標(biāo)簽片段更有可能會反過來影響試驗蛋白的折疊。然而，在期望僅僅篩選那些溶解性強的蛋白的應(yīng)用中，利用C末端融合蛋白(標(biāo)簽-試驗蛋白)就可以僅僅選擇那些溶解性最高的蛋白。
不同的三片段系統(tǒng)也能被預(yù)見。在一個具體實施方式
中，GFP被剪接成3個片段，典型地作為一個更大的檢測片段和二個更小的標(biāo)簽片段。試驗蛋白被插入到二個標(biāo)簽片段(如S10-X-S11)之間的讀碼框中，且如果試驗蛋白是可溶的，與檢測片段(在本例中，GFP1-9)的互補會重新建立GFP熒光。三片段系統(tǒng)(如S1-9+S10-X-S11脫落GFP系統(tǒng))進一步在名為設(shè)計一種(GFP S10)-X-(GFP S11)三明治標(biāo)簽形式和利用檢測片段GFP 1-9 OPT進行檢測這些分部中得到闡述，見下文中實施例12。這些″三明治″類型的可溶解蛋白檢測分析形式在某些應(yīng)用中有優(yōu)勢，例如篩選變異蛋白質(zhì)文庫得到更高可溶解的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。三明治形式確保僅有的那些全長和完整無缺的試驗蛋白被檢測。讀碼框移位或通過突變作用引入試驗蛋白的內(nèi)部核糖體連接位點不會造成完全融合的S10-X-S11，這樣互補就不會發(fā)生。因此，在人工定向進化方法中使用該系統(tǒng)能有效地篩選出這些異常的克隆。
體內(nèi)蛋白質(zhì)檢測分析相關(guān)的，體內(nèi)具體實施方式
中，細(xì)胞被設(shè)計用來表達兩個(或所有)互補片段，其中的一個或兩個片段被融合到試驗蛋白。該片段可以被同時或順序表達，這依賴試驗的目的是否是檢測(和定量)總蛋白表達或僅僅可溶的和/或不可溶的部分。一般優(yōu)選兩個片段的順序表達；因為共同表達可能會掩飾不溶性試驗蛋白(見上文)。試驗蛋白與標(biāo)簽片段的融合蛋白順序表達(或添加)之后，緊接著是互補檢測片段的表達，其提供時間讓不溶的試驗蛋白與標(biāo)簽片斷的融合蛋白聚集并防止互補。
更明確地，舉個例子，試驗蛋白的編碼序列融合到報告蛋白的自行互補片段的可溶性第一標(biāo)簽片段的讀碼框(5’-＞3’)內(nèi)，然后放置于第一個獨立誘導(dǎo)啟動子的控制下。自行互補片段的可溶性第二檢測片段的編碼序列放置于第二個獨立誘導(dǎo)啟動子的調(diào)控下。這兩個目的核酸結(jié)構(gòu)可以合并到相同或不同的載體(如一個或兩個質(zhì)粒)，假如啟動子保持獨立誘導(dǎo)，宿主細(xì)胞同載體一起被轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)染。攜帶結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞最初在基本條件下進行培養(yǎng)，從而能抑制這兩個獨立誘導(dǎo)啟動子。然后細(xì)胞在一段充分可以表達融合蛋白的時間內(nèi)(如在大腸桿菌中，典型的大約0.5-3.5小時)被誘導(dǎo)表達試驗蛋白與標(biāo)簽片段的融合蛋白，之后一段“休止”期內(nèi)(大腸桿菌中大約0.5-1.5小時)誘導(dǎo)試劑擴散出細(xì)胞(或在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，通過主動抑制啟動子，如用反義多核苷酸來切斷啟動子)。然后細(xì)胞被誘導(dǎo)表達檢測片段，在大腸桿菌中典型的約0.5-4小時。一種對哺乳動物可選擇的實施方式是，在“休止”期之后或在主動抑制第一誘導(dǎo)啟動子之后利用蛋白轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)檢測片段蛋白(見下文)。
兩個獨立的可控制的啟動子系統(tǒng)已被描述，且其在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的。例如，Lutz和Bujard，1997，在大腸肝菌中通過lacR/O，TetR/O和AraC/11-12調(diào)控要素獨立嚴(yán)格的調(diào)控轉(zhuǎn)錄單元，核酸研究.25(6)1203-1210)。
在一個實施例中，啟動子位于Laclq蛋白和樹膠醛糖誘導(dǎo)物/阻抑物的抑制下的載體可以被用來表達檢測片段(如從Clontech，Palo Alto，CA得到的pPROLAR載體)。通過供給生長媒介以IPTG和樹膠醛糖能減輕抑制，造成克隆檢測片段的表達。在該系統(tǒng)中，宿主大腸桿菌細(xì)胞的遺傳背景提供了araC阻抑物。為了試驗蛋白-標(biāo)簽融合蛋白結(jié)構(gòu)的可控表達，采用一個在它內(nèi)部這種結(jié)構(gòu)受四環(huán)素阻抑物蛋白的抑制的載體(如pPROTET載體；Clontech)。在該系統(tǒng)中，通過供給脫水四環(huán)素到生長媒介從而減輕抑制，造成試驗蛋白-標(biāo)簽的融合蛋白構(gòu)體的表達。tetR和Laclq阻抑物蛋白可以被提供給第三載體，或可以結(jié)合于攜帶片段的載體(見下文實施例1)。
將上述系統(tǒng)用于試驗蛋白-標(biāo)簽融合蛋白和之后檢測片段的順序表達，將脫水四環(huán)素添加到同上述構(gòu)體一起轉(zhuǎn)變的細(xì)胞中，該添加取代了tet阻抑物，且試驗蛋白-標(biāo)簽融合蛋白的表達被誘導(dǎo)。然后細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到帶有新鮮介質(zhì)的新培養(yǎng)皿上，經(jīng)過大約1小時使脫水四環(huán)素擴散到媒介中，這之后tet阻抑物再次結(jié)合到啟動子，關(guān)閉表達。然后，通過添加IPTG，獨立誘導(dǎo)的T7啟動子被激活，誘導(dǎo)檢測片段的表達。檢測片段的表達經(jīng)歷了一段充分的時間使其與可溶性第一片段-試驗蛋白的融合蛋白自行互補。熒光檢測(或顏色，在此使用脫落生色蛋白系統(tǒng))檢測出可溶性試驗蛋白-標(biāo)簽融合蛋白。見下文實施例4。
體內(nèi)溶解性檢測對于高產(chǎn)量篩選是有責(zé)任的，作為表達試驗蛋白變異體的大量細(xì)胞，其與標(biāo)簽片段融合，能通過在細(xì)胞內(nèi)表達的檢測片段或提供給細(xì)胞的檢測片段的互補產(chǎn)生的熒光來檢測溶解性。細(xì)胞分選可以被用來分離那些顯示可檢測熒光的細(xì)胞，因此從那些沒有顯示可檢測熒光或僅顯示微弱熒光的細(xì)胞中表達試驗蛋白的可溶解變異體。
體內(nèi)溶解性檢測優(yōu)選的例子是個體片段被順序表達，如表達試驗蛋白-標(biāo)簽片段的融合蛋白和之后的報告蛋白自行互補片段的表達。順序表達允許不溶性試驗蛋白聚合，從而使得該報告片段無法與其它報告片段互補。因此，通常為了本發(fā)明體內(nèi)溶解性檢測的應(yīng)用，試驗蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白的表達應(yīng)當(dāng)先于自行互補片段的表達一段充分的時間使不溶性融合蛋白聚集。在一些具體實施方式
中(如使用哺乳動物細(xì)胞)，在融合蛋白被表達后試驗蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白的表達被關(guān)閉，然后自行互補片段的表達被激活。按照這種方式，最精確的檢測被實施。相反，兩個報告片段-試驗蛋白融合蛋白與自行互補片段的共同表達可以折衷溶解性檢測結(jié)果，因為其允許在表達后立刻出現(xiàn)其它不溶性試驗蛋白的短暫溶解性，因此允許自行互補。
蛋白定量分析以上兩個溶解性檢測分析可以擴展到試驗蛋白的定量，尤其是可溶解部分，不可溶解部分和總蛋白表達的定量。例如，在一個可溶解和不可溶解蛋白部分的體外定量分析中，表達試驗蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白(如x-GFP s11)的細(xì)胞被裂解，不可溶解的部分被沉淀。然后，包含可溶解部分的上清液同互補檢測片段(如在包含互補片段的一系列微型滴定板孔中)混合，熒光被監(jiān)控。可選擇地，監(jiān)測片段可以被添加到裂解產(chǎn)物，然后添加到反應(yīng)容器。熒光度與可溶解的蛋白數(shù)量是直接成比例的，可溶解的蛋白數(shù)量可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)刻度曲線(下文實施例6所述)決定。通過變性和再次折疊沉淀的蛋白以及通過將該準(zhǔn)備與互補檢測片段結(jié)合，不可溶解的蛋白部分被定量。該方法換一種方式，總蛋白表達被測量且與可溶解物的數(shù)量比較用來確定不可溶解的數(shù)量。在相關(guān)的實施方式中，通過展開的互補片段的共同再次折疊，總蛋白數(shù)量(可溶解或不可溶解)可以在體外被定量。
在一個相關(guān)的實施方式中，通過試驗蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白和互補片段的共同表達，總蛋白數(shù)量(可溶解或不可溶解)可以在體內(nèi)被測試。熒光度與總蛋白的數(shù)量是成比例的。見下文實施例9。
三明治形式的脫落熒光蛋白系統(tǒng)報告熒光和生色蛋白可以被剪接成三個(或更多)個體片段，該片段能自行互補而形成重組的報告蛋白。在一個三明治形式蛋白檢測分析的實施方式中，熒光或生色蛋白的兩個標(biāo)簽片段被融合于試驗蛋白，其和片段一起能與第三片段互補而重組熒光表型或生色表型。例如，試驗蛋白可以被插入在兩個相鄰的GFPβ鏈之間，如GFPS10-x-GFP S11。通過與GFP1-9的可檢測互補，可溶性蛋白檢測被完成。在本實施方式中，三個片段的互補確定試驗蛋白是可溶解的，而且是全長，顯示融合于X的GFP兩個片段與X官能上連接。尤其在人工定向進化方法的上下文中，該方法提供確保試驗蛋白x實際上是全長并完整無缺(反之，X-GFP S11僅互補GFP 1-10，而非GFP 1-9)的優(yōu)勢，并預(yù)防截短的試驗蛋白，或具體表現(xiàn)為內(nèi)在核糖體結(jié)合位點的試驗蛋白，或經(jīng)蛋白質(zhì)水解的試驗蛋白的出現(xiàn)。
相關(guān)的嚴(yán)格的可溶解性檢測實施方式利用融合于一個試驗蛋白的兩個標(biāo)簽片段，其中通過功能性地與獨立的可區(qū)別的第三互補檢測片段重組，每個片段可以被獨立地檢測。更明確的，例如，在GFPS10-x-GFP S11的融合蛋白中，通過環(huán)形突變體GFP11-9δ10(環(huán)形突變體11-1-2-3-4-5-6-7-8-9，在這里11和1被連接在一起，10不見了，數(shù)字指鏈，見圖3)鏈10是可檢測的，反之，通過1-10δ11(1-2-3-4-5-6-7-8-9-10，在這里11不見了)鏈11是可檢測的。利用在一個或兩個互補對中GFP的色彩變化變異體(如GFP11-9δ10可以是藍綠色變異體(Y66W)，而GFP1-10δ11可以是黃色變異體(T203Y))，可以推動兩個標(biāo)簽獨立地同時檢測?？蛇x擇地，標(biāo)簽片段可以來自有獨特氨基酸序列的熒光蛋白，且和適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)檢測片段一起被檢測。例如，來自GFP的鏈11能被用來標(biāo)簽試驗蛋白X的N末端，也能和GFP的鏈1-10一起被檢測，然而來自紅色熒光蛋白DsRed(Matz et 1999，Nat.iotechnol.17969-973)的鏈11可以同時被使用作為相同試驗蛋白X的C末端的融合蛋白，且和DsRed的鏈1-10一同被檢測。
一個可選擇的實施方式利用FRET，其在兩個重組的與試驗蛋白連接的GFP之間被顯示。例如，CFP 11-9δ10::10-X-11::YFP 1-10可以被利用。這樣一種構(gòu)體與CFP-x-YFP在官能上是相同的，只要X是完整無缺的，預(yù)先顯示從CFP原料物質(zhì)到Y(jié)FP接受體的FRET，如果X是裂開的，則放松FRET，使CFP和YFP從接近的狀態(tài)下自由，F(xiàn)RET的效率依賴(1/r6)，在這里r是原料物質(zhì)和接受體之間的距離。
原核和真核細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用本發(fā)明的脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)可以應(yīng)用在實質(zhì)上的任何細(xì)胞類型，非限制地包括細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)和哺乳動物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)。有一個限制是GFP和GFP類似蛋白的表達必須在高酸性的環(huán)境下(如pH＝4.0或更小)。同樣地，在pH為6.5或更低的條件下，通?；パa率是低效率的(見下文實施例8)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員欣賞的是，用于表達標(biāo)簽和/或檢測片段的載體必須與寄居于載體的宿主細(xì)胞相兼容。同樣的，多樣的啟動子系統(tǒng)是可獲得的，且應(yīng)選擇和細(xì)胞類型、菌株等相兼容的啟動子系統(tǒng)。眾所周知，密碼子的最優(yōu)化技術(shù)可以被用來適應(yīng)那些在其它細(xì)胞中使用的序列。
當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞作為本發(fā)明的互補檢測時，對于密碼子最優(yōu)化的選擇是利用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑，如最近描述的“chariot”系統(tǒng)(Morris et 2001，轉(zhuǎn)移生物活性蛋白到哺乳動物細(xì)胞的肽載體，自然生物191173-1176)。該chariotTM試劑可以被用來直接轉(zhuǎn)染蛋白到哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。因此，這種方法對于體內(nèi)蛋白檢測分析是有用的，其中通過細(xì)胞在表達遺傳編碼的試驗蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白的之前或者之后，檢測片段可以被引入細(xì)胞。
溶解性增強的蛋白變異體的分離方法上文描述的蛋白溶解性檢測可以被用來與人工定向進化方法結(jié)合從而分離出相對于親本沒有進化過的蛋白而言增強了溶解性的蛋白變異體。
本技術(shù)領(lǐng)域公知的一種產(chǎn)生突變蛋白變異體文庫的方法可以被用來產(chǎn)生候選的試驗蛋白，該蛋白可以作為標(biāo)簽片段的融合蛋白而被表達。通常通過突變核酸會使目標(biāo)蛋白或多肽被突變。在本技術(shù)領(lǐng)域突變的技術(shù)是公知的。這些技術(shù)包括易錯PCR，化學(xué)突變，暗盒突變，但不限于此?？蛇x擇的，宿主細(xì)胞的突變菌株可以被用來增加突變頻率(Greener和Callahan(1995)策略分子生物學(xué)732)。例如，易錯性PCR(見上文如Ausubel)使用低精確度的聚合條件在一個長序列的任意位置上隨機引入低水平的點突變。其它突變的方法包括，例如，重組(WO98/42727)；寡核苷酸定向的突變(見Smith發(fā)表于遺傳學(xué)研究年報19423-462(1985)上的的評論；Botsteinand Shortie，科學(xué)2291193-1201(1985)；Carter，生物化學(xué)期刊2371-7(1986)；Kunkel，“寡核苷酸定向突變的效率”，在核酸和分子生物，Eckstein and Lilley，eds，Springer Verlag，Berlin(1987)，酶學(xué)方法100468-500(1983)，和酶學(xué)方法154329-350(1987))；磷脂酸化物修飾的DNA突變(Taylor等，核酸研究.138749-8764(1985)；Taylor等，核酸研究.138765-8787(1985)；Nakamaye and Eckstein，核酸研究.149679-9698(1986)；Sayers等，核酸研究.16791-802(1988)；Sayers等，核酸研究.16803-814(1988))，使用含有尿嘧啶的模板的突變(Kunkel，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 82488-492(1985)和Kunkel等，酶學(xué)方法154367-382，1987)；使用有缺口的雙DNA的突變(Kramer等，核酸研究.129441-9456(1984)；Kramer and Fritz，酶學(xué)方法，154350-367(1987)；Kramer等，核酸研究.167207(1988))；Frita等，核酸研究.166987-6999(1988))。附加的方法包括點錯配修復(fù)(Kramer等，細(xì)胞38879-887(1984))，使用修復(fù)不足宿主鏈的突變(Carter等，核酸研究.134431-4443(1985)；Carter，酶學(xué)方法154382-403(1987))，刪除突變(Eghtedarzadeh and Henikoff，核酸研究.145115(1986))，限制選擇和限制純化(Wells等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423(1986))，通過總遺傳合成的突變(Nambiar等，自然科學(xué)2231299-1301(1984)；Sakamar and Khorana，核酸研究.146361-6372(1988)；Wells等，基因34315-323(1985)；和Grundstrom等，核酸研究.133305-3316(1985)。突變試劑盒在商業(yè)上是提供的(如Bio-Rad，Amersham International)。更多最近的方法包括基于密碼子的突變，在該方法中整個密碼子被取代，從而增加了產(chǎn)生的突變體的多樣性，例如，在Murakami等2002在自然生物技術(shù)，2076-81雜志中描述的RID方法。
在細(xì)菌表達系統(tǒng)中，利用上文描述的體內(nèi)或體外檢測，表達變異體的克隆根據(jù)溶解度被快速篩選。因此，在一個體內(nèi)實施方式中，在大腸桿菌中產(chǎn)生克隆文庫，在第一個獨立的可誘導(dǎo)啟動子的控制下，每個克隆都隱藏了編碼與標(biāo)簽片段相融合的單個變異體蛋白的表達結(jié)構(gòu)。在第二個分離的可誘導(dǎo)啟動子或者檢測片段多肽本身的控制下，細(xì)胞通常可以隱藏編碼互補檢測片段的一個可表達構(gòu)體(引自蛋白轉(zhuǎn)染方法如上文所述的Morris等2001)。
在一個體內(nèi)實施例中，細(xì)胞被誘導(dǎo)用來表達標(biāo)簽片段-蛋白變異體融合蛋白，從而表達細(xì)胞中互補片段。在大多數(shù)優(yōu)選的實施方式中，融合蛋白的表達被抑制或關(guān)閉一段時間足以使不溶性融合蛋白聚合(如1小時，見下文實施例4和實施例10)，之后互補片段表達被誘導(dǎo)。在本方法的另一種變化方式中，細(xì)胞僅隱藏融合蛋白構(gòu)體，優(yōu)選在可誘導(dǎo)/可抑制啟動子的控制下，通過蛋白轉(zhuǎn)染方法引入互補片段。
不同的體外實驗是可能的。一般，這些包含如在大腸桿菌內(nèi)的突變蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白的表達，之后細(xì)胞裂解并且與互補檢測片段多肽進行反應(yīng)。
蛋白純化本發(fā)明的另一方面是利用脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)純化蛋白，該蛋白在上文的溶解性檢測中被確定為可溶解的。簡單地，標(biāo)簽片段被修飾包含一部分或氨基酸殘余物，其使標(biāo)簽被分配結(jié)合到底物上，利用標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)可以進行分離。在一個實施方式中，標(biāo)簽多肽利用公知且商業(yè)可用的化學(xué)(如，分子探針公司)被分配結(jié)合到玻璃珠上。可選擇的，如下文實施例13所述，標(biāo)簽片段被修飾并結(jié)合到組氨酸殘基，從而分配該標(biāo)簽結(jié)合到金屬親和樹脂珠。在一個特殊的實施方式中，GFP S11片段被設(shè)計出來以使在β-鏈外圍的指示殘余物被組氨酸殘余物取代。該HIS-標(biāo)簽片段沒有擾亂融合的試驗蛋白，于是能夠檢測與GFP 1-10檢測片段互補的可溶解蛋白(實施例13)。該HIS-標(biāo)簽片段可以被用來純化鈷類滴柱中的蛋白，不僅能使可溶解和不可溶解的蛋白定量，且不需要其它純化標(biāo)簽系統(tǒng)就能純化并洗提蛋白至95％的純度。見下文實施例13-17。
預(yù)先互補相對于那些生色團環(huán)化過程從未在其中發(fā)生過得片段，通過利用GFP片段內(nèi)預(yù)先形成的帶有相當(dāng)生色氨基酸的生色團，能夠使在GFP片段的互補過程中熒光形成的速率得到巨增。簡單的，一個非熒光的預(yù)先互補的帶有生色氨基酸的GFP片段可以通過以下方式形成(1)將片段與不包含生色氨基酸的互補片段混合；(2)完成熒光的互補反應(yīng)和形成；(3)伸展片段，如通過化學(xué)方法產(chǎn)生展開的非熒光GFP片段；(4)恢復(fù)含有生色氨基酸的片段且將其與其它片段分離；(5)使顯示生色氨基酸的片段恢復(fù)原來屬性。該片段實質(zhì)上保持非熒光性，即使其包含環(huán)化生色團，因為其實質(zhì)上已經(jīng)通過化學(xué)或其它方法被展開以至于成為非熒光，當(dāng)缺乏互補片段時，其仍保持展開的。在沒有產(chǎn)生與生色團共價修飾的情況下，僅僅通過再次增加互補、不包含生色團的GFP片段，可以獲得熒光的快速恢復(fù)。通過這種方法，由于緩慢的生色體環(huán)化反應(yīng)是完全的，互補中熒光的形成僅受互補片段結(jié)合速度及折疊β-管本身結(jié)構(gòu)形成的限制。
脫落蛋白片段設(shè)計分離可溶性自行互補片段的人工定向進化方法本發(fā)明的另一方面涉及通過人工定向進化方法和片段的連續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)生理想的脫落蛋白中間體的方法。連續(xù)誘導(dǎo)的結(jié)合與現(xiàn)有出版的方法相比，詳細(xì)說明了脫落片段的聯(lián)合誘導(dǎo)。簡單地，在連續(xù)誘導(dǎo)方法中，片段1不變，片段2進化。當(dāng)片段1不變，片段2進化時，片段2首先被表達，然后表達被關(guān)閉。片段被允許聚合或保持可溶解。接著，片段1被表達。如果兩個片段被同時表達，會導(dǎo)致假陽性，因為互補可以在聚合之前發(fā)生。連續(xù)表達可以選擇真陽性，如可溶解的變異體。在最適宜的片段2變異體選擇之后，該變異體保持不變，然后片段1進化。當(dāng)利用進一步連續(xù)誘導(dǎo)時，這個過程可以被持續(xù)至得到想要的片段溶解度。利用該方法，目標(biāo)片段可以在互補前被設(shè)計成本身是可溶解的。
削弱溶解度對可檢測蛋白的干擾可溶解片段可以被進一步設(shè)計用來減小對融合過客區(qū)域(試驗蛋白)的溶解性的干擾影響。簡單的，一種當(dāng)與片段融合時相對于單獨表達時溶解度較低的試驗蛋白在人工定向進化方法中被用作為誘餌結(jié)構(gòu)域，用來設(shè)計一種片段，這樣融合蛋白與非融合蛋白的溶解性是相似的，可以減輕該片段對試驗蛋白溶解性的影響。該方法在最優(yōu)化GFP的一個短小片段中被使用，導(dǎo)致產(chǎn)生一種削弱融合過客蛋白干擾影響的變異體(見下文實施例4)。
試劑盒本發(fā)明的另一方面提供脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)試劑盒，該試劑盒用于上文所述的各種檢測中。本發(fā)明的試劑盒可以使本發(fā)明的脫落熒光和脫落生色系統(tǒng)的使用更方便。實施本發(fā)明試驗的各種材料和試劑可以被提供。試劑盒可以包括不受限制的試劑，多肽或多核苷酸，細(xì)胞轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)染試劑，純化多肽的試劑和材料，恢復(fù)本身屬性的蛋白和再次折疊的試劑，還有在本發(fā)明的試驗和其它方法中使用的其它溶液或緩沖液。試劑盒也可以包括控制樣品，用于校準(zhǔn)本發(fā)明試驗的材料，及容器、試管、微型滴定盤等類似物，其中檢測反應(yīng)可以被操作。試劑盒可以在容器中被打包，其可以包含接受試劑盒內(nèi)容的隔間，操作試驗的說明等。
例如，試劑盒可以提供本發(fā)明的一個或更多的脫落熒光蛋白片段，編碼一個或更多熒光蛋白片段的一個或更多多核苷酸載體，適宜繁殖載體的細(xì)菌細(xì)胞菌株，預(yù)先轉(zhuǎn)換的細(xì)胞或與編碼一個或多個熒光蛋白片段的構(gòu)體進行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，及用于表達的融合蛋白的純化試劑。
在試劑盒的一個實施方式中，其便于操作本發(fā)明的蛋白測試分析，該試劑盒包含一個易接受的核酸載體，該載體包含標(biāo)簽熒光或生色蛋白片段(如GFP S11)的編碼序列，其包括一個多樣的克隆位點，該克隆位點用于插入讀碼框中試驗蛋白到標(biāo)簽片段編碼序列的N末端。隨意地，插入位點可以跟在讀碼框中連接多肽的編碼序列與下游標(biāo)簽序列的編碼序列之后。一個特殊的實施方式是pTET-SpecR質(zhì)粒，其設(shè)計在實施例1中被描述且在圖1中被說明。pTET-SpecR質(zhì)粒的完整核苷酸序列如圖1B中所示。
該接受體，或“標(biāo)簽載體”被用來提供適用于宿主細(xì)胞的試驗蛋白-標(biāo)簽融合蛋白。在體外檢測實時方式中，該試劑盒還包含一個預(yù)先純化的檢測片段(如GFP1-10多肽)，其用于檢測被標(biāo)簽載體表達的試驗蛋白-標(biāo)簽片段融合蛋白。在一個體內(nèi)檢測實施方式中，試劑盒還包含一個“檢測載體”，在獨立調(diào)節(jié)啟動子的控制下該“檢測載體”與標(biāo)簽載體兼容且編碼檢測片段。在體內(nèi)檢測的替換實施方式中，包含檢測載體的細(xì)胞(如在可誘導(dǎo)啟動子的控制下編碼GFP 1-10的載體)與兼容的標(biāo)簽載體一起在試劑盒中被提供，在該標(biāo)簽載體中試驗蛋白可以被克隆，其中通過分離的可誘導(dǎo)啟動子被控制表達。包含檢測載體的細(xì)胞可以與標(biāo)簽載體及被監(jiān)控的細(xì)胞熒光一起被轉(zhuǎn)換。
校準(zhǔn)本發(fā)明溶解性檢測的材料可以被提供。在一個實施方式中，試劑盒包含純化的亞硫酸還原酶GFP S11融合蛋白試劑。
熒光和生色蛋白本發(fā)明提供用來設(shè)計脫落熒光和脫落生色蛋白系統(tǒng)的方法和原理，在這里以通過用于蛋白檢測和定量的最佳脫落GFP系統(tǒng)的產(chǎn)生和分子進化為例。然而，其他GFP類似蛋白可以被用于本發(fā)明的實施。
熒光蛋白的基團包括從水母(Aequorea Victoria)(GFP)中分離的綠色熒光蛋白，還包括大量的GFP變異體，如青色熒光蛋白，藍色熒光蛋白，黃色熒光蛋白等(Zimmer，2002，化學(xué)革命.102759-781；Zhang等2002，自然科學(xué)評論3906-918)。典型地，這些變異體共享大約80％，或者更多的與SEQ ID NO2(或SEQ ID NO8)一致的序列。這些有色轉(zhuǎn)移的GFP突變異種具有從藍色到黃綠色的散發(fā)顏色、增加的亮度和耐光性(Tsien，1998，生物化學(xué)評論年報67509-544)。一個這樣的GFP突變異種被稱為增強的黃色熒光蛋白，其顯示散發(fā)的最大值達529nm。通過將色氨酸的非自然變異體合并入青色變異體，產(chǎn)生另一個最近描述的突變異種，即一個黃金變異體，其具有574nm的紅色轉(zhuǎn)移散發(fā)最大值的特征(Bae等.，2003，分子生物學(xué)期刊.3281071-1081)。
其它以GFP為基礎(chǔ)的變異體具有改進的激發(fā)和散發(fā)光譜(Tsien等美國專利申請?zhí)朥.S.Patent Appn.20020123113A1)，其增強了熒光強度和熱容量(Thastrup等美國專利申請?zhí)朥.S.Patent Appn.20020107362A1；Bjorn等美國專利申請?zhí)朥.S.Patent Appn.20020177189A1)，且在減少氧含量的情況下生色團的形成(Fisher，美國專利申請?zhí)朥.S.Patent No.6,414,119)也已被描述。來自Anthozoans Renillareniformis和Renilla kollikeri的GFP也已被描述(Ward等美國專利申請?zhí)朥.S.Patent Appn.20030013849)。
此外，超過100個GFP類似熒光蛋白和來自珊瑚類的非熒光生色蛋白現(xiàn)在已被識別(作為參考，見Verkusha等，2003，GFP類似熒光蛋白和珊瑚類的生色蛋白，在蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能的萬花筒，pp.405-439，Ed.V.Uversky.Research SignpostPress，India)。珊瑚蛋白基團包括與Discosoma珊瑚類分離的紅色熒光蛋白，DsRed(Matz et 1999，Nat.Biotechnol.17969-973)，及不同的DsRed變異體(如DsRed1，DsRed2)。DsRed和其它珊瑚熒光蛋白僅分享大約26-30％的氨基酸序列，其與來自水母的野生型GFP一致，然而所有重要的模體被保藏，顯示GFP的β11鏈管式結(jié)構(gòu)特性的形成。DsRed的晶體結(jié)構(gòu)已被解答，并顯示GFP MMDB Id5742的β11鏈管式結(jié)構(gòu)的保藏。
大量更長波長的紅色熒光蛋白DsRed的突變異種已被描述。例如，最近被描述的進一步轉(zhuǎn)移到紅色熒光蛋白的具有散發(fā)光譜的DsRed突變異種可以在本發(fā)明的實施中被使用(Wiehler等，2001，F(xiàn)EBS Letters 487384-389；Terskikh等，2000，Science2901585-1588；Baird等.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711984-11989)。最近一個DsRed的單節(jié)顯性變異體被描述(Campell et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci USA 997877-7882)。該變異體被稱為“mRFP1”，其很快成熟(野生型的DsRed與之相比需要超過30小時時間成熟)，沒有殘留的綠色熒光，有比其它DsRed變異體長大約25nm的激發(fā)和散發(fā)波長。
來自大量海洋生命形態(tài)的日益增加的大量其它熒光蛋白最近被描述，目前蛋白數(shù)據(jù)庫列出大量GFP和GFP突變晶體結(jié)構(gòu)，還有不同的GFP類似物品體結(jié)構(gòu)。推斷與來自珊瑚、海鰓、海鞘和海葵的GFP結(jié)構(gòu)相似的相關(guān)熒光蛋白已被描述，其可以用于產(chǎn)生本發(fā)明脫落熒光蛋白系統(tǒng)(作為參考，見Zimmer，2002，Chem.Rev.102759-781；Zhang等，2002，自然評論3906-918).
此外，來自Anemonia majano，Zoanthus sp.，Discosoma striata，Discosoma sp.和Clavularia sp.的熒光蛋白也已被報道(Matz等，見上文)?？寺∽允^珊瑚種類的熒光蛋白，Trachyphyllia geoffroyi，已被報道散發(fā)綠色、黃色和紅色光，暴露于UV光上從綠色光轉(zhuǎn)變到紅色光散發(fā)(Ando et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9912651-12656)。近來描述的來自?？臒晒獾鞍装ňG色和桔紅色熒光蛋白，其克隆自Anemonia sulcata(Wiedenmann et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9714091-14096)，一個自然增強的綠色熒光蛋白克隆自Heteractis magnifica的觸角(Hongbin et al.，2003，生化研究.Commun.301879-885)，一個普通的非熒光紫色生色蛋白顯示微弱的紅色熒光，其克隆自Anemonia sulcata，及一個顯示遠紅外轉(zhuǎn)移散發(fā)光譜(595nm)的突變異種(Lukyanov et al.，2000，J.Chem.27525879-25882)。
最近被描述的與?？鸈ntacmaea quadricolor，EqFP611分離的紅色熒光蛋白是一個具有單一共平面及貫穿生色團的遠紅外高熒光蛋白(Wiedenmann等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9911646-11651)。EqFP611的晶體結(jié)構(gòu)已被解答，顯示GFP MMDBId5742的β11鏈管式結(jié)構(gòu)的保藏(Petersen et al.，2003，生物化學(xué)雜志，August8，2003；M307896200)。
還有更多類型的具有生色和熒光特性的GFP類似蛋白已被描述。這樣一個源自珊瑚的蛋白基團，pocilloporins，顯示寬范圍的光譜和熒光特性(Dove and Hoegh-Guldberg，1999，PCT申請WO 00/46233；Dove等，2001，Coral Reefs 19197-204)。最近，來自暗礁建筑珊瑚Montipora efflorescens的pocilloporin Rtms5的純化和結(jié)晶化已被描述(Beddoe et 2003，Acta Cryst.D59597-599)。Rtms5是深藍色的，還是弱熒光的。然而，據(jù)報道Rtms5和Rtms5同族序列的其它生色蛋白，經(jīng)過單一氨基酸置換能被互換成遠紅外熒光蛋白(Beddoe等，2003，見上文；Bulina等.，2002，BMC生化.37；Lukyanov等.，2000，見上文)。
與pocilloporins密切相關(guān)的各種其它源自珊瑚的生色蛋白也是已知的(見例如，Lukyanov等2000，生物化學(xué)雜志.27525879-82；Gurskaya等，2001，F(xiàn)EBS Letters50716-20)。到此程度，這些生色蛋白包含被保藏的GFP和其它熒光蛋白的β11鏈管式結(jié)構(gòu)，它們可以被剪接到自行互補片段，且能被使用在此所述的檢測系統(tǒng)中。
具有來自MMDB Id5742的β11鏈管式結(jié)構(gòu)少于5埃，通常少于3或4埃，優(yōu)先少于2埃的根中間正方形偏離結(jié)構(gòu)的任何熒光蛋白可以在自行互補片段的生長中使用。有些時候，熒光蛋白以多聚的形式存在。例如，DsRed是四聚的(Cotlet et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9814398014403)。值得本領(lǐng)域技術(shù)人員欣賞的是，該多聚熒光蛋白與GFP(一個單體)之間的結(jié)構(gòu)偏離在熒光蛋白結(jié)構(gòu)的單節(jié)顯性單位的基礎(chǔ)上被估計。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員欣賞的是，使用本領(lǐng)域公知的對比方法，這樣一個適合的熒光蛋白或生色蛋白結(jié)構(gòu)可以被識別。在識別該蛋白中，在MMDB Id5742結(jié)構(gòu)的線性化和對比的關(guān)鍵特性是β-管式結(jié)構(gòu)的保藏(如，典型的包括β11鏈，但至少在一種情況下，更少的β鏈(見上文Wiedenmann et al.，2000)和第二結(jié)構(gòu)元素的布局或連接順序(見如Ormo等“水母綠色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)”Yang等，1996，科學(xué)2735280，1392-5；Yang等1996自然生物.101246-51)。典型地，在熒光蛋白和GFP結(jié)構(gòu)之間的多數(shù)偏離，其長度為關(guān)鍵β鏈之間的連接鏈或接頭(如見，DsRed和GFP的對比，Yarbrough等.，2001，.Proc Acad Sci USA 98462-7)。在Yarbrough等，DsRed和GFP的線性化如圖顯示。從該立體圖中明顯看出β11鏈管嚴(yán)格被保藏在兩個結(jié)構(gòu)之間。盡管與DsRed和GFP相比，序列一致率只有23％，C-α脊椎被線性化在1埃RMSD內(nèi)超過169個氨基酸。
在對比結(jié)構(gòu)中，使用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的運算法則，如使用CCP4程序組，合作計算方案，第4.1994?！癈CP4組蛋白結(jié)晶學(xué)程序”，Acta Cryst.D50，760-763，兩個被比較的結(jié)構(gòu)被線性化。在使用該程序中，用戶輸入被線性化的兩個結(jié)構(gòu)的PDB坐標(biāo)文件，該程序產(chǎn)生輸出線性化結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)，其使用嚴(yán)格的身體轉(zhuǎn)化(旋轉(zhuǎn)和平移)來使位于該兩個結(jié)構(gòu)中原子的全部不同點最小化。輸出的每一個結(jié)構(gòu)的線性化坐標(biāo)可以被分別顯現(xiàn)，或作為一個重疊，其通過可用的分子制圖程序如RASMOL，Sayle和Milner-White，1995年9月，生物化學(xué)科學(xué)趨勢(TIBS)，卷20，No.9，p.374)或者Swiss PDB閱讀器Guex，N and Peitsch，M.C.，1996 Swiss-Pdb閱讀器一個針對微機和PC機蛋白數(shù)據(jù)庫的快速且易使用的PDB閱讀器季刊時事通訊77，pp.7。
考慮到RMSD，RMSD的價值衡量與結(jié)構(gòu)線性化是同一程度的，且當(dāng)使用RMSD作為全部結(jié)構(gòu)相似點的描述符，其大小要被考慮。通過包括氨基酸塊縮放比例的RMSD版本典型地被處理，該氨基酸在一定的限度內(nèi)被線性化。滿足特定標(biāo)準(zhǔn)的線性化序列的完整塊越長，結(jié)構(gòu)就線性化得越好。在DsRed例子中，c-α碳的164能被線性化在GFP的1埃中。典型地，本領(lǐng)域技術(shù)人員會選擇一個程序，該程序可以線性化兩個基于嚴(yán)格身體轉(zhuǎn)化的試驗結(jié)構(gòu)，例如，Dali等分子生物雜志1993，233，123-138.中所述。運算法則的輸出是序列塊，通過使用嚴(yán)格身體轉(zhuǎn)化，其在兩個結(jié)構(gòu)之間可以有層次。具有Z刻痕的區(qū)域在Z＝2或在Z＝2之上被相似報道。對于每個這樣的塊，全部RMSD被報道。
本發(fā)明使用的熒光蛋白或生色蛋白的RMSD在5埃內(nèi)，至少80％的序列在β11鏈內(nèi)。優(yōu)選的，RMSD在2埃內(nèi)，至少90％的序列在β11鏈內(nèi)(通過如圖所示重疊的兩個線性化結(jié)構(gòu)的視覺檢查及與通過DALI程序輸出報道的線性化塊的對比，β鏈被確定)。作為本技術(shù)領(lǐng)域人員欣賞的，在β鏈之間的接頭可以相當(dāng)?shù)刈兓?，且不需要結(jié)構(gòu)之間的重疊。
在優(yōu)選實施方式中，熒光蛋白或生色蛋白是蛋白的變異版本，或與該蛋白相比改進其折疊或溶解特性的蛋白變異體。通常這種蛋白能被識別，例如通過使用WO0123602中描述的方法和其它方法來選擇增加的折疊。
例如，為了獲得具有增加折疊特性的熒光蛋白，減少熒光蛋白折疊產(chǎn)量的一個“誘餌”或“過客”肽被連接到熒光蛋白。該過客肽可以是當(dāng)被插入時減少熒光蛋白折疊產(chǎn)量的任何肽。變異熒光蛋白文庫被創(chuàng)造。該誘餌肽被插入熒光蛋白且蛋白的熒光程度被檢測。那些克隆顯示相對包含誘餌肽的融合蛋白而增加的熒光，且母熒光蛋白被選擇(熒光強度反映適當(dāng)折疊的熒光蛋白的數(shù)量)。該過客肽可以在末端被連接到熒光蛋白，或可以在中間位置被插入。
在一個特殊的實施方式中，用于本發(fā)明實施的野生型和變異熒光蛋白及生色蛋白可以在實驗上被改進而產(chǎn)生非常穩(wěn)定的“重疊”變異體。結(jié)合2003年4月24日申請的共同未決、共有的美國專利申請10/423,688描述的方法的全部作為參考，該方法可以被使用到GFP、DsRed和其它相關(guān)熒光蛋白及生色蛋白的人工定向進化中。這種重疊的變異體可以被剪接到自行互補片段中，該片段可以進一步被改進用來單獨調(diào)節(jié)片段的溶解特性或當(dāng)其融合于試驗蛋白時進行調(diào)節(jié)。
改進脫落熒光或生色蛋白片段的可溶解和非干擾(對試驗蛋白溶解性)變異體的特殊方法在上文中副標(biāo)題脫落蛋白片段設(shè)計下面被提出。
實施例發(fā)明的各種不同方面將會進一步描述，并且通過下面幾個具體實施例的方式進行闡述，但不是為了對發(fā)明范圍進行限制。
實施例1構(gòu)建質(zhì)粒pTET-SpecR商業(yè)用tet-啟動子PRO細(xì)菌表達系統(tǒng)(Clontech，Palo Alto，CA)利用從表達質(zhì)粒中分離出來的第二次質(zhì)粒上得到調(diào)控蛋白tetR，使得創(chuàng)建巨型質(zhì)粒庫的效率很低。為了克服這個缺陷，我們將控制目標(biāo)蛋白表達的tet啟動子和tetR調(diào)控蛋白重組于含有四環(huán)素誘導(dǎo)啟動子的tet的單個質(zhì)粒上，tet啟動子調(diào)控蛋白tetR，以及選擇性抗生素標(biāo)記SpecR，所述抗生素標(biāo)記對奇放線菌素這種抗生素有抗性。復(fù)制起點ColE1允許所述重組質(zhì)粒在帶有像p15起點這樣的兼容性起點的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)共存。這樣某種標(biāo)記有GFP片段的蛋白就可以在pTET質(zhì)粒中表達，而另外一種GFP檢測片段的結(jié)構(gòu)互補物蛋白，則可以在另外一種像pET載體(Novagen，Madison，WI)這樣的質(zhì)粒中表達。pTET-SpecR質(zhì)粒如圖1A所示，所述質(zhì)粒的序列以及遺傳單位如圖1B所示。
pTET-SpecR質(zhì)粒通過重疊PCR得到，從商業(yè)化pPROTet.6xHN載體，pPROLAR載體，以及BL21-PR菌株(Clontech，PaloAlto，CA)自帶的能夠自我復(fù)制的質(zhì)粒上重組元件。氯霉素抗性基因用從BL21-PRO菌株自帶的能夠自我復(fù)制的質(zhì)粒上克隆得到的奇放線菌素抗性標(biāo)記替代，并且置于pPROLAR載體的卡那霉素抗性標(biāo)記的啟動子的控制之下。我們利用分離自BL21-PRO菌株的奇放線菌素抗性的能夠自我復(fù)制的質(zhì)粒，克隆了位于T0轉(zhuǎn)錄終止密碼子序列上游的四環(huán)素抑制(tetR)蛋白。tetR的翻譯量由位于SacI下游的弱shine-Delgarno序列調(diào)節(jié)，通過從小型簡并性文庫中選擇一個shine-Delgarno突變子使得添加脫水四環(huán)素(如下所述)之后減少漏檢并且得到最大化的誘導(dǎo)。商業(yè)化pTET-SpecR質(zhì)粒上的Spel限制性位點被壓制。新質(zhì)?！皃TET-SpecR”用Ncol和Xbal限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs，Beverly，MA)進行酶切，來接收GFP S11脫落GFP克隆盒。最終的克隆位點結(jié)構(gòu)是Nco-1::6HIS::凝血酶分裂位點::Nde-1::frame shift stuffer::BamHI:(GGGS):Spel::GFP S11(TAAStop)::Kpnl?？寺∑蔚挠辛x鏈兩邊連接Ncol和KpnlNcoI NdeICCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGBamHI SpeIKpnIGGTGGCGGTTCTGGATCCGGAGGCACTAGTGGTGGCGGCTCAGGTACC[SEQ ID NO23]一段讀碼框移碼(frame shift stuffer)完美地加入到Ndel和BamHI限制性位點之間，從而避免了基于重組載體而產(chǎn)生的背景表達。
讀碼框移碼實施例1FS0序列CATATGTGTTAACTGAGTAGGATCCG[SEQ ID NO24]讀碼框1H M C * L S R I讀碼框2I C V N * V G S讀碼框3Y V L T E * D P讀碼框移碼實施例2FS1序列CATATGTAATTAATTAATTGGATCCG[SEQ ID NO25]讀碼框1H M * L I N W I讀碼框2I C N * L I G S讀碼框3Y V I N * L D PC末端脫落蛋白片段，例如GFP鏈11或者GFP鏈10-11，是通過特異性低聚核苷酸引物提供的Spel和Kpnl兩側(cè)的限制性位點以及目標(biāo)編碼序列克隆自限制性位點Spel和Kpnl之間的片段。同樣片段也可以通過特異性低聚核苷酸引物和PCR擴增包含有限制性位點的模板DNA得到，這是行業(yè)內(nèi)的公知技術(shù)。業(yè)內(nèi)人士同樣清楚完整的Ncol/Kpnl盒可以通過對目標(biāo)載體進行設(shè)計合適的限制性位點，從而轉(zhuǎn)移到如pET載體等其他表達載體或系統(tǒng)中。
TetR基因由BL21(DE3)PRO細(xì)胞(Clontech，Palo Alto，CA)中分離出的質(zhì)粒上克隆得到。通過利用tetR基因序列的5’和3’端特異性引物擴增完整的基因。上游引物包含一個SacI限制性位點以及之后的tet啟動子調(diào)控下的優(yōu)化抑制/誘導(dǎo)重組蛋白Shine-Delgamo序列(本實施例，及如下所述)。下游引物包含一個與PROTet質(zhì)粒的T0轉(zhuǎn)錄終止子序列同原的區(qū)域。PCR產(chǎn)物與T0終止子擴增物裝配起來，重產(chǎn)物通過PROTetTM6xHN載體(Clontech，Palo Alto，CA)的Sacl/Spel限制性位點克隆得到，之前利用公知技術(shù)通過PCR介導(dǎo)位點指向性突變反應(yīng)靜止了共同限制位點從而進行修改。
奇放線菌素抗性基因利用基因特異性引物從BL21DE3PRO的質(zhì)粒上擴增P1CAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGTAACGGCGCAGTGGCG，[SEQ ID NO26]P2CGCCACTGCGCCGTTACCATGCGAAACGATCCTCATCCTG，[SEQ ID NO27]P3GCATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCC，[SEQ ID NO28]P4ACCCCAGAGTCCCGCATTATTTGCCGACTACCTT，[SEQ ID NO29].
P1和P2引物包含pPROLar載體(Clontech，Palo Alto，CA)的卡那霉素啟動子序列，P3和P4引物包含卡那霉素位點末端到SacI之間的連接序列。完整的盒通過AatII/SacI限制性位點插入到新的pTET-SpecR質(zhì)粒內(nèi)。插入序列v1CATATGGGTGGCGGTTCTGGATCCGGAGGCACTAGTGGTGGCGGCTCAGGTACCTAACTCGAG[SEQ ID NO30]和v2CATATGGGTGGCACTAGTGGTGGCGGCTCAGGTACCTAACTCGAG[SEQID NO31]來自于重疊引物，并且通過NcoI和Xbal位點克隆到pTET-SpecR質(zhì)粒上，從而產(chǎn)生pTET-SpecR v1和pTET-SpecR v2質(zhì)粒。調(diào)控tetR蛋白翻譯的Shing-Delgamo序列通過突變和選擇進行優(yōu)化。簡單來說，折疊報告子GFP基因克隆到插入序列v1pTET-SpecR質(zhì)粒的Ndel-BamHI之間再轉(zhuǎn)化到DH10B菌株。tetR基因利用簡并引物進行擴增，所述簡并引物是針對Shine-Delgamo序列的4個核苷酸設(shè)計的，并且盒克隆到包含有pTET-SpecR接受載體的GFP的SacI/Spel之間。最終文庫轉(zhuǎn)化到BL21 DE3菌株。優(yōu)化突變子通過計算誘導(dǎo)率(誘導(dǎo)后的GFP熒光細(xì)胞除以誘導(dǎo)前的GFP熒光細(xì)胞)進行篩選，并且選擇在添加0.25μg/ml脫水四環(huán)素(anhydrotetracycline，AnTET)(表1)后有最大突變率的突變子。優(yōu)化的tetR序列的Shine-Delgarno序列顯示出最大的誘導(dǎo)率是AATAAA CATTAATG[SEQ ID NO32]。
表1表達于優(yōu)化pTET-SpecR載體和PROTetCmR商業(yè)載體中的GFP全細(xì)胞熒光

a誘導(dǎo)前熒光。
b3小時37℃誘導(dǎo)于250ng/ml脫水四環(huán)素后的熒光。
實施例2尋找可行的脫落GFP對為了實現(xiàn)脫落GFP蛋白的標(biāo)簽作用和如圖2所示的監(jiān)測作用，我們首先測試了幾對片段，分別來自折疊報告GFP和異常穩(wěn)定的“超級折疊”GFP，折疊報告GFP上面有突變F99S，M153T，V163A(Crameri，Whitehorn et al.1996)，F(xiàn)64L，和S65T(Patterson，Knobel et al.1997)，“超級折疊”GFP包含折疊報告GFP的突變以及S30R，Y39N，N105T，Y145F，I171V以及A206V。我們分別在兼容性大腸桿菌質(zhì)粒上共表達了幾對GFP片段，包括氨基酸1-145+145-238，1-155+156-238，1-171+171-238，1-195+196-238，1-214+214-238。連接點適應(yīng)β-鏈之間的環(huán)卡和轉(zhuǎn)角(Tsien 1998；Baird，Zacharias et al.1999)(如圖3所示)。從超級折疊GFP得到的片段對呈現(xiàn)出比從折疊報告GFP得到的片段對更亮的菌落。例如，超級折疊GFP在156和172斷裂點處的片段要比來自于折疊報告GFP的片段亮(如圖4所示)。我們的目標(biāo)是要最小化片段的尺寸以滿足作為一個蛋白標(biāo)簽的作用，所以我們選擇了最小片段(1-214+214-238)。為了進一步減小標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域的尺寸，我們也檢測了1-214(GFP1-10)來與214-230(GFP S11)互補，從小片段中除掉雜亂的殘基231-238(Tsien 1998)。表2所示為GFP S11結(jié)構(gòu)的序列包含野生型以及人工突變子。
表2GFP S11變異體序列

a通過直接進化得到的點突變用粗體表示。序列在GFP230位氨基酸處停止，添加的C末端GT氨基酸模體用Kpnl位點編碼。
b相應(yīng)于全長GFP位置的計數(shù)。
cC末端GT氨基酸模體來自Kpnl位點，后接TAA終止密碼子。
d序列終止于GFP的228位氨基酸，后接來自于Kpnl位點的GT。
e序列開始于GFP的215位氨基酸。230位之后為終止密碼子。
從帶有兼容性起始位點(Novagen，Madison，WI)的pET載體中共表達的超級折疊GFP片段1-214(GFP 1-10)和214-230(GFP S11野生型)表達生長出了有熒光的大腸桿菌菌落(如圖5所示)。沒有監(jiān)測到與相應(yīng)的折疊報告GFP片段(如圖5所示)發(fā)生的互補。超級折疊GFP 1-10是不溶性的，但是當(dāng)再次折疊包含體(實施例9，下述)與C端標(biāo)記有野生型GFP S11野生型的耐超高溫?zé)岚艟?Pyrobaculumaerophilum)(Fitz-Gibbon，Choi et al.1997)來源的可溶性亞硫酸還原酶一同培養(yǎng)之后可以得到亞硫酸還原酶-GFP S11野生型融合蛋白，可以產(chǎn)生時間依賴性的熒光增長(圖5，曲線圖)。
實施例3設(shè)計GFP檢測片段GFP 1-10我們通過DNA改組技術(shù)(Stemmer 1994)改進了超級折疊GFP 1-10，增強了它的溶解能力以及與亞硫酸還原酶-GFP 11的互補能力。超級折疊GFP 1-10的PCR擴增物參照已經(jīng)出版了的實驗步驟(Stemmer 1994)進行DNA斷裂和改組。GFP 1-10cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到pPROTET載體(Clontech，Palo Alto，CA)上的含有亞硫酸還原酶-GFP S11野生型標(biāo)簽蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)PRO表達菌株(Clontech，Palo Alto，CA)上。通過2次連續(xù)添加1.0 OD600nm冷凍的保存于20％甘油/LB原液的400倍稀釋液，使表達文庫質(zhì)粒附著在硝基纖維膜上。經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，把硝基纖維膜轉(zhuǎn)移到含有50μg/ml卡那霉素，35μg/ml氯霉素，和50μg/ml奇放線菌素介質(zhì)的LB/瓊脂培養(yǎng)皿上，加入1mM IPTG 37℃3小時，然后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿內(nèi)，同樣，培養(yǎng)皿內(nèi)含有上述同樣的抗生素和600ng/ml脫水四環(huán)素(AnTET)。挑出最快出現(xiàn)熒光反應(yīng)的菌落，冷凍于-80℃的20％甘油冰凍體系中。使這些菌落生長并用1mM IPTG誘導(dǎo)，利用過量的純化亞硫酸還原酶-GFP S11野生型融合蛋白進行體外互補效率檢測(實施例9)，篩選可溶性溶解產(chǎn)物。最佳的候選菌落被集中起來，準(zhǔn)備進行另一輪的進化。通過熒光染色終止子DNA測序確定突變。3輪DNA改組并選擇最亮的克隆之后，在體外進行最佳突變體的可溶性溶解產(chǎn)物互補，稱之為GFP 1-10 OPT，相比于同樣量的再次折疊超級折疊GFP 1-10改進了80倍。除了折疊報告GFP的突變體(如上所述)，來自于超級折疊GFP的GFP 1-10 OPT包括S30R，Y145F，I171V，A206V，以及7個新的突變體N39I，T105K，E111V，I128T，K166T，I167V，S205T，37℃在大腸桿菌種約50％可溶性表達。10mg/ml非熒光GFP 1-10 OPT溶液的可視紫外線光譜缺少紅色移位(red-shift)GFP(Tsien 1998)的480nm吸收條帶，表明添加的GFP 11激發(fā)了產(chǎn)生環(huán)化發(fā)色團(Tsien 1998)所需的折疊步驟。純化的GFP 1-10 OPT，超級折疊GFP，以及折疊報告GFP通過10mg/ml分析凝膠過濾進行研究。GFP 1-10 OPT洗脫出60％二聚體，35％單體，以及5％多聚體，而全長折疊報告子GFP和超級折疊GFP均洗脫出多于95％的單體，和少量二聚體和多聚體。
實施例4設(shè)計GFP S11C末端野生型GFP S11融合標(biāo)簽極大的減少了多種耐超高溫?zé)岚艟?Pyrobaculumaerophilum，F(xiàn)itz-Gibbon，Choi et al.1997)試驗蛋白(表3)。3-己酮糖6-磷酸鹽合酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，HPS)單獨的溶解度是60％，當(dāng)和野生型GFP 11(圖6，表3)融合時就不可溶。蛋白質(zhì)的溶解性用之前提到過的SDS-PAGE和凝膠分析檢測(Waldo，Standish et al.1999；Waldo 2003)。簡單來講，對高輸出篩選而言，1ml培養(yǎng)細(xì)胞菌液離心沉淀，加入110μl含有100mM TRIS，PH 7.5，150mM NaCl，和10％v∶v甘油的緩沖液(TNG緩沖液)再次懸濁。同時，3ml培養(yǎng)細(xì)胞菌液離心沉淀，加入300μl TNG緩沖液再次懸濁。超聲波破壁之后離心就得到可溶性沉淀部分。這些沉淀部分用等體積TNG再次懸濁。15μl可溶性沉淀部分與15μ1含有100mM TRIS，200mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，4％SDS，0.2％溴酚藍(bromophenol blue)，和20％甘油的2xSDS變性緩沖液混合100℃加熱15分鐘。變性樣品用4-20％梯度標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE(Biorad，Hercules，CA)進行分離。蛋白樣品使用凝膠編碼藍色染色試劑(Gel Code Blue stain reagent，Pierce，Rockford，IL)進行染色和使用GS-800校準(zhǔn)顯像密度計(Calibrated Densitometer，Biorad，Hercules，CA)成像。標(biāo)準(zhǔn)掃描儀提供蛋白質(zhì)點完整的光學(xué)密度D?？偙磉_蛋白含量通過將溶解性蛋白點光學(xué)密度(Ds)和沉淀部分(Dp)相加得到，溶解度定義為S＝Ds/(Ds+Dp)。我們將HPS作為人工定向進化方法的“誘餌”來尋找大腸桿菌內(nèi)那些HPS-GFP S11融合溶解度與HPS不融合溶解度相匹配的GFP S11突變體。
表3GFP S11標(biāo)簽對來自耐超高溫?zé)岚艟?8個試驗蛋白溶解度的影響


a18種來自極端嗜鹽的古細(xì)菌群的耐超高溫?zé)岚艟?Fitz-Gibbon，Choi等1997)的蛋白，表達于37℃大腸桿菌BL21(DE3)。b從氨基酸序列計算得到的理論上的分子重量kD。cSDS-PAGE密度計量決定的片段溶解性。相對不確定度是約5％，各三個重復(fù)取平均值。d不融合(non-fusion，NF)溶解度。eC末端與野生型GFP S11(WT)融合。fC末端與GFP S11優(yōu)化物融合(M1，M2，M3)。
HPS-GFP 11變異體和GFP 1-10 OPT的文庫分別通過pTET-SpecR載體(實施例1，上述)和pET 28載體順序表達。順序誘導(dǎo)試驗過程利用可獨立誘導(dǎo)的兼容性質(zhì)粒，從而避免了共翻譯折疊以及不溶性變異體HPS-GFPS11與GFP 1-10 OPT互補時的假陽性。己酮糖磷酸合酶-GFP 11(HPS-GFP S11)融合體用PCR進行擴增，并且用公知技術(shù)改組(Stemmer 1994)。GFP S11突變體文庫表達成C末端與帶有N末端6-HIS標(biāo)簽的誘餌蛋白HPS融合，表達載體是帶有AnTET-誘導(dǎo)性tet啟動子的pTET質(zhì)粒(Lutz和Bujard 1997)(如圖1和實施例1所示，如上所述)，并且質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入在包含有p15復(fù)制起點經(jīng)過修改的pET載體的表達GFP 1-10 OPT的BL21(DE3)菌株里。最優(yōu)物通過下述連續(xù)誘導(dǎo)試驗步驟進行篩選。37℃過夜培養(yǎng)后，帶有菌落的硝基纖維膜轉(zhuǎn)移到選擇性LB/瓊脂鮑爾培養(yǎng)皿上，所述培養(yǎng)皿含有300ng/ml AnTet，在37℃培養(yǎng)3小時，表達HPS-GFP S11文庫，轉(zhuǎn)移到干凈的“靜止”培養(yǎng)皿內(nèi)1小時讓AnTet從菌落中彌漫開來切斷HPS-GFP S11的表達，最終轉(zhuǎn)移到包含1mM IPTG的LB/瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)2小時從pET質(zhì)粒中誘導(dǎo)表達互補的GFP 1-10 OPT。由于HPS-GFP S11野生型結(jié)構(gòu)完全是不溶性的，按照連續(xù)表達試驗步驟表達HPS-GFP S11野生型和GFP 1-10 OPT的菌落僅僅呈現(xiàn)微弱的熒光。較亮的菌落，與溶解性較好的HPS-GFP 11優(yōu)選物有關(guān)，他們被挑選出來放到帶有選擇性液體培養(yǎng)液的96孔組織培養(yǎng)皿上，-80℃保存于20％甘油凍存液內(nèi)。菌落在1ml液體培養(yǎng)液內(nèi)生長并用300ng/ml AnTET誘導(dǎo)?？扇苄圆糠趾Y選出來在體外與過量的純化的GFP 1-10 OPT進行互補效率測試(如下所述，實施例9)?；パa速率最快的菌落被挑選出來并收集等待下一輪進化與篩選。兩輪進化之后得到2個不同的GFP S11突變體，L221H和T225N。我們先研究L221H變異體，命名為GFP 11 M1。這個突變體在體內(nèi)可以與GFP 1-10 OPT有效的互補，并且與HPS GFPS11野生型相比溶解能力也得到提高，但是不能完全除去GFP S11在融合蛋白溶解能力方面的有害效果(如圖6和表3所示)。GFP 11 M2是結(jié)合F223S和T225N(表3，如上所述)而得到的，F(xiàn)223S能夠驚人地增加不同脫落GFP片段的溶解性(實施例11，如下所述)。HPS-GFP 11 M2的溶解性相比于HPS-GFP11 M1或者HPS-GFP 11野生型都得到了極大改進(圖6，表3)。HPS-GFP 11 M2與GFP 1-10 OPT的互補速率相對于HPS-GFP 11 M1與同樣量的可溶性融合蛋白減少了約5倍(圖7)。我們從GFP S11 M2中移去了K214，K214是GFP 1-10 OPT的C末端殘留物的復(fù)制體，并且在熱點位點223利用一套簡并引物篩選得到64倍的簡并文庫，(公知技術(shù))，并且克隆得到C末端與HPS融合的GFP 11 M2結(jié)果變異體從而尋找更穩(wěn)定的突變體。約200克隆的可溶性部分在體外與GFP 1-10 OPT進行篩選(如實施例9所示)。最佳的GFP S11結(jié)構(gòu)(L221H，F(xiàn)223Y，T225N)(命名為GFP S11 M3，氨基酸序列RDHMVLHEYVNAAGIT[SEQ IDNO16]，表2，如上所述)用一個合適的互補平衡了融合蛋白溶解度(圖6，表2如上所述)的減少的波動(圖7)。我們同樣嘗試了根據(jù)上述實施例3的進行人工定向進化方法來改進GFP 1-10 OPT的互補，這種方法利用了GFP S11 M2標(biāo)簽作為互補目標(biāo)物。由此產(chǎn)生了變異體命名為GFP 1-10 A4，它與GFP S11 M2互補的速率是GFP 1-10OPT的約5倍。GFP 1-10 A4包含超級折疊突變體以及附加突變體R80Q，S99Y，T105N，E111V，I128T，K166T，E172V，以及S205T。A4變異體在大腸桿菌中主要表達成包涵體的形式并且相比于GFP 1-10 OPT，A4在體內(nèi)測試中不太有用。然而，突變體A4在體外測試中很有用，因為它通過用干凈的TNG緩沖液稀釋用尿素溶解的沉淀可以很容易的由包涵體再次折疊，并且互補GFP S11 M2或者GFP S11 M3是GFP 1-10 OPT的約4倍速率。
實施例5利用可溶性與不溶性GFP 1-10比較先后連續(xù)誘導(dǎo)或者聯(lián)合誘導(dǎo)的效果為了驗證聯(lián)合誘導(dǎo)會導(dǎo)致不溶性聚合的超級折疊GFP 1-10的互補，我們比較了先后連續(xù)誘導(dǎo)方式和聯(lián)合誘導(dǎo)方式的試驗步驟。BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞與巨型GFP1-10片段(折疊報告GFP 1-10，超級折疊GFP 1-10，或者GFP 1-10 OPT)共同轉(zhuǎn)染入帶有ColE1啟動子的pTET載體，同時亞硫酸還原酶-GFP S11野生型轉(zhuǎn)染入帶有p15啟動子的pET質(zhì)粒中，它們被放置在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上的雙層硝基纖維膜上，過夜生長直到菌落直徑達到1毫米。其中一層硝基纖維膜采用上述的連續(xù)誘導(dǎo)處理(如上述實施例4所述)。簡單說就是GFP 1-10首先用AnTET表達，然后放置在干凈的板上并除去AnTET，之后在另一塊干凈加有1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的培養(yǎng)皿上表達亞硫酸還原酶-GFP S11野生型。另一塊培養(yǎng)皿進行同時誘導(dǎo)表達(培養(yǎng)皿同時內(nèi)含有AnTET和IPTG)。熒光克隆通過光波工具用488nm光波激發(fā)(LightToolsResearch，Encinitas，CA)，柯達DC290數(shù)碼相機520nm波長條件下成像。當(dāng)超級折疊GFP 1-10瞬間表達，并先在體內(nèi)積累而不是誘導(dǎo)亞硫酸還原酶-GFP S11野生型，細(xì)胞的熒光反應(yīng)很微弱(圖8所示)。相反，細(xì)胞表達部分可溶性GFP 1-10 OPT及亞硫酸還原酶-GFP S11時無論是共表達還是連續(xù)表達都如預(yù)期明亮(圖8所示)。
實施例6體外脫落GFP敏感性測試我們用微型滴定管培養(yǎng)皿測量了200微升體系下不同量的純化亞硫酸還原酶-GFPS11 M3的熒光進程曲線(如圖9所示)。為了避免可能的高階動力學(xué)效果，我們利用高濃度和大過量的GFP 1-10 OPT(800pmol)啟動互補。為這些敏感性試驗，96孔板首先用0.5％小牛血清蛋白溶液封閉10分鐘，所述小牛血清溶液的溶劑為TNG緩沖液(100mM TRIS PH值為7.5，150mM NaCl，10％的v∶v甘油)。同樣的緩沖液2倍連續(xù)稀釋Talon樹脂純化(Clontech，Palo Alto，CA)的6HIS-亞硫酸還原酶-GFP S11M3溶解蛋白。稀釋物范圍在每20μl等量樣本有200-0.1pmol，等量樣本加到96孔板中，然后將大過量(800pmol)的GFP 1-10 OPT(約0.5mg/ml)加入到180μl等量樣品進行互補，這樣較大片段的濃度不會受到限制。為了檢測未加工的大腸桿菌裂解產(chǎn)物對這個反應(yīng)的敏感性，我們在另外一個試驗中，樣本先添加20μl表達不相關(guān)無標(biāo)簽蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)裂解產(chǎn)物，再添加GFP 1-10 OPT。用FL600顯微培養(yǎng)皿熒光讀數(shù)器(FL600 microplate fluorescence reader，Bio-tek，Winooski，VT)監(jiān)控?zé)晒鈩恿W(xué)(λexc＝488nm，λem＝530nm)，記錄間隔為3分鐘，記錄時間為15小時。空白對照(20μl表達不相關(guān)蛋白的大腸桿菌裂解產(chǎn)物，100μl 0.5mg/ml GFP1-10 OPT，和100μl TNG緩沖液中0.5％BSA)的背景熒光從最終的熒光值中減去?？瞻讓φ丈儆谧畹偷哪繕?biāo)濃度的30％信號(0.1pmol亞硫酸還原酶-GFP S11 M3)?；パa熒光是分析物濃度的線性函數(shù)(如圖9所示)。10到200pmol量的亞硫酸還原酶-GFPS11 M3在添加了GFP 1-10 OPT(圖9A所示)之后15分鐘內(nèi)都能被精確定量，并且0.1到10pmol需要約1小時(如圖9B所示)。廣泛濃度范圍的進程曲線都能通過簡單的線性縮放比例進行添加(如圖10所示)，表明反應(yīng)的動力學(xué)不受限于GFP 1-10 OPT的濃度。如圖9所示的對應(yīng)于反應(yīng)曲線的平滑線條標(biāo)記了GFP標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域的測試樣品所需要的蛋白量，只要測試樣品的測量條件與用已知濃度樣品來做反應(yīng)曲線時的條件相同即可(例如標(biāo)準(zhǔn)曲線中舉例了如圖9A所示亞硫酸還原酶-GFP利用同樣的GFP1-10 OPT試劑濃度和同樣的樣品體積)。這樣，在圖9A中，熒光線性擬合(Y)對應(yīng)于單位pmol的Y由公式Y(jié)＝2.46×(pmol)+22.8給出。假設(shè)我們要在與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的條件下檢測一個未知濃度的標(biāo)記蛋白，產(chǎn)生出200單位的檢測熒光。利用公式pmol＝(Y-22.8)/2.46，Y用200代替，就可以計算出pmol＝(200-22.8)/2.46＝72.0pmol。
實施例7快速連接脫落GFP片段為了區(qū)分脫落GFP片段的連接動力學(xué)和發(fā)色團形成動力學(xué)，我們將結(jié)合在Talon樹脂上的6HIS-GFP 1-10 OPT與N末端折疊報告GFP標(biāo)記的GFP S11 M3互補。50％v/v的Talon樹脂的懸濁液中的100μl等量樣本浸滿了帶有N末端6HIS親和標(biāo)簽(200μl 2mg/ml的蛋白質(zhì))的GFP 1-10 OPT。珠子(50μl容積)用300μl TNG緩沖液洗3次除去未連接的GFP 1-10 OPT，吸起剩下的緩沖液并棄之，并在96孔微量滴定板上進行熒光測試(圖11，步驟一)。過量的折疊報告GFP-GFP S11 M3溶解蛋白(200μl 5mg/ml的蛋白質(zhì))加上珠子，吹打混合15秒，快速轉(zhuǎn)移到小的0.2μl過濾離心管中，用0.5ml等體積的TNG清洗3次除去未連接的折疊報告GFP-GFP S11 M3蛋白。這一過程需要大約5分鐘。珠子轉(zhuǎn)移到干凈的微量滴定板(圖11，步驟二)并且進行熒光檢測，每3分鐘檢測一次，檢測12小時(圖11，步驟三)。珠子的熒光顯示折疊報告GFP-GFP S11 M3蛋白已迅速連接到6HIS-GFP 1-10 OPT(圖11，步驟二)。清洗過的珠子獲得附加熒光的速率可以與在溶液中觀測的媲美(圖11，步驟三)，表明熒光反應(yīng)動力學(xué)沒有被連接GFP片段的速率所限制。
實施例8互補檢測的穩(wěn)定性和輔助物及PH的影響我們檢測了一般化學(xué)輔助物和PH對互補反應(yīng)的影響。10份連續(xù)2倍連續(xù)稀釋的9M尿素與TNG協(xié)同作用。10種溶液的100μl等量樣本，其濃度范圍在9M到0.019M尿素之間，和10μl亞硫酸還原酶-GFP 11 M3，10μl GFP 1-10 OPT測試片段，及80μl TNG緩沖液結(jié)合。用FL-600培養(yǎng)皿讀數(shù)器每3分鐘收集一次共收集12小時的熒光數(shù)據(jù)(BLOTEK，Winooski，VT)。反應(yīng)在尿素含量超過2M時終止(圖12)。另外一個試驗，互補速率通過5mM二硫蘇糖醇改良了約30％，但是當(dāng)SDS濃度達到0.1％w/v時停止。我們接著測試了不同PH的溶液對互補反應(yīng)的效率的影響。10μl等摩爾的亞硫酸還原酶-GFP S11 M3融合蛋白或者S11野生型多肽溶液加入到180μl含有適當(dāng)量緩沖液MES(pH5-5.6)，HEPES(pH6.5-7.5)，TRIS(pH7.5-8.5)，BICINE(pH8.5-9.0)的0.1M溶液中，pH范圍在5.0到9.0之間，每0.5pH為一個單位。通過加入10μlGFP1-10 OPT(4mg/ml)啟動互補，并且互補動力學(xué)通過FL-600平板讀數(shù)器(BIOTEK，Winooski，VT)每3分鐘監(jiān)控一下，監(jiān)控過夜。當(dāng)?shù)陀趐H6.5且具有約pH7.3的明顯pKa時互補的效率很低(圖13)?；パa之后在高于5M尿素的情況下一部分熒光GFP顯示為慢的，熒光的時間依賴性的降低(t1/2≈20小時)，并且約5.5的pKa與“增強的”GFP相似(Patterson，Knobel等，1997)。
實施例9體外蛋白定量為了檢測脫落GFP系統(tǒng)是否可以在體外精確定量不同的蛋白質(zhì)，我們表達了18個熱棒菌蛋白(Pyrobaculum)作為pET載體與C末端GFP S11 M3標(biāo)簽共同構(gòu)建于液體培養(yǎng)液中，再利用SDS-PAGE和脫落GFP互補系統(tǒng)分析可溶性和沉淀部分(圖14)。為了pET表達蛋白定量測試我們檢測了18個熱棒菌(Pyrobaculum)蛋白的可溶部分，并且通過直接估計GFP S11和GFP 1-10突變體進行優(yōu)化試驗，20μl目標(biāo)蛋白可溶性部分的細(xì)胞裂解產(chǎn)物與再次折疊的180μl 0.35mg/ml GFP 1-10 OPT(約600pmol)在96孔微量滴定板中混合(Nunc-lmmunoTMplate，Rochester，NY)。為了檢測不溶性沉淀部分，每個再次懸濁不溶性部分的50μl被離心，干燥的沉淀部分用50單位的9M尿素溶解，通過迅速添加190μl溶解于TNG中的0.35mg/ml的GFP 1-10 OPT來檢測10μl沒有折疊的樣品。沉淀部分的熒光值用兩個因素之一進行衡量來彌補相對可溶性檢測而言較小體積，從而可以與可溶性部分檢測進行直接比較。測試中的尿素最終濃度為約0.4M(如上述實施例8和圖12所示)。通過SDS-PAGE來定量，15μl可溶性和沉淀部分的樣品與15μl2xSDS變性緩沖液混合，緩沖液中有100mM TRIS，200mM二硫蘇糖醇，4％SDS，0.2％溴酚藍，和20％甘油，100℃加熱15分鐘。變性樣品通過4％-20％梯度標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE(Biorad，Hercules，CA)分離。凝膠上的蛋白斑點用凝膠編碼藍色染色劑(Pierce，rockford，IL)染色并形成圖片，蛋白斑點的光學(xué)密度用GS-800校準(zhǔn)掃描顯像密度計(Biorad，Hercules，CA)定量。即使這樣，庫馬斯亮藍染料(Coomassie dye)染色后在染色效率方面依然呈現(xiàn)了蛋白依賴性差異(Tal，Silberstein et al.1985)，完成蛋白的互補和折疊后(約6小時)會發(fā)現(xiàn)測量的熒光反應(yīng)值與通過SDS-PAGE看到的蛋白量之間呈高度相關(guān)(圖14)。不溶性蛋白溶解于9M的尿素(如前面的實施例所述)，并且用含有過量GFP 1-10 OPT的緩沖液稀釋20倍之后發(fā)出的熒光與通過SDS-PAGE(圖14)所呈現(xiàn)的不溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量呈現(xiàn)出較好的相關(guān)性。相反，當(dāng)可溶性部分先用新鮮緩沖液進行稀釋，再等體積添加濃縮的GFP 1-10 OPT后，多種表達地很好的不溶性蛋白(例如，聚硫還原酶和核苷二磷酸激酶，如表3和圖14所示)沒有出現(xiàn)可檢測的互補現(xiàn)象。很有可能這些蛋白質(zhì)發(fā)生了錯誤折疊，并且通過稀釋而發(fā)生聚集，使得GFP 11 M3標(biāo)記物難以接近之后添加的部分GFP 1-10 OPT。
實施例10利用脫落GFP檢測系統(tǒng)估算體內(nèi)可溶性蛋白和總蛋白可操作性脫落蛋白質(zhì)標(biāo)簽系統(tǒng)能夠用來體內(nèi)標(biāo)簽并且檢測可溶性與不可溶性蛋白質(zhì)。我們理論上論證了可溶性蛋白質(zhì)能夠通過在有限時間內(nèi)首次表達標(biāo)簽蛋白從而在活的大腸桿菌細(xì)胞中被檢測到，并且隨后關(guān)閉表達讓標(biāo)簽蛋白能夠發(fā)展它固有的溶解能力表型，之后再在同樣的細(xì)胞內(nèi)表達互補的GFP片段。從我們的體外共再折疊沉淀物測試結(jié)果來看(實施例9)，我們期望共表達的GFP S11 M3標(biāo)簽蛋白和GFP 1-10OPT會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)互補并且先產(chǎn)生GFP熒光，之后才有試驗蛋白體內(nèi)聚集的發(fā)生，這樣可以對總表達蛋白進行估計。共表達帶有N末端6HIS和來自于pTET-SpecR質(zhì)粒的C末端GFP S11 M3標(biāo)簽的熱棒菌試驗蛋白(圖1)，和來自于pET載體的GFP 1-10 OPT(Novagen，Madison，WI)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞在含有50μg/ml卡那霉素和70μg/ml奇放線菌素的LB溶液中生長，當(dāng)OD 600nm＝1.0時稀釋在20％甘油內(nèi)-80℃凍存。細(xì)胞連續(xù)用2次400倍的LB稀釋液稀釋然后置于硝酸纖維膜上。32℃過夜生長，細(xì)胞連續(xù)誘導(dǎo)(實施例4)或者聯(lián)合誘導(dǎo)。對連續(xù)誘導(dǎo)而言，帶有過夜菌落的膜上的細(xì)胞平板在搖床培養(yǎng)1.5小時，平板含有250ng/ml AnTet，放置在靜止平板上1小時，最后1小時放置在加有1mM IPTG的平板上(注意相比于實施例4制造GFP S11較短的搖床培養(yǎng)時間)。對共誘導(dǎo)試驗步驟而言，帶有過夜菌落的膜轉(zhuǎn)移到含有600ng/ml AnTET和1mM IPTG的平板上37℃培養(yǎng)4小時，共表達GFP S11和巨型GFP片段1-10。平板上的培養(yǎng)克隆通過光波照射工具系統(tǒng)(LightTools Research，Encinitas，CA)用488nm激發(fā)濾光片進行光照，DC290數(shù)碼相機(柯達)通過彩色玻璃濾光器(520nm長波濾過，LightTools Research，Encinitas，CA)進行成像。熒光克隆在共表達或者連續(xù)表達之后成像，同樣構(gòu)造的可溶性和沉淀部分在液體培養(yǎng)基中連續(xù)誘導(dǎo)之后利用SDS-PAGE(圖15)進行分析。我們通過連接可溶性部分到過量的Talon樹脂(Novagen，Madison，WI)上估計可利用的，非聚合6HIS-標(biāo)記的蛋白量，之后進行SDS-PAGE檢測。簡單說來，為了分析用來進行體內(nèi)全細(xì)胞平板互補檢測的同樣克隆的可溶性和沉淀部分，克隆被分離出來在1ml 96孔板培養(yǎng)板中37℃培養(yǎng)。細(xì)胞在指數(shù)階段用250ng/ml AnTET誘導(dǎo)1小時，新鮮LB清洗3次，然后用1mMIPTG誘導(dǎo)1.5小時。誘導(dǎo)之后，培養(yǎng)沉淀部分用110μl TNG緩沖液進行再懸濁，并用超聲波降解。裂解產(chǎn)物離心分流得到可溶性和沉淀部分。40μl可溶性連續(xù)誘導(dǎo)液體培養(yǎng)菌提取物與等體積50％v/v金屬吸附樹脂珠(Talon resin，Clontech，PaloAlto，CA)的懸濁液混合至TNG緩沖液中并稍微離心。吸走沒有連接上的片段，珠子用過量TNG緩沖液連續(xù)沖洗2次。最后一次離心之后，丟棄緩沖液。加入40μl 2×SDS變性緩沖液，并100℃加熱15分鐘。不溶性部分被變性(實施例4，如上所述)。連接到Talon樹脂的變性的樣品分離于4-20％梯度標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)。蛋白質(zhì)樣品用凝膠編碼藍色染色劑(Pierce，Rockford，IL)染色并且用GS-800標(biāo)準(zhǔn)顯像密度計(Biorad，Hercules，CA)成像。體內(nèi)聯(lián)合誘導(dǎo)克隆熒光報道了和SDS-PAGE一致的全部蛋白，然而連續(xù)誘導(dǎo)克隆熒光與Talon連接可溶性蛋白的SDS-PAGE(圖15)一致。表達高溶解性蛋白質(zhì)的克隆無論GFP 1-10是共誘導(dǎo)還是連續(xù)誘導(dǎo)都很亮(蛋白質(zhì)2，4和5，圖15)。表達不溶性蛋白質(zhì)的克隆當(dāng)共誘導(dǎo)時GFP 1-10更亮(蛋白質(zhì)8，11，15，16，和18，圖15)。蛋白質(zhì)1，4，5，7，9，12和14的溶解性在pET系統(tǒng)(表3和圖14，如上所述)中很強的T7啟動子(Studier，Rosenberg等1990)表達時較從pTET質(zhì)粒(圖15)的較弱的tet啟動子區(qū)(Lutz和Bujard 1997)表達時來得低。啟動子區(qū)的強弱對蛋白質(zhì)表達水平和溶解度的影響在之前就已經(jīng)被注意到了(Makrides 1996；Baneyx 1999；Gerstein，Edwards等2003；Yokoyama 2003；Fahnert，Lilie等2004)。
實施例11設(shè)計一種脫落GFP互補對，其由一GFP S10-11標(biāo)簽片段和GFP 1-9檢測片段組成按照上文中實施例2的方法，我們定義了一個可行性脫落GFP對，其由一個含有超級折疊GFP氨基酸198-238的標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域，(GFP S10-11)，和一個帶有超級折疊GFP氨基酸1-198的互補檢測片段(GFP 1-9)組成，當(dāng)兩個片段在大腸桿菌中共表達時，其產(chǎn)生熒光細(xì)胞。GFP 1-9是不溶性單獨表達于大腸桿菌。單獨表達的片段也不是熒光。按照上文中實施例3的描述，并且利用亞硫酸還原酶-GFP S10-11融合蛋白作為互補標(biāo)簽，我們通過人工定向進化方法改進了GFP 1-9的折疊性和溶解性，產(chǎn)生新的變異體GFP 1-9 OPT，它包含了超級折疊GFP的突變(實施例2，如上所述)和附加突變S2R，T43S，A87V，F(xiàn)114S，和K166T。這個片段在大腸桿菌pET28載體(Novagen，Madison，WI)37℃時約50％可溶性表達。下一步我們根據(jù)上文中實施例4，利用改進的GFP 1-9 OPT作為互補目標(biāo)改進GFP S10-11的溶解性，改善它的融合蛋白折疊性和溶解性的不穩(wěn)定性。超級折疊GFP S10-11標(biāo)簽有序列NHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK[SEQ ID NO35]，而優(yōu)選的GFP S10-11有序列DHYLSTQTILSKDPNEERDHMVLLESVTAAGITHGMDELYK[SEQ ID NO36](突變N198D，S205T，V206I，K214E，F(xiàn)223S)。利用這些片段進行體外脫落GFP測試的敏感性根據(jù)上文中實施例6進行檢測，但具有有限量的GFP 1-9 OPT(2.5μM GFP 1-9 OPT)。在這些條件下，熒光如預(yù)期達到了穩(wěn)定水平，大于等于2.5μM標(biāo)簽片段濃度(圖16)。
實施例12設(shè)計一種(GFP S10)-X-(GFP S11)三明治標(biāo)簽形態(tài)和利用檢測片段GFP 1-9 OPT進行檢測為了在目標(biāo)蛋白的兩端共價連接的情況下進行嚴(yán)格的檢測，和為了減少潛在的由于僅標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白一端所產(chǎn)生的人工物，像蛋白質(zhì)水解或者內(nèi)部核糖體連接位點產(chǎn)生的短片段，我們設(shè)計了一種三明治形態(tài)，此時試驗蛋白被表達成融合在GFP的兩個小結(jié)構(gòu)域之間，然后與GFP的第三個結(jié)構(gòu)域互補。在本實施例中，試驗蛋白X表達成像三明治一樣夾在GFP鏈10和11之間形成(GFP S10)-X-(GFP S11)(圖17)。這種類型與GFP的第三結(jié)構(gòu)域互補，即GFP 1-9 OPT，從而產(chǎn)生完整的GFP。我們利用公知技術(shù)設(shè)計了結(jié)構(gòu)(GFP S10)-L1-X-L2-(GFP S11)，在此L1和L2是接頭，其中每個接頭由氨基酸GGGS組成，通過插入試驗蛋白到超級折疊GFP S10-11標(biāo)簽(圖18A)中的GFP S11和GFPS11之間。我們利用GFP 1-9 OPT成功地檢測到(GFP S10)-L1-亞硫酸還原酶-L2-(GFP S11)，盡管互補僅是C末端GFP S11 M3+GFP 1-10 OPT形態(tài)的約1/30有效。我們也發(fā)現(xiàn)了當(dāng)其他部分可溶性蛋白以這種三明治形態(tài)表達時，其變成了不可溶解的。首先我們改進了互補的效率而不考慮溶解性。我們由一個DNA結(jié)構(gòu)開始，該結(jié)構(gòu)編碼(GFP S10)-L1-Ndel::GGGSGSGG::BamHI-L2-(GFP S11)，GFPS10鏈和GFP S11鏈來自于超級折疊GFP(圖18A)，并且短氨基酸序列GGGSGSGG[SEQID NO37]提供了兩條GFP鏈之間的可伸縮接頭。這是通過DNA重排技術(shù)突變得到，并且通過連續(xù)誘導(dǎo)來自pTET載體的文庫，在體內(nèi)篩選帶有改進的與GFP 1-10 OPT互補的變異體文庫，其緊跟在來自作為板上克隆的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的pET載體的GFP 1-9OPT的表達之后(如實施例4所述)。6個最亮的克隆在三輪進化后被測序(圖18A)。我們注意六個中的第五個突變，這個結(jié)構(gòu)被稱為(GFP S10SM5)-L1-X-L2-(GFP S11SM5)(SM5＝三明治突變第5)。優(yōu)先序列YTMDLPDNHYLSTQTILLKDLNGTGVGSGGGSHMGGGSGSGGGSGGGSTSEKRDHMVLLEYVTAAGITDAS*，[SEQ ID NO38]，其中，GFP S10和GFPS11鏈用下劃線表示，星號是終止密碼子。第一個斜體序列來自Ndel克隆位點CATATG，編碼氨基酸HM。第二個斜體序列來自BamHI限制性位點GGATCC，編碼氨基酸GS。帶有框內(nèi)Ndel和BamHI限制性位點的試驗蛋白克隆到包含用本領(lǐng)域公知的方法先前被Ndel和BamHI限制性內(nèi)切酶消化的結(jié)構(gòu)的載體中。典型地，克隆盒內(nèi)的Ndel和BamHI位點之間的框內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含了能被帶有終止密碼子的移碼替換的結(jié)構(gòu)，它能夠防止由于未消化載體或轉(zhuǎn)移載體帶來的假陽性(如上所述的實施例1，典型的移碼序列)。這種方式是公知技術(shù)?？寺『杏蒒col和Xhol限制性位點包圍并克隆到pTET載體中。盡管克隆到Nde-1/BamH-1位點的可溶性亞硫酸還原酶的互補速率與起始鏈結(jié)構(gòu)想比增長了約20倍，通過檢測部分溶解性HPS蛋白發(fā)現(xiàn)對蛋白質(zhì)溶解性的有害影響也增大了(實施例4，如上所述)。接下來，為了同時選擇改進的互補和提高的融合蛋白穩(wěn)定性，我們利用同樣的誘餌蛋白己酮糖磷酸鹽合成酶，HPS，我們已經(jīng)在改進GFP S11溶解性和互補時用過這個蛋白(實施例4，如上所述)。HPS是約60％可溶性單獨表達自pTET載體(蛋白質(zhì)#9，圖15)，但是不溶性表達成(GFP S10SM5)-L1-HPS-L2-(GFP S11 SM5)融合蛋白。我們來看上游(GFP S10 SM5)結(jié)構(gòu)域，在一層14個合成的寡核苷酸的引物中利用重排和引物預(yù)測突變發(fā)生(圖18B)。每條引物都集中在GFP S10 SM5結(jié)構(gòu)域的14個氨基酸之一，包含一個NNN編碼簡并了中心目標(biāo)氨基酸和在克隆載體上周圍與GFP S10 SM5的同源序列(目標(biāo)序列如圖18B和圖19所示)。該層簡并引物在重組反應(yīng)(如實施例4所述的重組)時加入到碎片DNA中。這種引物-預(yù)測突變發(fā)生技術(shù)是公知技術(shù)。我們重排并擴增了被Ncol上游和BamHI下游包圍的結(jié)構(gòu)域，Ncol:(GFP S10SM5)-L1-Nde-1::HPS::BamH1-L2-(GFP S11 SM5)，在通過PCR反應(yīng)進行片段重排時加入簡并引物混合物。我們再次擴增了來自重組突變結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，然后消化出包含突變(GFP S10)層、利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化的凝膠的Ncol/Nde-1片段，然后克隆到包含Ncol//Ndel::HPS::BamH1-L2-(GFP S11 SM5)的接受載體。利用來自pTET和互補檢測)的連續(xù)誘導(dǎo)進行3輪選擇，8個最好的克隆的序列中的每個序列通過熒光染色中斷測序儀測序(圖19)。表現(xiàn)最好的克隆，命名為(GFP S10 A10)-L1-Ndel::HPS::BamH1-L2-(GFP S11 SM5)是約45％可溶性表達于大腸桿菌，有標(biāo)記的改進相對于不溶性起始結(jié)構(gòu)，并且現(xiàn)在互補信號是利用GFP1-10 OPT檢測三明治結(jié)構(gòu)中唯一的GFP S11 SM5標(biāo)簽(如上所述)的互補的約1/5到1/4倍。下面我們檢測利用18個熱棒菌試驗蛋白的測試(見上文表3，為明確的非融合的溶解性)。根據(jù)先前描述的方法利用本實施例的即時片段檢測可溶性沉淀部分(實施例9)。我們利用GFP 1-10 OPT僅特異性檢測(GFP S11 SM5)標(biāo)簽作為參考，檢測了這些三明治-形態(tài)標(biāo)記的蛋白質(zhì)，也用到了GFP 1-9 OPT，它需要三明治形態(tài)標(biāo)簽蛋白的(GFP S10 A10)和(GFP S11 SM5)鏈的連接。正如預(yù)期，當(dāng)檢測僅需一條鏈時互補更有效(GFP 1-10 OPT例中)，并且利用尿素-溶解的沉淀來檢測沉淀部分在GFP 1-10 OPT檢測例中是最有效的(圖20)。但是，利用GFP 1-9 OPT檢測到的三明治的可溶性部分熒光反應(yīng)與利用GFP 1-10檢測的信號密切相關(guān)，報告了如預(yù)期的可溶性蛋白。相似地，體內(nèi)連續(xù)誘導(dǎo)與可溶性pTET和GFP S11 M3融合表達也相關(guān)(圖20，實施例9所示，圖15)。優(yōu)化的選擇有如下氨基酸序列YTMDLPDDHYLSTQTILSKDLNGTDVGSGGGSHMGGGSGSGGGSGGGSTSEKRDHMVLLEYVTAAGITDAS*，[SEQ ID NO39]，GFP S10和GFP S11鏈用下劃線表示，星號代表終止密碼子。第一個斜體序列來自Ndel克隆位點CATATG，編碼氨基酸HM。第二個斜體序列來自BamHI限制性位點GGATCC，編碼氨基酸GS。帶有框內(nèi)Ndel和BamHI限制性位點的試驗蛋白質(zhì)通過公知技術(shù)克隆到包含有之前已被Ndel和BamHI限制酶消化的結(jié)構(gòu)的載體上。這個盒子由可以克隆到pTET載體的Ncol和Xhol限制性位點包圍。典型地，克隆盒內(nèi)的Ndel和BamHI位點之間的讀碼框內(nèi)區(qū)域包含了能被帶有終止密碼子的讀碼框移碼替換的結(jié)構(gòu)，它能夠防止由于未消化載體帶來的假陽性(實施例1，如上所述，典型的讀碼框移碼序列)。
實施例13設(shè)計GFP S11標(biāo)簽的富含組氨酸的突變子用于檢測和純化我們設(shè)計了對金屬親和蛋白純化珠有強親和性的GFP S11，從而組合成具有蛋白檢測和蛋白純化雙重功能的單個蛋白。我們猜測暴露到溶劑環(huán)境下并且側(cè)鏈伸出GFP結(jié)構(gòu)(Orm，Cubitt等1996；Tsien 1998)外的GFP鏈11的殘基能夠改變?yōu)榱硪环N氨基酸，且不用破壞具有巨型GFP 1-10檢測片段的GFP S11標(biāo)簽的互補。4個指向外部的殘基利用特異性引物通過PCR手段突變?yōu)榻M氨酸P1，GATATAACTAGTCATGACCACATGCACCTTCATGAG[SEQ ID NO40]；P2，CACATGCACCTTCATGAGCATGTACATGCTCAT[SEQ ID NO41]；和P3，GATATAGGTACCCCCATGAGCATGTACATGCTCATGAAGGTGCA[SEQ ID NO42]。結(jié)果GFP 11 H7片段KHDHMHLHEHVHAHGGT[SEQ ID NO18]被克隆成C末端帶有可溶性控制蛋白亞硫酸還原酶。GFP的X射線晶體結(jié)構(gòu)檢測(Orm，Cubitt等1996；Tsien 1998)(PDB ID REF1GFL)(Yang，Moss等1996)顯示了2個GFP 11 H7末端附加的殘基與GFP 1-10上其他氨基酸沒有特異性聯(lián)系。這些附加的殘基在GFP S11 H7標(biāo)簽內(nèi)突變成組氨酸，從而產(chǎn)生GFP S11 H9，HDHMHLHEHVHAHHHT[SEQ ID NO20]。該18個熱棒菌調(diào)控蛋白(表3，如上所述)融合到GFP S11H7或者GFP S11 H9并從pET載體中表達(實施例9，如上所述)，從而檢測這些標(biāo)簽是否能夠用來作為新的檢測和純化系統(tǒng)并在體外精確定量和純化融合蛋白。過夜液體培養(yǎng)物用新鮮LB稀釋，當(dāng)長到600nm下0.5OD時，用1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)4小時。可溶性沉淀部分通過超聲波分餾并離心。對這18個帶有C末端GFP S11 H7或者GFP S11H9融合標(biāo)簽的熱棒菌調(diào)控蛋白的SDS-PAGE溶解性進行如前所述的評估(實施例9，如上所述)(表4)。先決定這些蛋白的非融合溶解度(實施例9，如上所述)。GFP S11H7和GFP S11 H9標(biāo)簽對蛋白溶解度的影響最小。
表4GFP S11 H7或者H9標(biāo)簽對18種耐超高溫?zé)岚艟鞍兹芙舛鹊挠绊?

a18種來自極端嗜鹽的古細(xì)菌群的耐超高溫?zé)岚艟?Fitz-Gibbon，Choi等1997)的蛋白。b從氨基酸序列計算得到的理論上的分子重量kD。SDS-PAGE密度計量(試驗手段)決定片段溶解性。相對不確定度是約5％，各三個重復(fù)取平均值。d非融合(non-fusion，NF)溶解度和eC末端與野生型GFP S11(WT)融合，如實施例4fC末端與GFP S11組氨酸突變體融合(H7，H9)。
實施例14S11 H7融合蛋白和GFP 1-10 A4之間互補反應(yīng)的敏感度根據(jù)上文描述制得純化的亞硫酸還原酶-GFP S11 H7融合蛋白稀釋物(實施例6，如上所述)。稀釋物范圍從每100μl等量樣本中含有670pmol到0.7pmol，等量樣本加到96孔板中，然后用大過量(800pmol)的GFP 1-10 A4(約0.5mg/ml)加入100μl等量體積中，完成互補。GFP 1-10 A4檢測片段由于具有比GFP 1-10 OPT更高的互補速率而被用來檢測GFP S11 H7。熒光互補動力學(xué)印記(λexc＝480nm，λem＝520nm)通過FL600顯微平板熒光閱讀器(Bio-Tek，Winooski，VT)被監(jiān)控過夜。最終熒光值相對于亞硫酸還原酶-GFP S11 H7融合蛋白量作圖(圖21)。
實施例15通過N-6HIS標(biāo)簽或者C末端GFP S11 H7標(biāo)簽比較GFP的純化折疊報告GFP克隆到一個N-6HIS pET 28載體中(Novagen，Madison，WI)，或者克隆到帶有C末端GFP S11 H7標(biāo)簽(沒有N-6HIS標(biāo)簽)的pET載體中。表達每一種融合蛋白的200ml BL21(DE3)培養(yǎng)物生長到OD600~0.5時，加入1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)4小時。培養(yǎng)物沉淀用2ml TNG懸濁并超聲降解?？扇苄云畏诺絋alon樹脂純化珠(TALON，Clonteck，Palo Alto，CA)上。過量TNG緩沖液沖洗兩次之后再用加入5ml咪唑的TNG緩沖液沖洗一次，蛋白用TNG緩沖液中添加的150mM咪唑洗提。粗提物和純化后的片段(150mM咪唑洗提)用SDS-變性緩沖液混合然后100℃加熱15分鐘，溶解于4-20％梯度標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE(Biorad，Hercules，CA)。蛋白樣本用凝膠編碼藍色試劑(Pierce，Rockford，IL)染色，用GS-800校準(zhǔn)的掃描顯像密度計(Biorad，Hercules，CA)成像(圖22)。
實施例16融合有S11 H7，S11 H9，或者帶有N-6HIS標(biāo)簽，結(jié)合到Talon樹脂上的折疊報告GFP的咪唑洗提屬性為了判斷Talon純化樹脂(Talon Resin，Clontech，Palo Alto，CA)對6HIS，GFP S11 H7，和GFP S11 H9標(biāo)簽的相對親和性，綠色熒光蛋白(GFP)克隆到N末端融合有GFP S11 H7或者GFP S11 H9的非-6HIS標(biāo)簽的pET載體和N-6HIS標(biāo)簽的pET載體中。每個融合蛋白在大腸桿菌中的3ml培養(yǎng)物生長到OD600~0.5時，加入1mM IPTG37℃誘導(dǎo)4小時。培養(yǎng)物沉淀用150μl TNG懸濁并超聲降解。50μl可溶性片段經(jīng)過TNG緩沖液預(yù)孵后放到200μl Talon樹脂純化珠(TALON，Clonteck，Palo Alto，CA)上。1ml TNG緩沖液沖洗3次后，20μl 50％v∶v珠漿轉(zhuǎn)移到7個含有50μl TNG緩沖液，并分別加有0，5，10，25，50，75，和100mM咪唑的PCR管中，混勻，離心并沉淀珠，然后10μl洗提片段用190μl TNG緩沖液在96孔微型板中稀釋(Nunc-ImmunoTMplate，Nunc，Rochester，NY)。利用FL600微型平板熒光閱讀器(Bioteck，Winooski，VT)檢測熒光(λex＝488nm，λem＝530nm)(圖23)。結(jié)果顯示GFP S11 H9標(biāo)簽相對于GFP S11 H7標(biāo)簽對Talon樹脂有更強的親和性，也許更適合在蛋白連接之后用高密度咪唑清洗來進行純化。
實施例17鈷純化幾類融合于S11 H9的試驗蛋白7種部分可溶(熱棒菌試驗蛋白)-GFP S11 H9融合蛋白被選擇來進行Talon樹脂珠純化，它利用了GFP S11 H9突變體對Talon樹脂的親和性。大腸桿菌BL21(DE3)中每個融合蛋白的3ml培養(yǎng)物生長到OD600~0.5，加入1mM IPTG 37℃誘導(dǎo)4小時。培養(yǎng)物沉淀用150μl TNG懸濁并超聲降解。50μl可溶性片段與50μl TNG洗滌過的Talon樹脂珠(Talon，Clontech，Palo Alto，CA)混合于300μl eppendorf管中。在周圍溫度約25℃時孵化10分鐘后，懸濁液離心并移去上清液，上清液作為未連接上的片段進行保存。小珠用含有5mM咪唑的1ml TNG緩沖液洗滌，然后用含有10mM咪唑的1ml TNG緩沖液沖洗去掉連接不牢的蛋白。通過旋轉(zhuǎn)0.2u濾筒中的小珠(Pierce，Rockford，IL)移去過量的上清液。連接上的蛋白用75μl含有150mM咪唑的TNG緩沖液孵育10分鐘來洗提，懸濁液通過0.2u濾筒進行離心并且過濾得上清液作為洗提片段保存。帶有每種蛋白的結(jié)合的粗提物(S)，未結(jié)合部分(U)，和洗提部分(E)的Talon樹脂用2×SDS緩沖液變性，加載到4-20％標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE(Biorad，Hercules，CA)(圖24)。
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序列表SEQ ID NO1GFP超級折疊1-10核苷酸序列ATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGAGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACAAACGGAAAACTCACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTCTGACCTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCACATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGACCTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTTTAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACGTTGAAGATGGTTCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGTCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCTAASEQ ID NO2GFP超級折疊1-10氨基酸序列MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKSEQ ID NO3GFP 1-10 OPT核苷酸序列ATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGAGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACAATCGGAAAACTCACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTCTGACCTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCACATGAAAAGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAAATACAAGACGCGTGCTGTAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAGGGTACTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTTTAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCACAGTTCGCCACAACGTTGAAGATGGTTCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTT
ACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAAACTGTCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGGGTACCTAASEQ ID NO4GFP 1-10 OPT氨基酸序列(additional mutations vs superfolderN39I，T105K，E111V，I 128T，K166T，I167V，S205T)MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEKGTSEQ ID NO5GFP 1-10 A4核苷酸序列ATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGAGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGAGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACAAACGGAAAACTCACCCTTAAATTCATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACGCTTGTCACTACTCTGACCTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCACATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATATTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGTAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAGGGTACTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTTTAACTCACACAATGTATATATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCACAATTCGCCACAACGTTGTAGATGGTTCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACTTGTCGACACAAACTGTCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGGGTACCTAASEQ ID NO6GFP 1-10 A4氨基酸序列(與超級折疊GFPR80Q，S99Y，T105N，E111V，I128T，K166T，E172V，S205T相對的附加突變)MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIYFKDDGNYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTIRHNVVDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEKGT
SEQ ID NO7GFP S11 214-238核苷酸序列AAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAGGTACCTAASEQ ID NO8GFP S11 214-238氨基酸序列KRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGTSEQ ID NO9GFP S11 214-230核苷酸序列AAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACAGGTACCTAASEQ ID NO10GFP S11 214-230氨基酸序列KRDHMVLLEFVTAAGITGTSEQ ID NO11GFP S11 M1核苷酸序列AAGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACAGGTACCTAASEQ ID NO12GFP S11 M1氨基酸序列(與wtL221H相對的附加突變)KRDHMVLHEFVTAAGITGTSEQ ID NO13GFP S11 M2核苷酸序列
AAGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTCTGTAAATGCTGCTGGGGGTACCTAASEQ ID NO14GFP S11 M2氨基酸序列(與GFP 11 wtL221H，F(xiàn)223S，T225N AA序列17殘基相對的附加突變)KRDHMVLHESVNAAGGTSEQ ID NO15GFP S11 M3核苷酸序列CGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTCTGTAAATGCTGCTGGGATTACATAASEQ ID NO16GFP S11 M3氨基酸序列(與GFP 11 wtL221H，F(xiàn)223Y，T225N相對的附加突變)RDHMVLHEYVNAAGIT*SEQ ID NO17GFP S11 H7核苷酸序列AAGCATGACCACATGCACCTTCATGAGCATGTACATGCTCATGGGGGTACCTAASEQ ID NO18GFP S11 H7氨基酸序列(與GFP 11 wtR215H，V219H，L221H，F(xiàn)223H，T225H，A227H相對的附加突變)KHDHMHLHEHVHAHGGTSEQ ID NO19GFP S11 H9核苷酸序列CATGACCACATGCACCTTCATGAGCATGTACATGCTCATCACCATACCTAA
SEQ ID NO20GFP S11 H9氨基酸序列(與GFP 11 wtR215H，V219H，L221H，F(xiàn)223H，T225H，A227H，G228H，I229H相對的附加突變)HDHMHLHEHVHAHHHTSEQ ID NO21來自PTET-SPECR載體的單一遺傳元素(包含從T0到AatIItet抑制蛋白tetR和在那霉素啟動子調(diào)控下的奇放線菌素基因，和控制tet抑制蛋白表達的RBS)TTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGTATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTGGACATCATTAATGTTTATTGAGCTCTCGAACCCCAGAGTCCCGCATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAG
ATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATGATGTTTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACCCCAAAAAAACATGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCSEQ ID NO22完整的PTET-SPECR載體序列TCGAGTCCCTATCAGTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACATCAGCAGGACGCACTGACCGAGTTCATTAAAGAGGAGAAAGATACCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTGGCGGTTCTGGATCCGGAGGCACTAGTGGTGGCGGCTCAGGTACCTAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCTCTAGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGCCCTAGACCTAGGCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGACTAGCGCTTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGTATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATT
CGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTGGACATCATTAATGTTTATTGAGCTCTCGAACCCCAGAGTCCCGCATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATGATGTTTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACCCCAAAAAAACATGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCACCSEQ ID NO33GFP 1-9 OPT的核苷酸序列ATGCGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCCGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACAAACGGAAAACTCAGCCTTAAATTTATTTGCAC
TACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTCTGACCTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCACATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGTCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGACCTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTCTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTTTAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCACAATTCGCCACAACGTTGAAGATGGTTCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAATAASEQ ID NO34GFP 1-9 OPT的氨基酸序列MRKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLSLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSVMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKSEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDSEQ ID NO36GFP 10-11 OPT的氨基酸序列DHYLSTQTILSKDPNEERDHMVLLESVTAAGITHGMDELYKSEQ ID NO39NcoI(GFP S10 A4)-KpnI-linker-NdeI-BamHI-linker-SpeI-(GFP S11 SM5)-NheI-XhoI“10-x-11優(yōu)選三明治”的氨基酸序列YTMDLPDDHYLSTQTILSKDLNGTDVGSGGGSHMGGGSGSGGGSGGGSTSEKRDHMVLLEYVTAAGITDASSEQ ID NO43GFP 1-10 OPT+GFP S11 M3“GFP 1-10 OPT M3”的核苷酸序列ATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGAGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACAATCGGAAAACTCACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTCTGACCTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCACATGAAAAGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTA
TATCTTTCAAAGATGACGGGAAATACAAGACGCGTGCTGTAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAGGGTACTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTTTAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCACAGTTCGCCACAACGTTGAAGATGGTTCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAAACTGTCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTCTGTAAATGCTGCTGGGATTACATAASEQ ID NO44GFP 1-10 OPT+GFP S11 M3“GFP 1-10 OPT M3”的氨基酸序列MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEKRDHMVLHESVNAAGIT*SEQ ID NO45GFP 1-10 OPT+GFP S11 M3+tail of GFP“GFP 1-10 OPT M3 tailed”的核苷酸序列ATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGAGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACAATCGGAAAACTCACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTCTGACCTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCACATGAAAAGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATGACGGGAAATACAAGACGCGTGCTGTAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAAGGGTACTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTTTAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCACAGTTCGCCACAACGTTGAAGATGGTTCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAAACTGTCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTCTGTAAATGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAASEQ ID NO46
GFP 1-10 OPT+GFP S11 M3+tail of GFP“GFP 1-10 OPT M3 tailed”的氨基酸序列MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATIGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGKYKTRAVVKFEGDTLVNRIELKGTDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFTVRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQTVLSKDPNEKRDHMVLHESVNAAGITHGMDELYK*SEQ ID NO47GFP 10-11 OPT.的核苷酸序列GACCATTACCTGTCGACACAAACTATCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAGAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTCTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATSEQ ID NO48NcoI(GFP S10 A4)-KpnI-linker-NdeI-BamHI-linker-SpeI-(GFP S11 SM5)-NheI-XhoI“10-x-11優(yōu)選三明治”的核苷酸序列GATATACCATGGATTTACCAGACGACCATTACCTGTCGACACAAACTATCCTTTCGAAAGATCTCAACGGTACCGACGTTGGGTCTGGCGGTGGCTCCCATATGGGTGGCGGTTCTGGATCCGGTGGAGGGTCTGGTGGCGGATCAACTAGTGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTATGTAACTGCTGCTGGGATTACAGGTGCTAGCTAACTCGAGAATAGC
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，它是GFP變異蛋白的β11鏈，該鏈的氨基酸序列選自SEQ ID NOS12、14和16中的一種。
2.一種分離的多肽，其特征在于，它是GFP變異蛋白的β11鏈，該鏈的氨基酸序列選自SEQ ID NOS18和20中的一種。
3.一種分離的多肽，其特征在于，它是GFP變異蛋白的β1-10的肽鏈，該肽鏈的氨基酸序列選自SEQ ID NOS4和6中的一種。
4.一種試劑盒，其特征在于，它包含權(quán)利要求1至3中任一項所述的分離的多肽。
5.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
6.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求2所述的多肽。
7.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求3所述的多肽。
8.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO3所示序列。
9.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO5所示序列。
10.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO11所示序列。
11.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO13所示序列。
12.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO15所示序列。
13.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO17所示序列。
14.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO19所示序列。
15.一種表達載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求5至14中任一項所述的核苷酸分子。
16.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求15所述的表達載體。
17.一種分離的核苷酸分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO21所示序列。
18.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求17所述的核苷酸分子。
19.一種pTET-SpecR質(zhì)粒載體，其特征在于，它具有SEQ ID NO22所示序列。
20.如權(quán)利要求19所述的載體，其特征在于，一編碼熒光蛋白β1和3相鄰肽鏈之間標(biāo)簽片段的多核苷酸被插入到載體的Spel和Kpnl兩個單一限制性酶切位點之間的讀碼框內(nèi)，且在所述標(biāo)簽片段的3’末端、Kpnl限制性酶切位點之前的讀碼框內(nèi)引入一個終止密碼子，以終止標(biāo)簽的翻譯。
21.如權(quán)利要求19所述的載體，其特征在于，一編碼熒光蛋白β1和10相鄰肽鏈之間標(biāo)簽片段的多核苷酸被插入到載體的Spel和Kpnl兩個單一限制性酶切位點之間的讀碼框內(nèi)，且在所述標(biāo)簽片段的3’末端、Kpnl限制性酶切位點之前的讀碼框內(nèi)引入一個終止密碼子，以終止標(biāo)簽的翻譯。
22.如權(quán)利要求20所述的載體，其特征在于，所述標(biāo)簽片段選自SEQ ID NO12、14、16、18和20所示序列。
23.如權(quán)利要求20所述的載體，其特征在于，所述編碼標(biāo)簽片段的多核苷酸選自SEQ ID NO11、13、15、17和19所示序列。
24.如權(quán)利要求20所述的載體，其特征在于，它還包含一段編碼異源多肽的多核苷酸，該段多核苷酸插在載體的Ndel和BamHl兩個單一限制性酶切位點之間的讀碼框內(nèi)。
25.如權(quán)利要求21所述的載體，其特征在于，它還包含一段編碼異源多肽的多核苷酸，該段多核苷酸插在載體的Ndel和BamHl兩個單一限制性酶切位點之間的讀碼框內(nèi)。
26.如權(quán)利要求22所述的載體，其特征在于，它還包含一段編碼異源多肽的多核苷酸，該段多核苷酸插在載體的Ndel和BamHl兩個單一限制性酶切位點之間的讀碼框內(nèi)。
27.如權(quán)利要求23所述的載體，其特征在于，它還包含一段編碼異源多肽的多核苷酸，該段多核苷酸插在載體的Ndel和BamHl兩個單一限制性酶切位點之間的讀碼框內(nèi)。
28.一種包含權(quán)利要求19所述載體的大腸桿菌。
29.一種包含權(quán)利要求20所述載體的大腸桿菌。
30.一種包含權(quán)利要求21所述載體的大腸桿菌。
31.一種包含權(quán)利要求22所述載體的大腸桿菌。
32.一種包含權(quán)利要求23所述載體的大腸桿菌。
33.一種含有權(quán)利要求28所述大腸桿菌的試劑盒。
34.一種含有權(quán)利要求29所述大腸桿菌的試劑盒。
35.一種含有權(quán)利要求30所述大腸桿菌的試劑盒。
36.一種脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，它包含熒光蛋白的至少兩個多肽片段，所述熒光蛋白選自GFP、GFP類似熒光蛋白及其變異蛋白，所述片段(a)都含有熒光蛋白完全互補的β鏈，(b)不能自發(fā)熒光，(c)自發(fā)地自我互補以重新組成熒光蛋白并產(chǎn)生熒光表型。
37.如權(quán)利要求36所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，它包含兩個多肽片段。
38.如權(quán)利要求36所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，它包含三個多肽片段。
39.如權(quán)利要求37所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光蛋白的一個多肽片段與一條異源性多肽融合，如果該異源多肽是可溶的，所述融合多肽就能自發(fā)地與熒光蛋白的另一個多肽片段自行互補。
40.如權(quán)利要求39所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述異源性多肽通過一個多肽接頭被融合。
41.如權(quán)利要求36所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光蛋白是一種環(huán)形突變體或變異體。
42.如權(quán)利要求37所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述的兩個多肽片段為β鏈對，選自s1-10和s11；s1-9和s10-11；s1-8和s9-11；s1-7和s8-11；s1-6和s7-11；s1-5和s6-11；s1-4和s5-11；s1-3和s4-11；s1-2和s3-11；s1和s2-11。
43.如權(quán)利要求42所述的脫落熒光蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述多肽片段來源于具有SEQ ID NO46氨基酸序列的GFP變異蛋白。
44.一種脫落生色蛋白系統(tǒng)，其特征在于，它包含生色蛋白及其變異蛋白的至少兩個多肽片段，所述片段(a)都含有生色蛋白完全互補的β鏈，(b)不能自己生色，(c)自發(fā)地自我互補以重新組成生色蛋白并產(chǎn)生生色表型。
45.如權(quán)利要求44所述的脫落生色蛋白系統(tǒng)，其特征在于，它包含兩個多肽片段。
46.如權(quán)利要求44所述的脫落生色蛋白系統(tǒng)，其特征在于，它包含三個多肽片段。
47.如權(quán)利要求45所述的脫落生色蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述生色蛋白的一個多肽片段與一條異源性多肽融合，如果該異源性多肽是可溶的，所述融合多肽就能自發(fā)地與生色蛋白的另一個多肽片段自行互補。
48.如權(quán)利要求47所述的脫落生色蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述異源性多肽通過一個多肽接頭被融合。
49.如權(quán)利要求44所述的脫落生色蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述生色蛋白是一種環(huán)形突變體或變異體。
50.如權(quán)利要求45所述的脫落生色蛋白系統(tǒng)，其特征在于，所述的兩個多肽片段是β鏈對，選自s1-10和s11；s1-9和s10-11；s1-8和s9-11；s1-7和s8-11；s1-6和s7-11；s1-5和s6-11；s1-4和s5-11；s1-3和s4-11；s1-2和s3-11；s1和s2-11。
51.一種分離熒光蛋白的可溶性自行互補片段的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)使編碼第一檢測片段多肽的核酸發(fā)生突變并產(chǎn)生一個突變體文庫；(b)將第一檢測片段多肽的突變體在宿主細(xì)胞中進行表達；(c)裂解細(xì)胞；(d)使裂解產(chǎn)物與第二檢測片段多肽接觸，并使第一檢測片段多肽的突變體能和第二檢測片段多肽產(chǎn)生自行互補；(e)在裂解液中檢測熒光，并挑選出一個或更多個最佳突變的第一檢測片段多肽；(f)使編碼第二檢測片段多肽的核酸發(fā)生突變并產(chǎn)生一個突變體文庫；(g)將第二檢測片段多肽的突變體在宿主細(xì)胞中進行表達；(h)裂解細(xì)胞；(i)使裂解產(chǎn)物與步驟(e)中所述的挑選出的最佳突變體接觸，并使第二檢測片段多肽的突變體能和第一檢測片段多肽的最佳突變體產(chǎn)生自行互補；(j)在裂解液中檢測熒光，并挑選出一個或更多個最佳突變的第二檢測片段多肽；分離出第一和第二檢測片段多肽的最佳突變體。
52.一種分離熒光蛋白的可溶性自行互補片段的方法，其特征在于，它包括如下步驟；(a)使編碼第一檢測片段多肽的核酸發(fā)生突變并產(chǎn)生一個突變體文庫；(b)將步驟(a)中的突變體文庫克隆到表達載體中；(c)把步驟(b)中表達載體上的突變體文庫轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；(d)在宿主細(xì)胞中瞬時表達第一突變體文庫；(e)將第二檢測片段多肽通過轉(zhuǎn)染或相容表達載體表達導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使第一檢測片段多肽的突變體能與第二檢測片段自行互補；(f)檢定細(xì)胞中的熒光，并挑選出一個或更多個第一檢測片段多肽的最佳突變體；(g)使編碼第二檢測片段多肽的核酸發(fā)生突變并產(chǎn)生一個突變體文庫；(h)將步驟(g)中的突變體文庫克隆到表達載體中；(i)把步驟(h)中表達載體上的突變體文庫轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；(j)在宿主細(xì)胞中瞬時表達第二突變體文庫；(k)將步驟(f)中所述的最佳突變體通過轉(zhuǎn)染或相容表達載體表達導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使第二檢測片段多肽的突變體能與第一檢測片段多肽的最佳突變體自行互補；(l)檢定細(xì)胞中的熒光，并挑選出一個或更多個第二檢測片段多肽的最佳突變體；分離出第一和第二檢測片段多肽的最佳突變體。
53.如權(quán)利要求51或52所述的方法，其特征在于，所述第一和第二檢測片段多肽為GFPβ鏈對，選自s1-10和s11；s1-9和s10-11；s1-8和s9-11；s1-7和s8-11；s1-6和s7-11；s1-5和s6-11；s1-4和s5-11；s1-3和s4-11；s1-2和s3-11；s1和s2-11。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述檢測片段多肽來源于具有SEQID NO46氨基酸序列的GFP變異蛋白。
55.一種檢測體內(nèi)可溶性試驗蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含報告蛋白片段的自行互補片段的可溶性第一標(biāo)簽片段的編碼序列，該序列與試驗蛋白的編碼序列融合，且受控于第一獨立可誘導(dǎo)啟動子；(b)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含報告蛋白片段的自行互補片段的可溶性第二檢測片段的編碼序列，該序列受控于第二獨立可誘導(dǎo)啟動子；(c)培養(yǎng)同時含有(a)和(b)兩個結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，在基礎(chǔ)條件下使其中的兩個獨立可誘導(dǎo)啟動子受抑制；(d)誘導(dǎo)(a)中結(jié)構(gòu)編碼的第一片段與試驗蛋白的融合蛋白表達，用足夠的時間使融合蛋白表達，接著如果融合蛋白不溶，再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(e)然后誘導(dǎo)(b)中結(jié)構(gòu)編碼的第二片段表達，用足夠的時間使第二檢測片段表達并使其與可溶性第一標(biāo)簽片段和試驗蛋白的融合蛋白自行互補；(f)檢定細(xì)胞中的報告蛋白活性，從而檢測到可溶性試驗蛋白。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述試驗蛋白通過一接頭多肽與報告蛋白自行互補片段的標(biāo)簽片段的N末端融合。
57.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種熒光蛋白。
58.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種生色蛋白。
59.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β11鏈，所述第二檢測片段為β1-10鏈。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段選自SEQ ID NOS12、14和16所示序列。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段選自SEQ ID NOS4和6所示序列。
62.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β10-11鏈，所述第二檢測片段為β1-9鏈。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段具有SEQ NO34所示序列。
64.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段具有SEQ NO36所示序列。
65.一種檢測體內(nèi)可溶性試驗蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼報告蛋白的自行互補片段的可溶性第一標(biāo)簽片段的多核苷酸序列，該序列與試驗蛋白的編碼序列融合；(b)在一定條件下培養(yǎng)含有(a)結(jié)構(gòu)的哺乳動物細(xì)胞，并用足夠的時間使試驗蛋白與標(biāo)簽片段的融合蛋白得到表達，如果該融合蛋白不溶，再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(c)將報告蛋白的自行互補片段的可溶性第二檢測片段通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)染至哺乳動物細(xì)胞中；(d)檢定細(xì)胞中的報告蛋白活性，從而檢測出可溶性試驗蛋白。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述試驗蛋白通過一接頭多肽與報告蛋白自行互補片段的標(biāo)簽片段的N末端融合。
67.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種熒光蛋白。
68.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種生色蛋白。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β11鏈，所述第二檢測片段為β1-10鏈。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段選自SEQ ID NOS12、14和16所示序列。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段選自SEQ ID NOS4和6所示序列。
72.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β10-11鏈，所述第二檢測片段為β1-9鏈。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段具有SEQ NO34所示序列。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段具有SEQ NO36所示序列。
75.一種檢測體內(nèi)可溶性試驗蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼熒光蛋白的β1和3相鄰肽鏈之間的標(biāo)簽片段的多核苷酸序列，在兩個相鄰β鏈之間的讀碼框內(nèi)插入一段編碼試驗蛋白的多核苷酸；(b)在一定條件下培養(yǎng)含有(a)結(jié)構(gòu)的哺乳動物細(xì)胞，并用足夠的時間使試驗蛋白與標(biāo)簽片段的融合蛋白得到表達，如果該融合蛋白不溶，再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(c)將熒光蛋白的自行互補片段的可溶性第二檢測片段通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)染至哺乳動物細(xì)胞中；(d)檢定細(xì)胞中的熒光，從而檢測出可溶性試驗蛋白。
76.一種檢測體內(nèi)可溶性試驗蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼熒光蛋白的β1和3相鄰肽鏈之間的標(biāo)簽片段的多核苷酸序列，在兩個相鄰β鏈之間的讀碼框內(nèi)插入一段編碼試驗蛋白的多核苷酸，且受控于第一獨立可誘導(dǎo)性啟動子；(b)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含不在(a)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的熒光蛋白β鏈的可溶性第二檢測片段的多核苷酸編碼序列，且使該多核苷酸受控于第二獨立可誘導(dǎo)性啟動子；(c)培養(yǎng)同時含有(a)和(b)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，在基礎(chǔ)條件下使兩個獨立可誘導(dǎo)性啟動子在此受到抑制；(d)誘導(dǎo)(a)結(jié)構(gòu)編碼的第一片段與試驗蛋白的融合蛋白表達，并用足夠的時間使融合蛋白得到表達，接著如果融合蛋白不溶，再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(e)誘導(dǎo)(b)結(jié)構(gòu)編碼的第二片段表達，并用足夠的時間使第二檢測片段得到表達，且該表達產(chǎn)物能與可溶性第一標(biāo)簽片段和試驗蛋白的融合蛋白進行自行互補；(f)檢定細(xì)胞中的熒光，從而檢測出可溶性試驗蛋白。
77.如權(quán)利要求55所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光是被定量檢測，且該熒光被用于檢測表達的可溶性試驗蛋白的數(shù)量。
78.如權(quán)利要求65所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光是被定量檢測，且該熒光被用于檢測表達的可溶性試驗蛋白的數(shù)量。
79.如權(quán)利要求75所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光是被定量檢測，且該熒光被用于檢測表達的可溶性試驗蛋白的數(shù)量。
80.如權(quán)利要求76所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光是被定量檢測，且該熒光被用于檢測表達的可溶性試驗蛋白的數(shù)量。
81.一種定量體內(nèi)總試驗蛋白的檢測方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼熒光蛋白的自行互補片段的可溶性第一標(biāo)簽片段的核苷酸序列，該序列與試驗蛋白的編碼序列融合；(b)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼熒光蛋白的自行互補片段的可溶性第二檢測片段的核苷酸序列；(c)培養(yǎng)同時含有(a)和(b)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并在一定條件下使(a)結(jié)構(gòu)編碼的第一片段和試驗蛋白的融合蛋白表達，同時使(b)結(jié)構(gòu)編碼的第二片段也表達，且用足夠的時間使標(biāo)簽片段和檢測片段自行互補；(d)定量檢測熒光以確定總蛋白量。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β11鏈，所述第二檢測片段為β1-10鏈。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段選自SEQ ID NOS12、14和16所示序列。
84.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段選自SEQ ID NOS4和6所示序列。
85.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β10-11鏈，所述第二檢測片段為β1-9鏈。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段具有SEQ ID NO34所示序列。
87.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段具有SEQ ID NO36所示序列。
88.一種定量體內(nèi)總試驗蛋白的檢測方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼熒光蛋白的β1和3相鄰肽鏈之間的標(biāo)簽片段的多核苷酸序列，在兩個相鄰β鏈之間的讀碼框內(nèi)插入一段編碼試驗蛋白的多核苷酸；(b)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含不在(a)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的熒光蛋白β鏈的可溶性第二檢測片段的多核苷酸編碼序列；(c)培養(yǎng)含有(a)和(b)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并在一定條件下使(a)結(jié)構(gòu)編碼的第一片段和試驗蛋白的融合蛋白表達，同時使(b)結(jié)構(gòu)編碼的第二片段也表達，且用足夠的時間使標(biāo)簽片段和檢測片段自行互補；(d)定量檢測熒光以確定總蛋白量。
89.一種檢測體外可溶性試驗蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼報告蛋白的自行互補片段的可溶性第一標(biāo)簽片段的核苷酸序列，該序列與試驗蛋白的編碼序列融合；(b)培養(yǎng)含有(a)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并在一定條件下使(a)結(jié)構(gòu)編碼的標(biāo)簽片段和試驗蛋白的融合蛋白表達，且用足夠的時間讓融合蛋白表達，如果該融合蛋白不溶，接著再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(c)裂解細(xì)胞；(d)讓裂解液與報告蛋白的自行互補片段的第二互補檢測片段接觸；(e)檢定報告蛋白活性，而檢測到報告蛋白活性就表明該試驗蛋白是可溶的。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述試驗蛋白通過一個接頭多肽與報告蛋白的自行互補片段的標(biāo)簽片段的N末端融合。
91.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種熒光蛋白。
92.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種生色蛋白。
93.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β11鏈，所述第二檢測片段為β1-10鏈。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段選自SEQ ID NOS12、14和16所示序列。
95.如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段選自SEQ ID NOS4和6所示序列。
96.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β10-11鏈，所述第二檢測片段為β1-9鏈。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段具有SEQ ID NO34所示序列。
98.如權(quán)利要求96所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段具有SEQ ID NO36所示序列。
99.一種定量體外不溶性試驗蛋白的檢測方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼報告蛋白的自行互補片段的可溶性第一標(biāo)簽片段的核苷酸序列，該序列與試驗蛋白的編碼序列融合；(b)培養(yǎng)含有(a)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并在一定條件下使(a)結(jié)構(gòu)編碼的第一標(biāo)簽片段和試驗蛋白的融合蛋白表達，且用足夠的時間讓融合蛋白表達，如果該融合蛋白不溶，接著再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(c)裂解細(xì)胞，并從中分離出不溶性成分；(d)用化學(xué)變性的方法溶解不溶性成分；(e)將溶解變性的不溶性蛋白成分以適當(dāng)配比在一種含有報告蛋白自行互補片段的第二互補檢測片段的稀釋液中進行復(fù)性，在一定條件下并用足夠的時間使其自行互補；(f)定量檢測熒光以確定不溶性蛋白量。
100.如權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，所述試驗蛋白通過一個接頭多肽與報告蛋白自行互補片段的標(biāo)簽片段的N末端融合。
101.如權(quán)利要求99所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種熒光蛋白。
102.如權(quán)利要求99所述的方法，其特征在于，所述報告蛋白是一種生色蛋白。
103.如權(quán)利要求101所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β11鏈，所述第二檢測片段為β1-10鏈。
104.如權(quán)利要求103所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段選自SEQ ID NOS12、14和16所示序列。
105.如權(quán)利要求103所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段選自SEQ ID NOS4和6所示序列。
106.如權(quán)利要求101所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段為β10-11鏈，所述第二檢測片段為β1-9鏈。
107.如權(quán)利要求106所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽片段具有SEQ ID NO34所示序列。
108.如權(quán)利要求106所述的方法，其特征在于，所述第二檢測片段具有SEQ ID NO36所示序列。
109.一種定量體外總試驗蛋白的檢測方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼報告蛋白自行互補片段的可溶性第一標(biāo)簽片段的核苷酸序列，該序列與試驗蛋白的編碼序列融合；(b)培養(yǎng)含有(a)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并在一定條件下使(a)結(jié)構(gòu)編碼的第一標(biāo)簽片段和試驗蛋白的融合蛋白表達，且用足夠的時間讓融合蛋白表達，如果該融合蛋白不溶，接著再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(c)裂解細(xì)胞；(d)用化學(xué)變性的方式將裂解液中的總蛋白溶解；(e)將裂解液中的溶解蛋白以適當(dāng)配比在一種含有報告蛋白自行互補片段的第二互補檢測片段的稀釋液中進行復(fù)性，在一定條件下，并用足夠的時間使其自行互補；(f)定量檢測熒光以確定總蛋白量。
110.一種檢測體內(nèi)可溶性試驗蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)提供一個多核苷酸結(jié)構(gòu)，它包含編碼熒光蛋白的β1和3相鄰肽鏈之間的標(biāo)簽片段的多核苷酸序列，在兩個相鄰β鏈之間的讀碼框內(nèi)插入一段編碼試驗蛋白的多核苷酸；(b)在一定條件下培養(yǎng)含有(a)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并使(a)結(jié)構(gòu)編碼的第一標(biāo)簽片段和試驗蛋白的融合蛋白表達，且用足夠的時間讓融合蛋白表達，如果該融合蛋白不溶，接著再用足夠的時間使表達的融合蛋白聚集；(c)裂解細(xì)胞；(d)讓裂解液與不在(a)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的熒光蛋白β鏈的第二互補檢測片段多肽接觸；(e)檢定報告蛋白活性，檢測到報告蛋白活性就表明該試驗蛋白是可溶的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于熒光蛋白和生色蛋白自行互補片段的蛋白標(biāo)簽和檢測系統(tǒng)。本發(fā)明的系統(tǒng)以來源于水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein GFP)的自行互補片段的各種結(jié)合為例，所述片段可被用于以多種檢驗形式檢測和定量體內(nèi)和體外蛋白的溶解性。
文檔編號C07H21/04GK1886420SQ200480035241
公開日2006年12月27日 申請日期2004年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者杰弗里·S·沃爾多, 斯蒂芬妮·克本特斯 申請人:加利福尼亞大學(xué)