專利名稱：糖基聚乙二醇化的因子Ⅸ的制作方法
本申請(qǐng)要求下列申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/527,089(在2003年12月3日提交，此處引用其整體作為參考用于所有目的)；U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/539,387(2004年1月26日提交)；U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)No.60/592,744(2004年7月29日提交)；U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/614,518(2004年9月29日提交)；和U.S.臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/623,387(2004年10月29日提交)，此處引用其各自整體作為參考用于所有目的。
背景技術(shù)：
維生素K依賴性蛋白質(zhì)(例如因子IX)在其氨基端45個(gè)殘基中包含9到13個(gè)γ-羧基谷氨酸殘基(Gla)。Gla殘基通過(guò)肝中利用維生素K羧化蛋白質(zhì)前體中谷氨酸殘基側(cè)鏈的酶產(chǎn)生。維生素K依賴性蛋白質(zhì)與大量生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，其中最詳細(xì)描述的為凝血(Nelsestuen，Vitam.Horm.58355-389(2000)綜述)。維生素K依賴性蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)Z、蛋白質(zhì)S、凝血酶原(因子II)、因子X(jué)、因子IX、蛋白質(zhì)C、因子VII、Gas6和基質(zhì)GLA蛋白質(zhì)。因子VII、IX、X和II用于促凝過(guò)程而蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和蛋白質(zhì)Z用于抗凝作用。Gas6是由生長(zhǎng)停滯特異基因6(gas6)編碼的生長(zhǎng)停滯激素并與蛋白質(zhì)S相關(guān)。見(jiàn)Manfioletti等，Mol.Cell.Biol.134976-4985(1993)?；|(zhì)GLA蛋白質(zhì)通常發(fā)現(xiàn)于骨中并對(duì)阻止循環(huán)中軟組織鈣化是關(guān)鍵的。Luo等，Nature 38678-81(1997)。
調(diào)節(jié)血液凝固是代表了許多主要健康問(wèn)題(包括不能形成血塊和血栓、形成不需要的血塊)的過(guò)程。在許多情形下使用阻止不需要的血塊形成的試劑且許多試劑是可用的。不幸的是，多數(shù)現(xiàn)有療法具有不良的副作用?？诜鼓?jiǎng)├缛A法林(Warfarlin)通過(guò)抑制維生素K在肝中的作用而作用，從而阻止維生素K依賴性蛋白質(zhì)谷氨酸殘基的完全羧化，引起循環(huán)系統(tǒng)中活性蛋白質(zhì)濃度降低和形成血塊能力降低。藥物與其靶標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性使華法林療法復(fù)雜化。飲食中維生素K的波動(dòng)可引起華法林過(guò)量或不足。凝結(jié)活性的波動(dòng)為該療法的不良結(jié)果。
注射的物質(zhì)例如肝素(包括低分子量肝素)也是常用的抗凝血?jiǎng)Ａ硗?，這些化合物使用過(guò)量并必須小心監(jiān)控。
更新種類的抗凝血?jiǎng)┌ɑ钚晕稽c(diǎn)修飾的維生素K依賴性凝血因子例如因子VIIa和IXa。活性位點(diǎn)被絲氨酸蛋白酶抑制劑例如氨基酸或短肽的氯甲基酮衍生物封閉?；钚晕稽c(diǎn)修飾的蛋白質(zhì)保留與其各自的輔因子形成復(fù)合物的能力，但是是失活的，從而不產(chǎn)生酶活性并阻止輔因子與各自的活性酶復(fù)合。簡(jiǎn)言之，這些蛋白質(zhì)顯示提供無(wú)其他抗凝血?jiǎng)┎涣几弊饔玫目鼓煼ǖ囊嫣?。活性位點(diǎn)修飾的因子X(jué)a為該組中另一可能的抗凝血?jiǎng)?。其輔因子蛋白質(zhì)為因子Va?；钚晕稽c(diǎn)修飾的激活蛋白C(APC)可能也是凝血的有效抑制子。見(jiàn)Sorensen等，J.Biol.Chem.27211863-11868(1997)?；钚晕稽c(diǎn)修飾的APC結(jié)合因子Va并阻止因子X(jué)a結(jié)合。
使用維生素K依賴性凝血因子的主要阻礙在于成本。維生素K依賴性蛋白質(zhì)的生物合成依賴于完整的谷氨酸羧化體系，其存在于少量動(dòng)物細(xì)胞類型中。這些蛋白質(zhì)的超量生產(chǎn)受限于該酶體系。另外，這些蛋白質(zhì)的有效劑量較高。通常劑量為1000ug肽/kg體重。見(jiàn)Harker等，1997，如上。
另一阻止治療肽使用的現(xiàn)象是眾所周知的蛋白質(zhì)糖基化方面，即這些肽顯示的體內(nèi)相對(duì)短的半衰期?？傊?，短的體內(nèi)半衰期問(wèn)題意味著治療糖肽必須時(shí)常以高劑量給藥，最終轉(zhuǎn)化為必須更高(與制備更有效的產(chǎn)生更長(zhǎng)效用的糖蛋白治療劑的方法相比)的醫(yī)療費(fèi)。
例如，因子VIIa說(shuō)明了該問(wèn)題。因子VII和VIIa在人中有大約2-4小時(shí)的循環(huán)半衰期。即在2-4小時(shí)內(nèi)，肽在血清中的濃度減少一半。當(dāng)使用因子VIIa作為促凝血?jiǎng)┲委熌承┬问降难巡r(shí)，標(biāo)準(zhǔn)方案為每?jī)尚r(shí)注射高劑量(45到90.mu.g/kg體重)VIIa。見(jiàn)Hedner等，Transfus.Med.Rev.778-83(1993)。因此，使用這些蛋白質(zhì)作為促凝血?jiǎng)┗蚩鼓獎(jiǎng)?在因子VIIa情況下)要求以頻繁間隔和高劑量施用蛋白質(zhì)。
提供成本效益好的糖肽療法問(wèn)題的一種解決方法為提供具有更長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的肽。例如，已經(jīng)通過(guò)將合成聚合物附著在肽主鏈上產(chǎn)生了具有改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的糖肽治療劑。示例性的與肽綴合的多聚體為聚乙二醇(“PEG”)。使用PEG衍生肽治療劑被證明減少了肽的免疫原性。例如，U.S.專利No.4,179,337(Davis等)公開了非免疫原的多肽例如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶聯(lián)的酶和肽激素。除減少免疫原性外，循環(huán)中的清除時(shí)間也因?yàn)樗龆嚯牡腜EG綴合物的尺寸增大而延長(zhǎng)。
PEG及其衍生物附著肽的主要方式為通過(guò)肽氨基酸殘基的非特異性成鍵(見(jiàn)例如U.S.專利號(hào)4,088,538、U.S.專利號(hào)4,496,689、U.S.專利號(hào)4,414,147、U.S.專利號(hào)4,055,635和PCT WO 87/00056)。PEG附著肽的另一方式為通過(guò)非特異性氧化糖肽上的糖基殘基(見(jiàn)例如WO 94/05332)。
在這些非特異性方法中，聚乙二醇以隨機(jī)、非特異性方式加至肽主鏈的反應(yīng)性殘基上。當(dāng)然，隨機(jī)加入PEG具有其缺點(diǎn)，包括缺乏最終產(chǎn)物同質(zhì)性，和可能降低肽的生物學(xué)或酶活性。因此，為了產(chǎn)生治療肽，引起特異標(biāo)記的、容易鑒定的、基本同質(zhì)的產(chǎn)物的衍生策略是占優(yōu)勢(shì)的。已經(jīng)發(fā)展了這樣的方法。
特異標(biāo)記的、同質(zhì)的肽治療劑可通過(guò)酶作用在體外產(chǎn)生。與通常的合成多聚體或其他標(biāo)記附著至肽的非特異性方法不同，基于酶的合成具有區(qū)域選擇性和立體選擇性的優(yōu)點(diǎn)。用于標(biāo)記的肽合成中的兩種主要類型的酶為糖基轉(zhuǎn)移酶(例如唾液酸轉(zhuǎn)移酶、寡糖基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶)和糖苷酶。這些酶可用于糖的特異附著，糖隨后可被修飾以包含治療部分。另外，糖基轉(zhuǎn)移酶和修飾的糖苷酶可用于將修飾的糖直接轉(zhuǎn)移至肽主鏈(見(jiàn)例如U.S.專利6,399,336和U.S.專利申請(qǐng)出版物20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，此處引用各項(xiàng)作為參考)。結(jié)合化學(xué)和酶合成元素的方法也是已知的(見(jiàn)例如Yamamoto等，Carbohydr.Res.305415-422(1998)和U.S.專利申請(qǐng)出版物20040137557，此處引用作為參考)。
因子IX是非常有價(jià)值的治療肽。盡管現(xiàn)在使用市售形式的因子IX，這些肽可通過(guò)增強(qiáng)產(chǎn)生的分離糖蛋白產(chǎn)物藥物代謝動(dòng)力學(xué)的修飾來(lái)改進(jìn)。因此，本領(lǐng)域仍需要具有改進(jìn)效用和更佳藥物代謝動(dòng)力學(xué)的更長(zhǎng)效的因子IX肽。此外，為了對(duì)最大數(shù)量的個(gè)體有效，必須能夠以工業(yè)規(guī)模產(chǎn)生具有改進(jìn)治療藥物代謝動(dòng)力學(xué)的因子IX肽，其具有可預(yù)測(cè)的、基本同質(zhì)的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠容易地一次又一次地復(fù)制。
幸運(yùn)的，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的因子IX肽和制備他們的方法。除了具有改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的因子IX肽之外，本發(fā)明還提供工業(yè)可行的和成本效益好的用于生產(chǎn)這些因子IX肽的方法。本發(fā)明的因子IX肽包含修飾基團(tuán)例如PEG部分、治療部分、生物分子等等。本發(fā)明因此滿足了對(duì)用于治療疾病和病癥(其中因子IX提供了有效的治療)具有改進(jìn)的治療功效和改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的因子IX肽的需要。
發(fā)明概述目前發(fā)現(xiàn)用一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇部分受控修飾因子IX提供了具有改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的新因子IX衍生物。此外，已發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了用于可靠制造本發(fā)明修飾的因子IX肽的成本效益好的方法。
一方面，本發(fā)明提供包括
部分的因子IX肽。在上式中，D為-OH或R1-L-HN-。符號(hào)G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烴基。R1為包含直鏈或分支聚乙二醇?xì)埢牟糠郑磺襆為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭。通常，當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，且當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-NH-。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，在文中公布的唾液酸類似物中，COOH還代表COO-或其鹽。
在另一方面，本發(fā)明提供制造包含上述部分的PEG化因子IX的方法。本發(fā)明的方法包括(a)在適合轉(zhuǎn)移的條件下，將底物因子IX肽與PEG-唾液酸供體和轉(zhuǎn)移PEG-唾液酸至因子IX肽氨基酸或糖基殘基上的酶接觸。示范的PEG-唾液酸供體部分具有式 在一個(gè)實(shí)施方案中宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌或真菌。
在另一方面，本發(fā)明提供治療有此需要的受試者中疾病的方法，其中該疾病特征為受試者中凝血受損。該方法包括向受試者施用能夠有效改善受試者中病癥的數(shù)量的本發(fā)明因子IX肽綴合物的步驟。該方法能治療的示范的病癥為血友病。
在另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明因子IX肽和藥學(xué)可用載體的藥物制劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)下文詳述明白其他本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)。
附圖描述

圖1為因子IX的結(jié)構(gòu)，顯示潛在糖基化位點(diǎn)Asn 157、Asn 167；Ser 53、Ser 61、Thr 159、Thr 169和Thr 172的存在和定位。
圖2為顯示示范的本發(fā)明實(shí)施方案的圖，其中因子IX肽上糖殘基被重構(gòu)并糖基聚乙二醇化(A)唾液酸部分用唾液酸酶去除且產(chǎn)生的半乳糖殘基用圖5的唾液酸衍生物糖基聚乙二醇化；(B)甘露糖殘基用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(C)N-聚糖的唾液酸部分用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(D)O-聚糖的唾液酸部分用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(E)來(lái)自2(A)的因子IX的SDS PAGE凝膠；(F)來(lái)自產(chǎn)生2(C)和2(D)的反應(yīng)的因子IX的SDS PAGE凝膠。
圖3為比較未糖基化的因子IX和酶促糖基聚乙二醇化的因子IX的體內(nèi)停留壽命的曲線。
圖4為比較圖3所示種類活性的表格。
圖5為因子IX的氨基酸序列。
圖6為與未聚乙二醇化的因子IX比較，多種糖基聚乙二醇化的因子IX分子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)圖形表示。
圖7是本發(fā)明中使用的代表性的修飾的糖種類圖表。
圖8是本發(fā)明中使用的代表性修飾的糖種類的圖表。
圖9是用于將修飾的唾液酸部分(如文中公開的那些)和未修飾的唾液酸部分轉(zhuǎn)移至受體的唾液酸轉(zhuǎn)移酶圖表。
發(fā)明詳述及優(yōu)選的實(shí)施方案縮寫PEG，聚乙二醇；PPG，聚丙二醇；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰氨基葡糖基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖胺基乙酸(mannosaminyl acetate)；Xyl，木糖基和NeuAc，唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸基)；M6P，甘露糖-6-磷酸；Sia，唾液酸，N-乙酰神經(jīng)氨酸基及其衍生物和類似物。
定義除非另有說(shuō)明，文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。通常，文中使用的術(shù)語(yǔ)以及細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)和核酸化學(xué)和雜交中的實(shí)驗(yàn)室操作為本領(lǐng)域熟知并常規(guī)使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于核酸和肽合成。技術(shù)和操作通常根據(jù)本文件中各處提供的本領(lǐng)域常規(guī)方法和多種一般參考(一般參見(jiàn)Sambrook等《MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL》，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，文中引用作為參考)執(zhí)行。文中使用的術(shù)語(yǔ)以及分析化學(xué)和下述有機(jī)合成的實(shí)驗(yàn)室操作為本領(lǐng)域熟知并通常使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其變更用于化學(xué)合成和化學(xué)分析。
所有文中描述的寡糖以非還原糖(即Gal)名稱或縮寫描述，跟著是糖苷鍵構(gòu)型(α或β)、環(huán)鍵(1或2)、與鍵有關(guān)的還原糖的環(huán)位置(2、3、4、6或8)，然后是還原糖的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每種糖優(yōu)選吡喃糖。標(biāo)準(zhǔn)糖生物學(xué)命名法綜述見(jiàn)《Essentials ofGlycobiology》，Varki等編輯，CSHL Press(1999)。
寡糖被認(rèn)為具有還原性末端和非還原性末端，無(wú)論還原性末端的寡糖是否事實(shí)上為還原性糖。與公認(rèn)的術(shù)語(yǔ)相同，文中所述的寡糖用左側(cè)為非還原性末端和右側(cè)為還原性末端表示。
術(shù)語(yǔ)“唾液酸”是指九碳羧化糖家族的任何成員。唾液酸家族最常見(jiàn)的成員為N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3，5-雙脫氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-1-onic acid(常縮寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的另一成員為N-乙醇酰-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；鶊F(tuán)被羥基化。再一唾液酸家族成員為2-酮-3-脫氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。還包括9-取代唾液酸例如9-O-C1-C6?；?Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙?；?Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。唾液酸家族綜述見(jiàn)例如Varki，Glycobiology 225-40(1992)；《Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function》R.Schauer編輯(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化過(guò)程中唾液酸化合物的合成及使用在1992年十月1日公布的國(guó)際申請(qǐng)書WO 92/16640中公開。
“肽”是指多聚體，其中單體為氨基酸并通過(guò)酰胺鍵結(jié)合，也可稱為多肽。另外，非天然氨基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸亦包括在內(nèi)。非基因編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明。另外，本發(fā)明也可使用被修飾含有活性基團(tuán)、糖基化位點(diǎn)、多聚體、治療部分、生物分子等的氨基酸。本發(fā)明中使用的所有氨基酸可為d-或1-異構(gòu)體。通常優(yōu)選1-異構(gòu)體。此外，其他肽模擬物(peptidomimetics)也可用于本發(fā)明。文中所用“肽”是指糖基化和非糖基化的肽。還包括被表達(dá)肽的體系不完全糖基化的肽。一般的綜述見(jiàn)Spatola，A.F.，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，B.Weinstein編輯，Marcel Dekker，New York，267頁(yè)(1983)。
術(shù)語(yǔ)“肽綴合物”是指本發(fā)明的種類，其中肽與文中公開的修飾的糖綴合。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸以相似方式作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸為由遺傳密碼編碼的以及隨后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸)。氨基酸類似物是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即與氫結(jié)合的α碳、羧基、氨基和R基團(tuán)(例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。這些類似物有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保持了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但以與天然存在氨基酸類似形式作用的化學(xué)化合物。文中使用“氨基酸”，無(wú)論其在接頭中或肽序列組成中，都指該氨基酸的D-和L-異構(gòu)體以及這兩種異構(gòu)體的混合。
文中使用術(shù)語(yǔ)“修飾的糖”是指天然或非天然存在的碳水化合物，其在本發(fā)明方法中被酶促加至肽的氨基酸或糖基殘基上。修飾的糖選自許多酶底物，包括但不僅限于糖核苷酸(單-、雙-和三磷酸)、活化的糖(例如糖基鹵化物、糖基甲磺酸)、和既未活化又非核苷酸的糖?！靶揎椀奶恰庇谩靶揎椈鶊F(tuán)”共價(jià)官能化。有用的修飾基團(tuán)包括但不僅限于PEG部分、治療部分、診斷部分、生物分子等。修飾基團(tuán)優(yōu)選不是天然存在或未修飾的碳水化合物。選擇用修飾基團(tuán)官能化的部位使得其不阻礙“修飾的糖”被酶加至肽上。
術(shù)語(yǔ)“水溶性的”是指在水中具有若干可檢測(cè)程度溶解性的部分。檢測(cè)和/或定量溶解性的方法為本領(lǐng)域所熟知的。示范的水溶性多聚體包括肽、糖、聚醚、聚胺、聚羧酸等。肽可具有混合序列或由單一氨基酸序列組成(例如聚賴氨酸)。示范的多糖為聚唾液酸。示范的聚醚為聚乙二醇。聚乙二胺為示范的聚胺，且聚丙烯酸為代表性的聚羧酸。
水溶性多聚體的多聚體主鏈可為聚乙二醇(即PEG)。然而，應(yīng)該理解其他相關(guān)的多聚體也適合用于本發(fā)明實(shí)踐，而且術(shù)語(yǔ)PEG或聚乙二醇的使用旨在包括并不僅限于該方面。術(shù)語(yǔ)PEG包括聚乙二醇的任何形式，包括烷氧基PEG、雙官能PEG、多臂PEG、叉狀PEG、分支PEG、側(cè)掛型PEG(即有一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)懸掛在多聚體主鏈上的PEG或相關(guān)多聚體)或帶有可降解鍵的PEG。
多聚體主鏈可以是線性的或分支的。分支的多聚體主鏈通常為本領(lǐng)域已知。一般的，分支的多聚體具有中樞分支核心部分和結(jié)合在中樞分支核心的許多線性多聚體鏈。PEG通常以分支形式使用，其可通過(guò)向多種多元醇(例如丙三醇、季戊四醇和山梨糖醇)加成環(huán)氧乙烷來(lái)制備。中樞分支部分還可產(chǎn)生自一些氨基酸例如賴氨酸。分支聚乙二醇通?？梢訰(-PEG-OH)m方式表示，其中R代表核心部分例如丙三醇或季戊四醇，且m代表臂的數(shù)目。多臂PEG分子(例如U.S.專利No.5,932,462中所述，在文中引用其整體作為參考)也可作為多聚體主鏈?zhǔn)褂谩?br> 許多其他的多聚體也適用于本發(fā)明。非肽且水溶性的具有2到大約300末端的多聚體主鏈在本發(fā)明尤其有用。合適的多聚體實(shí)例包括但不僅限于其他聚亞烷基二醇例如聚丙二醇(“PPG”)，乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚氧乙基多元醇、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚α-羥基酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯酰嗎啉)(例如在U.S.Pat.No.5,629,384中所描述的，文中引用其整體作為參考)和其共聚物，三元共聚物及混合物。盡管多聚體主鏈每條鏈的分子量可變，其一般在從大約100Da至大約100,000Da的范圍內(nèi)，通常從大約6000Da到大約80,000Da。
文中在向病人施用肽藥物的上下文中使用“曲線下面積”或“AUC”是指從零到無(wú)窮大作為時(shí)間函數(shù)的描述病人體循環(huán)中藥物濃度的曲線下的總面積。
文中在向病人施用肽藥物的上下文中使用術(shù)語(yǔ)“半衰期”或“t1/2”是指藥物在病人中的血漿濃度降至一半需要的時(shí)間。依賴于多重清除機(jī)制、重新分配和本領(lǐng)域其他熟知的機(jī)制，可以存在超過(guò)一個(gè)關(guān)于肽藥物的半衰期。通常，定義α和β半衰期使得α期與重新分配相關(guān)，且β期與清除相關(guān)。然而，對(duì)于大部分被限制在血液中的蛋白質(zhì)藥物而言，至少存在兩個(gè)清除半衰期。對(duì)一些糖基化的肽來(lái)說(shuō)，快速β期清除可由巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞上識(shí)別末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖或巖藻糖的受體介導(dǎo)。較慢的β期清除可通過(guò)腎小球?qū)τ行О霃剑?nm(大約68kD)分子的過(guò)濾和/或在組織中特異或非特異吸收和代謝發(fā)生。糖基聚乙二醇化可給末端糖(例如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)加帽從而阻斷通過(guò)識(shí)別這些糖的受體的快速α期清除。還可給予較大的半徑并因此減少分布容量及組織吸收，從而延長(zhǎng)晚β期。因此，糖基聚乙二醇化對(duì)α期和β期半衰期的精確影響將依賴于大小、糖基化狀態(tài)和如本領(lǐng)域熟知的其他參數(shù)而變化。“半衰期”的進(jìn)一步解釋可見(jiàn)《Pharmaceutical Biotechnology》(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar編輯，Harwood Publishers，Amsterdam，101-120頁(yè))。
文中使用術(shù)語(yǔ)“糖綴合”是指修飾的糖種類與多肽(例如因子IX肽底物)的氨基酸或糖基殘基的酶介導(dǎo)結(jié)合。“糖綴合”的下位類別為“糖基聚乙二醇化”，其中修飾的糖的修飾基團(tuán)為聚乙二醇和其烴基衍生物(例如m-PEG)或其活性衍生物(例如H2N-PEG，HOOC-PEG)。
術(shù)語(yǔ)“大規(guī)模的”和“工業(yè)規(guī)模的”可互換使用，并指在單個(gè)反應(yīng)循環(huán)完成時(shí)產(chǎn)生至少大約250mg，優(yōu)選至少大約500mg，且更優(yōu)選至少大約1g糖綴合物的反應(yīng)循環(huán)。
文中使用術(shù)語(yǔ)“糖基連接基團(tuán)”是指與修飾基團(tuán)(例如PEG部分、治療部分、生物分子)共價(jià)結(jié)合的糖基殘基；糖基連接基團(tuán)連接修飾基團(tuán)和綴合物殘余部分。在本發(fā)明方法中，“糖基連接基團(tuán)”共價(jià)結(jié)合在糖基化的或非糖基化的肽上，從而將試劑連接在肽的氨基酸和/或糖基殘基上?！疤腔B接基團(tuán)”通常通過(guò)“修飾的糖”酶促附著在肽的氨基酸和/或糖基殘基上而從“修飾的糖”得來(lái)。糖基連接基團(tuán)可為糖衍生的結(jié)構(gòu)，其在修飾基團(tuán)-修飾的糖盒形成時(shí)降解(例如氧化→Schiff堿形成→還原)或糖基連接基團(tuán)可是完整的?！巴暾奶腔B接基團(tuán)”是指衍生自其中將修飾基團(tuán)結(jié)合至綴合物殘余部分的糖單體未降解(例如被如高碘酸鈉氧化)的部分的連接基團(tuán)。本發(fā)明的“完整的糖基連接基團(tuán)”可衍生自天然存在的寡糖，通過(guò)向親本糖結(jié)構(gòu)加成糖基單位或從中移除一個(gè)或多個(gè)糖基單位。
文中使用術(shù)語(yǔ)“靶向部分”是指將選擇性定位于身體特定組織或區(qū)域的種類。定位由分子決定子的特異識(shí)別、靶向劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水性相互作用等介導(dǎo)。其他將試劑靶向至特定組織或區(qū)域的機(jī)制為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。示范的靶向部分包括抗體、抗體片段、運(yùn)鐵蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)等。
文中使用“治療部分”是指任何可用于治療的試劑，包括但不僅限于抗生素、抗炎劑、抗腫瘤藥物、細(xì)胞毒素和放射性試劑?！爸委煵糠帧卑ㄉ锘钚詣┣八?其中多于一個(gè)的治療部分結(jié)合在載體上的構(gòu)建體例如多價(jià)體)。治療部分還包括蛋白質(zhì)和包含蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。示范的蛋白質(zhì)包括但不僅限于粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、干擾素(例如干擾素α、-β、-γ)、白介素(例如白介素II)、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)和抗體融合蛋白質(zhì)(例如腫瘤壞死因子受體(TNFR)/Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白質(zhì))。
文中使用“可藥用載體”包括任何與綴合物組合后保留綴合物活性并與受試者免疫系統(tǒng)無(wú)反應(yīng)的物質(zhì)。實(shí)例包括但不僅限于任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體例如磷酸鹽緩沖鹽水、水、乳液(例如油/水乳液)以及多種類型的濕潤(rùn)劑。其他載體也可包括滅菌溶液、片劑(包括包衣片劑)和膠囊。一般這些載體包含賦形劑例如淀粉、乳、糖、某種類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油脂、樹膠、二元醇或其他已知賦形劑。這些載體還可包括香料添加劑或著色添加劑或其他成分。包含這些載體的組合物根據(jù)熟知的常規(guī)方法配制。
文中使用“施用”是指口服、作為栓劑使用、局部接觸、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、病灶內(nèi)或鼻內(nèi)或皮下施用，或向受試者植入緩釋裝置(例如微型滲透泵)。施用通過(guò)任何途徑進(jìn)行，包括腸胃外和跨粘膜(例如口腔的、鼻的、陰道的、直腸的或經(jīng)皮膚的)。腸胃外給藥包括例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、微動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下的、腹膜內(nèi)的、心室內(nèi)和顱內(nèi)的。另外，當(dāng)注射旨在治療腫瘤例如誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡時(shí)，可直接施用至腫瘤和/或腫瘤周圍組織。其他模式的遞送包括但不僅限于使用脂質(zhì)體制劑、靜脈輸注液、透皮貼劑等。
術(shù)語(yǔ)“改善”是指在治療病理或病癥中任何成功的標(biāo)記，包括任何客觀的或主觀的參數(shù)例如癥狀的減輕、緩和或消除或病人身體或精神狀態(tài)的改善。癥狀的改善可基于客觀的或主觀的參數(shù)，包括體格檢查和/或精神評(píng)估的結(jié)果。
術(shù)語(yǔ)“治療”是指對(duì)疾病或病癥的“治療”，包括阻止病癥或疾病在可能患該疾病但未經(jīng)歷或顯示該疾病癥狀的動(dòng)物上發(fā)生(預(yù)防療法)、抑制疾病(減緩或阻止其發(fā)展)、使得疾病癥狀或副作用減輕(包括姑息療法)和解除疾病(使疾病消退)。
術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”或任何語(yǔ)法上相等的術(shù)語(yǔ)是指當(dāng)施用于動(dòng)物以治療疾病時(shí)足夠引起對(duì)該疾病治療的數(shù)量。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指物質(zhì)，其本質(zhì)上或基本上不含有用于產(chǎn)生該物質(zhì)的成分。就本發(fā)明肽綴合物而言，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指本質(zhì)上或基本上不含有用于制備肽綴合物的混合物中通常伴隨材料的成分的材料。“分離的”和“純的”可互換使用。一般的，本發(fā)明分離的肽綴合物具有的純度水平優(yōu)選以范圍表達(dá)。肽綴合物純度范圍的下限為大約60％、大約70％或大約80％，且純度范圍的上限為大約70％、大約80％或大于大約90％。
當(dāng)肽綴合物純度大于大約90％時(shí)，其純度也優(yōu)選以范圍表示，純度范圍的下限為大約90％、大約92％、大約94％、大約96％或大約98％。純度范圍的上限為大約92％、大約94％、大約96％、大約98％或大約100％純度。
純度由領(lǐng)域公認(rèn)的任何分析方法確定(例如銀染凝膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳上的譜帶強(qiáng)度、HPLC或相似方法)文中使用“群體的基本上每個(gè)成員”描述本發(fā)明肽綴合物群體的特征，其中加至肽的選定比例的修飾的糖被加至肽上多個(gè)同樣的受體位點(diǎn)。“群體的基本上每個(gè)成員”是講與修飾的糖綴合的肽上位點(diǎn)的“同質(zhì)性”并涉及本發(fā)明的綴合物，其為至少約80％、優(yōu)選至少約90％和更優(yōu)選至少約95％同質(zhì)。
“同質(zhì)性”指與修飾的糖基結(jié)合的受體部分群體的結(jié)構(gòu)一致性。因此，在本發(fā)明肽綴合物(其中每個(gè)修飾的糖部分與受體位點(diǎn)結(jié)合，該受體位點(diǎn)與每個(gè)其他修飾的糖結(jié)合的受體位點(diǎn)有相同結(jié)構(gòu))中，肽綴合物被稱為大約100％同質(zhì)的。同質(zhì)性通常以范圍表達(dá)。肽綴合物同質(zhì)性范圍的下限為大約60％、大約70％或大約80％，且純度范圍上限為大約70％、大約80％、大約90％或大于大約90％。
當(dāng)肽綴合物大于或等于大約90％同質(zhì)時(shí)，其同質(zhì)性也優(yōu)選以范圍表達(dá)。同質(zhì)性范圍的下限為大約90％、大約92％、大約94％、大約96％或大約98％。純度范圍的上限為大約92％、大約94％、大約96％、大約98％或大約100％同質(zhì)性。肽綴合物的同質(zhì)性通常通過(guò)一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定，例如液相層析質(zhì)譜法(LC-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF)、毛細(xì)管電泳等。上述討論同樣適用于其他O-糖基化和N-糖基化位點(diǎn)。
當(dāng)涉及糖肽種類時(shí)，“基本均一的糖型”或“基本均一的糖基化模式”是指被目的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)糖基化的受體部分比例。例如，在α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶情況下，如果在本發(fā)明肽綴合物中基本所有的(如下定義)Galβ1，4-GlcNAc-R和其唾液酸化的類似物均被巖藻糖化，則存在基本均一的巖藻糖化模式。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解起始物質(zhì)可含有糖基化的受體部分(例如巖藻糖化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計(jì)算出的糖基化百分比將包括被本發(fā)明方法糖基化的受體部分以及在起始材料中已經(jīng)被糖基化的受體部分。
上述“基本均一的”定義中術(shù)語(yǔ)“基本”通常是指至少大約40％、至少大約70％、至少大約80％、或更優(yōu)選的至少大約90％，和更優(yōu)選的至少大約95％的特定糖基轉(zhuǎn)移酶受體部分被糖基化。例如，如果因子IX肽綴合物包括Ser連接的糖基殘基，群體中至少大約70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、或更優(yōu)選99.8％的肽將有相同的糖基殘基與相同的Ser殘基共價(jià)結(jié)合。
當(dāng)取代基團(tuán)被其常用由左至右寫的化學(xué)式指定時(shí)，其同等地包含由從右至左書寫所造成的化學(xué)相等的取代基，例如-CH2O-也旨在描述-OCH2-。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烴基(alkyl)”自身或作為另一取代基的一部分是指具有指定數(shù)量碳原子(即C1-C10是指一到十個(gè)碳)的直鏈或支鏈或環(huán)烴基，或其組合，其可為完全飽和的、單或多不飽和的，并可包含雙或多價(jià)基團(tuán)。飽和烴基的實(shí)例包括(但不僅限于)例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、環(huán)己基甲基、環(huán)丙甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物或異構(gòu)體。不飽和烴基為具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵的烴基。不飽和烴基的實(shí)例為(但不僅限于)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-丁二烯基、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高級(jí)同系物及異構(gòu)體。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“烴基”還旨在包括如下更詳細(xì)定義的烴衍生物，例如“雜烴基(heteroalkyl)”。被限制為碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)的烴基稱為“同烴基(homoalkyl)”。
術(shù)語(yǔ)“亞烷基”自身或作為另一取代物的部分是指來(lái)自于烷的二價(jià)基團(tuán)，如以-CH2CH2CH2CH2-(但不僅限于)為例，并還包括如下文作為“雜亞烷基”描述的那些基團(tuán)。通常，烴基(或亞烷基)基團(tuán)會(huì)有1到24個(gè)碳原子，本發(fā)明優(yōu)選具有10或更少碳原子的那些基團(tuán)?！暗图?jí)烴基”或“低級(jí)亞烷基”為較短鏈的烴基或亞烷基基團(tuán)，通常具有八個(gè)或更少的碳原子。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常規(guī)含義使用，并指各自通過(guò)氧原子、氨基或硫原子與分子剩余部分結(jié)合的烷基。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“雜烴基”自身或與另一術(shù)語(yǔ)組合是指穩(wěn)定的直鏈或支鏈或環(huán)狀烴基或其組合，由所述數(shù)量的碳原子和至少一個(gè)選自O(shè)、N、Si和S的雜原子組成，其中氮和硫原子可任選地被氧化且氮雜原子可任選地被季銨化。雜原子O、N、S和Si可被置于雜烴基基團(tuán)任何內(nèi)部位置或烴基基團(tuán)結(jié)合分子剩余部分的位置。實(shí)例包括(但不僅限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多可有兩個(gè)連續(xù)雜原子，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類似的，術(shù)語(yǔ)“雜亞烷基”自身或作為另一取代基的部分是指來(lái)自雜烴基的二價(jià)基團(tuán)，如以-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-(但不僅限于)為例。對(duì)于雜亞烷基基團(tuán)，雜原子也可占據(jù)鏈末端之一或兩端(例如亞烷氧基、亞烷基雙氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基等)。另外，對(duì)于亞烷基和雜亞烷基連接基團(tuán)，連接基團(tuán)式的書寫方向不表示連接基團(tuán)的方向。例如，式-C(O)2R’-既代表-C(O)2R＇-也代表-R′C(O)2-。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烴”和“雜環(huán)烴”自身或與其他術(shù)語(yǔ)組合分別表示“烴基”和“雜烴基”的環(huán)狀形式。另外，對(duì)雜環(huán)烴來(lái)說(shuō)，雜原子可占據(jù)雜環(huán)與分子剩余部分連接的位置。環(huán)烴的實(shí)例包括但不僅限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烴的實(shí)例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“鹵素”自身或作為另一取代基的部分是指氟、氯、溴或碘原子。另外，術(shù)語(yǔ)如“鹵烴基”旨在包括單鹵烴基和多鹵烴基。例如，術(shù)語(yǔ)“鹵代(C1-C4)烴基”旨在包括(但不僅限于)三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“芳基”是指多不飽和的、芳香族取代基，其可為單環(huán)或相互稠合或共價(jià)連接的多環(huán)(優(yōu)選1到3個(gè)環(huán))。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指包含一個(gè)到四個(gè)選自N、O和S的雜原子的芳香基團(tuán)(或環(huán))，其中氮和硫原子可任選地被氧化，且氮原子可任選地季銨化。雜芳基可通過(guò)雜原子附著于分子的剩余部分。芳基和雜芳基基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯[b]噻吩基、2，3-二氫苯[1，4]二氧芑-6基、苯[1，3]間二氧雜環(huán)戊烯-5-基和6-喹啉基。上述各芳基和雜芳基環(huán)體系的取代基選自下述合適的取代基。
簡(jiǎn)言之，與其他術(shù)語(yǔ)(例如芳氧基、arylthioxy，芳烴基)組合使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”包括如上文定義的芳基和雜芳基環(huán)。因此，術(shù)語(yǔ)“芳烴基“旨在包括其中芳基附著于烴基基團(tuán)的那些基團(tuán)(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基等)，包括其中碳原子(如亞甲基)被例如氧原子代替的烴基(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧)丙基等)。
各上述術(shù)語(yǔ)(例如“烴基”、“雜烴基”、“芳基”和“雜芳基”)旨在包括所指基團(tuán)的取代或非取代形式。下文提供了每種類型基團(tuán)的優(yōu)選的取代基。
烴基和雜烴基的取代基(包括通常被稱為亞烷基、鏈烯基、雜亞烷基、雜鏈烯基、炔基、環(huán)烴、雜環(huán)烷烴、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基)通常被稱為“烴基取代基”，且其可為一個(gè)或多個(gè)選自(但不僅限于)-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R、-OC(O)R’-、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2的基團(tuán)，數(shù)量從0到(2m’+1)，其中m’為該基團(tuán)中碳原子總數(shù)量。R′、R″、R和R””各自優(yōu)選獨(dú)立的表示氫、取代或非取代的雜烴基、取代或非取代的芳基(例如1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、取代或非取代的烴基、烷氧基、或硫代烷氧基基團(tuán)或芳烴基。當(dāng)本發(fā)明化合物包含多于一個(gè)R基團(tuán)，例如當(dāng)存在超過(guò)一個(gè)這些基團(tuán)時(shí)每個(gè)R基團(tuán)被獨(dú)立地選擇例如各自為R′、R″、R和R””。當(dāng)R’和R”結(jié)合在同一氮原子上時(shí)，它們可與氮原子一起形成5-、6-或7-元的環(huán)。例如，-NR’R”旨在包括但不僅限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據(jù)上述取代基的討論，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解術(shù)語(yǔ)“烴基”旨在包括含有與除氫基團(tuán)外基團(tuán)例如鹵烴基(例如-CF3和-CF2CF3)和?；?例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)結(jié)合的碳原子的基團(tuán)。
與烴基的取代基類似，芳基和雜芳基基團(tuán)的取代基通常被稱為“芳基取代基”。該取代基選自例如鹵素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烴基，數(shù)量從0到芳環(huán)體系開價(jià)的總數(shù)量；且其中R′、R″、R和R””優(yōu)選的獨(dú)立選自氫、取代或非取代的烴基、取代或非取代的雜烴基、取代或非取代的芳基和取代或非取代的雜芳基。當(dāng)本發(fā)明化合物包含多于一個(gè)R基團(tuán)，例如當(dāng)存在多于一個(gè)這些基團(tuán)時(shí)每個(gè)R基團(tuán)被獨(dú)立地選擇例如各自為R′、R″、R和R””。在下面的方案中，符號(hào)X代表上述的“R”。
芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選地被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基代替，其中T和U獨(dú)立地為-NR-、-O-、-CRR’-或單鍵，且q為從0到3的整數(shù)?；蛘撸蓟螂s芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選地被式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B獨(dú)立的為-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或單鍵，且r為從1到4的整數(shù)。這樣形成的新環(huán)的一個(gè)單鍵可任選地被雙鍵代替。或者，芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個(gè)取代基可任選地被式-(CRR′)s-X-(CR”R)d-的取代基代替，其中s和d獨(dú)立地為從0到3的整數(shù)，且X為-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S-(O)2NR＇-。取代基R、R′、R″和R優(yōu)選獨(dú)立選自氫或取代的或非取代的(C1-C6)烴基。
文中使用術(shù)語(yǔ)“雜原子”旨在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
序論如上所述，因子IX在凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中是至關(guān)重要的。圖1提供了因子IX的結(jié)構(gòu)和序列。體內(nèi)因子IX的缺乏表征了一種類型的血友病(B型)。該疾病的治療通常限于靜脈傳輸因子IX的人血漿蛋白濃縮物。然而，除時(shí)間和費(fèi)用的實(shí)踐缺點(diǎn)外，傳輸血液濃縮物涉及使病人傳染病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合癥或血栓栓塞性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
當(dāng)因子IX證明其自身是治療應(yīng)用的重要和有用化合物時(shí)，從重組細(xì)胞制備因子IX的現(xiàn)有方法(U.S.專利No.4,770,999)引起具有相當(dāng)短生物學(xué)半衰期以及不準(zhǔn)確糖基化方式的產(chǎn)物，該產(chǎn)物可能引起免疫原性、功能缺失、對(duì)達(dá)到相同效應(yīng)的更大和更頻繁劑量的提高的需要等。
為了提高用于治療目的的重組因子IX的效力，本發(fā)明提供了糖基化的和非糖基化的因子IX肽與多聚體如PEG(m-PEG)、PPG(m-PPG)等的綴合物。該綴合物可另外地或可選地通過(guò)與不同種類例如治療部分、診斷部分、靶向部分等進(jìn)一步綴合而被修飾。
本發(fā)明的綴合物通過(guò)修飾的糖酶促附著至糖基化或非糖基化的肽上形成。糖基化位點(diǎn)和糖殘基為修飾基團(tuán)綴合(例如通過(guò)糖綴合)肽提供了位點(diǎn)。示范的修飾基團(tuán)為水溶性多聚體，如聚乙二醇(例如甲氧基聚乙二醇)。因子IX肽的修飾可促進(jìn)重組的因子IX在患者循環(huán)中的穩(wěn)定性和滯留時(shí)間，和/或減少重組的因子IX的抗原性。
本發(fā)明的方法使得裝配具有基本上同質(zhì)衍生模式的肽和糖肽成為可能。本發(fā)明中使用的酶通常對(duì)肽的特定的氨基酸殘基、氨基酸殘基組合或特定的糖基殘基具有選擇性。該方法也實(shí)用于大規(guī)模制備修飾肽和糖肽。因此，本發(fā)明的方法提供了大規(guī)模制備具有預(yù)選的均一衍生模式的糖肽的實(shí)用方法。
本發(fā)明還提供了具有提高的治療半衰期(歸功于例如降低的清除率，或降低的被免疫系統(tǒng)或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吸收的速率)的糖基化或非糖基化肽綴合物。此外，本發(fā)明的方法提供了掩蔽肽上抗原決定簇的方法，從而降低或消除了對(duì)該肽的宿主免疫應(yīng)答。也可使用靶向劑的選擇性附著以將肽靶向至對(duì)特定靶向劑特異的特定組織或細(xì)胞表面受體。
綴合物首先，本發(fā)明提供了選擇的修飾基團(tuán)和因子IX肽之間的綴合物。
肽和修飾基團(tuán)之間的連接包括插入肽和選定部分之間的糖基連接基團(tuán)。如文中所述，選定的部分基本上是任意可附著在糖單位上，產(chǎn)生被合適的轉(zhuǎn)移酶(其將修飾的糖加至肽上)識(shí)別的“修飾的糖”的種類。修飾的糖的糖元件被插入肽和選定的部分之間時(shí)，成為“糖基連接基團(tuán)”，例如“完整的糖基連接基團(tuán)”。糖基連接基團(tuán)由任何在用修飾基團(tuán)修飾后成為酶(其將修飾的糖加至肽的氨基酸或糖基殘基上)底物的單糖或寡糖形成。
糖基連接基團(tuán)可為，或可包括，在加入修飾基團(tuán)前或加入修飾基團(tuán)時(shí)被降解性修飾的糖部分。例如，糖基連接基團(tuán)可衍生自糖殘基，其由完整糖例如通過(guò)偏高碘酸的作用氧化降解為相應(yīng)的醛，并隨后用適當(dāng)?shù)陌忿D(zhuǎn)化為席夫堿，然后還原為相應(yīng)的胺。
示范的本發(fā)明綴合物符合一般的結(jié)構(gòu) 其中符號(hào)a、b、c、d和s代表正的非零整數(shù)；且t為0或正整數(shù)?！霸噭睘橹委焺?、生物活性劑、可探測(cè)標(biāo)記、水溶性部分(例如PEG、m-PEG、PPG和m-PPG)等。“試劑”可為肽例如酶、抗體、抗原等。接頭可為任何廣范圍的連接基團(tuán)，如下?；蛘?，接頭可為單鍵或“零級(jí)接頭”。
在示范的實(shí)施方案中，選擇的修飾基團(tuán)為水溶性多聚體如m-PEG。水溶性多聚體通過(guò)糖基連接基團(tuán)共價(jià)附著在肽上。糖基連接基團(tuán)共價(jià)附著于肽的氨基酸殘基或糖基殘基上。本發(fā)明還提供了氨基酸殘基和糖殘基用糖基連接基團(tuán)修飾的綴合物。
示范的水溶性多聚體為聚乙二醇例如甲氧基聚乙二醇。本發(fā)明使用的聚乙二醇不受限制于任何特定的形式或分子量范圍。對(duì)于非分支的聚乙二醇分子，分子量?jī)?yōu)選在500和100,000之間。優(yōu)選使用分子量2,000-60,000道爾頓且更優(yōu)選從大約5,000至大約30,000道爾頓。
在另一實(shí)施方案中，聚乙二醇為含有多于一個(gè)附著的PEG部分的分支PEG。分支PEG的實(shí)例描述于U.S.專利No.5,932,462；U.S.專利No.5,342,940；U.S.專利No.5,643,575；U.S.專利No.5,919,455；U.S.專利No.6,113,906；U.S.專利No.5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；和Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。文中公開了另外的分支多聚體種類。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分支PEG的各聚乙二醇分子量等于或大于大約2,000、5,000、10,000、15,000、20,000、40,000、50,000和60,000道爾頓。
除提供通過(guò)酶促加入糖基連接基團(tuán)形成的綴合物外，本發(fā)明提供取代模式高度同質(zhì)的綴合物。使用本發(fā)明的方法可能形成肽綴合物，其中本發(fā)明綴合物群體中基本上所有修飾的糖部分都結(jié)合在多拷貝結(jié)構(gòu)一致的氨基酸或糖基殘基上。因此，另一方面，本發(fā)明提供了具有通過(guò)完整的糖基連接基團(tuán)共價(jià)結(jié)合肽的水溶性多聚體部分群體的肽綴合物。在優(yōu)選的本發(fā)明綴合物中，群體中基本上每個(gè)成員通過(guò)糖基連接基團(tuán)結(jié)合肽糖基殘基，且糖基連接基團(tuán)結(jié)合的各肽糖基殘基具有相同的結(jié)構(gòu)。
還提供了具有通過(guò)糖基連接基團(tuán)與之結(jié)合的水溶性多聚體部分群體的肽綴合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，水溶性多聚體部分群體中的基本上每個(gè)成員通過(guò)糖基連接基團(tuán)結(jié)合肽的氨基酸殘基，且糖基連接基團(tuán)附著的各氨基酸殘基具有相同的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還提供了上述綴合物的類似綴合物，其中肽通過(guò)完整的糖基連接基團(tuán)綴合治療部分、診斷部分、靶向部分、毒素部分等。上述各部分可為小分子、天然多聚體(如多肽)或合成多聚體。本發(fā)明的肽包含至少一個(gè)N-或O-連接的糖基化位點(diǎn)，其被包括PEG部分的糖基殘基糖基化。PEG通過(guò)完整的糖基連接基團(tuán)共價(jià)附著于因子IX肽。糖基連接基團(tuán)共價(jià)附著于因子IX肽的氨基酸殘基或糖基殘基?；蛘?，糖基連接基團(tuán)附著于糖肽的一個(gè)或多個(gè)糖基單位。本發(fā)明還提供糖基連接基團(tuán)既附著于氨基酸殘基又附著于糖基殘基的綴合物。
在示范的實(shí)施方案中，因子IX肽包含具有式
的部分。
在上式中，D選自-OH和R1-L-HN-。G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基。R1為包含直鏈或支鏈聚乙二醇?xì)埢牟糠?。L為接頭，其為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的成員。因此，當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，而當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-NH-。
在一個(gè)實(shí)施方案中，R1-L具有式 其中a為0至20的整數(shù)。
在示范的實(shí)施方案中，R1具有選自 的結(jié)構(gòu)，其中e和f為獨(dú)立地選自從1到2500的整數(shù)，而q為從1到20的整數(shù)。在其他實(shí)施方案中，R1具有選自
的結(jié)構(gòu)，其中e、f和f’為獨(dú)立地選自從1到2500的整數(shù)，而q和q’為獨(dú)立地選自1到20的整數(shù)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供因子IX肽綴合物，其中R1具有選自
的結(jié)構(gòu)，其中e、f和f’為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)；而q、q’和q’’為獨(dú)立的選自1到20的整數(shù)。
在其他實(shí)施方案中，R1具有選自 的結(jié)構(gòu)，其中e和f為獨(dú)立地選自1到2500的整數(shù)。
在另一示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有式 的部分的肽。該Gal可附著于氨基酸或直接或間接(例如通過(guò)糖基殘基)附著于氨基酸的糖基殘基上。
在其他實(shí)施方案中，該部分具有式
Gal可附著于氨基酸或直接或間接(例如通過(guò)糖基殘基)附著于氨基酸的糖基殘基上。
在示范的實(shí)施方案中，該結(jié)構(gòu)伴隨因子IX上O-糖基化位點(diǎn)的糖基聚乙二醇化(圖2B)在另一示范的實(shí)施方案中，該肽包含根據(jù)式 的部分，其中AA為所述肽的氨基酸殘基，且在上述的每個(gè)結(jié)構(gòu)中，D和G如文中所述。
示范的肽氨基酸殘基(一個(gè)或多個(gè)上述種類可與之綴合)包括絲氨酸和蘇氨酸，例如SEQ.ID.NO1的絲氨酸53或61或蘇氨酸159、162或172。
在另一示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有式 的糖基殘基的因子IX綴合物。
其中a、b、c、d、i、r、s、t和u為獨(dú)立地選自0和1的整數(shù)。指數(shù)q為1。指數(shù)e、f、g和h獨(dú)立地選自從0到6的整數(shù)。指數(shù)j、k、l和m為獨(dú)立地選自從0到100的整數(shù)。指數(shù)v、w、x和y獨(dú)立地選自0和1，且v、w、x和y中至少一個(gè)為1。符號(hào)AA代表因子IX肽的氨基酸殘基。
符號(hào)Sia-(R)代表具有式 的基團(tuán)，其中D選自-OH和R1-L-HN-。符號(hào)G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烴基。R1代表包括直鏈或支鏈聚乙二醇?xì)埢牟糠?。L為接頭，其為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的成員。一般的，當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，而當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-HN-。
在另一個(gè)示范的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的綴合物中PEG修飾的唾液酸部分具有式 其中“s”代表從0到20的整數(shù)，且n為從1到2500的整數(shù)。在選定的實(shí)施方案中，s為1而PEG為大約20kD。
在另一示范的實(shí)施方案中，PEG修飾的唾液酸具有式
其中L為連接唾液酸部分和PEG部分的取代或非取代烴基或取代或非取代的雜烴基接頭部分。
在示范的實(shí)施方案中，其中糖基殘基具有上文公開的結(jié)構(gòu)，其與Asn157和Asn167的一個(gè)或二者都綴合。
因子IX已被克隆及測(cè)序?；旧暇哂腥魏涡蛄械娜魏我蜃覫X肽被作為本發(fā)明綴合物的因子IX肽組分使用。在示范的實(shí)施方案中，該肽具有SEQ ID NO1給出的序列YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT.
本發(fā)明絕非僅限于文中公開的序列。因子IX變體為本領(lǐng)域所熟知的，如描述于例如U.S.專利Nos.4,770,999、5,521,070(其中第一個(gè)位置的酪氨酸被丙氨酸取代)、U.S.專利No.6,037,452(其中因子X(jué)I與烯化氧基團(tuán)連接)和U.S.專利No.6,046,380(其中編碼因子IX的DNA在至少一個(gè)剪接位點(diǎn)被修飾)。如文中所指，因子IX的變體為本領(lǐng)域所熟知的，且本公開內(nèi)容包括這些已知的或?qū)?lái)將要發(fā)展的或公開的變體。
用于確定突變的或修飾的因子IX活性的方法可通過(guò)使用本領(lǐng)域描述的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如如Biggs(1972，Human Blood CoagulationHaemostasis and Thrombosis第一版，Oxford，Blackwell，Scientific，614頁(yè))中所述的一步活化部分凝血致活酶時(shí)間實(shí)驗(yàn)法。簡(jiǎn)言之，為了測(cè)定根據(jù)本發(fā)明方法發(fā)展的因子IX分子的生物活性，該測(cè)定法可使用等體積的活化部分凝血致活酶試劑、使用本領(lǐng)域熟知的無(wú)菌靜脈切開放血術(shù)從血友病B患者中分離的缺乏因子IX的血漿和正?；旌涎獫{作為標(biāo)準(zhǔn)，或樣品來(lái)完成。在該實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)單位的活性被定義為一毫升正?；旌涎獫{中存在的數(shù)量。另外，根據(jù)因子IX將缺乏因子IX患者的血漿凝血時(shí)間降低至正常能力測(cè)定生物活性可如例如Proctor和Rapaport(Amer.J.Clin.Path.36212(1961)所述來(lái)完成。
本發(fā)明的肽包括至少一個(gè)N連接或O連接的糖基化位點(diǎn)，其中至少一個(gè)與包含PEG部分的糖基殘基綴合。PEG通過(guò)完整的糖基連接基團(tuán)共價(jià)附著于肽。該糖基連接基團(tuán)共價(jià)附著于肽的氨基酸殘基或糖基殘基?；蛘?，糖基連接基團(tuán)附著于糖肽的一個(gè)或多個(gè)糖基單位。本發(fā)明還提供綴合物，其中糖基連接基團(tuán)既附著于氨基酸殘基又附著于糖基殘基。
PEG部分直接附著于完整的糖基接頭，或通過(guò)非糖基接頭(例如取代或非取代的烴基、取代或非取代的雜烴基)附著。
修飾的糖本發(fā)明使用修飾的糖和修飾的糖核苷酸以形成修飾的糖的綴合物。在本發(fā)明的修飾的糖化合物中，糖部分優(yōu)選為糖、脫氧糖、氨基糖或N-?；?。術(shù)語(yǔ)“糖”及其等價(jià)物″糖基″是指單體、二聚體、寡聚體和多聚體。糖部分還用修飾基團(tuán)官能化。修飾基團(tuán)通常通過(guò)與糖上胺、巰基或羥基(例如伯羥基)部分綴合而綴合在糖部分上。在示范的實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)通過(guò)胺部分附著在糖上，例如通過(guò)在胺與修飾基團(tuán)的活性衍生物間反應(yīng)形成的酰胺、氨基甲酸乙酯或脲。
任何糖可用于本發(fā)明綴合物的糖核心。在形成本發(fā)明組合物時(shí)有用的示范的糖核心包括但不僅限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖和唾液酸。其他有用的糖包括氨基糖例如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-氨基類似物等。糖核心可為天然存在的結(jié)構(gòu)或其可被修飾以產(chǎn)生用于綴合修飾基團(tuán)的位點(diǎn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供唾液酸衍生物，其中9-羥基部分被胺代替。該胺非常容易用選擇的修飾基團(tuán)的活性類似物衍生。
在示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用具有式 的修飾的糖胺。其中G為糖基部分，L為鍵或接頭而R1為修飾基團(tuán)。示范的鍵為糖基部分上NH2和修飾基團(tuán)上互補(bǔ)反應(yīng)性的基團(tuán)之間形成的鍵。因此，示范的鍵包括(但不局限于)NHR1、OR1、SR1等。例如，當(dāng)R1包含羧酸部分時(shí)，該部分可被激活并與糖基殘基上NH2部分偶聯(lián)，提供具有NHC(O)R1結(jié)構(gòu)的鍵。類似的，OH和SH基團(tuán)可各自轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醚或硫醚衍生物。
示范的接頭包括烴基和雜烴基部分。接頭包括連接基團(tuán)，例如以?；鶠榛A(chǔ)的連接基團(tuán)如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。連接基團(tuán)為本發(fā)明種類組分之間形成的鍵，例如在糖基部分和接頭(L)之間，或接頭和修飾基團(tuán)(R1)之間。其他連接基團(tuán)為醚、硫醚和胺。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭為氨基酸殘基，例如甘氨酸殘基。甘氨酸的羧酸部分通過(guò)與糖基殘基上的胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺，且甘氨酸的胺通過(guò)與修飾基團(tuán)上活性羧酸或碳酸酯反應(yīng)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺或氨基甲酸乙酯。
另一個(gè)示范的接頭為PEG部分或用氨基酸殘基官能化的PEG部分。該P(yáng)EG通過(guò)PEG一端的氨基酸殘基與糖基基團(tuán)結(jié)合并通過(guò)另一PEG末端與R1結(jié)合。或者，氨基酸殘基結(jié)合R1而不與氨基酸結(jié)合的PEG端與糖基基團(tuán)結(jié)合。
可作為NH-L-R1范例的種類有式-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1，其中指數(shù)s和t為獨(dú)立的0或1。指數(shù)a、b和d為獨(dú)立的從0到20的整數(shù)，且c為從1到2500的整數(shù)。其他類似的接頭以其中-NH部分被另一基團(tuán)例如-S、-O或-CH2代替的種類為基礎(chǔ)。
更具體的，本發(fā)明利用其中NH-L-R1為NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1的化合物。在這些式中，指數(shù)a、b和d為獨(dú)立選自從0到20的整數(shù)，優(yōu)選從1到5。指數(shù)c為1到2500的整數(shù)。
在下面的討論中，本發(fā)明使用選定的唾液酸衍生物進(jìn)行說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可討論著眼于說(shuō)明的清晰度且公開的結(jié)構(gòu)和組成通常適用于糖基團(tuán)、修飾的糖基團(tuán)、有活性的修飾的糖基團(tuán)和修飾的糖基團(tuán)綴合物種類。
在說(shuō)明性的實(shí)施方案中，G為唾液酸且本發(fā)明使用的選定的化合物具有式
如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，上面示范的化合物中唾液酸部分可用任何其他的氨基糖代替，包括但不局限于葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、它們的N-乙?；苌锏?。
在另一說(shuō)明性的實(shí)施方案中，糖的伯羥基部分用修飾基團(tuán)官能化。例如，唾液酸的9-羥基可轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胺并官能化以產(chǎn)生本發(fā)明的化合物。根據(jù)該實(shí)施方案的通式包括 在另一示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用修飾的糖，其中6-羥基的位置轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胺部分，該部分帶有例如上面公開的接頭-修飾基團(tuán)盒。可作為這些修飾的糖的核心的示范的糖基團(tuán)包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。根據(jù)該實(shí)施方案代表性的修飾的糖具有式
其中R3-R5和R7為獨(dú)立選自H、OH、C(O)CH3、NH和NHC(O)CH3的成員。R6為如上所述的OR1、NHR1或NH-L-R1。
本發(fā)明使用的選定的綴合物基于甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或基于具有甘露糖、半乳糖或葡萄糖立體化學(xué)的種類。這些化合物的通式為 在另一示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用如上公開的活化為相應(yīng)的核苷酸糖的化合物。本發(fā)明使用的示范的糖核苷酸的修飾形式包括核苷酸單、雙或三磷酸或其類似物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更優(yōu)選地，修飾的糖核苷酸的糖核苷酸部分選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在示范的實(shí)施方案中，核苷酸磷酸附著于C-1。
因此，在糖基部分為唾液酸的說(shuō)明性的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用具有式
的化合物。其中L-R1如上所述，且L1-R1代表結(jié)合修飾基團(tuán)的接頭。如同L，根據(jù)L1的示范的接頭類型包括鍵、烴基或雜烴基部分。根據(jù)這些實(shí)施方案，示范的修飾的糖核苷酸化合物在圖7和圖8中公開。
在另一示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明修飾的糖和底物因子IX肽之間形成的綴合物。在該實(shí)施方案中，修飾的糖的糖部分成為底物和修飾基團(tuán)間的糖基連接基團(tuán)。示范的糖基連接基團(tuán)為完整的糖基連接基團(tuán)，其中形成連接基團(tuán)的糖基部分不被化學(xué)(如偏高碘酸鈉)或酶(如氧化酶)降解。本發(fā)明選定的綴合物包含結(jié)合在氨基糖(例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等)的胺部分的修飾基團(tuán)。根據(jù)該基序的示范的修飾基團(tuán)-完整的糖基連接基團(tuán)盒基于唾液酸結(jié)構(gòu)，例如具有式 的那些。
在上式中，L1和R1如上所述。
在另一示范的實(shí)施方案中，綴合物在底物因子IX和糖部分之間形成，其中修飾基團(tuán)通過(guò)糖基部分6-碳位置的接頭附著。因此，根據(jù)該實(shí)施方案的說(shuō)明性的綴合物具有式 其中基團(tuán)如上所述。技術(shù)人員將理解上面公開的修飾的糖部分還可通過(guò)2、3、4、或5碳原子上的氧或氮原子與底物綴合。
該實(shí)施方案中使用的說(shuō)明性化合物包括具有式 的化合物，其中R基團(tuán)和指數(shù)如上所述。
本發(fā)明還提供了用L-R1在6-碳位置修飾的糖核苷酸用途。根據(jù)本實(shí)施方案的示范的種類包括
其中R基團(tuán)和L代表上述部分。指數(shù)“y”為0、1或2。
本發(fā)明使用的另一示范的核苷酸糖基于具有GDP甘露糖立體化學(xué)的種類。根據(jù)本實(shí)施方案示范的種類有結(jié)構(gòu) 在另一示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了綴合物，其中修飾的糖基于UDP半乳糖的立體化學(xué)。本發(fā)明使用的示范的核苷酸糖有結(jié)構(gòu)
在另一示范的實(shí)施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立體化學(xué)。根據(jù)本實(shí)施方案的示范的種類有式 修飾基團(tuán)R1為許多種類例如水溶性多聚體、水不溶性多聚體、治療劑、診斷劑等中之任一。示范的修飾基團(tuán)性質(zhì)在下文更詳細(xì)地描述。
修飾基團(tuán)水溶性多聚體許多水溶性多聚體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并在實(shí)踐本發(fā)明中有用。術(shù)語(yǔ)水溶性多聚體包括例如糖(例如葡聚糖、直鏈淀粉、透明質(zhì)酸、聚唾液酸、類肝素、肝素等)、聚氨基酸(例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸)、核酸、合成聚合體(如聚丙烯酸、聚醚例如聚乙二醇)、肽、蛋白質(zhì)等種類。本發(fā)明可應(yīng)用任何水溶性多聚體，唯一的限制為該多聚體必須包含綴合物剩余部分可與之綴合的位點(diǎn)。
活化多聚體的方法還可見(jiàn)WO 94/17039、U.S.專利No.5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193，U.S.專利No.5,219,564、U.S.專利No.5,122,614、WO 90/13540、U.S.專利No.5,281,698以及WO 93/15189，且關(guān)于活化的多聚體和肽例如凝血因子VIII(WO94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、氧載體分子(U.S.專利No.4,412,989)核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
優(yōu)選的水溶性多聚體為多聚體樣品中大部分多聚體分子有大致相同的分子量；這樣的多聚體為″單分布的(homodisperse)″。
還通過(guò)聚乙二醇綴合物說(shuō)明了本發(fā)明?？色@得若干關(guān)于PEG官能化和綴合的綜述和專題文章。見(jiàn)例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology，13530-65(1987)；Wong等，EnzymeMicrob.Technol.14866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra等，Pharmazie，575-29(2002)。制備反應(yīng)性PEG分子并使用反應(yīng)性分子形成綴合物的途徑為本領(lǐng)域已知。例如U.S.專利No.5,672,662公開了選自線性或分支聚環(huán)氧烷、聚(氧乙基化的多元醇)、聚烯醇和聚烯丙酰嗎啉的多聚體酸的活性酯的水溶性且可分離的綴合物。
U.S.專利No.6,376,604公開了通過(guò)將多聚體的末端羥基與雙(1-苯三唑基碳酸酯)在有機(jī)溶劑中反應(yīng)制備水溶性且非肽多聚體的水溶性1-苯三唑基碳酸酯的方法。該活性酯用于與生物活性劑例如蛋白質(zhì)或肽形成綴合物。
WO 99/45964描述了包含生物活性劑和活性水溶性多聚體的綴合物，其包含的多聚體主鏈有至少一個(gè)末端與多聚體主鏈通過(guò)穩(wěn)定鍵連接，其中至少一個(gè)末端含有具有與分支部分連接的近端反應(yīng)基團(tuán)的分支部分，其中生物活性劑與至少一個(gè)近端反應(yīng)基團(tuán)連接。其他分支聚乙二醇描述于WO 96/21469、U.S.專利No.5,932,462描述了由包含含有反應(yīng)官能團(tuán)的分支末端的分支PEG分子形成的綴合物。自由反應(yīng)基團(tuán)能夠與生物活性種類例如蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)，形成聚乙二醇和生物活性種類間的綴合物。U.S.專利No.5,446,090描述了雙功能PEG接頭及其在形成PEG接頭兩端均有肽的綴合物中的用途。
包含可降解PEG鍵的綴合物描述于WO 99/34833；和WO 99/14259，以及U.S.專利No.6,348,558。這些可降解鍵適用于本發(fā)明。
在本發(fā)明上下文中，在文中公開的分支多聚體的形成和這些分支多聚體與其他種類例如糖、糖核苷酸等綴合中使用上面公開的本領(lǐng)域公認(rèn)的多聚體活化方法。
本發(fā)明中使用的示范的聚乙二醇分子包括但不僅限于具有式 的聚乙二醇分子。其中R8為H、OH、NH2、取代或未取代的烴基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烴基、取代或未取代的雜烴基，例如縮醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q、或-(CH2)qC(Y)Z1。指數(shù)“e”表示從1到2500的整數(shù)。指數(shù)b、d和q獨(dú)立地表示從0到20的整數(shù)。符號(hào)Z和Z1獨(dú)立的表示OH、NH2、離去基團(tuán)例如咪唑、對(duì)硝基苯基、HOBT、四唑、鹵化物、S-R9、活性酯類的醇部分；-(CH2)pC(Y1)V或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符號(hào)Y表示H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符號(hào)X、Y、Y1、A1和U獨(dú)立的表示部分O、S、N-R11。符號(hào)V表示OH、NH2、鹵素、S-R12、活性酯類的醇部分、活性酰胺的胺部分、糖核苷酸和蛋白質(zhì)。指數(shù)p、q、s和v為獨(dú)立地選自0到20整數(shù)的成員。符號(hào)R9、R10、R11和R12獨(dú)立地表示H、取代或未取代的烴基、取代或未取代的雜烴基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜環(huán)烴基和取代或未取代的雜芳基。
在另一示范的實(shí)施方案中，聚乙二醇分子選自下面
在形成本發(fā)明綴合物中有用的聚乙二醇可為線性或分支的。適用于本發(fā)明用途的分支聚乙二醇分子包括但不僅限于下式所述的 其中R8和R8’獨(dú)立地選自上文定義為R8的基團(tuán)。A1和A2獨(dú)立地選自上文定義為A1的基團(tuán)。指數(shù)e、f、o和q如上所述。Z和Y如上所述。X1和X1’獨(dú)立的選自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH。
在其他示范的實(shí)施方案中，分支PEG基于半胱氨酸、絲氨酸和雙賴氨酸核心。因此，更多的示范的分支PEG包括
在另一實(shí)施方案中，分支PEG部分基于三賴氨酸肽。該三賴氨酸可被單、雙、三或四PEG化。根據(jù)該實(shí)施方案示范的種類具有式 其中e、f和f’獨(dú)立地選自從1到2500的整數(shù)；且q、q’和q”獨(dú)立選自從1到20的整數(shù)。
在本發(fā)明示范的實(shí)施方案中，PEG為m-PEG(5kD、10kD、15kD、20kD或30kD)。示范的分支PEG種類為絲氨酸或半胱氨酸-(m-PEG)2，其中m-PEG為20KD的m-PEG。
如技術(shù)人員將理解的，本發(fā)明使用的分支多聚體包括上文公開的主題的變體。例如上面所示雙賴氨酸-PEG綴合物可包含三個(gè)聚合的亞基，第三個(gè)結(jié)合在上文結(jié)構(gòu)中顯示未修飾的α-胺上。類似地，用三個(gè)或四個(gè)聚合的亞基官能化的三賴氨酸的應(yīng)用在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明使用的另外的示范的種類包括
和這些種類的碳酸酯及活性酯，例如 其他適合于活化制備文中公開的化合物時(shí)使用的線性PEG的活化基團(tuán)或離去基團(tuán)包括，但不僅限于種類
被這些和其他種類活化的PEG分子和制造活化的PEG的方法在WO04/083259中公開。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解分支多聚體的一個(gè)或多個(gè)m-PEG臂可被具有不同末端例如OH、COOH、NH2、C2-C10-烴基等的PEG部分替代。另外，上述結(jié)構(gòu)容易通過(guò)在α-碳原子和“氨基酸”側(cè)鏈官能團(tuán)之間插入烴基接頭(或去除碳原子)而被修飾。因此，“同系”衍生物及高級(jí)同系物，以及低級(jí)同系物為本發(fā)明使用的分支PEG的有用“氨基酸”核心。
文中公開的分支PEG種類通過(guò)例如下面方案公開的方法可容易地制備 其中Xa為O或S且r為從1到5的整數(shù)。參數(shù)e和f為從1到2500的獨(dú)立選擇的整數(shù)。
因此，根據(jù)該方案，天然或非天然的氨基酸與活性m-PEG衍生物接觸(在本情況下為甲苯磺酸酯)，通過(guò)烷化側(cè)鏈雜原子X(jué)a而形成1。單官能化的m-PEG氨基酸與活性m-PEG衍生物處于N-?；瘲l件下，從而組合成分支m-PEG2。如技術(shù)人員會(huì)理解的，甲苯磺酸離去基團(tuán)可用任何合適的離去基團(tuán)代替，例如鹵素、甲磺酸、三氟甲基磺酸酯等。類似的，用于?；返姆磻?yīng)性碳酸酯可用活性酯例如N-羥基琥珀酰亞胺等代替，或該酸可用脫水劑如二環(huán)己基碳二亞胺、羰二咪唑等原位活化。
在示范的實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)為PEG部分，然而，任何修飾基團(tuán)(如水溶性多聚體、水不溶性多聚體、治療部分等)可通過(guò)適當(dāng)?shù)逆I被整合進(jìn)糖基部分。修飾的糖通過(guò)酶方法、化學(xué)方法或其組合形成，從而產(chǎn)生修飾的糖。在示范的實(shí)施方案中，糖在任何允許修飾基團(tuán)結(jié)合并仍然允許糖作為能夠?qū)⑿揎椀奶桥c肽偶合的酶的底物的位點(diǎn)用活性胺取代。在示范的實(shí)施方案中，當(dāng)半乳糖胺為修飾的糖時(shí)，胺部分在6-位附著于碳原子。
水溶性多聚體修飾的種類本發(fā)明使用水溶性多聚體修飾的核苷酸糖種類，其中糖部分用水溶性多聚體修飾。示范的修飾的糖核苷酸帶有通過(guò)糖上胺部分修飾的糖基團(tuán)。修飾的糖核苷酸例如糖核苷酸的糖基胺衍生物在本發(fā)明的方法中也是有用的。例如(無(wú)修飾基團(tuán)的)糖基胺可與肽(或其他種類)酶促綴合且游離的糖基胺部分隨后與所需的修飾基團(tuán)綴合。另外，修飾的糖核苷酸可作為將修飾糖轉(zhuǎn)移至底物(例如肽、糖肽、脂類、苷元(aglycone)、糖脂等)上糖基受體的酶的底物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，糖核心為半乳糖或葡萄糖，R5為NHC(O)Y。
在示范的實(shí)施方案中，修飾的糖基于6-氨基-N-乙?；?糖部分。如下所示關(guān)于N-乙酰半乳糖胺，6-氨基-糖部分通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法容易制得。
在上圖中，指數(shù)n表示從1到2500的整數(shù)，優(yōu)選從10到2500，并更優(yōu)選從10到1200。符號(hào)“A”表示活化基團(tuán)，例如鹵素、活性酯(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)的組分、碳酸酯(對(duì)硝基苯基碳酸酯)的組分等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，其他PEG-酰胺核苷酸糖通過(guò)該方法及類似方法可容易制得。
在其他示范的實(shí)施方案中，酰胺部分被基團(tuán)例如氨基甲酸乙酯或尿素代替。
在另一實(shí)施方案中，R1為分支PEG，例如上文公開的種類之一。根據(jù)本實(shí)施方案的說(shuō)明性化合物包括
其中X4為鍵或O。
另外，如上所討論的，本發(fā)明提供用水溶性多聚體修飾的核苷酸糖，其可為直鏈或分支的。例如，有下示式的化合物在本發(fā)明范圍內(nèi)
其中X4為鍵或O。
類似的，本發(fā)明提供那些修飾的糖種類的核苷酸糖，其中6-位碳被修飾 其中X4為O或鍵。
還提供了包含本發(fā)明組成的肽和糖肽、脂和糖脂的綴合物。例如，本發(fā)明提供了有下式的綴合物
水不溶性多聚體在另一實(shí)施方案中，與上面所討論的類似，修飾的糖包括水不溶性多聚體而非水溶性多聚體。本發(fā)明的綴合物也可以包括一個(gè)或多個(gè)水不溶性多聚體。本發(fā)明的本實(shí)施方案通過(guò)綴合物作為以受控方式投送治療肽的載體的用途進(jìn)行說(shuō)明。多聚體藥物投送系統(tǒng)為本領(lǐng)域已知。參閱如Dunn等編輯，《POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS》，ACS Symposium Series 469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，基本上所有已知的藥物投送系統(tǒng)都可應(yīng)用于本發(fā)明的綴合物。
代表性水不溶性多聚體包括但不僅限于polyphosphazines、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷基、聚丙烯酰胺、聚亞烷基二醇、聚環(huán)氧烷、聚亞烷基對(duì)苯二酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚異丁烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚異丁烯酸己酯、聚異丁烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚異丁烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)苯二酸乙酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、pluronics和聚乙烯苯酚及其共聚物。
可用于本發(fā)明綴合物的合成修飾的天然多聚體包括但不僅限于烴基纖維素、羥烴基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。多種合成修飾的天然多聚體中特別優(yōu)選的成員包括但不僅限于甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素、三醋酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽和丙烯酸和甲基丙烯酸酯和藻酸的多聚體。
本文中討論的這些和其他多聚體可以便利地從商業(yè)來(lái)源如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)獲得，或使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從這些供應(yīng)商處獲得的單體合成。
可用于本發(fā)明綴合物的代表性可生物降解多聚體包括但不僅限于聚乳酸交酯、聚乙醇酸交酯及其共聚物，聚對(duì)苯二酸乙酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共-己內(nèi)酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酐、聚原酸酯及其混合物和共聚物。特別有用的是形成凝膠的組合物，如含有膠原、pluronics等等的那些。
可用于本發(fā)明的多聚體包括含有水不溶性物質(zhì)的“雜合”多聚體，所述水不溶性物質(zhì)在其結(jié)構(gòu)的至少一部分中具有可生物再吸收分子。這些多聚體的實(shí)例為含有水不溶性共聚物的多聚體，所述共聚物的每條多聚體鏈具有可生物再吸收區(qū)、親水區(qū)和多個(gè)可交聯(lián)官能團(tuán)。
就本發(fā)明而言，“水不溶性物質(zhì)”包括基本不溶于水或含水環(huán)境的物質(zhì)。因此，盡管共聚物的某些區(qū)域或片段可能是親水的或甚至是水溶性的，多聚體分子整體在水中無(wú)任何顯著程度的溶解。
就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)“可生物再吸收分子”含有能夠代謝或降解并被身體再吸收和/或通過(guò)正常排泄途徑排出的區(qū)域。該代謝產(chǎn)物或降解產(chǎn)物優(yōu)選基本上對(duì)身體無(wú)害的。
只要共聚物組合物整體不是水溶性的，可生物再吸收區(qū)可以是疏水的或親水的。因此，基于使多聚體整體保持水不溶性來(lái)選擇可生物再吸收區(qū)。因此，選擇相對(duì)特性(即所含有的官能團(tuán)種類、可生物再吸收區(qū)的相對(duì)比例和親水區(qū))以保證有用的可生物再吸收組合物保持為水不溶性。
示范的可再吸收多聚體包括如合成產(chǎn)生的聚α-羥基羧酸/聚氧化烯的可再吸收嵌段共聚物(參閱Cohn等，U.S.專利No.4,826,945)。這些共聚物無(wú)交聯(lián)且為水溶性，從而身體可以排泄降解的嵌段共聚物組分。參閱Younes等，J Biomed.Mater.Res.211301-1316(1987)和Cohn等，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
目前優(yōu)選的可生物再吸收多聚體包括一個(gè)或多個(gè)選自以下的組分聚酯、聚羥酸、聚內(nèi)酯、聚酰胺、聚酯-酰胺、聚氨基酸、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、poly(phosphazines)、聚磷酸酯、聚硫代酯、多糖及其混合物。更優(yōu)選的可生物再吸收多聚體包括聚羥酸組分。在聚羥酸中，優(yōu)選聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。
除了形成體內(nèi)可吸收(“生物再吸收”)的片段以外，可用于本發(fā)明方法的優(yōu)選多聚體包衣還可形成可排泄和/或可代謝的片段。
本發(fā)明中還可以使用高級(jí)共聚物。例如1984年3月20日公布的Casey等，U.S.專利No.4,438,253公開了從聚乙醇酸和羥基末端的聚亞烷基二醇的酯交換作用產(chǎn)生的三嵌段共聚物。這些組合物用于可再吸收的單絲縫合線。通過(guò)向共聚物結(jié)構(gòu)中摻入原碳酸芳香酯如原碳酸-4-對(duì)甲苯酯來(lái)控制這些組合物的柔性。
還可以使用基于乳酸和/或乙醇酸的其他多聚體。例如1993年4月13日公布的Spinu的U.S.專利No.5,202,413公開了具有聚乳酸和/或聚乙醇酸交酯連續(xù)嵌段的可生物降解多嵌段共聚物，通過(guò)將丙交酯和/或乙交酯開環(huán)聚合到二醇寡聚體或二氨殘基、接著用雙功能化合物如二異氰酸酯、二酰氯或二氯硅烷進(jìn)行鏈延伸來(lái)產(chǎn)生所述嵌段共聚物。
可以將可用于本發(fā)明的包衣的可生物再吸收區(qū)設(shè)計(jì)成可水解和/或酶切割的。就本發(fā)明而言，“可水解切割”指共聚物特別是可生物再吸收區(qū)在水或含水環(huán)境中對(duì)水解的敏感性。類似的，本文所使用的“可酶切割”指共聚物特別是可生物再吸收區(qū)對(duì)內(nèi)源或外源酶切割的敏感性。
置于身體中時(shí)，親水區(qū)可以加工成可排泄和/或可代謝片段。因此，親水區(qū)可以包括如聚醚、聚環(huán)氧烷、多元醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烴基唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)及其共聚物和混合物。另外，親水區(qū)還可以是如聚環(huán)氧烷。這些聚環(huán)氧烷可以包括如聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷及其混合物和共聚物。
是水凝膠組分的多聚體也可用于本發(fā)明。水凝膠是能夠吸收相對(duì)大量水的聚合物質(zhì)。形成水凝膠的化合物實(shí)例包括但不僅限于聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明膠、角叉菜膠和其他多糖、羥基亞乙基甲基丙烯酸(HEMA)及其衍生物等等?？梢援a(chǎn)生穩(wěn)定、可生物降解和可生物再吸收的水凝膠。另外，水凝膠組合物可以包含表現(xiàn)一種或多種這些特性的亞基。
可通過(guò)交聯(lián)控制完整性的生物相容的水凝膠組合物是已知的，并優(yōu)選用于本發(fā)明的方法。例如Hubbell等，1995年4月25日公布的U.S.專利No.5,410,016和1996年6月25日公布的5,529,914公開了為交聯(lián)的嵌段共聚物的水溶性系統(tǒng)，所述嵌段共聚物具有夾在兩個(gè)易水解延長(zhǎng)部分中的水溶性中心嵌段片段。這些共聚物由可光聚合的丙烯酸酯官能團(tuán)進(jìn)一步末端加帽。在交聯(lián)時(shí)，這些系統(tǒng)成為水凝膠。這些共聚物的水溶性中心嵌段可以包括聚乙二醇，而易水解延伸部分可以是聚α-羥酸，如聚乙醇酸或聚乳酸。參閱Sawhney等，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，凝膠為熱可逆凝膠。目前優(yōu)選包含如pluronics、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、多糖、聚氨基甲酸酯水凝膠、尿素-聚氨基甲酸酯水凝膠及其組合的熱可逆凝膠。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含脂質(zhì)體組分?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備脂質(zhì)體，如1985年6月11日公布的Eppstein等，U.S.專利No.4,522,811中所述。例如，脂質(zhì)體制劑的制備可以通過(guò)將合適的脂質(zhì)(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、花生酰磷脂酰膽堿和膽固醇)溶于無(wú)機(jī)溶劑中，隨即蒸發(fā)溶劑，在容器表面留下干脂質(zhì)的薄膜。然后向容器中引入活性化合物或其可藥用鹽的水溶液。然后用手旋動(dòng)以從容器表面釋放脂質(zhì)物質(zhì)并分散脂質(zhì)聚集體，從而形成脂質(zhì)體懸液。
上述微粒和制備微粒的方法用于舉例，并無(wú)意用于限定可用于本發(fā)明的微粒的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，用不同方法制備的一系列的微粒都可用于本發(fā)明。
在上文水溶性多聚體的上下文中討論的結(jié)構(gòu)形式(直鏈和分支)一般也可用于水不溶性多聚體。因此，例如可以用兩個(gè)水不溶性多聚體部分使半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸分支核心官能化。用于產(chǎn)生這些種類的方法一般與用于產(chǎn)生水溶性多聚體的方法非常相似。
可以通過(guò)選擇化學(xué)劑量、可用糖基化位點(diǎn)的數(shù)目、選擇對(duì)特定位點(diǎn)具有選擇性的酶等等控制綴合物中PEG取代的程度(圖2F)。糖基PEG化的因子IX種類相對(duì)于未標(biāo)記的因子IX表現(xiàn)出增強(qiáng)的循環(huán)半衰期(圖3、圖6)。
方法除了上文討論的綴合物以外，本發(fā)明提供制備這些及其他綴合物的方法。另外，本發(fā)明提供通過(guò)對(duì)具有發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試者或患病的受試者施用本發(fā)明的綴合物來(lái)預(yù)防、治療或改善疾病狀態(tài)的方法。
因此，本發(fā)明提供在所選擇部分和因子IX肽之間形成共價(jià)綴合物的方法。
在示范的實(shí)施方案中，在水溶性多聚體、治療部分、靶向部分或生物分子和糖基化或非糖基化的因子IX肽之間形成綴合物。多聚體、治療部分或生物分子通過(guò)糖基連接基團(tuán)與肽綴合，所述糖基連接基團(tuán)插入肽和修飾基團(tuán)(如水溶性多聚體)之間并與二者共價(jià)連接。該方法包括將肽與含有修飾的糖和將修飾的糖與底物(如肽、苷元、糖脂)綴合的酶(如糖基轉(zhuǎn)移酶)的混合物接觸。在適于在修飾的糖和因子IX肽間形成共價(jià)鍵的條件下進(jìn)行反應(yīng)。
受體因子IX肽一般從新合成，或在原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌)或真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲、真菌或植物細(xì)胞中重組表達(dá)。肽可以是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或片段。另外，肽可以是野生型或突變的肽。在示范的實(shí)施方案中，肽包含在肽序列中加入或去除一個(gè)或多個(gè)N-或O-連接糖基化位點(diǎn)的突變。
在示范的實(shí)施方案中，按以下方式使因子IX O-糖基化并用水溶性多聚體官能化。將肽產(chǎn)生為具有可用的氨基酸糖基化位點(diǎn)，或者如果肽是糖基化的，切除糖基部分以暴露氨基酸。例如，α-1N-乙酰氨基半乳糖基化(GalNAc)絲氨酸或蘇氨酸，并使用ST6GalNAcT1用唾液酸-修飾基團(tuán)盒使NAc-半乳糖基化的肽唾液酸化?；蛘撸煤诵?GalT-1使NAc-半乳糖基化的肽半乳糖基化，并使用ST3GalT1用唾液酸-修飾基團(tuán)盒使產(chǎn)物唾液酸化。本方法的示例綴合物具有以下鍵Thr-α-1-GalNAc-β-1，3-Gal-α2，3-Sia*，其中Sia*為唾液酸-修飾基團(tuán)盒。
在使用多種酶和糖基供體的本發(fā)明的方法中(如上文所公開)，單獨(dú)的糖基化步驟可分別進(jìn)行，或者在“單釜”反應(yīng)中組合。例如，在上文公開的三個(gè)酶的反應(yīng)中，GalNAc轉(zhuǎn)移酶、GalT和SiaT及其供體可以在一個(gè)容器中組合。或者，可以單獨(dú)進(jìn)行GalNAc反應(yīng)，并作為單一的步驟加入GalT和SiaT及適當(dāng)?shù)奶腔w。進(jìn)行反應(yīng)的另一種模式涉及依次加入每種酶及適當(dāng)?shù)墓w，并以“單釜”模式進(jìn)行反應(yīng)。上文公開的每種方法的組合也可用于制備本發(fā)明的化合物。
在本發(fā)明的綴合物中，特別是糖基聚乙二醇化的N-連接聚糖中，唾液酸-修飾基團(tuán)盒可以以α-2，6或α-2，3鍵與Gal連接。
本發(fā)明的方法還提供重組產(chǎn)生的不完全糖基化因子IX肽的修飾。在本發(fā)明方法中使用修飾的糖可以使肽同時(shí)發(fā)生進(jìn)一步的糖基化和用如水溶性多聚體、治療劑等等進(jìn)行衍生。修飾的糖的糖部分可以是與完全糖基化的肽中的受體綴合的殘基，或者具有所需特性的其他糖部分。
可用于本發(fā)明的修飾肽的示范的方法公開于WO 04/099231、WO03/031464以及其中公開的參考文獻(xiàn)。
在示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生含有部分 的PEG化因子IX，其中D為-OH或R1-L-HN-。符號(hào)G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烴基。R1是含有直鏈或分支聚乙二醇?xì)埢牟糠?。符?hào)L代表選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭。通常當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，且當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-NH-。本發(fā)明的方法包含(a)使底物因子IX肽與PEG-唾液酸供體以及能夠?qū)EG-唾液酸部分從供體轉(zhuǎn)移到底物因子IX肽的酶相接觸。
示范的PEG-唾液酸供體為例如具有式 的核苷酸糖，以及在適于轉(zhuǎn)移的條件下將PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移到因子IX肽的氨基酸或糖基殘基上的酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在形成本發(fā)明的綴合物以前在宿主細(xì)胞中表達(dá)底物因子IX肽。示范的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌或真菌。
本文所述方法可用于上文章節(jié)公開的每種因子IX綴合物。
通過(guò)本發(fā)明方法修飾的因子IX肽可以是合成或野生型肽，或者可以是通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法如定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的突變肽。肽的糖基化一般是N-連接或O-連接。示范的N-連接為將修飾的糖附著于天冬酰胺殘基側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X為除脯氨酸以外的任何氨基酸)為碳水化合物部分酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，在多肽中存在的所述其中任一種三肽序列產(chǎn)生可能的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化指一個(gè)糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)附著于羥基氨基酸的羥基側(cè)鏈，所述羥基氨基酸優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用不常見(jiàn)或非天然氨基酸如5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
可以通過(guò)改變氨基酸序列在肽或其他結(jié)構(gòu)中便利地加入糖基化位點(diǎn)，以使其含有一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)在肽序列內(nèi)摻入一個(gè)或多個(gè)含有-OH基團(tuán)的種類(優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸殘基)來(lái)進(jìn)行添加(以獲得O-連接糖基化位點(diǎn))。也可以通過(guò)肽的突變或完全化學(xué)合成來(lái)進(jìn)行添加。優(yōu)選通過(guò)DNA水平的變化改變肽的氨基酸序列，特別是通過(guò)在預(yù)選的堿基處突變編碼肽的DNA，從而產(chǎn)生將翻譯成所需氨基酸的密碼子。優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行DNA突變。
在示范的實(shí)施方案中，通過(guò)改組多核苷酸加入糖基化位點(diǎn)。可以用DNA改組實(shí)驗(yàn)流程調(diào)控編碼候選肽的多核苷酸。DNA改組是遞歸重組和突變的方法，通過(guò)隨機(jī)片段化相關(guān)基因庫(kù)并接著用與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)類似的方法重新組裝片段來(lái)實(shí)施。參閱如Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)和U.S.專利No.5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
加入或去除糖基化位點(diǎn)和加入或去除糖基結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)的示范的方法在WO 04/099231、WO 03/031464及相關(guān)U.S.和PCT申請(qǐng)中有詳細(xì)描述。
本發(fā)明還使用在因子IX肽中加入(或去除)一個(gè)或多個(gè)選定的糖基殘基的方法，其后使修飾的糖與肽中至少一個(gè)選定的糖基殘基綴合。例如當(dāng)需要使修飾的糖與因子IX肽中不存在或不以所需的量存在的糖基殘基綴合時(shí)，可以使用該技術(shù)。因此，在使修飾的糖與肽偶聯(lián)之前通過(guò)酶或化學(xué)偶聯(lián)使選定的糖基殘基與肽綴合。在另一實(shí)施方案中，在綴合修飾的糖之前通過(guò)從糖肽中去除碳水化合物殘基來(lái)改變糖肽的糖基化模式。參閱如WO 98/31826。例如在使用PEG修飾的唾液酸進(jìn)行糖基PEG化之前，可以從因子IX中去除唾液酸基團(tuán)以形成無(wú)唾液酸的因子IX(圖2E)。
選定的糖基殘基的示范的附著點(diǎn)包括但不僅限于(a)N-連接糖基化的共有位點(diǎn)和O-連接糖基化的位點(diǎn)；(b)是糖基轉(zhuǎn)移酶受體的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和組氨酸；(d)游離羧基；(e)游離巰基，如半胱氨酸中的那些；(f)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或色氨酸中的游離羥基；(g)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳族殘基或(h)谷氨酰胺的酰胺基?？捎糜诒景l(fā)明的示范的方法描述于1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，259-306頁(yè)(1981)。
使PEG修飾的糖與糖基化或非糖基化的肽綴合，使用適當(dāng)?shù)拿附閷?dǎo)綴合。優(yōu)選地，選擇修飾的供體糖、酶和受體肽的濃度以使糖基化進(jìn)行到直至將受體消耗盡。在唾液酸轉(zhuǎn)移酶上下文中公開的以下考慮的因素通常可用于其他糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)。
已知大量使用糖基轉(zhuǎn)移酶合成所需寡糖結(jié)構(gòu)的方法并通?？捎糜诒景l(fā)明。示例方法描述于例如本文引入作為參考文獻(xiàn)的WO 96/32491、Ito等，Pure Appl.Chem.65753(1993)、U.S.專利No.5,352,670、5,374,541、5,545,553和共同所有的U.S.專利No.6,399,336和6,440,703。
本發(fā)明使用單種糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶組合實(shí)施。例如，可以使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖轉(zhuǎn)移酶的組合。在使用多于一種酶的實(shí)施方案中，優(yōu)選在起始反應(yīng)混合物中組合酶和底物，或者在第一個(gè)酶反應(yīng)完成或接近完成時(shí)向反應(yīng)介質(zhì)中加入第二個(gè)酶反應(yīng)的酶和試劑。通過(guò)在一個(gè)容器中依次進(jìn)行兩個(gè)酶反應(yīng)，與分離中間產(chǎn)物的程序相比提高了總產(chǎn)率。另外，清除并處理額外的溶劑和副產(chǎn)品的需求減少了。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一種和第二種酶均為糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種酶為內(nèi)切糖苷酶。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用兩種以上的酶裝配本發(fā)明的修飾的糖蛋白。在向肽中加入修飾的糖之前或之后任意時(shí)刻使用酶改變肽的糖結(jié)構(gòu)。
在另一實(shí)施方案中，本方法使用一種或多種糖苷外切酶或內(nèi)切酶。糖苷酶一般是經(jīng)設(shè)計(jì)以形成而非破壞糖基鍵的突變體。突變體聚糖酶一般包含活性位點(diǎn)酸性氨基酸殘基被氨基酸殘基取代。例如當(dāng)內(nèi)切聚糖酶為endo-H時(shí)，取代的活性位點(diǎn)殘基一般為130位置的天冬氨酸、132位置的谷氨酸或其組合。該氨基酸一般被絲氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺取代。
突變體酶一般通過(guò)與內(nèi)切聚糖酶水解步驟的逆反應(yīng)相似的合成步驟催化反應(yīng)。在這些實(shí)施方案中，糖基供體分子(如所需的寡或單糖結(jié)構(gòu))含有離去基團(tuán)，通過(guò)將供體分子加到蛋白質(zhì)的GlcNAc殘基上進(jìn)行反應(yīng)。例如，離去基團(tuán)可以是鹵素如氟。在其他實(shí)施方案中，離去基團(tuán)為Asn或Asn-肽部分。在其他實(shí)施方案中，修飾了糖基供體分子上的GlcNAc殘基。例如GlcNAc殘基可以含有1，2唑啉部分。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明綴合物的每種酶均以催化量存在。具體酶的催化量根據(jù)該酶底物的濃度以及反應(yīng)條件(如溫度、時(shí)間和pH值)而改變。在預(yù)選的底物濃度和反應(yīng)條件下確定給定酶的催化量的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
進(jìn)行上述方法的溫度的范圍可以從剛高于冰點(diǎn)到最敏感的酶變性的溫度。優(yōu)選的溫度范圍為從約0℃到約55℃，并更優(yōu)選約20℃到約37℃。在另一示范的實(shí)施方案中，使用嗜熱酶在提高的溫度下進(jìn)行本方法的一個(gè)或多個(gè)部分。
使反應(yīng)混合物保持足以使受體糖基化的一段時(shí)間，從而形成所需的綴合物。一些綴合物常常可以在若干小時(shí)后檢測(cè)到，通常在24小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)得到可回收的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，反應(yīng)速率取決于可對(duì)選定的系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化的多種因素(如酶濃度、供體濃度、受體濃度、溫度、溶劑體積)。
本發(fā)明還提供修飾的肽的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。本文使用的工業(yè)規(guī)模一般產(chǎn)生至少250mg、優(yōu)選至少500mg并更優(yōu)選至少1g純化的最終綴合物。
在下文的討論中，通過(guò)將修飾的唾液酸部分綴合到糖基化肽來(lái)示例本發(fā)明。用PEG標(biāo)記示范的修飾的唾液酸。下文關(guān)于PEG修飾的唾液酸和糖基化肽的集中討論是為了說(shuō)明的清晰性，而不意味著本發(fā)明僅限于這兩種配偶體的綴合物。技術(shù)人員會(huì)理解，本討論可以普遍應(yīng)用于加入唾液酸以外的修飾的糖基部分。另外，本討論同樣可以應(yīng)用于用PEG以外的試劑(包括其他PEG部分、治療部分和生物分子)修飾糖基單位。
可以使用酶促方法將PEG化或PPG化碳水化合物選擇性引入肽或糖肽。該方法使用含有PEG、PPG或被屏蔽的反應(yīng)性官能團(tuán)的修飾的糖，并與適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶或糖合酶組合。通過(guò)選擇產(chǎn)生所需碳水化合物鍵并使用修飾的糖作為供體底物的糖基轉(zhuǎn)移酶，可以將PEG或PPG直接引入肽骨架，引入糖肽中原有的糖殘基或引入加入至肽中的糖殘基。
唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體以天然存在的結(jié)構(gòu)或重組、酶或化學(xué)方法放置的結(jié)構(gòu)存在于待用本發(fā)明方法修飾的肽中。合適的受體包括如半乳糖受體如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他受體(參閱如Paulson等，J.Bio.Chem.2535617-5624(1978))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶的受體通過(guò)糖肽的體內(nèi)合成存在于待用本發(fā)明方法修飾的糖肽上。可以不預(yù)先修飾糖肽的糖基化模式而使用所述的方法將這些糖肽唾液酸化?；蛘撸景l(fā)明的方法可以用于唾液酸化不含有適當(dāng)受體的肽；首先通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法修飾肽使其含有受體。在示范的實(shí)施方案中，通過(guò)GalNAc轉(zhuǎn)移酶的作用加入GalNAc殘基。
在示范的實(shí)施方案中，通過(guò)將半乳糖殘基附著于與肽相連的適當(dāng)受體(如GlcNAc)來(lái)裝配半乳糖受體。該方法包括將待修飾的肽與含有適當(dāng)量的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(如Galβ1，3或Galβ1，4)和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w(如UDP-半乳糖)的反應(yīng)混合物孵育。使反應(yīng)基本完成或者在加入預(yù)選量的半乳糖殘基時(shí)中止反應(yīng)。裝配選定的糖受體的其他方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
在另一實(shí)施方案中，首先整體或部分“剪切”與糖肽連接的寡糖，以暴露糖基轉(zhuǎn)移酶受體或可以加入一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)殘基以得到適當(dāng)受體的部分。附著和剪切反應(yīng)中可以使用酶如糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶(參閱如U.S.專利No.5,716,812)。
在以下討論中，通過(guò)具有附著的PEG部分的修飾的糖示例本發(fā)明的方法。討論著眼于說(shuō)明的清晰性。技術(shù)人員會(huì)理解，本討論同樣與修飾的糖帶有治療部分、生物分子等等的實(shí)施方案相關(guān)。
在加入修飾的糖之前預(yù)先“剪切”碳水化合物殘基的本發(fā)明示例實(shí)施方案中，將高級(jí)甘露糖“剪回”第一級(jí)雙觸角結(jié)構(gòu)。將帶有PEG部分的修飾的糖與通過(guò)“剪回”暴露的一個(gè)或多個(gè)糖殘基綴合。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)與PEG部分綴合的GlcNAc部分加入PEG部分。修飾的GlcNAc附著于雙觸角結(jié)構(gòu)末端甘露糖殘基中的一個(gè)或兩個(gè)?；蛘撸葱揎椀腉lcNAc可以加入分支種類的一個(gè)或兩個(gè)末端。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)具有半乳糖殘基的修飾的糖將PEG部分加至雙觸角結(jié)構(gòu)的一個(gè)或兩個(gè)末端甘露糖殘基，所述修飾的糖與加至末端甘露糖殘基的GlcNac殘基綴合?；蛘撸梢栽谝粋€(gè)或兩個(gè)末端GlcNAc殘基中加入未修飾的Gal。
在另一實(shí)施例中，使用修飾的唾液酸將PEG部分加至Gal殘基。
在另一示范的實(shí)施方案中，將高級(jí)甘露糖結(jié)構(gòu)“剪回”至雙觸角結(jié)構(gòu)從中所分支出的甘露糖。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)用多聚體修飾的GlcNAc加入PEG部分?；蛘撸瑢⑽葱揎椀腉lcNAc加至甘露糖，接著加入帶有附著的PEG部分的Gal。在另一實(shí)施方案中，依次將未修飾的GlcNAc和Gal加至甘露糖，接著加入用PEG部分修飾的唾液酸部分。
在另一實(shí)施方案中，將高級(jí)甘露糖“剪回”至附著第一個(gè)甘露糖的GlcNAc。將GlcNAc與帶有PEG部分的Gal殘基綴合?；蛘撸瑢⑽葱揎椀腉al加至GlcNAc，接著加入用水溶性糖修飾的唾液酸。在另一實(shí)施方案中，末端GlcNAc與Gal綴合，接著用帶有PEG部分的修飾的巖藻糖將GlcNAc藻糖化。
還可以將高級(jí)甘露糖(high mannose)剪回至附著于肽的Asn的第一個(gè)GlcNAc。在一個(gè)實(shí)施例中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc與帶有水溶性多聚體的GlcNAc綴合。在另一實(shí)施例中，用帶有水溶性多聚體的Gal修飾GlcNAc-(Fuc)a的GlcNAc。在另一實(shí)施方案中，用Gal修飾GlcNAc，接著與用PEG部分修飾的唾液酸的Gal綴合。
另一示范的實(shí)施方案公開于共同所有的U.S.專利申請(qǐng)出版物20040132640、20040063911、20040137557、U.S.專利申請(qǐng)No10/369,979、10/410,913、10/360,770、10/410,945和PCT/US02/32263，均在本文中引入作為參考文獻(xiàn)。
上文公開的實(shí)施例提供對(duì)本文所公開方法能力的說(shuō)明。使用本文所述的方法可以“剪回”和建立基本任何所需結(jié)構(gòu)的碳水化合物殘基?？梢匀缟衔乃_將修飾的糖加至碳水化合物部分的末端，或者可以插入肽核心和碳水化合物的末端之間。
在示范的實(shí)施方案中，使用唾液酸酶從因子IX糖肽中去除原有的唾液酸，從而暴露全部或多數(shù)下面的半乳糖殘基。或者，用半乳糖殘基或者具有半乳糖單位末端的寡糖殘基標(biāo)記肽或糖肽。暴露或加入半乳糖殘基之后，使用適當(dāng)?shù)耐僖核徂D(zhuǎn)移酶加入修飾的唾液酸。本方法概述于方案1。
方案1 在概括于方案2的另一方法中，在唾液酸上存在屏蔽的反應(yīng)官能團(tuán)。屏蔽的反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選未被用于將修飾的唾液酸附著到因子IX的條件影響。在將修飾的唾液酸共價(jià)附著于肽之后，去除屏蔽并使肽與試劑如PEG綴合。試劑通過(guò)其與修飾的糖殘基的未屏蔽反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)以特異性方式與肽綴合。
方案2
取決于糖肽寡糖側(cè)鏈的末端糖(表1)，本文公開的任何修飾的糖可以與其適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶一起使用。如上文所討論的，引入PEG化結(jié)構(gòu)所需的糖肽末端糖可以在表達(dá)中天然引入，或者可在反應(yīng)后使用適當(dāng)?shù)奶擒彰?、糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物產(chǎn)生。
表1
在另一實(shí)施方案中，UDP-半乳糖-PRG與牛乳β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，從而將修飾的半乳糖轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)哪┒薔-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)。糖肽的末端GlcNAc殘基可以在表達(dá)中產(chǎn)生(如在哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌的表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)生)，也可以如所需通過(guò)用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉(zhuǎn)移酶處理糖肽而產(chǎn)生。
在另一示范的實(shí)施方案中，使用GlcNAc轉(zhuǎn)移酶如GNT1-5將PEG化GlcN轉(zhuǎn)移到糖肽的末端甘露糖殘基。在另一示范的實(shí)施方案中，從糖肽中酶促去除N-和/或O-連接聚糖結(jié)構(gòu)以暴露接著與修飾的糖綴合的氨基酸或末端糖基殘基。例如，使用內(nèi)切糖苷酶去除糖肽的N-連接結(jié)構(gòu)以暴露糖肽上作為GlcNAc-連接-Asn的末端GlcNAc。使用UDP-Gal-PEG和適當(dāng)?shù)陌肴樘寝D(zhuǎn)移酶在暴露的GlcNAc上引入PEG-半乳糖官能團(tuán)。
在另一可選實(shí)施方案中，使用已知將糖殘基轉(zhuǎn)移到肽骨架的糖基轉(zhuǎn)移酶直接將修飾的糖加入肽骨架。該示范的實(shí)施方案公開于方案3。在本發(fā)明的實(shí)用中可以使用的示范的糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不僅限于GalNAc轉(zhuǎn)移酶(GalNAc T1-14)、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、木糖轉(zhuǎn)移酶、甘露糖轉(zhuǎn)移酶等等。使用本方法可以將修飾的糖直接加到缺少任何碳水化合物的肽或者加到原有糖肽。在這兩種情況下，修飾的糖的加入在以糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性定義的肽骨架的特定位置發(fā)生，而不以如使用化學(xué)方法修飾蛋白質(zhì)肽骨架中出現(xiàn)的隨機(jī)方式發(fā)生。可以通過(guò)將適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄性O(shè)計(jì)到多肽鏈中而在缺少糖基轉(zhuǎn)移酶底物肽序列的蛋白質(zhì)或糖肽中引入一系列的試劑。
方案3
在上文公開的各個(gè)示范的實(shí)施方案中，可以在將修飾的糖與肽綴合后使用一個(gè)或多個(gè)額外的化學(xué)或酶修飾步驟。在示例實(shí)施方案中，使用酶(如巖藻糖轉(zhuǎn)移酶)將糖基單位(如巖藻糖)附加到肽上附著的末端修飾糖。在另一實(shí)施例中，使用酶反應(yīng)使修飾的糖不能綴合的位點(diǎn)“加帽”。或者，使用化學(xué)反應(yīng)改變所綴合的修飾的糖的結(jié)構(gòu)。例如，使所綴合的修飾的糖與試劑反應(yīng)，所述試劑使其與修飾的糖所附著的肽組分之間的鍵穩(wěn)定或不穩(wěn)定。在另一實(shí)施例中，在與肽綴合后去保護(hù)修飾的糖的組分。技術(shù)人員會(huì)理解，在修飾的糖與肽綴合之后，可以在本發(fā)明方法中使用一系列的酶和化學(xué)方法。修飾的糖-肽綴合物的進(jìn)一步加工在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
酶除了上文形成?；?連接綴合物的內(nèi)容中所討論的酶以外，可以通過(guò)使用其他酶的方法加工、剪回或修飾綴合物和起始底物(如肽、脂質(zhì))的糖基化模式。使用將糖供體轉(zhuǎn)移到受體的酶重構(gòu)肽和脂質(zhì)的方法在2003年4月17日公布的DeFrees，WO 03/031464 A2中有非常詳細(xì)的描述。下文中公開了本發(fā)明方法中使用酶的簡(jiǎn)要概述。
糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶催化以分步的方式將活化的糖(供體NDP-或NMP-糖)加到蛋白質(zhì)、糖肽、脂質(zhì)或糖脂或正延長(zhǎng)的寡糖的非還原末端。通過(guò)轉(zhuǎn)移酶和與脂質(zhì)連接的寡糖供體Dol-PP-NAG2Glc3Man9的模塊(enblock)轉(zhuǎn)移和接著的剪切核心來(lái)合成N-連接糖肽。在這種情況下，“核心”糖的性質(zhì)與隨后的附著存在某些差異。多種糖基轉(zhuǎn)移酶為本領(lǐng)域已知。
本發(fā)明中可以使用任何糖基轉(zhuǎn)移酶，只要其能利用修飾的糖作為糖供體。這些酶的實(shí)例包括Leloir途徑糖基轉(zhuǎn)移酶，如半乳糖轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖轉(zhuǎn)移酶、木糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等等。
對(duì)于涉及糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的酶促糖合成，可以從任何來(lái)源克隆或分離糖基轉(zhuǎn)移酶。許多克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶以及它們的多核苷酸序列是已知的。參閱如“The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases”(http//www.vei.co.uk/TGN/gt-guide.htm)。也可以在多種公共數(shù)據(jù)庫(kù)(包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等等)中發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列和可推導(dǎo)出氨基酸序列的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。
可用于本發(fā)明方法中的糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不僅限于半乳糖轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和寡糖轉(zhuǎn)移酶。合適的糖基轉(zhuǎn)移酶包括得自真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的糖基轉(zhuǎn)移酶。
編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA可以通過(guò)化學(xué)合成獲得、通過(guò)篩選來(lái)自適當(dāng)細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)物的mRNA逆轉(zhuǎn)錄本獲得、通過(guò)篩選來(lái)自適當(dāng)細(xì)胞的基因組文庫(kù)獲得、或通過(guò)這些方法的組合獲得?？梢杂卯a(chǎn)生自糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列的寡核苷酸探針篩選mRNA或基因組DNA。可以根據(jù)已知方法用常規(guī)雜交試驗(yàn)中所用的可檢測(cè)基團(tuán)(如熒光基團(tuán)、放射性原子或化學(xué)發(fā)光基團(tuán))標(biāo)記探針。另外，可以用產(chǎn)生自糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列的PCR寡核苷酸引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列。參閱如Mullis等的U.S.專利No.4,683,195和Mullis的U.S.專利No.4,683,202。
可以在用含有編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中合成糖基轉(zhuǎn)移酶。載體用于擴(kuò)增編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA和/或表達(dá)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA。表達(dá)載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列與能夠使糖基轉(zhuǎn)移酶在適當(dāng)宿主中表達(dá)的適當(dāng)?shù)目刂菩蛄杏行нB接。對(duì)這些控制序列的需求取決于選擇的宿主細(xì)胞和選定的轉(zhuǎn)化方法而不同?？刂菩蛄幸话惆ㄞD(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼適當(dāng)?shù)膍RNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。擴(kuò)增載體不需要表達(dá)控制結(jié)構(gòu)域。所需的僅為在宿主中復(fù)制的能力(通常由復(fù)制起點(diǎn)賦予)和便于識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記。
在示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用原核酶。這樣的糖基轉(zhuǎn)移酶包括許多革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂寡糖(LOS)的合成中所涉及的酶(Preston等，Critical Reviews in Microbiology 23(3)139-180(1996))。這些酶包括但不僅限于如大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等物種的rfa操縱子蛋白(包括β1，6半乳糖轉(zhuǎn)移酶和β1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶(參閱如EMBL登錄號(hào)M80599和M86935(大腸桿菌)、EMBL登錄號(hào)S56361(鼠傷寒沙門氏菌))、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Swiss-Prot登錄號(hào)P25740(大腸桿菌)、β1，2-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登錄號(hào)P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot登錄號(hào)P19817(鼠傷寒沙門氏菌))和β1，2-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(rfaK)(EMBL登錄號(hào)U00039(大腸桿菌))。氨基酸序列已知的其他糖基轉(zhuǎn)移酶包括已在如肺炎克來(lái)伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、小腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)、結(jié)腸耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprosum)中表征的操縱子及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操縱子所編碼的。
另外適用于本發(fā)明的是產(chǎn)生含有乳糖-N-新四糖、D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰-D-葡糖氨-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖和已在粘膜病原體淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中鑒定出的Pk血型三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的結(jié)構(gòu)中涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶(Scholten等，J.Med.Microbiol.41236-243(1994))。來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的編碼這些結(jié)構(gòu)的生物合成中所涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶的基因鑒定自腦膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等，Mol.Microbiol.18729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，由三個(gè)基因lgtA、lgtB和lgE組成的基因座編碼添加乳糖-N-新四糖鏈中最后三個(gè)糖所需的糖基轉(zhuǎn)移酶(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。近年來(lái)已證明了lgtB和lgtA基因產(chǎn)物的酶活性，提供了其預(yù)計(jì)的糖基轉(zhuǎn)移酶功能的第一個(gè)直接證據(jù)(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中有兩個(gè)額外的基因，即，將β-D-GalNAc加到乳糖-N-新四糖結(jié)構(gòu)末端半乳糖的3位置的lgtD，和將末端α-D-Gal加到截短LOS的乳糖元件，從而產(chǎn)生Pk血型抗原結(jié)構(gòu)(前述Gotshlich(1994))的lgtC。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，分離的抗原型L1也表達(dá)Pk血型抗原并顯示帶有l(wèi)gtC基因(前述Jennings等，(1995))。奈瑟氏球菌糖基轉(zhuǎn)移酶及相關(guān)基因還描述于USPN5,545,553(Gotschlich)。來(lái)自幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因也已表征(Martin等，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))?？漳c彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明(參閱如http//afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所使用的糖基轉(zhuǎn)移酶為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。示范的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移到受體糖的羥基位置的酶。將非核苷酸糖轉(zhuǎn)移至受體的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明。
在一些實(shí)施方案中，受體糖為例如寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GalNAc β-基團(tuán)中的GlcNAc。適用于該反應(yīng)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括最先從人乳中表征的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)(參閱如Palcic等，CarbohydrateRes.1901-11(1989)、Prieels等，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)和Nunez等，Can.J.Chem.592086-2095(1981))和發(fā)現(xiàn)于人血清的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIV、FTV、FTVI)。還表征了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，即唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAc β巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。還表征了Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組形式(參閱Dumas等，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)和Kukowska-Latallo等，Genes and Development 41288-1303(1990))。其他示范的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括如α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.69)?？梢酝ㄟ^(guò)Mollicone等Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或U.S.專利No.5,374,655中所述的方法進(jìn)行酶促巖藻糖基化。用于產(chǎn)生巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞還包括合成GDP-巖藻糖的酶系統(tǒng)。
半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在另一組實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶為半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。示范的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括α(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.151，參閱如Dabkowski等，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等，Nature 345229-233(1990)、牛(GenBank j04989，Joziasse等，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))、鼠(GenBank m26925；Larsen等，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989))、豬(GenBank L36152；Strahan等，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一合適的α(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶為參與合成B血型抗原的酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人))。另一示范的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶為核心Gal-T1。
同樣適合本發(fā)明方法用途的是β(1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，其包括如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))、人(Masri等，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))、鼠(Nakazawa等，J.Biochem.104165-168(1988)))以及E.C.2.4.1.38和神經(jīng)酰胺半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等，J.Neurosci.Res.38234-242(1994)))。其他合適的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括如α1，2半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(來(lái)自如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等，Mol.Biol.Cell 5519-528(1994))。
唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸轉(zhuǎn)移酶是可用于本發(fā)明的重組細(xì)胞和反應(yīng)混合物的另一類型的糖基轉(zhuǎn)移酶。產(chǎn)生重組唾液酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞還會(huì)產(chǎn)生唾液酸轉(zhuǎn)移酶的唾液酸供體CMP-唾液酸。適合本發(fā)明用途的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的實(shí)例包括ST3Gal III(如大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST3Gal II、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAcI、ST6GalNAcII和ST6GalNAc III(本文使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶命名法如Tsuji等，Glycobiology 6V-xiv(1996)中所述)。示范的α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶指將唾液酸轉(zhuǎn)移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal的α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.6)。參閱Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1981)、Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一示范的α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.4)將唾液酸轉(zhuǎn)移到二糖或糖苷的非還原末端Gal上。參閱Rearick等，J.Biol.Chem.2544444(1979)和Gillespie等，J.Biol.Chem.26721004(1992)。其他示范的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(參閱Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
優(yōu)選地，對(duì)于糖肽類碳水化合物的糖基化，唾液酸轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑼僖核徂D(zhuǎn)移到序列Galβ1，4GlcNAc-(完全唾液酸化的碳水化合物結(jié)構(gòu)上末端唾液酸后最普遍的次級(jí)(penultimate)序列)上(見(jiàn)表2)。
表2使用Galβ1，4GlcNAc序列作為受體底物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶
1)Goochee等，Bio/Technology 91347-1335(1991)2)Yamamoto等，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert等，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996)
本發(fā)明中有用的其他唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括上文圖4表格中的那些。該唾液酸轉(zhuǎn)移酶可用于將PEG化的唾液酸部分從PEG化的唾液酸供體種類轉(zhuǎn)移到肽的N-連接糖基殘基(圖2C)或IX因子的O-連接糖基殘基(圖2D)上。
可用于所述方法的唾液酸轉(zhuǎn)移酶實(shí)例為ST3Gal III，也稱為α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.6)。該酶催化將唾液酸轉(zhuǎn)移到Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GalNAc糖苷的Gal上(參閱如Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)、Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1991))并負(fù)責(zé)糖肽中與天冬酰胺相連的寡糖的唾液酸化。該唾液酸通過(guò)在兩個(gè)糖之間形成α鍵與Gal相連。糖之間的成鍵(連接)是在NeuAc的2位置和Gal的3位置之間。這一具體酶可分離自大鼠肝(weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982))；并且人cDNA(Sasaki等，(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787、kitagawa& Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等，(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列已知，便于通過(guò)重組表達(dá)產(chǎn)生該酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。
本發(fā)明中有用的其他示范的唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括分離自空腸彎曲桿菌的那些酶，包括α(2，3)。參閱如WO 99/49051。
除了表2中列出之外的唾液酸轉(zhuǎn)移酶也可用于唾液酸化具有商業(yè)重要性的糖肽的經(jīng)濟(jì)高效的大規(guī)模方法中。作為找出這些其他酶的可用性的簡(jiǎn)單測(cè)試，將多種量(1-100mU/mg蛋白質(zhì))的每種酶與無(wú)唾液酸基-α1AGP(1-10mg/ml)進(jìn)行反應(yīng)，以將目的唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸化糖肽的能力與牛ST6Gal I、ST3Gal III或兩者進(jìn)行比較。另外，在該評(píng)估中可以使用其他糖肽或從肽骨架上酶促釋放的糖肽或N-連接寡糖代替無(wú)唾液酸基-α1AGP。具有比ST6Gal I更高效的唾液酸化糖肽的N-連接寡糖的能力的唾液酸轉(zhuǎn)移酶可用于肽唾液酸化的大規(guī)模實(shí)用方法中。
GalNAc轉(zhuǎn)移酶
N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明的實(shí)踐中是有用的，特別是對(duì)于將GalNAc部分與肽的O-連接糖基化位點(diǎn)的氨基酸連接。合適的N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶包括但不僅限于α(1，3)N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶、β(1，4)-N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等，J.Biol.Chem.26915162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶(Homa等，J.Biol.Chem.26812609(1993))。
通過(guò)基因操作從克隆的基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)如GalNAc TI-XX酶為本領(lǐng)域所熟知。參閱如U.S.專利No.4,761,371。一種方法涉及收集足夠的樣品，然后通過(guò)N端測(cè)序確定酶的氨基酸序列。使用該信息分離編碼全長(zhǎng)(與膜結(jié)合的)轉(zhuǎn)移酶的cDNA克隆，所述cDNA克隆在昆蟲細(xì)胞系Sf9中的表達(dá)合成完全活性的酶。然后使用16種不同蛋白質(zhì)的已知糖基化位點(diǎn)周圍的氨基酸的半定量分析和接著的合成肽體外糖基化研究確定酶的受體特異性。該工作已經(jīng)證明，糖基化肽片段中的某些氨基酸殘基是過(guò)量(overrepresent)的，并且糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍特定位置的殘基可能比其他氨基酸部分對(duì)受體效率具有更顯著的影響。
與細(xì)胞結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所使用的酶為與細(xì)胞結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶。盡管已知有許多可溶性糖基轉(zhuǎn)移酶(參閱如U.S.專利No.5,032,519)，糖基轉(zhuǎn)移酶與細(xì)胞結(jié)合時(shí)一般為與膜結(jié)合的形式。迄今已研究的許多與膜結(jié)合的酶被認(rèn)為是膜內(nèi)蛋白，即它們被聲處理后不從膜中解離，并需要洗滌劑來(lái)溶解。已經(jīng)在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞上鑒定了表面糖基轉(zhuǎn)移酶，并且已認(rèn)識(shí)到這些表面糖基轉(zhuǎn)移酶在生理?xiàng)l件下保持了催化活性。然而，細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶認(rèn)識(shí)更深入的功能是對(duì)于細(xì)胞間的識(shí)別(Roth，《MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA》，1990)。
已經(jīng)發(fā)展了改變細(xì)胞所表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。例如，Larson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989)報(bào)道了分離決定細(xì)胞表面寡糖結(jié)構(gòu)及其相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的克隆序列的遺傳方法。將從已知表達(dá)UDP-半乳糖.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶的鼠細(xì)胞系分離的mRNA所產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)染進(jìn)COS-1細(xì)胞中。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并測(cè)試α1-3半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性。
Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892713-2717(1992)公開了將β-內(nèi)酰胺酶錨定到大腸桿菌外表面的方法。產(chǎn)生了由(i)外膜蛋白的信號(hào)序列、(ii)外膜蛋白跨膜區(qū)段和(iii)完整的成熟β-內(nèi)酰胺酶序列組成的三體融合物，最終產(chǎn)生活性表面結(jié)合的β-內(nèi)酰胺酶分子。然而，F(xiàn)rancisco方法僅限于原核細(xì)胞系統(tǒng)，并且作者認(rèn)識(shí)到，其發(fā)揮正常功能需要完整的三體融合物。
磺基轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明還提供產(chǎn)生肽(包括硫酸化分子)的方法，所述硫酸化分子包括如硫酸多糖如肝素、硫酸類肝素、carragenen及相關(guān)化合物。合適的磺基轉(zhuǎn)移酶包括如軟骨素-6-磺基轉(zhuǎn)移酶(Fukuta等，J.Biol.Chem.27018575-18580(1995)描述的雞cDNA；GenBank登錄號(hào)D49915)、糖胺聚糖N-乙酰葡萄糖胺N-脫乙酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶1(Dixon等，Genomics 26239-241(1995)；UL 18918)和糖胺聚糖N-乙酰葡萄糖胺N-脫乙酰酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶2(Orellana等，J.Biol.Chem.2692270-2276(1994)和Eriksson等，J.Biol.Chem.26910438-10443(1994)中描述的鼠cDNA；GenBank登錄號(hào)U2304中描述的人cDNA)。
糖苷酶本發(fā)明還包括野生型和突變體糖苷酶的用途。已經(jīng)證明突變體β-半乳糖苷酶通過(guò)α-糖基氟化物與半乳糖受體分子的偶聯(lián)催化形成二糖。(Withers，U.S.專利No.6,284,494，2001年9月4日頒發(fā))。本發(fā)明有用的的其他糖苷酶包括如β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、β-木糖苷酶、β-巖藻糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α-木糖苷酶、α-巖藻糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶/唾液酸酶。在示范的實(shí)施方案中，在糖基PEG化之前使用唾液酸酶從因子IX(圖2A)的N-聚糖中去除唾液酸。本發(fā)明還提供無(wú)需預(yù)先除去唾液酸的方法。因此，涉及使用修飾的唾液酸部分的和ST3Gal3的唾液酸交換反應(yīng)的方法可以用于本發(fā)明。
固定化的酶本發(fā)明還提供固定于固體和/或可溶支持物的酶的用途。在示范的實(shí)施方案中，提供了通過(guò)本發(fā)明方法的完整糖基接頭與PEG綴合的糖基轉(zhuǎn)移酶。PEG-接頭-酶綴合物任選地附著于固體支持物。在本發(fā)明方法中使用固體支持的酶簡(jiǎn)化了反應(yīng)混合物的建立和反應(yīng)產(chǎn)物的純化，并使酶容易回收。本發(fā)明的方法中使用了糖基轉(zhuǎn)移酶綴合物。酶和支持物的其他組合對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
融合蛋白在另一示范的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用融合蛋白，所述融合蛋白具有一種以上與合成所需糖肽綴合物相關(guān)的酶活性。融合多肽可以由例如糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域與輔助酶的催化活性結(jié)構(gòu)域相連組成。輔助酶催化結(jié)構(gòu)域可以催化例如核苷酸糖(糖基轉(zhuǎn)移酶的供體)形成中的一個(gè)步驟，或催化與糖基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)相關(guān)的反應(yīng)。例如，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸可以與編碼參與核苷酸糖合成的酶的多核苷酸按讀碼框連接。從而得到的融合蛋白不僅可以催化合成核苷酸糖，還可以催化將糖部分轉(zhuǎn)移到受體分子。融合蛋白可以是連接成一個(gè)可表達(dá)核苷酸序列的兩個(gè)或多個(gè)循環(huán)酶。在其他實(shí)施方案中融合蛋白包括兩個(gè)或多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域。參閱如5,641,668?？梢允褂枚喾N合適的融合蛋白方便地設(shè)計(jì)和生產(chǎn)本發(fā)明的修飾的糖肽(參閱如PCT專利申請(qǐng)PCT/CA98/01180，1999年6月24日作為WO 99/31224公布)。
制備修飾的糖一般通過(guò)使用反應(yīng)基團(tuán)將糖部分或糖部分-接頭盒或PEG或PEG-接頭盒基團(tuán)連接在一起，所述反應(yīng)基團(tuán)一般通過(guò)連接方法轉(zhuǎn)化成新有機(jī)官能團(tuán)或非活性種類。糖反應(yīng)性官能團(tuán)位于糖部分的任何位置?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)踐中的反應(yīng)基團(tuán)和反應(yīng)類型一般為生物綴合化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。目前偏好的適于反應(yīng)性糖部分的反應(yīng)類型是在相對(duì)溫和條件下進(jìn)行的。它們包括但不僅限于親核取代(如?；u化物、活性酯和醇、胺的反應(yīng))、親電取代(如烯胺反應(yīng))和碳-碳和碳-雜原子多重鍵的加成(如Michael反應(yīng)、Diels-Alder加成)。這些及其他有用的反應(yīng)在例如March，《ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY》，第三版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，《BIOCONJUGATETECHNIQUES》，Academic Press，San Diego，1996和Feeney等，《MODIFICATION OF PROTEINS》、《Advances in Chemistry Series》，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982中有所討論。
側(cè)掛于糖核或修飾基團(tuán)的有用的反應(yīng)性官能團(tuán)包括但不僅限于(a)羧基基團(tuán)及其多種衍生物，包括但不僅限于N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥芐基三唑酯、?；u、?；溥颉⒘蛑?、對(duì)硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香酯；(b)羥基基團(tuán)，其可轉(zhuǎn)化為如酯、醚、醛等；(c)鹵烴基基團(tuán)，其中鹵化物可以隨后用親核基團(tuán)(如胺、羧酸陰離子、硫醇陰離子、碳負(fù)離子或醇鹽離子替換，從而引起鹵素原子官能團(tuán)處新基團(tuán)的共價(jià)附著；(d)能夠參與Diels-Alder反應(yīng)的親雙烯體，例如馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)；(e)醛或酮基團(tuán)，可以通過(guò)形成羰基衍生物如亞胺、腙、縮氨基脲或肟，或通過(guò)這些機(jī)制如Grignard加成或烷基鋰加成進(jìn)一步衍生；(f)與胺繼發(fā)反應(yīng)例如形成氨磺酰的磺酰鹵化物基團(tuán)；(g)巰基，其可以轉(zhuǎn)換為如二硫化物或與酰鹵反應(yīng)；
(h)胺或巰基基團(tuán)，其可以是如酰化的、烴基化的或氧化的；(i)能夠進(jìn)行環(huán)加成、?；ichael加成等等的烯烴；和(j)能夠與如胺和羥基化合物反應(yīng)的環(huán)氧化物。
可以選擇反應(yīng)性官能團(tuán)使其不參與或不干擾組裝反應(yīng)性糖核或修飾基團(tuán)所必需的反應(yīng)。另外，可以通過(guò)保護(hù)基的存在來(lái)保護(hù)反應(yīng)性官能團(tuán)，使其不參與反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解如何保護(hù)特定的官能團(tuán)以使其不與選定的一組反應(yīng)條件發(fā)生干擾。有用的保護(hù)基的實(shí)例參閱如Greene等，《PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS》，JohnWiley & Sons，New York，1991。
在接下來(lái)的討論中，給出了可用于本發(fā)明的實(shí)用的修飾的糖的大量具體實(shí)例。在示范的實(shí)施方案中，使用唾液酸衍生物作為修飾基團(tuán)附著的糖核。唾液酸衍生物的討論著重于使說(shuō)明更清楚，而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，可以用以唾液酸為示例所述的類似方式活化和衍生多種其他糖部分。例如，大量方法可用于修飾半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖以成為若干糖底物，其可容易地用本領(lǐng)域已知的方法修飾。參閱如Elhalabi等，Curr.Med.Chem.693(1999)和Schafe等，J.Org.Chem.6524(2000)。
在示范的實(shí)施方案中，用本發(fā)明方法修飾的肽為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生，并因而含有不完全唾液酸化的N-和/或O-連接寡糖鏈的糖肽。缺乏唾液酸并含有末端半乳糖殘基的糖肽的寡糖鏈可以PEG化、PPG化或用修飾的唾液酸進(jìn)行修飾。
在方案4中，用被保護(hù)的氨基酸(如甘氨酸)衍生物的活性酯處理氨基糖苷1，將糖胺殘基轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的被保護(hù)的氨基酸酰胺加合物。用醛縮酶處理加合物以形成α-羥基羧酸鹽2。通過(guò)CMP-SA合成酶的作用將化合物2轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的CMP衍生物，接著通過(guò)催化氫化CMP衍生物產(chǎn)生化合物3。使用通過(guò)將化合物3與活性PEG或PPG衍生物(如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-p-硝基苯)反應(yīng)形成甘氨酸加合物而引入的胺作為PEG附著的位點(diǎn)，分別產(chǎn)生如4或5的種類。
方案4 表3描述了用PEG部分衍生的單磷酸糖的代表性實(shí)例。表3中的某些化合物通過(guò)方案4的方法制備。其他衍生物通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備。參閱如Keppler等，《Glycobiology》1111R(2001)和Charter等，《Glycobiology》101049(2000)。其他胺反應(yīng)性的PEG或PPG類似物是市售的，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的方法制備。
表3 在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的修飾的磷酸糖可以在上文所述位置和其他位置進(jìn)行取代。目前優(yōu)選的唾液酸取代在下式中公開
其中X為連接基團(tuán)，優(yōu)選選自-O-、-N(H)-、-S、CH2-和-N(R)2，其中各個(gè)R分別獨(dú)立選自R1-R5。符號(hào)Y、Z、A和B各代表選自上文所述X定義的基團(tuán)。X、Y、Z、A和B各自獨(dú)立選擇，因此它們可以相同或不同。符號(hào)R1、R2、R3、R4和R5代表H、PEG部分、治療部分、生物分子或其他部分。另外，這些符號(hào)代表與PEG部分、治療部分、生物分子或其他部分結(jié)合的接頭。
本發(fā)明公開的附著于綴合物的示范的部分包括但不僅限于PEG衍生物(如酰基-PEG、?；?烴基-PEG、烴基-?；?PEG、氨基甲?；?PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(如?；?PPG、?；?烴基-PPG、烴基-?；?PPG、氨基甲?；?PPG、芳基-PPG)、治療部分、診斷部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、類肝素、SLeX、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、Sialyl LewisX、FGF、VFGF、蛋白質(zhì)、軟骨素、角質(zhì)素、皮膚素、白蛋白、整合素、觸角寡糖、肽等等。將多種修飾基團(tuán)與糖部分綴合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的(《POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRYBIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS》，J.Milton Harris編輯，Plenum Pub.Corp.，1992；《POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICALAND BIOLOGICAL APPLICATIONS》，J.Milton Harris編輯，ACSSymposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，《BIOCONJUGATE TECHNIQUES》，Academic Press，SanDiego，1996和Dunn等編輯，《POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS》，ACS Symposium Series Vol.469，American ChemicalSociety，Washington，D.C.1991》。
接頭基團(tuán)(交聯(lián)基團(tuán))制備可用于本發(fā)明方法的修飾的糖包括將PEG部分附著到糖殘基并優(yōu)選形成穩(wěn)定的加合物，所述加合物為糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。因此，經(jīng)常優(yōu)選使用接頭(例如PEG和糖部分與交聯(lián)劑反應(yīng)綴合PEG和糖)?？捎糜趯⑿揎椈鶊F(tuán)附著于碳水化合物部分的示范的雙功能化合物包括但不僅限于雙功能聚乙二醇、聚酰胺、聚醚、聚酯等等。將碳水化合物與其它分子連接的一般方法為文獻(xiàn)中已知。參閱如Lee等，《Biochemistry》281856(1989)、Bhatia等，Anal.Biochem.178408(1989)、Janda等，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)和Bednarski等，WO 92/18135。在下文的討論中，新生修飾的糖中的糖部分的反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行溫和處理。討論著重于使說(shuō)明更清楚。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，該討論也適用于修飾基團(tuán)的反應(yīng)基團(tuán)。
多種試劑可用于修飾帶有分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)的修飾的糖的成分(交聯(lián)試劑和交聯(lián)方法的綜述參閱Wold，F(xiàn).，Meth.Enzymol.25623-651，1972、Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，在《ENZYMES ASDRUGS》(Holcenberg和Roberts編輯)，395-442頁(yè)，Wiley，New York，1981中、Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983、Mattson等，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，在本文中全部整體引入作為參考)。優(yōu)選的交聯(lián)試劑來(lái)自多種零長(zhǎng)度、同雙功能和異雙功能交聯(lián)試劑。零長(zhǎng)度交聯(lián)試劑包括不引入外部材料的兩個(gè)內(nèi)部化學(xué)基團(tuán)直接綴合。催化形成二硫鍵的試劑屬于這一類別。另一實(shí)例為誘導(dǎo)羧基和伯氨基縮合形成酰胺鍵的試劑，如碳二亞胺、乙基氯代甲酸酯、Woodward’s試劑K(2-乙基-5-苯基異噁唑-3’-磺酸酯)和羰二咪唑。除了這些化學(xué)試劑以外，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(谷氨酰-肽γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零長(zhǎng)度交聯(lián)試劑。該酶在與蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰胺殘基的氨甲酰基團(tuán)處催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，通常以伯氨基作為底物。優(yōu)選的同和異雙功能試劑分別含有兩個(gè)相同的或兩個(gè)不同的位點(diǎn)，其可以對(duì)氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異基團(tuán)具有反應(yīng)性。
純化因子IX綴合物通過(guò)上述方法產(chǎn)生的產(chǎn)物可以不經(jīng)純化而使用。然而，通常優(yōu)選回收產(chǎn)物?？梢允褂檬熘臉?biāo)準(zhǔn)技術(shù)回收糖基化的糖，如薄層或厚層層析、柱層析、離子交換層析或膜過(guò)濾。如下文以及本文所引用的文獻(xiàn)所討論，優(yōu)選使用膜過(guò)濾(更優(yōu)選使用反滲透膜)或一種或多種柱層析技術(shù)進(jìn)行回收。例如，可以使用分子量截止值約3000到約10000的膜去除蛋白質(zhì)如糖基轉(zhuǎn)移酶。然后可以使用納米過(guò)濾或反滲透去除鹽和/或純化產(chǎn)物糖(參閱如WO 98/15581)。納米過(guò)濾膜是反滲透膜的一種，其透過(guò)一價(jià)鹽而截留多價(jià)鹽和大于約100到約2000道爾頓的不帶電溶質(zhì)(取決于所使用的膜)。因此，在一般應(yīng)用中，通過(guò)本發(fā)明方法制備的糖將留在膜上而污染鹽將透過(guò)。
如果在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生修飾的糖蛋白，第一步去除宿主細(xì)胞或裂解片段的微粒碎屑(例如通過(guò)離心或超濾)，任選地，可以用市售的蛋白濃縮濾器濃縮蛋白質(zhì)，接著通過(guò)一個(gè)或多個(gè)步驟從其他雜質(zhì)中分離多肽變體，所述步驟選自免疫親和層析、離子交換柱分級(jí)分離(如二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基基團(tuán)的基質(zhì))、Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、lentillectin-Sepharose、WGA-Sepharose、Con A-Sepharose、EtherToyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl或A蛋白Sepharose上的層析、SDS-PAGE層析、硅膠層析、層析聚焦、反相HPLC(如帶有側(cè)掛脂肪基團(tuán)的硅膠)、使用如Sephadex分子篩或大小排阻層析的凝膠過(guò)濾、與多肽選擇性結(jié)合的柱上的層析以及乙醇或硫酸銨沉淀。
在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的修飾糖肽一般通過(guò)首先從細(xì)胞、酶等中提取和接著的一次或多次濃縮、鹽析、含水離子交換或分子排阻層析步驟進(jìn)行分離。另外，可以通過(guò)親和層析純化修飾的糖蛋白。最后可以使用HPLC進(jìn)行最后的純化步驟。
可以在任何前述步驟中引入蛋白酶抑制劑(如甲磺酰氟(PMSF))以抑制蛋白酶解，并可以含有抗生素以阻止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，首先使用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾器(如Amicon或Millipore Pellicon超濾設(shè)備)濃縮來(lái)自產(chǎn)生本發(fā)明修飾糖肽的系統(tǒng)的上清液。在濃縮步驟之后，可以將濃縮液應(yīng)用于合適的純化基質(zhì)。例如，合適的親和基質(zhì)可以含有與合適的支持物結(jié)合的肽的配體、凝集素或抗體分子。另外，可以使用陰離子交換樹脂，如含有側(cè)掛的DEAE基團(tuán)的基質(zhì)或底物。合適的基質(zhì)包括丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或在蛋白質(zhì)純化中普遍使用的其他類型。另外，可以應(yīng)用陽(yáng)離子交換步驟。合適的陽(yáng)離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基基團(tuán)的多種不溶基質(zhì)。特別優(yōu)選磺丙基基團(tuán)。
最后，為進(jìn)一步純化多肽變體組合物，可以應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)使用疏水RP-HPLC介質(zhì)(如具有側(cè)掛的甲基或其他脂肪基團(tuán)的硅膠)的RP-HPLC步驟。還可以利用某些或全部上述純化步驟的多種組合來(lái)提供同質(zhì)修飾的糖蛋白。
可以通過(guò)與Urdal等，J.Chromatog.296171(1984)中所公開的相類似的方法純化從大規(guī)模發(fā)酵得到的本發(fā)明修飾糖肽。該參考文獻(xiàn)描述了用于純化重組人IL-2的在制備級(jí)HPLC柱上進(jìn)行的兩個(gè)連續(xù)的RP-HPLC步驟。另外，可以利用如親和層析的技術(shù)純化修飾的糖蛋白。
藥物組合物在另一方面中，本發(fā)明提供藥物組合物。藥物組合物包含可藥用稀釋劑以及非天然存在的PEG部分、治療部分或生物分子和糖基化的或非糖基化的因子IX肽的共價(jià)綴合物。多聚體、治療部分或生物分子通過(guò)完整的糖基連接基團(tuán)與肽綴合，所述連接基團(tuán)插入肽和多聚體、治療部分或生物分子之間并與二者共價(jià)連接。
本發(fā)明的藥物組合物適用于多種藥物投送系統(tǒng)。本發(fā)明中有用的合適制劑可見(jiàn)于《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第十七版，(1985)。藥物投送方法的簡(jiǎn)單綜述參閱Langer，Science 2491527-1533(1990)。
可以為任何適當(dāng)?shù)慕o藥方式配制藥物組合物，包括如局部、口服、鼻、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。對(duì)于腸胃外給藥(如皮下注射)，載體優(yōu)選含有水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖劑。對(duì)于口服給藥，可以使用任何上述載體或固體載體如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可以使用可生物降解微球(如多聚乳酸、聚乙醇酸)作為本發(fā)明藥物組合物的載體。合適的可生物降解微球公開于如U.S.專利No.4,897,268和5,075,109。
藥物組合物一般經(jīng)腸胃外(如靜脈內(nèi))給藥。因此，本發(fā)明提供經(jīng)腸胃外給藥的組合物，其含有溶解于或懸浮于可接受載體(優(yōu)選水性載體如水、緩沖水、鹽水、PBS等等)的化合物。組合物可以含有接近生理?xiàng)l件所需的可藥用輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)整劑、濕潤(rùn)劑、洗滌劑等等。
這些組合物可以使用常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌或進(jìn)行過(guò)濾滅菌。得到的水溶液可以原樣包裝待用或凍干，凍干的制劑在給藥前與無(wú)菌水性載體組合。制劑的pH一般在3和11之間，優(yōu)選從5到9并最優(yōu)選從7到8。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的糖肽可以摻入由標(biāo)準(zhǔn)小泡形成性脂質(zhì)所形成的脂質(zhì)體中。多種方法可用于制備脂質(zhì)體，如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)、U.S.專利No.4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述。使用多種靶向劑(如本發(fā)明的唾液酸半乳糖苷)靶向脂質(zhì)體為本領(lǐng)域所熟知(參閱如U.S.專利No.4,957,773和4,603,044)。
可以使用將靶向劑與脂質(zhì)體偶聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法一般涉及將脂質(zhì)組分(如磷脂酰乙醇胺)摻入脂質(zhì)體中，所述脂質(zhì)組分可以被活化用于附著靶向劑，或衍生的親脂化合物，如本發(fā)明的脂質(zhì)衍生的糖肽。
靶向機(jī)制一般需要以使靶向部分可與靶標(biāo)(如細(xì)胞表面受體)相互作用的方式將靶向劑置于脂質(zhì)體的表面?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(如分別用長(zhǎng)鏈烷基鹵或脂肪酸烷基化或?；妓衔锷洗嬖诘牧u基)在脂質(zhì)體形成前將本發(fā)明的碳水化合物附著于脂質(zhì)分子。另外，可以按以下方式形成脂質(zhì)體在形成膜時(shí)首先將連接體部分摻入膜中。該連接體部分必須具有能緊密嵌入并錨定在膜中的親脂部分。它還必須具有可在脂質(zhì)體的水性表面有化學(xué)活性的反應(yīng)性部分。選擇反應(yīng)性部分，以使其在化學(xué)上適合與隨后加入的靶向劑或碳水化合物形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵。在一些情況下，可以將靶向劑直接附著于連接體分子，但在多數(shù)情況下更適合使用第三個(gè)分子作為化學(xué)橋，從而將膜中的連接體分子與三維擴(kuò)張到小泡表面外的靶向劑或碳水化合物連接。
通過(guò)本發(fā)明方法制備的化合物還可以用作診斷劑。例如，可以使用經(jīng)標(biāo)記的化合物在懷疑具有炎癥的患者中定位炎癥或腫瘤轉(zhuǎn)移的區(qū)域。對(duì)于該用途，化合物可以使用125I、14C或氚進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明的藥物組合物中使用的活性成分為糖基聚乙二醇化的因子IX及其具有參與凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的生物特性的衍生物。本發(fā)明的脂質(zhì)體分散體可作為腸胃外制劑用于治療以低或缺陷型凝血為特征的凝血障礙，如多種類型的血友病。優(yōu)選腸胃外施用本發(fā)明的因子IX組合物(如IV、IM、SC或IP)。取決于受治疾病和給藥途徑，有效劑量預(yù)計(jì)將發(fā)生可觀的變化，但預(yù)計(jì)活性物質(zhì)在約0.1到000μg/kg體重的范圍內(nèi)。治療凝血障礙優(yōu)選的劑量為每周三次約50到約3000μg/kg。更優(yōu)選每周三次約500到約2000μg/kg。更優(yōu)選每周三次約750到約1500μg/kg，并最優(yōu)選每周三次約1000μg/kg。由于本發(fā)明提供具有增強(qiáng)的體內(nèi)停留時(shí)間的因子IX，在施用本發(fā)明的組合物時(shí)可以任選地降低所述的劑量。(這些劑量是否合適？)提供以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的綴合物和方法，而非限制所要求的發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1制備UDP-GalNAc-6’-CHO將UDP-GalNAc(200mg，0.30mmole)溶于1mM CuSO4溶液(20mL)和25mM NaH2PO4溶液(pH6.0，20mL)中。接著加入半乳糖氧化酶(240U，240μL)和過(guò)氧化氫酶(13000U，130μL)，用充滿氧的氣球裝配反應(yīng)系統(tǒng)并在室溫下攪拌七天。接著過(guò)濾(離心管，MWCO 5K)反應(yīng)混合物，在4℃儲(chǔ)存濾液(～40mL)待用。TLC(二氧化硅；乙醇/水(7/2)；Rf＝0.77；茴香醛染色顯影)。
實(shí)施例2制備UDP-GaINAc-6’-NH2在0℃下向上述UDP-GalNAc-6’-CHO溶液(2mL或～20mg)中加入乙酸銨(15mg，0.194mmole)和NaBH3CN(1M THF溶液；0.17mL，0.17mmole)并在室溫下溫育過(guò)夜。用含水的G-10柱過(guò)濾反應(yīng)物，并收集產(chǎn)物。將合適的級(jí)分凍干并冷凍儲(chǔ)存。TLC(二氧化硅；乙醇/水(7/2)；Rf＝0.72；茚三酮染色顯影)。
實(shí)施例3制備UDP-GaINAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)將半乳糖氨基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)(58mg，0.045mmole)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。接著加入U(xiǎn)MP-morpholidate(60mg，0.15mmole)并在70℃將所得的混合物攪拌48小時(shí)。在反應(yīng)混合物中通入氮?dú)馀莩ト軇┎⑼ㄟ^(guò)反相層析(C-18二氧化硅，不連續(xù)梯度在10到80％之間，甲醇/水)純化殘留物。收集所需的級(jí)分并減壓干燥以獲得50mg(70％)白色固體。TLC(二氧化硅，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀察值1485、1529、1618、1706。
實(shí)施例4制備半胱氨酸-PEG2(2) 4.1合成(1)在氬氛中向L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)的無(wú)水甲醇溶液(20mL)中加入氫氧化鉀(84.2mg，1.5mmol，粉末)。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，接著分若干部分在2小時(shí)中加入分子量20千道爾頓的mPEG-O-甲苯磺酸(Ts；1.0g，0.05mmol)。在室溫下將混合物攪拌5天，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。將殘留物溶于水(30mL)中，并在室溫下攪拌2小時(shí)以破壞所有過(guò)量的20千道爾頓mPEG-O-甲苯磺酸。用乙酸中和溶液，將pH調(diào)整至pH5.0并裝入(C-18硅)反相層析柱。用甲醇/水梯度洗脫柱(產(chǎn)物在約70％甲醇處洗脫)，用蒸發(fā)光散射監(jiān)控產(chǎn)物洗脫液，收集適當(dāng)?shù)募?jí)分并溶于水(500mL)中。層析(離子交換，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氫氧化物型，從水到水/乙酸-0.75N的梯度)該溶液并用乙酸將適當(dāng)級(jí)分的pH調(diào)低至6.0。在反相柱(C-18硅)上加載該溶液并用上述甲醇/水梯度洗脫。將產(chǎn)物級(jí)分合并、濃縮、重溶于水并凍干以得到453mg(44％)白色固體(1)。該化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。通過(guò)SDS PAGE確認(rèn)產(chǎn)物純度。
4.2合成(2)向1(440mg，22μmol)溶于無(wú)水CH2Cl2(30mL)的溶液中逐滴加入三乙胺(～0.5mL)直至溶液呈堿性。室溫下在1小時(shí)中將CH2Cl2(20mL)中的20千道爾頓mPEG-O-對(duì)硝基苯碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg，30.8μmol)分若干份加入。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物溶于水(100mL)中，并用1.0N NaOH將pH調(diào)整至9.5。在室溫下將堿性溶液攪拌2小時(shí)，接著用乙酸中和至pH7.0。然后將溶液裝入反相層析(C-18硅)柱。用甲醇/水梯度洗脫柱(產(chǎn)物在約70％甲醇處洗脫)，用蒸發(fā)光散射監(jiān)控產(chǎn)物洗脫液，收集適當(dāng)?shù)募?jí)分并溶于水(500mL)中。層析(離子交換，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氫氧化物型，從水到水/乙酸-0.75N的梯度)該溶液并用乙酸將適當(dāng)級(jí)分的pH調(diào)低至6.0。在反相柱(C-18硅)上加載該溶液并用上述甲醇/水梯度洗脫。將產(chǎn)物級(jí)分合并、濃縮、重溶于水并凍干以得到575mg(70％)白色固體(2)。該化合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1HS-CHH-CHN)，3.39(s，3H，CH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。通過(guò)SDS PAGE確認(rèn)產(chǎn)物純度。
實(shí)施例5制備UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)將半乳糖氨基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1千道爾頓)(58mg，0.045mmole)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。接著加入U(xiǎn)MP-morpholidate(60mg，0.15mmole)并在70℃將所得的混合物攪拌48小時(shí)。在反應(yīng)混合物中通入氮?dú)馀莩ト軇┎⑼ㄟ^(guò)反相層析(C-18硅，不連續(xù)梯度在10到80％之間，甲醇/水)純化殘留物。收集所需的級(jí)分并減壓干燥以獲得50mg(70％)白色固體。TLC(硅，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀察值1485、1529、1618、1706。
實(shí)施例6糖PEG化CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的因子IX本實(shí)施例公開制備無(wú)唾液酸的因子IX并用CMP-唾液酸-PEG使其唾液酸化。
6.1重組因子IX去唾液酸在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生重組形式的凝血因子IX(重組因子IX)。將6000IU重組因子IX溶于總體積12mL的USP水中。用另外6mL USP水將該溶液轉(zhuǎn)移至Centricon Plus20，PL-10離心濾器中。將溶液濃縮至2mL，接著用15mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2、0.05％NaN3稀釋并重濃縮。重復(fù)四次稀釋/濃縮以將緩沖液有效改變?yōu)榻K體積3.0mL。將2.9mL該溶液(約29mg重組因子IX)轉(zhuǎn)移到小塑料管中并加入530mU α2-3，6，8-神經(jīng)氨酸酶-瓊脂糖綴合物(霍亂弧菌(Vibrip chlerae)，Calbiochem，450μL)。在32℃將反應(yīng)混合物柔和旋轉(zhuǎn)26.5小時(shí)。10000rpm將混合物離心2分鐘并收集上清液。用0.5mL 50mM Tris-HCl pH7.12、1M NaCl、0.05％NaN3洗滌(含有神經(jīng)氨酸酶的)瓊脂糖珠6次。10000rpm下將混合的洗滌液和上清液再次離心2分鐘以除去所有殘留的瓊脂糖樹脂。用同樣的緩沖液將混合的去唾液酸蛋白質(zhì)溶液稀釋到19mL，并在Centricon Plus 20，PL-10離心濾器中濃縮到～2mL。將該溶液用15mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN3稀釋兩倍并濃縮到2mL。用Tris緩沖液將最終的去唾液酸化重組因子IX溶液稀釋到3mL終體積(～10mg/mL)。用IEF-電泳分析天然和去唾液酸化的重組因子IX樣品。先用10μLTris緩沖液稀釋1.5μL(15μg)樣品再與12μL上樣緩沖液混合進(jìn)行等電聚焦電泳(pH3-7)。使用標(biāo)準(zhǔn)程序上樣、跑膠和固定。凝膠用Colloidal Blue Stain染色(圖154)，顯示去唾液酸化因子IX的條帶。
實(shí)施例7制備PEG(1kDa和10kDa)-SA-因子IX將去唾液酸化的重組因子IX(29mg，3mL)分成兩份1.5mL(14.5mg)樣品置于兩個(gè)15mL離心管中。用12.67mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN3稀釋每一溶液并加入CMP-SA-PEG-1k或10k(7.25μmol)。將管輕輕顛倒混勻并加入2.9U ST3Gal3(326μL)(總體積14.5mL)。再次將管顛倒并在32℃輕柔旋轉(zhuǎn)65小時(shí)。在-20℃冷凍終止反應(yīng)。用SDS-PAGE分析10μg反應(yīng)樣品。在使用Dulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液pH7.1(Gibco)，6mL/分鐘的Toso HaasBiosep G3000SW(21.5×30cm，13μm)HPLC柱上純化PEG化的蛋白質(zhì)。用SDS Page和IEF凝膠監(jiān)控反應(yīng)和純化。用2μL 50mM Tris-HClpH 7.4、150mM NaCl、0.05％NaN3緩沖液稀釋10μL(10μg)樣品后與12μL上樣緩沖液和1μL 0.5M DTT混合并在85℃加熱6分鐘，然后上樣至Novex Tris-Glycine 4-20％ 1mm凝膠。凝膠用ColloidalBlue Stain染色(圖155)，顯示PEG(1kDa和10kDa)-SA-因子IX條帶。
實(shí)施例8直接唾液酸-糖基PEG化因子IX本實(shí)施例公開不預(yù)先用唾液酸酶處理制備唾液酸-PEG化因子IX。
8.1用CMP-SA-PEG-(10KDa)唾液酸-PEG化因子IX將在CHO細(xì)胞中表達(dá)并完全唾液酸化的因子IX(1100 IU)溶于5mL 20mM組氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN3和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0。接著將CMP-SA-PEG-(10KDa)(27mg，2.5μmol)溶于該溶液并加入1U ST3Gal3。在32℃輕柔混合28小時(shí)完成反應(yīng)。如Invitrogen所述用SDS-PAGE分析反應(yīng)物。用磷酸緩沖鹽溶液pH7.0(PBS)在Amersham Superdex 200(10×300mm，13μm)HPLC柱上純化產(chǎn)物蛋白質(zhì)，1mL/分鐘，Rt＝9.5分鐘。
實(shí)施例9用CMP-SA-PEG-(20KDa)唾液酸-PEG化因子IX將在CHO細(xì)胞中表達(dá)并完全唾液酸化的因子IX(1100 IU)溶于5mL 20mM組氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN3和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0。接著將CMP-SA-PEG-(20KDa)(50mg，2.3μmol)溶于該溶液并加入CST-II。反應(yīng)混合物在32℃輕柔混合42小時(shí)后結(jié)束。如Invitrogen所述用SDS-PAGE分析反應(yīng)物。
用磷酸緩沖鹽溶液pH7.0(Fisher)在Amersham Superdex 200(10×300mm，13μm)HPLC柱上純化產(chǎn)物蛋白質(zhì)，1mL/分鐘，Rt＝8.6分鐘。
實(shí)施例10糖基PEG化因子IX的唾液酸加帽本實(shí)施例公開唾液酸-糖基PEG化肽的唾液酸加帽程序。此處因子IX為示范的肽。
10.1因子IX-SA-PEG(10kDa)的N-連接和O-連接聚糖的唾液酸加帽在CentriconPlus 20 PL-10(Millipore Corp.，Bedford，MA)離心濾器中濃縮純化的重組因子IX-PEG(10kDa)(2.4mg)，并將緩沖液更換為50mM Tris-HCl pH7.2、0.15M NaCl、0.05％NaN3至終體積1.85mL。用372μL同一Tris緩沖液稀釋蛋白質(zhì)溶液并加入7.4mg固體CMP-SA(12μmol)。輕輕顛倒溶液混勻并加入0.1U ST3Gal 1和0.1U ST3Gal 3。在32℃將反應(yīng)混合物輕柔旋轉(zhuǎn)42小時(shí)。
用SDS-PAGE分析10μg反應(yīng)物樣品。使用Novex Tris-Glycine4-12％ 1mm凝膠并如Invitrogen所述用Colloidal Blue染色。簡(jiǎn)言之，將10μL(10μg)樣品與12μL上樣緩沖液和1μL 0.5M DTT混合并在85℃加熱6分鐘(圖156，第4道)。
實(shí)施例11糖基聚乙二醇化的因子IX的藥代動(dòng)力學(xué)研究在正常小鼠的PK研究中測(cè)試了四種糖基聚乙二醇化的因子IX變體(PEG-9變體)。先前已經(jīng)在體外通過(guò)凝血、內(nèi)源性凝血酶潛力(ETP)和血栓彈性描記法(TEG)測(cè)試建立了四種化合物的活性?；钚越Y(jié)果概括于表I。
為評(píng)估四種PEG-9化合物在循環(huán)中的活性延長(zhǎng)，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了PK研究。使用非血友病小鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2只動(dòng)物，每只動(dòng)物3個(gè)樣品。采樣時(shí)間點(diǎn)為施用化合物后0、0.08、0.17、0.33、1、3、5、8、16、24、30、48、64、72和96小時(shí)。離心血樣并保存為兩份等分試樣；一份用于凝血分析，一份用于ELISA。由于材料的限制，以不同劑量進(jìn)行PEG-9給藥BeneFIX 250U/kg；2K(低取代“LS”(每個(gè)肽分子1-2個(gè)PEG取代)200U/kg；2K(高取代“HS”(每個(gè)肽分子3-4個(gè)PEG取代)200U/kg；10K 100U/kg；30K 100U/kg。所有劑量基于測(cè)試的凝血試驗(yàn)單位。
結(jié)果概括于圖6和表II。
表II
結(jié)果證明了所有PEG-9化合物的延長(zhǎng)的趨勢(shì)。不直接比較AUC和Cmax的值。然而，比較了清除率(CL)，并且PEG-9化合物的CL低于BeneFIX，表示在小鼠中較長(zhǎng)的存在時(shí)間。盡管BeneFIX以最高劑量給藥，與BeneFIX相比，PEG-9化合物的最后可檢測(cè)凝血活性的時(shí)間增長(zhǎng)了。
實(shí)施例12制備LS和HS糖基PEG化因子IX通過(guò)ST3Gal-III催化的交換反應(yīng)從天然因子IX制備低PEG取代程度的糖基PEG化因子IX。在10mM組氨酸、260mM甘氨酸、1％蔗糖和0.02％吐溫80，pH7.2的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于使用CMPSA-PEG(2kD和10kD)的PEG化，在32℃下將因子IX(0.5mg/mL)與ST3Gal III(50mU/mL)和CMP-SA-PEG(0.5mM)孵育16小時(shí)。對(duì)于使用CMP-SA-PEG 30kD的PEG化，因子IX的濃度提高到1.0mg/mL，CMP-SA-PEG的濃度降低到0.17mM。在這些條件下，超過(guò)90％的因子IX分子被至少1個(gè)PEG部分取代。
通過(guò)酶促去唾液酸化從天然因子IX制備高度PEG取代的糖基PEG化因子IX。用PD10柱將因子IX肽緩沖液更換至50mM mES，pH6.0，將濃度調(diào)整至0.66mg/mL并在32℃下用AUS唾液酸酶(5mU/mL)處理16小時(shí)。用SDS-PAGE、HPLC和MALDI聚糖分析證實(shí)去唾液酸化。在QSepharose FF柱上純化無(wú)唾液酸的因子IX以去除唾液酸酶。用Ultra15濃縮器濃縮CaCl2級(jí)分，并用PD10柱將緩沖液更換為MES，pH6.0。
通過(guò)在32℃下與ST3Gal-III(50mU/mL)和CMP-SA-PEG(0.5mM)孵育16小時(shí)進(jìn)行無(wú)唾液酸的因子IX(0.5mg/mL)的2kD和10kD PEG化。對(duì)于使用CMPSA-PEG-30kD的PEG化，因子IX的濃度提高到1.0mg/mL，CMP-SA-PEG的濃度降低到0.17mM。PEG化16小時(shí)后，通過(guò)加入1mMCMP-SA并在32℃繼續(xù)額外孵育8小時(shí)用唾液酸使帶有末端半乳糖的聚糖加帽。在這些條件下，超過(guò)90％的因子IX分子被至少1個(gè)PEG部分取代。在SDS-PAGE中，通過(guò)本方法產(chǎn)生的因子IX具有較高的表觀分子量。
實(shí)施例13制備O-糖基PEG化因子IX通過(guò)在32℃將肽與GalNAcT-II(25mU/mL)和1mM UDP-GalNAc孵育從頭將O-聚糖鏈引入天然因子IX(1mg/mL)中。孵育4小時(shí)后，通過(guò)加入CMPSA-PEG(0.5mM的2Kd或10Kd或0.17mM的30kD)和ST6GalNAc-I(25mU/mL)起始PEG化反應(yīng)并額外孵育20小時(shí)。
應(yīng)該理解本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說(shuō)明性目的，其多種修飾或改變將暗示給本領(lǐng)域技術(shù)人員，并包括于本申請(qǐng)的精神和范圍以及附帶的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)谒心康闹幸云湔w引入作為參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.含有至少一個(gè)具有以下通式的部分的因子IX肽 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇?xì)埢某蓡T的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，且當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-NH-。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中L-R1具有下式 其中a為從0到20的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e和f為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)；且q為從0到20的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e、f和f’為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)；且q和q’為獨(dú)立選自1到20的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e、f和f’為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)；且q、q’和q”為獨(dú)立選自1到20的整數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e和f為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式
8.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式
9.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式 其中AA為所述肽的氨基酸殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的因子IX肽，其中所述氨基酸殘基選自絲氨酸或蘇氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中所述肽具有SEQ.ID.NO1的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的因子IX肽，其中所述氨基酸殘基為SEQ.ID.NO1位置61處的絲氨酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式 其中a、b、c、d、i、r、s、t和u為獨(dú)立選自0和1的整數(shù)；q為1；e、f、g和h為獨(dú)立選自0到6的整數(shù)；j、k、l和m為獨(dú)立選自0到100的整數(shù)；v、w、x和y獨(dú)立選自0和1，且v、w、x和y中至少一個(gè)為1；AA為所述因子IX肽的氨基酸殘基；Sia-(R)具有下式 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇?xì)埢某蓡T的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，且當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-NH-。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的因子IX肽，其中所述糖基殘基附著于選自Asn157、Asn167及其組合的成員。
15.含有根據(jù)權(quán)利要求1的因子IX和可藥用載體的藥物制劑。
16.在哺乳動(dòng)物中刺激凝血的方法，所述方法包含對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求1的所述因子IX肽。
17.在受試者中治療血友病的方法，所述方法包含對(duì)所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1的所述因子IX肽。
18.產(chǎn)生含有下面部分的因子IX肽綴合物的方法 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇?xì)埢某蓡T的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，且當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-NH-。所述方法包括(a)在適于轉(zhuǎn)移的條件下，使底物因子IX肽與具有式 的PEG-唾液酸供體部分以及將所述PEG-唾液酸轉(zhuǎn)移到所述因子IX肽的氨基酸或糖基殘基上的酶相接觸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中L-R1具有下式 其中a為從0到20的整數(shù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e和f為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)；且q為從0到20的整數(shù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e、f和f’為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)；且q和q’為獨(dú)立選自1到20的整數(shù)。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e、f和f’為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)；且q、q’和q”為獨(dú)立選自1到20的整數(shù)。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結(jié)構(gòu) 其中e和f為獨(dú)立選自1到2500的整數(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述因子IX肽綴合物含有具有下式的部分
25.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述因子IX肽綴合物含有具有式下式的部分
26.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述因子IX肽綴合物含有具有下式的部分 其中AA為所述因子IX肽的氨基酸殘基。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述氨基酸殘基選自絲氨酸或蘇氨酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述因子IX底物肽具有SEQ.ID.NO1的氨基酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的因子IX肽，其中所述氨基酸殘基為SEQ.ID.NO1位置61處的絲氨酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述因子IX綴合物含有具有通式 的糖基殘基，其中a、b、c、d、i、r、s、t和u為獨(dú)立選自0和1的整數(shù)；q為1；e、f、g和h為獨(dú)立選自0到6的整數(shù)；j、k、l和m為獨(dú)立選自0到100的整數(shù)；v、w、x和y獨(dú)立選自0和1，且v、w、x和y中至少一個(gè)為1；AA為所述因子IX肽的氨基酸殘基；Sia-(R)具有下式 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇?xì)埢某蓡T的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當(dāng)D為OH時(shí)，G為R1-L-，且當(dāng)G為-C(O)(C1-C6)烴基時(shí)，D為R1-L-NH-。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述糖基殘基附著于選自Asn157、Asn167及其組合的成員。
32.權(quán)利要求18的方法，所述方法在步驟(a)之前還包含(b)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述底物因子IX肽。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述宿主選自昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供因子IX和PEG部分之間的綴合物。該綴合物通過(guò)介于并共價(jià)附著于肽和修飾基團(tuán)間的完整糖基連接基團(tuán)連接。該綴合物由糖基化的肽通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶作用形成。糖基轉(zhuǎn)移酶將修飾的糖部分連接在肽的糖基殘基上。還提供了制備該綴合物的方法、用該綴合物治療多種病癥的方法和包含該綴合物的藥物制劑。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1889937SQ200480035951
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者S·德弗利斯, R·J·拜爾, C·鮑, K·潘尼爾瑟瓦姆 申請(qǐng)人:尼奧斯技術(shù)有限公司