專利名稱：葡糖激酶調(diào)節(jié)劑吡啶羧酸衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防通過葡糖激酶(GLK)介導(dǎo)的導(dǎo)致胰島素分泌的葡萄糖閾值降低的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的一類苯甲酰氨基吡啶基羧酸。另外，預(yù)期這些化合物通過增加肝臟葡萄糖攝取降低血糖。此類化合物可能具有治療II型糖尿病和肥胖癥的功效。本發(fā)明還涉及含所述化合物的藥用組合物和用所述化合物治療GLK介導(dǎo)疾病的方法。
在胰腺β-細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，主要的原生質(zhì)膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT2。在生理葡萄糖濃度下，GLUT2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的速率不是限于在這些細(xì)胞中攝取葡萄糖全部速率的速率。葡萄糖攝取速率受葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)的速率的限制，該磷酸化經(jīng)葡糖激酶(GLK)[1]催化。GLK具有高葡萄糖(6-10mM)Km，不受G-6-P[1]生理濃度抑制。GLK表達(dá)僅限于幾種組織和細(xì)胞類型，最明顯的是胰腺β細(xì)胞和肝細(xì)胞(肝細(xì)胞)[1]。在這些細(xì)胞中，GLK活性是限制葡萄糖利用的比率，因此它調(diào)節(jié)葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌和肝糖原合成的程度。這些過程對維持整個身體葡萄糖穩(wěn)定至關(guān)重要，在糖尿病中，兩者均功能異常[2]。
在糖尿病的一種亞型，即青少年發(fā)育期開始II型糖尿病(MODY-2)中，功能突變GLK缺失導(dǎo)致該糖尿病[3，4]。MODY-2患者中的高血糖由胰腺和肝臟中缺陷性葡萄糖利用所致[5]。在MODY-2患者的胰腺中缺陷性葡萄糖利用導(dǎo)致刺激胰島素分泌的葡萄糖閾值升高。相反，很少激活GLK突變降低導(dǎo)致家族性胰島素休克的該閾值[6，6a，7]。除了在MODY-2糖尿病患者中觀察到GLK活性降低外，在II型糖尿病患者中肝葡糖激酶活性也降低[8]。重要的是，在該疾病的飲食性和遺傳性兩種類型中普遍或肝臟選擇性過度表達(dá)GLK，阻止或反轉(zhuǎn)糖尿病表型發(fā)展[9-12]。此外，用果糖急性治療II型糖尿病可通過刺激肝葡萄糖利用提高葡萄糖耐量[13]。據(jù)認(rèn)為，該作用通過下述機(jī)制，通過果糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞中的胞質(zhì)GLK活性增加介導(dǎo)[13]。
通過與GLK調(diào)節(jié)蛋白(GLKRP)結(jié)合抑制肝GLK活性。通過果糖-6-磷酸(F6P)與GLKRP結(jié)合穩(wěn)定GLK/GLKRP復(fù)合物，而通過果糖-1-磷酸(F1P)置換該磷酸糖去穩(wěn)定。通過果糖激酶介導(dǎo)的飲食果糖磷酸化生成F1P。因此，GLK/GLKRP復(fù)合物完整性和肝GLK活性按營養(yǎng)依賴性方式調(diào)節(jié)，因?yàn)镕6P在吸收后狀態(tài)升高，而F1P主要處于膳食后狀態(tài)。與肝細(xì)胞相對照，在不存在GLKRP條件下，胰腺β-細(xì)胞表達(dá)GLK。因此，β-細(xì)胞GLK活性只受其底物、葡萄糖的利用度調(diào)節(jié)。小分子可直接或通過使GLK/GLKRP復(fù)合物去穩(wěn)定激活GLK。預(yù)計前一類化合物在肝臟和胰腺中刺激葡萄糖利用，預(yù)計后者只在肝臟起作用。但是，預(yù)計具有任一特征的化合物對治療II型糖尿病有治療益處，因?yàn)樵摷膊〉奶卣髟谟趦煞N組織中均存在缺陷性葡萄糖利用。
GLK、GLKRP和KATP通道在下丘腦神經(jīng)元中表達(dá)，下丘腦是調(diào)節(jié)能量平衡和控制食物攝取的重要腦區(qū)域[14-18]。這些神經(jīng)元已表明表達(dá)促食欲和厭食神經(jīng)多肽[15，19，20]，并假定它們是下丘腦中的葡萄糖感知神經(jīng)元，環(huán)境葡萄糖濃度變化抑制或興奮這些神經(jīng)元[17，19，21，22]。這些神經(jīng)元感知葡萄糖水平變化的能力在多種遺傳和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的肥胖癥模型中有缺陷[23-28]。給大腦室內(nèi)(icv)輸注葡糖激酶的競爭性抑制劑葡萄糖類似物，刺激瘦大鼠食物攝取[29，30]。相反，icv輸注葡萄糖抑制進(jìn)食[31]。因此，GLK的小分子激活劑可通過對GLK的中樞作用減少食物攝取和增加重量。因此除糖尿病以外，GLK激活劑還可能具有治療包括肥胖癥在內(nèi)的飲食性疾病的治療用途。對于治療II型糖尿病而言，在使葡萄糖穩(wěn)定正?；?，作用于肝臟和/或胰腺中的同一化合物的下丘腦作用是加和或協(xié)同的。因此，GLK/GLKRP系統(tǒng)可描述為潛在的″糖尿病-肥胖癥(Diabesity)″靶(具有糖尿病和肥胖癥兩種益處)。
在WO 0058293和WO 01/44216(Roche)中，將一系列芐基氨基甲?；衔锩枋鰹槠咸羌っ讣せ顒?。通過在GLK活性與NADH生成相關(guān)的測定中測量此類化合物的直接作用，評價此類化合物激活GLK的機(jī)理，而NADH生成通過光學(xué)測量，見實(shí)施例A中所述體外測定的詳細(xì)內(nèi)容。本發(fā)明化合物可直接激活GLK，或可通過抑制GLKRP與GLK的相互作用激活GLK。后一個機(jī)理比GLK直接激活劑具有重要優(yōu)勢，該優(yōu)勢在于它們不會造成預(yù)計的直接刺激后嚴(yán)重低血糖事件。與已知的GLK激活劑相比，許多本發(fā)明化合物可表現(xiàn)出有利的選擇性。
WO 9622282、WO 9622293、WO 9622294、WO 9622295、WO9749707和WO 9749708公開用于制備可用作與本發(fā)明公開的那些結(jié)構(gòu)上類似的加壓素化合物的多種中間體。結(jié)構(gòu)類似化合物還在WO9641795和JP8143565(加壓素拮抗性)，在JP8301760(皮膚損傷預(yù)防)和在EP619116(osetopathy(骨病))中公開。
WO 01/12621公開用作c-JUN N-末端激酶抑制劑的異唑基嘧啶和相關(guān)化合物的制備和含此類化合物的藥用組合物。
Cushman等[Bioorg Med Chem Lett(1991)1(4)，211-14]描述合成含吡啶的1，2-二苯乙烯和酰胺的方法以及對它們用作蛋白酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)行評價。Rogers等[J Med Chem(1981)24(11)1284-7]描述用作環(huán)AMP磷酸二酯酶抑制劑的介離子6-羥基嘌呤類似物。
WO 00/26202描述制備用作抗腫瘤藥物的2-氨基-噻唑衍生物的方法。GB 2331748描述制備噻唑衍生物殺蟲劑的方法。WO 96/36619描述制備用作促消化道運(yùn)動藥物的氨基噻唑衍生物的方法。美國專利5466715和美國專利5258407描述制備3，4-二取代苯酚免疫刺激劑的方法。JP 58069812描述含苯甲酰胺衍生物的降血糖藥物。美國專利3950351描述2-苯甲酰氨基-5-硝基噻唑，Cavier等[Eur J Med Chem-Chim Ther(1978)13(6)，539-43]論述這些化合物的生物學(xué)意義。
國際申請?zhí)朩O 03/015774描述用作葡糖激酶激活劑的一類苯甲酰基氨基雜環(huán)化合物，和國際申請?zhí)朩O 03/000262描述用作葡糖激酶激活劑的一類乙烯基苯基衍生物。
國際申請?zhí)朩O 03/000267描述一類苯甲?；被拎せ人?，它們是葡糖激酶(GLK)激活劑。我們出乎意料之外地發(fā)現(xiàn)，這些化合物中的一小部分因其水溶性提高和血漿結(jié)合水平降低，口服后具有較高血藥水平，同時保留對GLK酶的高效力。這使得該亞類化合物尤其適用于治療或預(yù)防通過GLK介導(dǎo)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物 式(I)其中A為苯基或5元或6元雜芳環(huán)，其中A未被取代或被獨(dú)立選自R3的1或2個基團(tuán)取代；R1選自氫和甲基；R2選自氫和甲基；R3選自甲基、甲氧基、氟、氯和氰基；條件是R1和R2中的至少一個為甲基。
式(I)化合物可形成本發(fā)明范圍內(nèi)的鹽。盡管其它鹽可用于例如分離或純化化合物，但優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽。
在本說明書中，術(shù)語″雜芳基″表示含有至少一個選自氮、硫和氧的原子的芳族單環(huán)5-6元碳環(huán)。除另有說明外，“雜芳基”環(huán)可以與碳或氮連接，除非通過氮連接導(dǎo)致帶電荷的季氮。
優(yōu)選″雜芳基″環(huán)為含有一個選自氮、硫和氧的雜原子的5元芳環(huán)。
含有至少一個雜原子的芳族單環(huán)5-6元環(huán)的實(shí)例包括噻吩基、呋喃基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、咪唑基、唑基、異唑基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基和嘧啶基，優(yōu)選呋喃基或噻吩基。
應(yīng)理解由于有一個或多個不對稱碳原子，以上定義的某些式(I)化合物可存在旋光性或外消旋形式，本發(fā)明包括其定義中的任何具有直接刺激GLK或抑制GLK/GLKRP相互作用性質(zhì)的這種旋光性或外消旋形式?？砂凑毡绢I(lǐng)域中熟知的有機(jī)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如由旋光性原料合成或拆分外消旋體，來進(jìn)行旋光性形式的合成。還應(yīng)理解某些化合物可存在互變異構(gòu)體，本發(fā)明還涉及激活GLK的本發(fā)明化合物的任何和所有互變異構(gòu)體。
優(yōu)選的式(I)化合物為其中采用任何一個或多個以下定義的那些化合物(1)R1為甲基；優(yōu)選 (2)R2為氫；(3)A選自苯基、呋喃基和噻吩基，優(yōu)選苯基和噻吩基；(4)A未被取代或被甲基或氟取代；(5)優(yōu)選式(I)3位上的基團(tuán)為
按照本發(fā)明的再一個特征，提供以下優(yōu)選的各組本發(fā)明化合物(I)式(Ia)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥 式(Ia)其中R2和A定義同以上式(I)化合物。
(II)式(Ib)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥 式(Ib)其中R2定義同以上式(I)化合物。
(III)式(Ic)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥 式(Ic)其中A′為雜芳基；R2定義同以上式(I)化合物。
(IV)式(Id)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥 式(Id)其中A定義同以上式(I)化合物。
(V)式(Ie)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥 式(Ie)其中A選自苯基、噻吩基和呋喃基；A任選被甲基、甲氧基、氯或氟取代；R1選自氫和甲基；R2選自氫和甲基；條件是R1和R2中的至少一個為甲基。
在本發(fā)明的再一方面，提供任一實(shí)例或其鹽、溶劑合物或前藥。在本發(fā)明的再一方面，提供任何兩個或多個實(shí)例或其鹽、溶劑合物或前藥。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物包括以下任何一個、兩個或多個化合物1)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；2)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；
3)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(2-甲氧基苯基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；4)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-噻吩-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；5)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-氯噻吩-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；6)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-噻吩-3-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；7)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；8)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{4-氟苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；9)6-{3-[(2S)-2-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；10)6-{3-[(2R)-2-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；和11)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{2-氯苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；12)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{3，5-二氟苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；13)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{3-氟苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；14)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-甲基噻吩-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；15)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{3-甲氧基苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；16)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{2-甲基苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；
17)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{4-甲氧基苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；18)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-氯呋喃-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；或其鹽、溶劑合物或前藥。
更優(yōu)選的本發(fā)明化合物為以下任何一個化合物1)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；2)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；和3)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；或其鹽、溶劑合物或前藥。
可以前藥的形式給予本發(fā)明化合物。前藥為可在體內(nèi)降解產(chǎn)生本發(fā)明化合物的生物前體或藥學(xué)上可接受的化合物(例如本發(fā)明化合物的酯或酰胺，尤其為體內(nèi)可水解的酯)。在本領(lǐng)域中已知各種前藥形式。有關(guān)此類前藥衍生物的實(shí)例，參見a)Design of Prodrugs，H.Bundgaard編輯，(Elsevier，1985)和Methods in Enzymology，第42卷，第309-396頁，K.Widder等編輯(Academic Press，1985)；b)A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen編輯；c)H.Bundgaard，第5章″Design and Application of Prodrugs″，H.Bundgaard著，第113-191頁(1991)；d)H.Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，8，1-38(1992)；e)H.Bundgaard等，Journal of Pharmaceutical Sciences，77，285(1988)；和
f)N.Kakeya等，Chem Pharm Bull，32，692(1984)。
以上引用的文獻(xiàn)內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
前藥的實(shí)例如下?？稍隗w內(nèi)水解的含羧基或羥基的本發(fā)明化合物的酯為例如可在人或動物體內(nèi)水解產(chǎn)生母體酸或醇的藥學(xué)上可接受的酯。用于羧基的適宜的藥學(xué)上可接受的酯包括C1-C6烷氧基甲酯例如甲氧基甲基酯、C1-C6烷酰氧基甲酯例如新戊酰氧基甲基酯、2-苯并[c]呋喃酮基酯、C3-C8環(huán)烷氧基羰基氧基C1-C6烷基酯，例如1-環(huán)己基羰基氧基乙基酯；1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲酯，例如5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲基酯；和C1-6烷氧基羰基氧基乙酯。
可在體內(nèi)水解的含羥基的本發(fā)明化合物的酯包括無機(jī)酯，例如磷酸酯(包括氨基磷酸環(huán)酯)和α-酰氧基烷基醚以及相關(guān)化合物，由于酯在體內(nèi)水解，斷裂產(chǎn)生母體羥基。α-酰氧基烷基醚的實(shí)例包括乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基甲氧基。用于羥基形成體內(nèi)可水解酯的基團(tuán)的選擇包括烷?；?、苯甲酰基、苯基乙?；⑷〈谋郊柞；捅交阴；?、烷氧基羰基(產(chǎn)生碳酸烷基酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲?；?產(chǎn)生氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙?；?。
適宜的本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽為例如堿性足夠強(qiáng)的本發(fā)明化合物的酸加成鹽，例如與例如以下無機(jī)或有機(jī)酸形成的酸加成鹽例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、檸檬酸或馬來酸。此外，酸性足夠強(qiáng)的本發(fā)明苯并嗪酮衍生物的適宜的藥學(xué)上可接受的鹽為堿金屬鹽，例如鈉或鉀鹽；堿土金屬鹽，例如鈣或鎂鹽；銨鹽或與提供生理上可接受的陽離子的有機(jī)堿形成的鹽，例如與甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、嗎啉或三-(2-羥乙基)胺形成的鹽。
本發(fā)明的再一個特征為含以上定義的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體的藥用組合物。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用作藥物的以上定義的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物。
再按照本發(fā)明，提供式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物用于制備治療通過GLK介導(dǎo)的疾病、尤其II型糖尿病的藥物。
化合物適宜配制成以這種方式使用的藥用組合物。
按照本發(fā)明的另一方面，提供通過給予需要這種治療的哺乳動物有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥治療GLK介導(dǎo)的疾病、尤其糖尿病的方法。
可通過本發(fā)明化合物或組合物治療的具體疾病包括在II型糖尿病中降低血糖而無嚴(yán)重低血糖風(fēng)險(并潛在治療I型糖尿病)、異常脂血癥、肥胖癥、抗胰島素性、代謝綜合征X、葡萄糖耐量減弱。
如上所述，因而可將GLK/GLKRP系統(tǒng)描述為潛在的″糖尿病-肥胖癥″(糖尿病和肥胖癥兩者益處)靶。因此，按照本發(fā)明的另一方面，提供式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥在制備用于聯(lián)合治療或預(yù)防糖尿病和肥胖癥的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的另一方面，提供式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥在制備用于治療或預(yù)防肥胖癥的藥物中的用途。
按照本發(fā)明的再一方面，提供通過給予需要這種治療的哺乳動物有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥來聯(lián)合治療肥胖癥和糖尿病的方法。
按照本發(fā)明的再一方面，提供通過給予需要這種治療的哺乳動物有效量的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥治療肥胖癥的方法。
本發(fā)明組合物可以為適用于口服使用的形式(例如作為片劑、錠劑、硬或軟膠囊劑、水性或油性混懸劑、乳劑、可分散散劑或顆粒劑、糖漿或酏劑)；適用于局部使用的形式(例如作為霜劑、軟膏劑、凝膠劑或水性或油性溶液或混懸劑)；適用于吸入給藥形式(例如作為微粉或液體氣霧劑)；適用于吹入給藥的形式(例如作為微粉散劑)或適用于腸胃外給藥形式(例如用作靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或肌內(nèi)給藥的無菌水性或油性溶液，或作為直腸給藥的栓劑)。
可通過常規(guī)方法，用本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)藥用賦形劑得到本發(fā)明組合物。因此，預(yù)定口服使用的組合物可含有例如一種或多種著色劑、甜味劑、矯味劑和/或防腐劑。
用于片劑的適宜的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括例如惰性稀釋劑，例如乳糖、碳酸鈉、磷酸鈣或碳酸鈣；造粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉或藻酸(algenic acid)；粘合劑，例如淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉；防腐劑，例如對-羥基苯甲酸乙酯或丙酯和抗氧化劑，例如抗壞血酸。片劑可未包衣或包衣，以改變其崩解度，使活性成分隨后在胃腸道吸收，或改善其穩(wěn)定性和/或外觀，在任一情形中，使用常規(guī)包衣劑和本領(lǐng)域熟知的方法。
口服使用的組合物可以為硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合，或?yàn)檐浢髂z膠囊形式，其中活性成分與水或油例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水混懸劑通常含微粉形式的活性成分以及一種或多種懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠和阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑，例如卵磷脂或環(huán)氧烷與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，例如十七烷亞乙氧基鯨蠟醇，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，例如十七烷亞乙氧基鯨蠟醇，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇脫水物的部分酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。水性混懸劑也可含有一種或多種防腐劑(例如對-羥基苯甲酸乙酯或丙酯、抗氧化劑(例如抗壞血酸)、著色劑、矯味劑和/或甜味劑(例如蔗糖、糖精或阿司帕坦)。
可通過將活性成分懸浮在植物油(例如落花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如液體石蠟)配制油性混懸劑。油性混懸劑還可含增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？杉尤胩鹞秳├缟鲜瞿切┖统C味劑，以提供爽口的口服制劑。可通過加入抗氧化劑例如抗壞血酸保存這些組合物。
適用于通過加水制備水混懸劑的可分散散劑和顆粒劑通常含活性成分以及分散劑或濕潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑。通過上述那些已舉例說明了適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑。也可存在其它的賦形劑，例如甜味劑、矯味劑和著色劑。
本發(fā)明的藥用組合物還可以為水包油乳劑形式。油相可以為植物油例如橄欖油或落花生油，或礦物油例如液體石蠟，或任何這些油的混合物。適宜的乳化劑可以為例如天然存在的膠，例如阿拉伯膠或黃芪膠；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂；由脂肪酸和己糖醇脫水物衍生的酯或部分酯(例如脫水山梨糖醇單油酸酯)和所述部分酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。乳劑也可含甜味劑、矯味劑和防腐劑。
可用甜味劑例如甘油、丙二醇、山梨醇、阿司帕坦或蔗糖配制糖漿和酏劑，也可含有緩和劑、防腐劑、矯味劑和/或著色劑。
藥用組合物也可以為無菌注射水或油混懸劑形式，可按照已知方法，用上述一種或多種適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配制。無菌注射制劑也可為無毒、腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑的無菌注射溶液或混懸劑，例如1，3-丁二醇溶液。
吸入給藥的組合物可以為設(shè)計成將活性成分以含微粉固體或液滴的氣霧分配的常規(guī)加壓氣霧劑形式?？墒褂贸Ｒ?guī)氣霧劑拋射劑，例如揮發(fā)性氟化烴或烴，可將氣霧劑裝置便利地設(shè)計成按計量活性成分分配。
有關(guān)制劑的進(jìn)一步信息，讀者可參考Comprehensive MedicinalChemistry(Corwin Hansch；編輯委員會主席)，Pergamon Press 1990，第5卷，第25.2章。
與一種或多種賦形劑組合產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量需根據(jù)治療宿主和具體的給予途徑而變化。例如，預(yù)定給予人口服的制劑通常含例如與適當(dāng)和適宜量的賦形劑混合的0.5mg-2g活性藥物，其可占總組合物約5％至約98％(重量)。單位劑型通常含約1mg至約500mg活性成分。有關(guān)給藥途徑和給藥方案的進(jìn)一步信息，讀者可參考Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch；編輯委員會主席)，Pergamon Press 1990，第5卷，第25.3章。
治療或預(yù)防目的的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的劑量大小自然根據(jù)病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、動物或患者的年齡和性別、給藥途徑；根據(jù)熟知的醫(yī)學(xué)原理而變化。
在使用式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物用于治療或預(yù)防目的時，通常給予日劑量例如0.5mg-75mg/kg體重，如果需要可按分劑量給藥。一般而言，當(dāng)使用腸胃外途徑時，給藥劑量較小。因此，例如靜脈內(nèi)給藥，通常使用的劑量范圍例如為0.5mg-30mg/kg體重。類似地，吸入給藥使用的劑量范圍例如為0.5mg-25mg/kg體重。但優(yōu)選口服用藥。
本文中所述增加GLK活性可作為單獨(dú)療法使用或與一種或多種其它物質(zhì)和/或適應(yīng)癥治療聯(lián)合使用?？赏ㄟ^同時、序貫或分別給予治療的各個成分實(shí)現(xiàn)這種聯(lián)合治療。同時治療可以用同一片劑或獨(dú)立片劑。例如治療糖尿病時，化療可包括以下主要治療類別1)胰島素和胰島素類似物；2)胰島素促分泌素，包括磺酰脲類(例如格列本脲、格列吡嗪)、膳食葡萄糖調(diào)節(jié)劑(例如瑞格列奈、那格列奈)；3)改善內(nèi)分泌作用的藥物(例如二肽基肽酶IV抑制劑和GLP-1激動劑)；
4)胰島素增敏劑，包括PPARγ激動劑(例如吡格列酮和羅格列酮)和具有PPARα和γ組合活性的藥物；5)調(diào)節(jié)肝葡萄糖平衡的藥物(例如甲福明、果糖1，6二磷酸酯酶抑制劑、糖原磷酸化酶抑制劑、糖原合成酶激酶抑制劑)；6)設(shè)計用于減少腸吸收葡萄糖的藥物(例如阿卡波糖)；7)阻止腎重吸收葡萄糖的藥物(SGLT抑制劑)；8)設(shè)計用于治療慢性高血糖并發(fā)癥的藥物(例如醛糖還原酶抑制劑)；9)減肥藥(例如西布曲明和奧利司他)；10)抗異常脂血癥藥物，例如HMG-CoA還原酶抑制劑(例如他汀類藥物)；PPARα激動劑(貝特類藥物(fibrates)，例如吉非貝齊)；膽汁酸螯合劑(考來烯胺)；膽固醇吸收抑制劑(植物stanols，合成抑制劑)；膽汁酸吸收抑制劑(IBATi)和煙酸及其類似物(煙酸和緩釋制劑)；11)抗高血壓藥物，例如β阻滯劑(例如阿替洛爾、普萘洛爾)；ACE抑制劑(例如賴諾普利)；鈣拮抗劑(例如硝苯地平)；血管緊張素受體拮抗劑(例如坎地沙坦)；α拮抗劑和利尿藥(例如呋塞米、芐噻嗪)；12)淤血調(diào)節(jié)劑，例如抗血栓形成藥、纖維蛋白溶解激活劑和抗血小板藥物；凝血酶拮抗劑；Xa因子抑制劑；VIIa因子抑制劑)；抗血小板藥物(例如阿司匹林、氯吡格雷)；抗凝血藥(肝素和低分子量類似物、水蛭素)和華法林；13)拮抗高血糖素作用的藥物；和14)抗炎藥，例如非甾體抗炎藥(例如阿司匹林)和甾體抗炎藥(例如可的松)。
按照本發(fā)明的另一方面，提供作為下述實(shí)施例終產(chǎn)物制備的各化合物及其鹽、溶劑合物和前藥。
可通過適用于制備此類化合物或結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物的任何已知方法制備本發(fā)明化合物或其鹽?？墒褂贸Ｒ?guī)方法將官能團(tuán)保護(hù)或去保護(hù)。
有關(guān)保護(hù)基團(tuán)例如氨基和羧酸保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例(以及形成和最終去保護(hù)的方法)，參見T.W.Greene和P.G.M.Wuts，″Protective Groups inOrganic Synthesis″，第二版，John Wiley & Sons，New York，1991。
提供合成式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的方法作為本發(fā)明的再一個特征。因此，按照本發(fā)明的再一方面，提供制備式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的方法，該方法包括(a)使式(IIIa)酸或其活化衍生物與式(IIIb)化合物反應(yīng)， 式(IIIa)式(IIIb)其中P1為H或保護(hù)基團(tuán)例如C1-4烷基(優(yōu)選甲基或乙基)；或(b)使式(IIIc)化合物脫保護(hù)， 式(IIIc)其中P1為保護(hù)基團(tuán)；或(c)使式(IIId)化合物與式(IIIe)化合物反應(yīng)， 式(IIId)式(IIIe)
其中X1為離去基團(tuán)，且X2為羥基，或X1為羥基，且X2為離去基團(tuán)，和其中P1為保護(hù)基團(tuán)；或(d)使式(IIIf)化合物與式(IIIg)化合物反應(yīng) 式(IIIf)式(IIIg)其中X3為離去基團(tuán)，且X4為羥基，或X3為羥基，且X4為離去基團(tuán)；或(e)使式(IIIh)化合物與式(IIIi)化合物反應(yīng)， 式(IIIh) 式(IIIi)其中X5為離去基團(tuán)，且其中P1為H或保護(hù)基團(tuán)，例如C1-4烷基(優(yōu)選甲基或乙基)；然后，如果需要i)將一種式(I)化合物轉(zhuǎn)化為另一種式(I)化合物；ii)除去任何保護(hù)基團(tuán)；iii)形成其鹽、前藥或溶劑合物。
技術(shù)人員熟知方法a)-e)中適宜的離去基團(tuán)，它們包括例如活化羥基離去基團(tuán)(例如甲磺酸酯和甲苯磺酸酯基)和鹵素離去基團(tuán)，例如氟、氯或溴。
式(IIIa)至式(IIIi)化合物有市售，或可通過本領(lǐng)域已知的和/或本文實(shí)施例中舉例說明的任何便利方法制備。一般而言，人們會認(rèn)識到任選在適宜的堿的存在下，可通過親核取代或金屬催化方法形成任何芳基-O或烷基-O鍵。
以上反應(yīng)的具體反應(yīng)條件如下方法a)-在本領(lǐng)域中熟知使氨基與羧酸偶合反應(yīng)形成酰胺。例如，(i)使用適當(dāng)?shù)呐己戏磻?yīng)，例如在DMAP的存在下，在適宜的溶劑例如DCM、氯仿或DMF中，在室溫下使碳二亞胺與EDAC進(jìn)行偶合反應(yīng)；或(ii)其中通過在適宜的溶劑例如二氯甲烷的存在下，與草酰氯反應(yīng)將羧基活化為酰氯的反應(yīng)。然后在堿例如三乙胺或吡啶的存在下，在適宜的溶劑，例如氯仿或DCM中，在0℃至室溫下，使酰氯與式IIIb化合物反應(yīng)。
方法b)-本領(lǐng)域中熟知的脫保護(hù)反應(yīng)。P1的實(shí)例包括C1-6烷基和芐基。其中P1為C1-6烷基，可在氫氧化鈉的存在下，在適宜的溶劑例如THF/水中進(jìn)行反應(yīng)。
方法c)-可使式(IIId)與式(IIIe)化合物一起在適宜的溶劑例如DMF或THF中，任選使用金屬催化劑例如披鈀碳或碘化亞銅，在0-100℃范圍內(nèi)，和堿例如氫化鈉或叔丁醇鉀反應(yīng)；或者，使式(IIId)和式(IIIe)化合物一起在適宜的溶劑例如THF或DCM中，和適宜的膦例如三苯膦和偶氮二羧酸酯例如偶氮二甲酸二乙酯反應(yīng)；方法d)-用以上方法c)中所述反應(yīng)條件，可使式(IIIf)和式(IIIg)化合物進(jìn)行反應(yīng)。
方法e)-可在極性溶劑例如DMF或非極性溶劑例如THF中，在0-100℃下，任選使用金屬催化劑例如披鈀碳或碘化亞銅，使式(IIIh)和式(IIIi)化合物與強(qiáng)堿例如氫化鈉或叔丁醇鉀反應(yīng)。
在制備過程中，對分子內(nèi)的官能團(tuán)使用保護(hù)基團(tuán)可能最好。可通過文獻(xiàn)中所述或化學(xué)技術(shù)人員已知的適宜除去所討論保護(hù)基團(tuán)的任何便利方法除去保護(hù)基團(tuán)，選擇此類方法以便在使分子內(nèi)其它基團(tuán)受到干擾最小的情況下除去保護(hù)基團(tuán)。
以下給出保護(hù)基團(tuán)的具體實(shí)例，為了方便，其中″低級″表示優(yōu)選其采用的基團(tuán)具有1-4個碳原子。應(yīng)理解這些實(shí)例并非窮盡性。當(dāng)以下給出除去保護(hù)基團(tuán)方法的具體實(shí)例時，同樣也不是窮盡性的。未具體提到的保護(hù)基團(tuán)的用途和脫保護(hù)的方法自然在本發(fā)明范圍內(nèi)。
羧基保護(hù)基團(tuán)可以是形成酯的脂族或芳脂族醇?xì)埢蛐纬甚サ募坠柰榇細(xì)埢?優(yōu)選所述醇或甲硅烷醇含1-20個碳原子)。羧基保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括直鏈或支鏈(1-12C)烷基(例如異丙基、叔丁基)；低級烷氧基低級烷基(例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、異丁氧基甲基；低級脂族酰氧基低級烷基(例如乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基)；低級烷氧基羰基氧基低級烷基(例如1-甲氧基羰基氧基乙基、1-乙氧基羰基氧基乙基)；芳基低級烷基(例如對甲氧基芐基、鄰-硝基芐基、對-硝基芐基、二苯甲基和2-苯并[c]呋喃酮基)；三(低級烷基)甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；三(低級烷基)甲硅烷基低級烷基(例如三甲基甲硅烷基乙基)；和(2-6C)烯基(例如烯丙基和乙烯基乙基)。
尤其適宜除去羧基保護(hù)基團(tuán)的方法包括例如酸、金屬或酶催化水解。
羥基保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括低級烯基(例如烯丙基)；低級烷酰基(例如乙?；?；低級烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低級烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基低級烷氧基羰基(例如苯甲酰氧基羰基、對甲氧基芐氧基羰基、鄰-硝基芐氧基羰基、對-硝基芐氧基羰基)；三低級烷基/芳基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)；芳基低級烷基(例如芐基)；和三芳基低級烷基(例如三苯基甲基)。
氨基保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括甲酰基、芳烷基(例如芐基和取代的芐基，例如對甲氧基芐基、硝基芐基和2，4-二甲氧基芐基和三苯基甲基)；二-對甲氧苯基甲基和呋喃基甲基；低級烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)；低級烯基氧基羰基(例如烯丙基氧基羰基)；芳基低級烷氧基羰基(例如芐氧基羰基、對-甲氧基芐氧基羰基、鄰-硝基芐氧基羰基、對-硝基芐氧基羰基；三烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基)；亞烷基(例如亞甲基)；亞芐基和取代的亞芐基。
適宜除去羥基和氨基保護(hù)基團(tuán)的方法包括例如酸、堿、金屬或酶催化水解，或光解基團(tuán)例如鄰-硝基芐氧基羰基，或用氟離子除去甲硅烷基。
酰胺基保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括芳烷氧基甲基(例如芐氧基甲基和取代的芐氧基甲基)；烷氧基甲基(例如甲氧基甲基和三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)；三烷基/芳基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)；三烷基/芳基甲硅烷氧基甲基(例如叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基、叔丁基二苯基甲硅烷氧基甲基)；4-烷氧基苯基(例如4-甲氧基苯基)；2，4-二(烷氧基)苯基(例如2，4-二甲氧基苯基)；4-烷氧基芐基(例如4-甲氧基芐基)；2，4-二(烷氧基)芐基(例如2，4-二(甲氧基)芐基)；和1-烯基(例如烯丙基、1-丁烯基和取代的乙烯基，例如2-苯乙烯基)。
可通過使酰胺基與適宜的芳烷氧基甲基氯反應(yīng)將芳烷氧基甲基引入酰胺基，和通過催化氫化除去。可通過使酰胺與適宜的氯化物反應(yīng)引入烷氧基甲基、三烷基/芳基甲硅烷基和三烷基/甲硅烷氧基甲基，和用酸除去；或在含甲硅烷基基團(tuán)的情形中，用氟離子除去?？赏ㄟ^用適宜的鹵化物進(jìn)行芳基化或烷基化便利地引入烷氧基苯基和烷氧基芐基，和通過用硝酸鈰銨氧化除去。最后，可通過使酰胺與適宜的醛反應(yīng)引入1-烯基，和用酸除去。
以下實(shí)施例用于舉例說明目的，并不限制本申請范圍。每個例舉化合物代表本發(fā)明的具體和獨(dú)立方面。在以下非限定性實(shí)施例中，除非另有說明，否則
(i)通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行蒸發(fā)，除去殘余固體例如通過過濾除去干燥劑后進(jìn)行后續(xù)處理；(ii)操作在室溫下即在18-25℃范圍內(nèi)，和在惰性氣氛例如氬氣或氮?dú)庀逻M(jìn)行；(iii)給出的收率僅用于說明，不一定是能得到的最大收率；(iv)通過核(通常質(zhì)子)磁共振(NMR)和質(zhì)譜技術(shù)確證式(I)終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；按δ標(biāo)度測量質(zhì)子磁共振化學(xué)位移值，峰多重性表示如下s，單峰；d，雙峰；t，三重峰；m，多重峰；br，寬峰；q，四重峰，quin，五重峰；(v)通常不完全表征中間體，通過薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、紅外(IR)或NMR分析評價純度；(vi)Isolute硅膠柱是指預(yù)裝硅膠柱(從1g至最高達(dá)70g)，得自IST(International Sorbent Technology)，Hengoed，Mid Glamorgan，Wales UK，CF82 7RJ，用Flashmaster 2系統(tǒng)洗脫；Argonaut Technologies，Inc.，Hengoed，Mid Glamorgan，Wales UK CF82 8AU；(vii)Biotage柱是指預(yù)裝硅膠柱(從40g至最高達(dá)400g)，用biotage泵和流份收集器系統(tǒng)洗脫；Biotage UK Ltd，Hertford，Herts，UK；和(viii)Celite是指硅藻土。
縮寫DCM 二氯甲烷；DEAD 二偶氮甲酸二乙酯；DIAD 偶氮二甲酸二-異丙酯；DMSO 二甲基亞砜；DMF 二甲基甲酰胺；EDAC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；HPMC 羥丙基甲基纖維素；LCMS 液相色譜/質(zhì)譜；
RT室溫；和THF 四氫呋喃；實(shí)施例16-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸 向6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(180mg，0.376mmol)的THF溶液中加入蒸餾水(1.0ml)和氫氧化鈉溶液(0.95ml，1M，0.95mmol，～2.5當(dāng)量)。加入甲醇(2滴)助溶，將混合物在環(huán)境溫度下攪拌2小時。將反應(yīng)混合物用鹽酸溶液(1ml，1M)中和，真空除去THF；再加入水，將得到的固體濾除，再用蒸餾水洗滌。部分干燥后，將固體懸浮于乙腈(2ml)，溫和攪拌～1h；將固體過濾，再用乙腈洗滌，干燥，得到6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸，為無色固體，1H NMR(d6-DMSO)1.25(2d，6H)，2.85-3.05(m，2H)，3.35(s，3H)，3.5(m，2H)，4.75(m，1H)，4.85(m，1H)，6.65(s，1H)，7.2(m，3H)，7.3(m，4H)，8.3(s，2H)，8.9(s，1H)，11.15(s，1H)，13.2(br s，1H)；m/z 465(M+H)+，463(M+H)-，100％ LC-MS。
按以下流程制備用于制備實(shí)施例1的中間體 描述如下6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯 在氬氣、攪拌下，向6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-羥基-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(1.0g，2.46mmol)、(R)-1-甲氧基-2-丙醇(0.34ml，3.47mmol，1.4當(dāng)量)和聚合物載體上的三苯膦(約3mmol/g，2.5g，約3當(dāng)量)的無水THF(20ml)溶液中加入偶氮二甲酸二叔丁酯(DTAD，1.13g，4.9mmol，2當(dāng)量)，將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌過夜。將大多數(shù)有機(jī)溶劑真空除去，將乙酸乙酯加入殘渣中；將懸浮液通過硅藻土過濾，再用乙酸乙酯徹底洗滌。將溶劑真空除去，將殘渣層析(40gBiotage硅膠柱，用含10％增至20％乙酸乙酯的己烷洗脫)，得到6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(740mg)，為無色膠狀物，
1H NMR(d6-DMSO)1.2(2d，6H)，2.9-3.0(m，2H)，3.3(s，3H)，3.45(m，2H)，3.85(s，3H)，4.7(m，1H)，4.8(m，1H)，6.65(s，1H)，7.2(m，3H)，7.3(m，4H)，8.3(s，2H)，8.9(s，1H)，11.1(br s，1H)；m/z 479(M+H)+，477(M-H)-。
6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-羥基-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯 向6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(6g，12.1mmol)的THF∶甲醇混合物(300ml 1∶1)的溶液中加入披鈀碳催化劑(600mg 10％w/w)，在氫氣氛下，將得到的懸浮液在環(huán)境溫度下攪拌過夜。將催化劑濾除，依次用甲醇和THF洗滌，將濾液蒸發(fā)，得到6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-羥基-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(5g)，為無色固體1H NMR(d6-DMSO)1.25(d，3H)，2.8-3.0(m，2H)，3.9(s，3H)，4.75(m，1H)，6.55(s，1H)，6.95(s，1H)，7.1(s，1H)，7.2(m，1H)，7.3(m，4H)，8.35(m，2H)，8.9(s，1H)，9.7(br s，1H)，11.05，(s，1H)；m/z 407(M+H)+，405(M-H)-，97％LC-MS。
6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯
在氬氣、攪拌下，將3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酸(10g，27.6mmol)的DCM(150ml)溶液加入草酰氯(6.0ml，69.2mmol，2.5當(dāng)量)的DCM(50ml)溶液中。加入催化量的DMF，將得到的溶液攪拌5小時。然后將溶液真空蒸發(fā)，再與DCM共沸，將殘渣在高真空下干燥，得到酰氯，它不經(jīng)表征直接使用。
將以上酰氯(約27.6mmol)溶于THF，在氬氣、攪拌下，將它加入6-氨基煙酸甲酯(6.3g，41mmol，1.5當(dāng)量)的含吡啶(25ml)的THF(75ml)溶液中。將反應(yīng)化合物攪拌過夜，然后將大多數(shù)溶劑真空除去。將殘渣溶于乙酸乙酯(300ml)，依次用水(2份)、1M檸檬酸(2份，直至洗滌液為酸性)和鹽水洗滌；將得到的溶液干燥(MgSO4)，蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物，為淡棕色膠狀物(約13g)。將該產(chǎn)物層析(200g Biotage硅膠柱，用含10％增至15％乙酸乙酯的己烷洗脫)，得到6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(6.6g)，為無色泡沫狀物，1H NMR(d6-DMSO)1.1(d，3H)，2.8-3.05(m，2H)，3.85(s，3H)，4.8(m，1H)，5.2(s，2H)，6.75(s，1H)，7.1-7.5(m，12H)，8.35(s，2H)，8.9(s，1H)，11.10，(br s，1H)，由于殘留乙酸乙酯(約25mol％)，圖譜還含有乙酸乙酯信號；m/z497(M+H)+。
3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酸 將3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基)]-5-芐氧基-苯甲酸甲酯(12.5g，33.2mmol)的THF和甲醇混合物(200ml 1∶1混合物)溶液用氫氧化鈉(4g，100mmol，3當(dāng)量)的蒸餾水(100ml)溶液處理，將反應(yīng)混合物攪拌過夜。用檸檬酸溶液(110ml，1M)將得到的溶液酸化，將大多數(shù)有機(jī)溶劑真空除去。將殘渣用水(約100ml)稀釋，用乙酸乙酯(2×100)萃??；合并萃取液，依次用水和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，蒸發(fā)，得到3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酸，為無色固體(10.5g)。
1H NMR(d6-DMSO)1.2(d，3H)，2.8-3.0(m，2H)，4.7(m，1H)，5.15(s，2H)，6.8(m，1H)，7.0(m，1H)，7.1(m，1H)，7.15-7.5(m，10H)；m/z 363(M+H)+，361(M-H)-3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酸甲酯 向3-羥基-5-芐氧基-苯甲酸甲酯(10.3g，40mmol)的THF溶液中加入三苯膦(15.7g，60mmol，1.5當(dāng)量)和(R)-1-苯基-丙-2-醇。攪拌下，向溶液通入氬氣，在冰浴中冷卻；滴加偶氮二甲酸二乙酯溶液(DEAD，26ml，40％甲苯溶液，60mmol，1.5當(dāng)量)，保持內(nèi)部溫度＜10℃。加入后，將溶液攪拌過夜，使溫度升至環(huán)境溫度。
將大多數(shù)溶劑真空蒸發(fā)，將殘渣溶于己烷/乙酸乙酯混合物(150ml1∶1)；將溶液在環(huán)境溫度下靜置過夜，將得到的不溶性物質(zhì)過濾除去。將濾液蒸發(fā)，將殘渣層析(400g Biotage硅膠柱，用含10％v/v乙酸乙酯的己烷洗脫)，得到3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-芐氧基-苯甲酸甲酯(12.5g)，為淺金黃色油狀物。
1H NMR(d6-DMSO)1.2(d，3H)，2.8-3.0(m，2H)，3.85(s，3H)，4.75(m，1H)，5.15(s，2H)，6.85(m，1H)，7.05(m，1H)，7.1(m，1H)，7.2-7.5(m，10H)3-羥基-5-芐氧基-苯甲酸甲酯
攪拌下，向3，5-二羥基苯甲酸甲酯(1000g，5.95mol)的DMF(6L)溶液中加入碳酸鉀(1240g，9mol)。在氬氣下將懸浮液在環(huán)境溫度下攪拌。在1h內(nèi)，向該懸浮液中緩慢加入芐基溴(1440g，8.42mol，1.42當(dāng)量)，溶液略微放熱，將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌過夜。然后將其小心用氯化銨溶液(5L)隨后用水(35L)猝滅。將水懸浮液用DCM(1份3L和2份5L)萃取。將合并的萃取液用水(10L)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥過夜。將溶液真空蒸發(fā)，將粗產(chǎn)物分三批層析(閃柱，3×2kg硅膠，用含10％DCM的己烷-100％DCM-含50％乙酸乙酯的DCM組成的梯度洗脫)除去原料；然后將粗洗脫液按175g/批再層析(AmiconHPLC，5kg正相硅膠，用含20％v/v乙酸乙酯的異己烷洗脫)，得到3-羥基-5-芐氧基-苯甲酸甲酯(325g)，為極淺金黃色油狀物。
1H NMR(d6-DMSO)3.8(s，3H)，5.1(s，2H)，6.65(m，1H)，7.0(m，1H)，7.05(m，1H)，7.3-7.5(m，5H)，9.85(brs，1H)。
實(shí)施例26-{3-[(1S)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸 用與制備實(shí)施例1類似的方法，由相應(yīng)的6-{3-[(1S)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯制備實(shí)施例2。
1H NMR δ(d6-DMSO)1.22(d，3H)，1.27(d，3H)，2.96(m，2H)，3.26(s，3H)，3.46(m，2H)，4.70(m，1H)，4.82(m，1H)，6.19(d，1H)，6.34(m，1H)，6.65(s，1H)，7.18(s，2H)，7.52(m，1H)，8.28(s，2H)，8.85(s，1H)，11.10(bs，1H)，COOH未出現(xiàn)(M+H)+455
用與實(shí)施例2類似的方法，也用適當(dāng)?shù)氖中源贾苽鋵?shí)施例2.1-2.15。
$用檸檬酸(1.3ml，1M)中和這些實(shí)施例的反應(yīng)物按以下流程制備用于實(shí)施例2的中間體， 描述如下6-{3-[(1S)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯 攪拌下，將6-[3-羥基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基]-3-吡啶甲酸甲酯(900mg，2.5mmol)、(1R)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙醇(441mg，3.5mmol，1.4當(dāng)量)和三苯膦(982mg，1.5當(dāng)量)的無水THF(20ml)溶液在冰浴中冷卻，滴加入偶氮二甲酸二異丙基酯(DIAD，714μl，3.75mmol，1.5當(dāng)量)的THF(2.5ml)溶液。將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌過夜，然后將大多數(shù)有機(jī)溶劑真空除去，將殘渣層析(70g Isolute硅膠柱，用含0％增至50％乙酸乙酯的己烷洗脫)，得到6-{[3(1S)-(1-甲基-2-呋喃基乙氧基)]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(527mg)，為無色膠狀物，
1H NMR(d6-DMSO)1.22(d，3H)，1.29(d，3H)，2.91(dd，1H)，3.02(dd，1H)，3.27(s，3H)，3.46(m，2H)，3.85(s，3H)，4.75(m，2H)，6.19(m，1H)，6.35(m，1H)，6.66(m，1H)，7.17(m，2H)，7.52(m，1H)，8.31(d，2H)，8.90(s，1H)，11.78(bs，1H)；NMR還含N，N′-二-異丙氧基羰基肼的信號；m/z 469(M+H)+；LC/MS測定為86％。
還制備用于制備實(shí)施例2.1-2.15的合適酯。
#這些實(shí)施例使用聚合物載體上的三苯膦(4.4當(dāng)量)合成以上酯所需醇有市售(實(shí)施例2.7和2.8)，或用下述方法A或方法B制備。
方法A(1R)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙醇 (所有操作均在氬氣下進(jìn)行)。將2-溴呋喃(3.65g，24.75mmol)溶于THF(10ml)，加入鎂屑(0.7g，28.75mmol，1.16當(dāng)量)和催化量的碘，將混合物劇烈攪拌或小心升溫至反應(yīng)開始。然后將溫度維持在約60℃直至大多數(shù)鎂耗盡。然后將混合物冷卻至-20℃，加入碘化亞銅(0.109g，0.575mmol)，隨后滴加入(R)-1，2-環(huán)氧丙烷(1.11g，19.17mmol)的THF(15ml)溶液，保持溫度在-25℃至-20℃之間。加入后，將反應(yīng)混合物再攪拌2h，使反應(yīng)物升溫至環(huán)境溫度，用飽和氯化銨溶液(20ml)處理，用乙酸乙酯(2×75ml)萃取。然后將有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮至棕色流動性液體。將該液體層析(50g Isolute硅膠柱，用含5％增至20％或30％乙酸乙酯的己烷洗脫)，得到(1R)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙醇，為淺黃色流動性油狀物。(2.03g，65％)；1H NMR δ(d6-DMSO)1.03(d，3H)，2.56(dd，1H)，2.72(dd，1H)，3.84(m，1H)，4.61(d，1H)，6.08(m，1H)，6.32(m，1H)，7.45(s，1H)。
方法B(1R)-1-甲基-2-(5-甲基噻吩)-2-基乙醇 在-78℃下，通過滴加正丁基鋰的己烷溶液(10.7ml，1.6M)處理二異丙胺(2.4ml；17.05mmol)的無水THF(25mL)溶液，將反應(yīng)混合物在-78℃下攪拌30分鐘。然后通過導(dǎo)管將混合物引入盛有2-甲基噻吩(1.5ml，15.5mmol)的THF(25ml)溶液的燒瓶中，在-78℃下，將反應(yīng)物攪拌1小時。然后使混合物升溫至最高達(dá)-30℃，加入碘化亞銅(I)(1.48g；7.75mmol)，在-30℃下維持20min，然后加入(R)-1，2-環(huán)氧丙烷(1.1ml；17.05mmol)。加入后，將反應(yīng)混合物再攪拌2小時，升溫至最高達(dá)環(huán)境溫度，用飽和氯化銨溶液(20ml)處理，用乙酸乙酯(2×75ml)萃取。然后將有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，真空濃縮，得到紅/橙色殘渣。將其層析(用含10％增至30％乙酸乙酯的己烷洗脫)，得到(1R)-1-甲基-2-(5-甲基噻吩)-2-基乙醇，為黃色/橙色流動性油狀物(870mg；36％)；1H NMR(d6-DMSO)1.0(d，3H)，2.35(s，3H)，2.7(m，2H)，3.7(m，1H)，4.6(d，1H)，6.6(m，2H
還用與提出的方法A或方法B相似的方式制備以下手性醇。
*在這些實(shí)施例中用乙醚作反應(yīng)溶劑6-[3-羥基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基]-3-吡啶甲酸甲酯 攪拌下，向6-[3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基]-3-吡啶甲酸甲酯(17g，0.038mol)的THF(85ml)溶液中加入甲醇(85ml)。在氬氣氛下，加入披鈀碳催化劑(1.7g，10％w/w)，在氫氣氛下，將得到的懸浮液在環(huán)境溫度下攪拌過夜。使催化劑通過硅藻土濾除，用THF洗滌，蒸發(fā)濾液，得到淺棕色固體。將該固體用乙醚研磨，得到6-[3-羥基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基]-3-吡啶甲酸甲酯(9.8g)。
1H NMR(d6-DMSO)1.25(d，3H)，3.3(s，3H)，3.45(m，2H)，3.85(s，3H)，4.65(m，1H)，6.55(m，1H)，6.95(m，1H)，7.1(m，1H)，8.3(m，2H)，8.9(m，1H)，11.0，(s，1H)；m/z 361(M+H)+，359(M-H)-
6-[3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基]-3-吡啶甲酸甲酯 在氬氣、攪拌下，向3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酸(24g，75.9mmol)的含DMF(1ml)的DCM(250ml)溶液中滴加草酰氯(12.4ml，151.7mmol，2.0當(dāng)量)，將得到的溶液攪拌4小時。然后將溶液真空蒸發(fā)，再與DCM(3×100ml)共沸，將殘渣在高真空下干燥，得到酰氯，使用時未經(jīng)表征。
將以上酰氯(約75.9mmol)溶于THF(100ml)，在氬氣、攪拌下，將其加入到6-氨基煙酸甲酯(13.9g，91.1mmol，1.2當(dāng)量)的THF(100ml)和吡啶(100ml)混合物溶液中。將反應(yīng)混合物攪拌過夜，然后將大多數(shù)溶劑真空除去。將殘渣溶于乙酸乙酯(250ml)，將懸浮液依次用1M檸檬酸(2份，直至洗滌液為酸性)和鹽水洗滌；將得到的溶液用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物，為棕色膠狀物(約40g)。將該物質(zhì)層析(400g Biotage硅膠柱，用含20％v/v乙酸乙酯的己烷洗脫)，得到6-[3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基]-3-吡啶甲酸甲酯(17.05g)，為淺棕色固體，1H NMR(d6-DMSO)1.21(d，3H)，3.47(m，2H)，3.86(s，3H)，3.72(m，1H)，5.16(s，2H)，6.78(t，1H)，7.23(s，1H)，7.29(s，1H)，7.31-7.49(m，5H)，8.32(s，2H)，8.90(app t，1H)，11.15(s，1H)m/z 451.47(M+H)+，449.48(M-H)-。
3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酸
將3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酸甲酯(得自前步反應(yīng)的粗產(chǎn)物，77.4mmol)的THF和甲醇混合物(232ml 1∶1)溶液用氫氧化鈉溶液(116ml 2M，232mmol，3當(dāng)量)處理，將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌4h。將得到的溶液用水(250ml)稀釋，將大多數(shù)有機(jī)溶劑真空除去。將得到的懸浮液用乙醚(3×200ml)洗滌，棄去洗滌液。將得到的水溶液用2M HCl溶液酸化至pH 4，用乙酸乙酯(2×200ml)萃?。缓喜⑤腿∫海名}水洗滌，干燥(MgSO4)，蒸發(fā)，得到3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酸(24.5g)，為淺黃色油狀物，其靜置固化，1H NMR(d6-DMSO)1.20(d，3H)，3.46(m，2H)，4.64(m，1H)，5.15(s，2H)，6.83(app t，1H)，7.06(s，1H)，7.13(s，1H)，7.30-7.49(m，5H)，12.67(s br，1H)。
3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酸甲酯 向3-芐氧基-5-羥基-苯甲酸甲酯(20g，77.4mmol)的THF溶液中加入聚合物載體上的三苯膦(51.7g，3mmol/g載荷，155mmol，2.0當(dāng)量)和(R)-1-甲氧基-丙-2-醇(10ml，102mmol，1.3當(dāng)量)。攪拌下，向溶液通入氬氣并在冰浴中冷卻；在10min內(nèi)，用注射器滴加入偶氮二甲酸二異丙基酯(DIAD，22.8ml 116mmol，1.5當(dāng)量)。加入后，將溶液攪拌20min，然后過濾，將殘渣用THF(500ml)洗滌；合并濾液和洗滌液，蒸發(fā)得到粗3-芐氧基-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酸甲酯，它在下一步使用時無需再純化，1H NMR(d6-DMSO)3.26(s，3H)，3.44(m，2H)，3.82(s，3H)，4.63(m，1H)，5.14(s，2H)，6.85(s，1H)，7.05(s，1H)，7.11(s，1H)，7.30-7.47(m，5H)；圖譜還含有與少量N，N’-二(異丙氧基羰基肼)相一致的信號。
3-芐氧基-5-羥基-苯甲酸甲酯按上述實(shí)施例1中間體制備方法制備該物質(zhì)。
實(shí)施例36-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-氯-呋喃-2-基)乙氧基)]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸 在70℃下，將6-{3-[(1S)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯(1000mg，2.14mmol)、N-氯琥珀酰亞胺(428mg，3.20mmol，1.5當(dāng)量)的四氯化碳(10ml)溶液攪拌5.5h。加入二氯乙烷(50ml)，將得到的反應(yīng)混合物用水(2×25ml)、鹽水(1×25ml)洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥。通過LCMS監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)指示有65％產(chǎn)物時，進(jìn)行后處理。然后將濾液濃縮，得到6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-氯-呋喃-2-基乙氧基)]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸甲酯粗品，為紅色油狀物(1030mg)。將該油狀物溶于THF(25ml)、蒸餾水(6.0ml)和氫氧化鈉溶液(6ml，1M，6mmol，～3.0當(dāng)量)。加入甲醇(1.25ml)助溶，將混合物在環(huán)境溫度下攪拌4小時。將反應(yīng)混合物用鹽酸溶液(6ml，1M)中和，真空除去THF；再加入水，將得到的固體濾除，再用蒸餾水洗滌。通過制備LC-MS完成最后純化，用含0.1％甲酸的5-100％乙腈/水在Phenonemex LUNA 10μm C18柱上洗脫，流速25ml/min，得到白色固體(176mg)。
1H NMR(d6-DMSO)1.21(d，3H)，1.27(d，3H)，2.93(t，2H)，3.27(s，3H)，3.44(m，2H)，4.71(m，1H)，4.80(m，1H)，6.27(m，1H)，6.32(m，1H)，6.65(m，1H)，7.16(m，2H)，8.18(d，2H)，8.86(m，1H)，11.50(bs，1H)，COOH not seen。(M+H)+489/491。
生物學(xué)試驗(yàn)可按以下方法測試式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)化合物的生物作用(1)可通過溫育GLK、ATP和葡萄糖測量GLK的酶活性?？赏ㄟ^將該測定與G-6-P脫氫酶、NADP/NADPH系統(tǒng)結(jié)合測定產(chǎn)物形成的速率，和測量340nm處光密度隨時間線性增加(Matschinsky等1993)?？砂碆rocklehurst等(Diabetes 2004，53，535-541)中所述，有或無GLKRP，用該測定法評價化合物激活GLK的能力。
(2)用于測量GLK與GLKRP間結(jié)合相互作用的GLK/GLKRP結(jié)合測定法?？捎迷摲椒ㄨb別通過調(diào)節(jié)GLK和GLKRP間相互作用來調(diào)節(jié)GLK的化合物。任選在測試化合物的存在下，將GLKRP和GLK與抑制濃度的F-6-P一起溫育，測量GLK與GLKRP間相互作用的程度。通過測定形成的GLK/GLKRP復(fù)合物減少量，檢測置換F-6-P或以某些其它方式減少GLK/GLKRP相互作用的化合物。通過測量形成GLK/GLKRP復(fù)合物的增加量檢測促進(jìn)F-6-P結(jié)合或以某些其它方式增強(qiáng)GLK/GLKRP相互作用的化合物。這種結(jié)合測定的具體實(shí)例描述如下。
GLK/GLKRP閃爍親近測定法按WO 01/20327(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中所述，用重組人GLK和GLKRP開發(fā)″混合和測定″96孔SPA(閃爍親近測定法)。在抑制濃度的放射性標(biāo)記的[3H]F-6-P(Amersham Custom SynthesisTRQ8689)的存在下，將GLK(生物素化的)和GLKRP與連接SPA株的鏈霉抗生物素(Amersham)一起溫育，發(fā)出信號。置換F-6-P或以某些其它方式破壞GLK/GLKRP結(jié)合相互作用的化合物會導(dǎo)致該信號消失。
在室溫下，使結(jié)合測定進(jìn)行2小時。反應(yīng)混合物含50mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mM ATP、5mM MgCl2、0.5mM DTT、重組生物素化GLK(0.1mg)、重組GLKRP(0.1mg)、0.05mCi[3H]F-6-P(Amersham)，得到終體積100ml。溫育后，通過加入0.1mg/孔連接SPA珠的抗生物素蛋白(Amersham)和在Packard TopCount NXT上進(jìn)行閃爍計數(shù)，測定GLK/GLKRP復(fù)合物形成的程度。
(3)用于測量GLKRP和F-6-P間結(jié)合相互作用的F-6-P/GLKRP結(jié)合測定法?？捎迷摲椒ㄌ峁┯嘘P(guān)化合物作用機(jī)理的進(jìn)一步信息。在GLK/GLKRP結(jié)合測定中鑒定的化合物可通過置換F-6-P或通過以某些其它方式調(diào)節(jié)GLK/GLKRP相互作用，來調(diào)節(jié)GLK和GLKRP的相互作用。例如，已知通常通過多個結(jié)合位點(diǎn)相互作用發(fā)生蛋白-蛋白相互作用。因此，調(diào)節(jié)GLK和GLKRP間相互作用的化合物可通過與一個或多個不同的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而起作用是可能的。
F-6-P/GLKRP結(jié)合測定只鑒別通過從其在GLKRP上的結(jié)合位點(diǎn)置換F-6-P來調(diào)節(jié)GLK和GLKRP相互作用的那些化合物。
無GLK存在下，將GLKRP與測試化合物和抑制濃度的F-6-P一起溫育，測量F-6-P和GLKRP間相互作用的程度?？赏ㄟ^形成的GLKRP/F-6-P復(fù)合物量的變化檢測置換F-6-P與GLKRP結(jié)合的化合物。這種結(jié)合測定的具體實(shí)例描述如下。
F-6-P/GLKRP閃爍親近測定法按WO 01/20327(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中所述，用重組人GLKRP開發(fā)″混合和測定″96孔閃爍親近測定法)。在抑制濃度的放射性標(biāo)記的[3H]F-6-P的存在下，將FLAG標(biāo)記的GLKRP與涂覆蛋白A的SPA珠(Amersham)和抗FLAG抗體一起溫育。產(chǎn)生信號。置換F-6-P的化合物會導(dǎo)致該信號消失。該測定與GLK/GLKRP結(jié)合測定的結(jié)合使觀察者鑒別通過置換F-6-P破壞GLK/GLKRP結(jié)合相互作用的化合物。
在室溫下，使結(jié)合測定進(jìn)行2小時。反應(yīng)混合物含50mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mM ATP、5mM MgCl2、0.5mM DTT、FLAG標(biāo)記的GLKRP(0.1mg)、抗-Flag M2抗體(0.2mg)(IBI Kodak)、0.05mCi[3H]F-6-P(Amersham)，得到終體積100ml。溫育后，通過加入0.1mg/孔連接SPA珠的蛋白A(Amersham)和在Packard TopCount NXT進(jìn)行閃爍計數(shù)，測定F-6-P/GLKRP復(fù)合物形成的程度。
制備重組GLK和GLKRP制備mRNA按Sambrook J，F(xiàn)ritsch EF & Maniatis T，1989中所述，通過在4M異硫氰酸胍、2.5mM檸檬酸鹽、0.5％Sarkosyl、100mM b-巰基乙醇中polytron勻化制備人肝臟總mRNA，隨后通過加入5.7M CsCl、25mM乙酸鈉，在135,000g(最大)下離心。
用FastTrackTMmRNA分離試劑盒(Invitrogen)直接制備聚A+mRNA。
PCR擴(kuò)增GLK和GLKRP cDNA序列通過用Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，1989中所述公認(rèn)技術(shù)，通過PCR從人肝臟mRNA得到人GLK和GLKRP cDNA。按Tanizawa等1991和Bonthron，D.T.等1994(后來在Warner，J.P.1995中校正)中所示GLK和GLKRP cDNA序列設(shè)計PCR引物。
在Bluescript II載體中克隆在大腸桿菌(E.coli)中用pBluescript II克隆GLK和GLKRPcDNA，pBluescript II(Short等1998)是類似于Yanisch-Perron C等(1985)應(yīng)用的重組克隆載體系統(tǒng)，它包含基于colEI的具有含多個獨(dú)特限制位點(diǎn)的多連接DNA片段的復(fù)制子，位于噬菌體T3和T7啟動子序列的側(cè)面；是絲狀噬菌體復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素藥物耐藥標(biāo)記基因。
轉(zhuǎn)化通常通過電穿孔進(jìn)行大腸桿菌(E.Coli)轉(zhuǎn)化。將400ml DH5a或BL21(DE3)株培養(yǎng)液在L-肉湯中生長至0.5 OD 600，通過在2,000g下離心收獲。將細(xì)胞在冰冷卻去離子水中漂洗兩次，再懸浮于1ml 10％甘油中，按等份試樣在-70℃下儲存。用Millipore V系列TM膜(0.0025mm)孔徑)使連接混合物脫鹽。在0.2cm電穿孔杯中，將40ml細(xì)胞與1ml連接混合物或質(zhì)粒DNA在冰上溫育10分鐘，然后在0.5kVcm-1、250mF下，用Gene PulserTM儀(BioRad)脈沖。在補(bǔ)充四環(huán)素的L-瓊脂上以10mg/ml或在補(bǔ)充氨芐青霉素的L-瓊脂上以100mg/ml選擇轉(zhuǎn)化物。
表達(dá)在大腸桿菌(E.coli)BL21細(xì)胞中，由載體pTB375NBSE表達(dá)GLK，產(chǎn)生含緊鄰蛋氨酸N末端的6-His標(biāo)記的重組蛋白。或者，另一個合適的載體是pET21(+)DNA，Novagen，目錄編號697703。使用該6-His標(biāo)記，可在購自Qiagen(目錄編號30250)的裝有鎳-次氮基三乙酸瓊脂糖的柱上純化該重組蛋白。
在大腸桿菌(E.coli)BL21細(xì)胞中，由載體pFLAG CTC(IBI Kodak)表達(dá)GLKRP，產(chǎn)生含C末端FLAG標(biāo)記的重組蛋白。將該蛋白開始通過DEAE Sepharose離子交換純化，隨后在購自Sigma-Aldrich(目錄編號A1205)的M2抗FLAG免疫親和性柱上利用FLAG標(biāo)記進(jìn)行最后純化。
使GLK生物素化通過與購自Sigma-Aldrich(目錄編號B2643)的N-羥基琥珀酰亞胺生物素酰胺己酸酯(biotinamidocaproate)反應(yīng)使GLK生物素化。簡而言之，在形成導(dǎo)致含共價結(jié)合生物素產(chǎn)物的穩(wěn)定酰胺鍵的限定摩爾比率下，使靶蛋白(GLK)的游離氨基與生物素-NHS反應(yīng)。通過透析除去產(chǎn)物中的過量非綴合生物素-NHS。具體地說，將7.5mg GLK加入0.31mg生物素-NHS的4mL 25mM HEPES pH 7.3、0.15M KCl、1mM二硫蘇糖醇、1mM EDTA、1mM MgCl2(緩沖液A)的溶液中。在含另外22mg生物素-NHS的100mL緩沖液A中透析該反應(yīng)混合物。4小時后，通過在緩沖液A中大量透析除去過量的生物素-NHS。
測量經(jīng)口給予大鼠后血漿水平和血漿蛋白結(jié)合水平給予大鼠化合物和取血漿樣品將行星式研磨的化合物[15min，500rpm 5鋯球，在Puluerisette 7研磨機(jī)中(Glen Creston Ltd，Stanmore Middlesex，UK)]懸浮于0.5％HPMC吐溫中，并按5ml/kg比例，劑量0.3-10mg/kg，經(jīng)口灌飼給予高脂肪食物飼養(yǎng)的(Research Diets，D12451，無限制喂養(yǎng)14天)雌性Alderley Park Zucker或Alderley Park Wistar大鼠。
通過如下方法清醒采血樣或終末采血樣得到血漿樣品清醒取血樣(用于化合物水平或血化學(xué))-用600μl StarstedtMultivette(EDTA)和22G針頭，在需要的時間點(diǎn)從尾靜脈采集靜脈血樣。將樣品保存在冰上，在3000rpm下離心10分鐘，停止離心15-30分鐘。吸出血漿，在-20℃下儲存用于化合物水平或血化學(xué)的終末采血樣-在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，通過暴露于CO2/O2處死動物。通過心臟穿刺采集血樣。將樣品保存在冰上，在3000rpm下離心10分鐘，停止離心15-30分鐘。吸出血漿，在-20℃下儲存。
測量大鼠血漿中化合物水平將25μl大鼠血漿加入96孔蛋白沉淀板(Varian inc.Palo Alto，California，USA)的各孔中。向各孔中加入含用作內(nèi)標(biāo)的1μg/ml(3-異丙氧基-5-芐氧基-苯甲酰基)氨基吡啶3-甲酸的500μl乙腈，將血漿蛋白沉淀。然后在真空下通過沉淀板吸出其中的血漿/溶劑混合物，收集洗脫液。用離心蒸發(fā)儀將洗脫液蒸發(fā)至干，再溶于200μl甲醇∶水∶甲酸(60∶40∶0.1)。
然后用并聯(lián)質(zhì)譜檢測器的高效液相色譜(HPLC-MS-MS)”分析再溶解樣品。用Phenomenex Prodigy C8，50×4.6，5μm柱(Phenomenex，Macclesfield，UK)，流速1ml/分鐘，進(jìn)樣體積10μl，用以下梯度洗脫方案運(yùn)行HPLC流動相A0.1％甲酸/水流動相B0.1％甲酸/甲醇流動相梯度 0min 50％A0.5min 5％A2.5min 5％A2.6min 50％A3.0min 50％A。
用Applied Biosystems API3000質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，California，USA)進(jìn)行質(zhì)譜。進(jìn)樣前，對測試化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜儀測試條件優(yōu)化。
由測試樣品的峰高與內(nèi)標(biāo)的峰高之比確定測試樣品濃度。參照比率濃度相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測試樣品的濃度，按上述處理方法，用(3-異丙氧基-5-芐氧基-苯甲?；?氨基吡啶3-甲酸作內(nèi)標(biāo)，用加入到大鼠血漿樣品中的已知測試樣品的濃度制備該標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測量化合物的血漿蛋白結(jié)合用平衡透析技術(shù)(W.Lindner等，J.Chromatography，1996，677，1-28)測量化合物的血漿蛋白結(jié)合。在37℃下，將含血漿和pH 7.4等滲磷酸鹽緩沖液的20μM濃度的化合物(每個透析池1ml)透析18小時。與Teflon、半微量透析池和47mm的分子量12-14000道爾頓的Spectra/Por2膜圓片(由PerBio Science UK Ltd提供，Tattenhall，Cheshire)一起使用Spectrum20-池平衡透析儀。透析后，除去血漿和緩沖液樣品，用HPLCUV/MS(帶UV和質(zhì)譜檢測器的高效液相色譜)分析，得到血漿中游離水平百分比。
按歸一化的1mg化合物/kg大鼠體重劑量計，本發(fā)明化合物激活葡糖激酶的EC50小于約150nM，血漿中游離百分比為約0.05％至約1％，峰血水平(包括結(jié)合和游離兩者)為約1μM至約10μM。
例如，實(shí)施例2.1具有以下值
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權(quán)利要求
1.一種式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物 式(I)其中A為苯基或5元或6元雜芳環(huán)，其中A未被取代或被獨(dú)立選自R3的1或2個基團(tuán)取代；R1選自氫和甲基；R2選自氫和甲基；R3選自甲基、甲氧基、氟、氯和氰基；條件是R1和R2中的至少一個為甲基。
2.權(quán)利要求1的式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物，其中R1為甲基。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物，所述化合物為式(Ia)化合物，其中A和R2定義同權(quán)利要求1 式(Ia)
4.權(quán)利要求3的式(Ia)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物，所述化合物為式(Ib)化合物 式(Ib)
5.權(quán)利要求3的式(Ia)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物，所述化合物為式(Ic)化合物； 式(Ic)其中A′為雜芳基。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ic)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物，其中R2為氫。
7.權(quán)利要求1的式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物，所述化合物為式(Ie)化合物， 式(Ie)其中A選自苯基、噻吩基和呋喃基；A任選被甲基、甲氧基、氯或氟取代；R1選自氫和甲基；R2選自氫和甲基；條件是R1和R2中的至少一個為甲基。
8.權(quán)利要求1的式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物，所述化合物選自1)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；2)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-呋喃-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；3)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(2-甲氧基苯基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；4)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-噻吩-2-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；5)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-氯噻吩-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；6)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-噻吩-3-基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；7)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；8)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{4-氟苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；9)6-{3-[(2S)-2-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；10)6-{3-[(2R)-2-甲基-2-苯基乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；和11)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{2-氯苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；12)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{3，5-二氟苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；13)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{3-氟苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；14)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-甲基噻吩-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；15)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{3-甲氧基苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；16)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{2-甲基苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；17)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-{4-甲氧基苯基}乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸；18)6-{3-[(1S)-1-甲基-2-(5-氯呋喃-2-基)乙氧基]-5-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-苯甲酰氨基}-3-吡啶甲酸。
9.一種藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
10.用作藥物的權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥。
11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥，所述化合物用于制備藥物，所述藥物用于治療通過GLK介導(dǎo)的疾病、尤其II型糖尿病。
12.一種治療GLK介導(dǎo)的疾病、尤其糖尿病的方法，所述方法通過給予需要這種治療的哺乳動物有效量的權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥。
13.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥在制備藥物中的用途，所述藥物用于聯(lián)合治療或預(yù)防糖尿病和肥胖癥。
14.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防肥胖癥。
15.一種聯(lián)合治療肥胖癥和糖尿病的方法，所述方法通過給予需要這種治療的哺乳動物有效量的權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥來治療。
16.一種治療肥胖癥的方法，所述方法通過給予需要這種治療的哺乳動物有效量的權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的式(I)化合物或其鹽、溶劑合物或前藥來治療。
17.一種制備權(quán)利要求1的式(I)化合物、其鹽、前藥或溶劑合物的方法，所述方法包括(a)使式(IIIa)酸或其活化衍生物與式(IIIb)化合物反應(yīng)， 式(IIIa) 式(IIIb)其中P1為H或保護(hù)基團(tuán)；或(b)使式(IIIc)化合物脫保護(hù)， 式(IIIc)其中P1為保護(hù)基團(tuán)；或(c)使式(IIId)化合物與式(IIIe)化合物反應(yīng)， 式(IIId) 式(IIIe)其中X1為離去基團(tuán)，且X2為羥基，或X1為羥基，且X2為離去基團(tuán)，和其中P1為保護(hù)基團(tuán)；或(d)使式(IIIf)化合物與式(IIIg)化合物反應(yīng) 式(IIIf) 式(IIIg)其中X3為離去基團(tuán)，且X4為羥基，或X3為羥基，且X4為離去基團(tuán)；或(e)使式(IIIh)化合物與式(IIIi)化合物反應(yīng)， 式(IIIh) 式(IIIi)其中X5為離去基團(tuán)，且其中P1為H或保護(hù)基團(tuán)；然后，如果需要i)將一種式(I)化合物轉(zhuǎn)化為另一種式(I)化合物；ii)除去任何保護(hù)基團(tuán)；iii)形成其鹽、前藥或溶劑合物。
全文摘要
本發(fā)明描述式(I)化合物或其鹽、前藥或溶劑合物其中A為任選被取代的苯基或5元或6元雜芳環(huán)；R
文檔編號C07D409/12GK1898209SQ200480039065
公開日2007年1月17日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者P·W·R·考爾克特, C·約翰斯通, D·麥克雷徹爾, K·G·派克 申請人:阿斯利康(瑞典)有限公司