專利名稱：使用拮抗性抗－cd40單克隆抗體治療多發(fā)性骨髓瘤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用拮抗性抗-CD40單克隆抗體治療多發(fā)性骨髓瘤的方法。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤(MM)是B細(xì)胞惡性腫瘤，其特征為具有低增殖指數(shù)和延長的生命跨度的分泌型漿細(xì)胞在骨髓中潛在的積累。該疾病最終攻擊骨或骨髓，在整個骨骼系統(tǒng)中導(dǎo)致多發(fā)性腫瘤和病損。所有癌癥中約1％和所有血液性惡性腫瘤中略超過10％由多發(fā)性骨髓瘤所致。MM在老年人群中發(fā)病率上升，診斷到該病的中值年齡是約61歲。當(dāng)前的治療方案(包括聯(lián)用諸如長春新堿、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、阿霉素和潑尼松或地塞米松的化療藥物)產(chǎn)生的完全消退率僅是約5％，自診斷之時起的中值存活時間是約36-48個月。近年來高劑量化療后進(jìn)行自體骨髓或外周血組細(xì)胞(PBMC)移植的進(jìn)展增加了完全消退率和消退持續(xù)時間。然而總的存活(時間)僅略微延長，并且未獲得完全治愈的證據(jù)。即使單用干擾素-α(IFN-α)或與類固醇聯(lián)合進(jìn)行維持治療，最終所有MM患者都會復(fù)發(fā)。
低細(xì)胞增殖率和產(chǎn)生多藥抗性限制了所有可用的MM化療治療方案的效力。對于超過90％的MM患者，該疾病變?yōu)榛瘜W(xué)抗性(chemoresisitant)。因此，人們尋求目標(biāo)為靶向表面抗原，例如漿細(xì)胞上的CD20和CD40的過繼性免疫治療的替代治療方案。
CD40是一種存在于正常和致瘤性人B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、其它抗原呈遞細(xì)胞(APC)、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面的55kDa細(xì)胞表面抗原。CD40配體與B細(xì)胞表面的CD40抗原結(jié)合刺激B細(xì)胞、導(dǎo)致B細(xì)胞成熟為分泌高水平可溶性免疫球蛋白的漿細(xì)胞。B細(xì)胞系的幾種腫瘤的惡性B細(xì)胞表達(dá)高水平的CD40并且其存活和增殖似乎依賴CD40信號傳導(dǎo)。因此，具有低級和高級B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病和何杰金病的患者的轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)CD40。重要的是，與CD20相比，在較高百分比的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有CD40(Maloney等，(1999)，Semin.Hematol.36(增刊3)30-33)。
由于多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后不佳，需要替代治療方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了治療多發(fā)性骨髓瘤人對象的方法，該方法包括給予對象抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，當(dāng)所述抗體或其抗原結(jié)合片段與人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時無明顯的激動活性。本發(fā)明也提供了抑制表達(dá)CD40抗原的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長的方法。
用于本發(fā)明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體對CD40具有強(qiáng)親和力，其特征為至少10-6M、優(yōu)選至少約10-7M-10-8M、更優(yōu)選至少約10-8M-10-12M的解離平衡常數(shù)(KD)。這些單克隆抗體和它們的抗原結(jié)合片段能特異性結(jié)合表達(dá)在人細(xì)胞表面的人CD40抗原。當(dāng)它們與人細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時，無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。在一個實(shí)施方案中，當(dāng)抗-CD40抗體或其片段結(jié)合正常人B細(xì)胞上的CD40抗原時顯示拮抗活性。在另一個實(shí)施方案中，當(dāng)抗-CD40抗體或其片段結(jié)合惡性人B細(xì)胞上的CD40抗原時，顯示拮抗活性。合適的單克隆抗體具有人恒定區(qū)；它們也優(yōu)選具有完全或部分的人源化框架區(qū)；最優(yōu)選完全的人抗體或它們的抗原結(jié)合片段。
這種單克隆抗體的例子是可通過重組產(chǎn)生的本文名為5.9和CHIR-12.12的抗體；名為131.2F8.5.9(本文稱為細(xì)胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(稱為細(xì)胞系12.12)的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體；含有SEQ ID NO6所示、SEQ ID NO7所示、SEQ ID NO8所示、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示氨基酸序列的單克隆抗體；含有SEQ ID NO2所示、SEQ ID NO4所示、SEQ ID NO5所示、同時含有SEQ ID NO2和SEQID NO4所示和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的單克隆抗體；具有由含有SEQ ID NO1所示、SEQ ID NO3所示、同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體；和保留了特異性結(jié)合人CD40能力的這些單克隆抗體的抗原結(jié)合片段，當(dāng)它們結(jié)合人細(xì)胞上的CD40抗原時，無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。這種單克隆抗體的例子也包括結(jié)合某表位的單克隆抗體，所述表位能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；結(jié)合某表位的單克隆抗體，所述表位含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示氨基酸序列的殘基82-87；在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和為CHIR-12.12單克隆抗體或任一上述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合人CD40抗原的能力。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，治療方法包括給予患者治療有效劑量的藥物組合物，該組合物含有合適的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段?？?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量約是0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。應(yīng)理解該治療方法包括單次給予治療有效劑量或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
可修飾適用于本發(fā)明方法的本文所鑒定的拮抗性抗-CD40抗體。這些拮抗性抗-CD40抗體的修飾物包括，但不限于免疫活性的嵌合性抗-CD40抗體、人源化抗-CD40抗體和免疫活性的鼠抗-CD40抗體。
附圖簡述

圖1顯示了mAb CHIR-12.12的輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖1A顯示輕鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQ ID NO2的殘基1-20)、可變區(qū)(SEQ ID NO2的殘基21-132)和恒定區(qū)(SEQ ID NO2的殘基133-239)。圖1B顯示重鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQID NO4的殘基1-19)、可變區(qū)(SEQ ID NO4的殘基20-139)和恒定區(qū)(SEQ IDNO4的殘基140-469)。圖1B所示mAb CHIR-12.12重鏈的交替恒定區(qū)反映了SEQ ID NO4的153位用絲氨酸殘基替換丙氨酸殘基。mAb CHIR-12.12重鏈的該變體的完整序列示于SEQ ID NO5。
圖2顯示mAb CHIR-12.12的輕鏈(圖2A；SEQ ID NO1)和重鏈(圖2B；SEQ ID NO3)的編碼序列。
圖3列出了mAb 5.9的輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖3A顯示了輕鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQ ID NO6的殘基1-20)、可變區(qū)(SEQ ID NO6的殘基21-132)和恒定區(qū)(SEQ ID NO6的殘基133-239)。圖3B顯示了重鏈的前導(dǎo)區(qū)(SEQ ID NO7的殘基1-19)、可變區(qū)(SEQ ID NO7的殘基20-144)和恒定區(qū)(SEQ ID NO7的殘基145-474)。圖3B所示mAb 5.9重鏈的交替恒定區(qū)反映了SEQ ID NO7的158位用絲氨酸殘基替換丙氨酸殘基。mAb 5.9重鏈的該變體的完整序列示于SEQ ID NO8。
圖4顯示了人CD40的短同種型(氨基酸序列示于圖4B；SEQ ID NO10)的編碼序列(圖4A；SEQ ID NO9)和人CD40的長同種型(氨基酸序列示于圖4D)的編碼序列(圖4C；SEQ ID NO11)。
圖5闡述了使用人多發(fā)性骨髓瘤IM-9異種移植模型以單克隆抗體CHIR-12.12和硼替佐米(bortezomib)(VELCADE_)聯(lián)合治療提高了體內(nèi)抗腫瘤活性。
圖6顯示了通過示差掃描量熱法(DSC)測定的CHIR-12.12在不同pH制劑中的熱解鏈溫度。
發(fā)明詳述本文所用的“腫瘤”指所有致瘤性細(xì)胞(無論是惡性還是良性的)的生長和增殖，和所有前癌和癌細(xì)胞和組織。
術(shù)語“癌癥”和“癌性的”表示或描述了以不受調(diào)控的細(xì)胞增殖為典型特征的哺乳動物的生理狀況。癌癥的例子包括，但不限于淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和白血病。
“抗體”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體顯示對抗原的結(jié)合有特異性，但免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后一類型的多肽有例如淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生和骨髓瘤以高水平產(chǎn)生的多肽。
術(shù)語“抗體”以最廣義用時包括全裝配的抗體、能結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab′、F′(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙體分子)和包含以上物質(zhì)的重組肽。
本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”指得自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能存在極少量天然發(fā)生的突變以外，構(gòu)成該群的每個抗體是相同的。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的約150,000道爾頓的異源四聚糖蛋白。每條輕鏈經(jīng)共價二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目視不同免疫球蛋白同種型的重鏈而不同。每條重鏈和輕鏈也具有有規(guī)律地隔開的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈的一端為可變區(qū)(VH)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端為可變區(qū)(VL)，在另一端為恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)配對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)配對。據(jù)信，特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成相互作用界面。
術(shù)語“可變”表示以下內(nèi)容在抗體之間，可變區(qū)的某些部分在序列上差別很大，這部分是每種特定抗體用于與其特定抗原特異性結(jié)合的部分。然而，可變性不是均勻分布于整個抗體可變區(qū)中。它集中于位于輕鏈或重鏈可變區(qū)的稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的3個區(qū)段。可變區(qū)的較保守部分稱為框架(FR)區(qū)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)包含主要采取β-片層構(gòu)型并由3個CDR相連的4個FR區(qū)，CDR形成(有時形成部分)連接β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密相聚，并且與另一條鏈的CDR緊靠在一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，Kabat等，(1991)NIH Publ.No.91-3242，第I卷，647-669頁)。
恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但顯示各種效應(yīng)器功能，例如Fc受體(FcR)結(jié)合、抗體參與依賴抗體的細(xì)胞毒性、調(diào)理作用、啟動依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性和肥大細(xì)胞脫顆粒。
本文使用的術(shù)語“超變區(qū)”指負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的抗體氨基酸殘基。超變區(qū)包括“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列》(Sequences of proteins ofImmunological Interest)(第5版，Public Health Service，National Institute ofHealth，Bethesda，MD)和/或“超變環(huán)”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196901-917)。“框架”或“FR”殘基是除超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙體分子；線性抗體(Zapata等，(1995)Protein Eng 8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性(multispecific)抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個稱為“Fab”片段的相同的抗原結(jié)合片段(每種具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn))與一殘留的“Fc”片段(其名字反映它易于結(jié)晶)。胃蛋白酶處理得到具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab′)2片段，該片段仍能交聯(lián)抗原。
“Fv”是含有完整的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv抗體中，該區(qū)由緊密的非共價締合的一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在單鏈Fv抗體中，一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)經(jīng)可彎曲的肽接頭共價相連從而使輕鏈和重鏈締合成類似于雙鏈Fv抗體中的“二聚體”結(jié)構(gòu)。每個可變區(qū)的3個CDR正是在這種構(gòu)型中相互作用而確定了VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個CDR共同賦予了該抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使一個可變區(qū)(或僅含有3個抗原特異性CDR的半個Fv)也能識別并結(jié)合抗原，雖然親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段也含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。Fab片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端多幾個殘基(包括抗體絞鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸殘基)而不同于Fab’片段。本文稱為Fab′-SH的是其恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有一個游離巰基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初制備為之間具有絞鏈半胱氨酸的成對Fab′片段?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)也是已知的。
任何脊椎動物種類的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可分為截然不同的兩種類型，該兩種類型根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列稱為kappa(κ)和lambda(λ)。
免疫球蛋白可依它們重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分為不同類型。人免疫球蛋白主要有5類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾類可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。不同的同種型具有不同的效應(yīng)器功能。例如，人IgG1和IgG3同種型可介導(dǎo)依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。
本文所用的“標(biāo)記”指直接或間接與抗體偶聯(lián)而產(chǎn)生“標(biāo)記”抗體的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記本身可檢測(例如，放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者就酶標(biāo)記而言，可催化底物化合物或組合物化學(xué)轉(zhuǎn)變成可檢測化合物。可用作可檢測標(biāo)記的放射性核素包括，例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。標(biāo)記也可以是不可檢測的實(shí)體，例如毒素。
術(shù)語“拮抗劑”以最廣義使用，包括能部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的天然靶分子的生物活性或其轉(zhuǎn)錄或翻譯的任何分子。
本文所用的“載體”包括當(dāng)其以所用劑量和濃度與細(xì)胞或哺乳動物接觸時沒有毒性的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。生理上可接受的載體通常是pH緩沖水溶液。生理上可接受的載體的例子包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克?！奥?lián)合”一種或多種其它治療性藥物給藥包括同步(同時)和以任何順序連續(xù)給藥。
本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”指以單核實(shí)體培養(yǎng)的微生物或真核細(xì)胞或細(xì)胞系，它們可以是或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移多核苷酸的受者，并且包括受轉(zhuǎn)染原始細(xì)胞的后代。應(yīng)理解，由于天然的、偶發(fā)的或設(shè)計(jì)的突變，一個細(xì)胞的后代在形態(tài)或基因組或總DNA互補(bǔ)性上無需和原始的親代完全相同。
“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選至少表達(dá)FcγRII并行使依賴抗原的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。具有ADCC活性的抗體通常是IgG1或IgG3同種型。應(yīng)注意，除了分離得到IgG1和IgG3抗體以外，這種ADCC介導(dǎo)性抗體可通過將非ADCC抗體的可變區(qū)或可變區(qū)片段工程改造為IgG1或IgG3同種型的恒定區(qū)來制備。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)域的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。此外，優(yōu)選的FcR可結(jié)合IgG抗體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者交替剪接形式。FcγRII受體包括具有相似氨基酸序列、主要在于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同的FcγIIA(“活化性受體”)和FcγIIB(“抑制性受體”)。活化性受體FcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15203-234)。FcR綜述見Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel等，(1994)Immunomethods 425-34和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126330-341。本文的術(shù)語“FcR”包括其它FcR，包括將來鑒定到的FcR。該術(shù)語也包括將成熟IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生受體，F(xiàn)cRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117587和Kim等，(1994)J.Immunol.24249(1994))。
制備人抗體的方法有很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌細(xì)胞無限增殖。然而，EBV-感染的細(xì)胞難于克隆并且得到的免疫球蛋白通常產(chǎn)量較低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 1005-40)。將來，可能通過引入轉(zhuǎn)化基因的有限組合來實(shí)現(xiàn)人B細(xì)胞的無限增殖。近來的發(fā)現(xiàn)增加了這種可能性，即端粒酶催化性亞基連同H-ras的SV40大癌蛋白和H-ras癌等位基因一起表達(dá)可導(dǎo)致正常人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)變(Hahn等，(1999)Nature 400464-468)?，F(xiàn)在已可能制備經(jīng)過免疫后能產(chǎn)生全套人抗體不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)(Jakobovits等，(1993)Nature 362255-258；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93；Fishwild等，(1996)Nat.Biotechnol.14845-851；Mendez等，(1997)Nat.Genet.15146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 23111-23；Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727；綜述見Little等，(2000)Immunol.Today 21364-370)。例如，嵌合型和種系突變小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合子消除可完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生已見描述(Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551-2555)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移入這種種系突變小鼠可制備轉(zhuǎn)基因小鼠品系(Jakobovits等，(1993)Nature 362255-258)。Mendez等，(1997)(Nature Genetics 15146-156)，當(dāng)用抗原攻擊后可產(chǎn)生高親和力完全人抗體。這可通過將兆堿基的人重鏈和輕鏈基因座通過種系整合入刪除了上述內(nèi)源性JH區(qū)段的小鼠來實(shí)現(xiàn)。這些小鼠(XenoMouse_II technology(Abgenix；Fremont，California))具有1,020kb的人重鏈基因座和800kb的人κ基因座，其中人重鏈基因座含有約66個VH基因、完全的DH和JH區(qū)域，以及3個不同的恒定區(qū)，人κ基因座含有32個Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。這些小鼠中產(chǎn)生的抗體在各方面，包括基因重排、裝配和所有成分極其類似于在人中觀察到的抗體。由于刪除了內(nèi)源性片段從而防止了鼠基因座中基因重排，此種人抗體的表達(dá)優(yōu)先壓倒內(nèi)源性抗體。這種小鼠可用特別感興趣的抗原免疫。
可篩選這種免疫動物血清對原先(接種)抗原的抗體反應(yīng)性?？蓮牧馨凸?jié)或脾細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞，選擇CD138-陰性和CD19-陽性淋巴細(xì)胞來選擇B細(xì)胞。一方面，可將這種B細(xì)胞培養(yǎng)物(BCC)與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生上述雜交瘤。
在另一方面，宜進(jìn)一步篩選這種B細(xì)胞培養(yǎng)物對原先(接種)抗原的反應(yīng)性。這種篩選包括用靶/抗原蛋白質(zhì)的ELISA、用能與感興趣抗原結(jié)合的已知抗體進(jìn)行競爭性試驗(yàn)和與瞬時感染的表達(dá)該靶抗原的CHO或其它細(xì)胞的體外結(jié)合試驗(yàn)。
本發(fā)明涉及治療多發(fā)性骨髓瘤的人患者的組合物和方法。這些方法包括用本文所述的抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段治療，其中給予該抗體或其抗原結(jié)合片段可在接受該治療方法的對象內(nèi)提高陽性治療應(yīng)答。適用于本發(fā)明方法的抗-CD40抗體能特異性結(jié)合表達(dá)于人細(xì)胞表面的人CD40抗原，并且當(dāng)與人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合后無明顯激動活性而顯示拮抗活性，如對于表達(dá)CD40的正常和瘤性人B細(xì)胞所證實(shí)的那樣。這些抗-CD40抗體和其抗原結(jié)合片段在本文中稱為拮抗性抗-CD40抗體。這種抗體包括，但不限于下文所述的完整的人單克隆抗體5.9和CHIR-12.12，和具有單克隆抗體5.9和CHIR-12.12結(jié)合特性的單克隆抗體。這些可重組產(chǎn)生的單克隆抗體描述于下文和分別于2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為“拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法”的待批臨時申請，以及轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))所述，各專利申請的內(nèi)容均全文納入本文作為參考。
具有單克隆抗體5.9和CHIR-12.12結(jié)合特性的抗體包括能競爭性干擾CD40結(jié)合和/或與5.9和CHIR-12.12相同表位結(jié)合的抗體。技術(shù)人員可采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法確定某抗體是否競爭性干擾5.9或CHIR-12.12。
當(dāng)這些抗體結(jié)合展示于人細(xì)胞，例如人B細(xì)胞表面上的CD40時，無明顯的激動活性；在一些實(shí)施方案中，抗體與展示于人細(xì)胞表面的CD40結(jié)合抑制了這些人細(xì)胞的增殖與分化。因此，適用于本發(fā)明方法的拮抗性抗-CD40抗體包括對表達(dá)細(xì)胞表面CD40抗原的正常和惡性人細(xì)胞可顯示拮抗活性的單克隆抗體。
拮抗性抗-CD40抗體單克隆抗體5.9和CHIR-12.12代表了用于本發(fā)明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體。5.9和12.12抗體是雜交瘤細(xì)胞系131.2F8.5.9(本文稱為細(xì)胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文稱為細(xì)胞系12.12)產(chǎn)生的IgG1同種型完全人抗-CD40單克隆抗體。采用含有人IgG1重鏈基因座和人κ鏈基因座的免疫的異種小鼠(XenoMouse_technology；Abgenix；Fremont，Califomia)脾細(xì)胞獲得了這些細(xì)胞系。使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞(Sierra BioSource)融合。將得到的雜交瘤亞克隆數(shù)次得到穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系5.9和12.12。本發(fā)明的其它抗體可用含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠或通過本領(lǐng)域已知和/或本文所述的其它方法類似地制備。
CHIR-12.12抗體的可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列，5.9抗體的可變區(qū)的氨基酸序列分別見2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為“拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法”的待批臨時申請，以及轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))中所述，各申請的內(nèi)容全文納入本文作為參考。mAb CHIR-12.12輕鏈和重鏈的前導(dǎo)區(qū)、可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列分別示于圖1A和1B。也參見SEQ IDNO2(mAb CHIR-12.12輕鏈的完整序列)、SEQ ID NO4(mAb CHIR-12.12重鏈的完整序列)和SEQ ID NO5(SEQ ID NO4所示mAb CHIR-12.12的重鏈變體的完整序列，其變體包含在SEQ ID NO4所示153位絲氨酸殘基替換了丙氨酸殘基)。編碼mAb CHIR-12.12輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別示于圖2A和2B。也參見SEQ ID NO1(mAb CHIR-12.12輕鏈的編碼序列)和SEQ ID NO3(mAb CHIR-12.12重鏈的編碼序列)。5.9mAb輕鏈和重鏈的前導(dǎo)區(qū)、可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列分別示于圖3A和3B。也參見SEQ ID NO6(mAb 5.9輕鏈的完整序列)、SEQ ID NO7(mAb 5.9重鏈的完整序列)和SEQ ID NO8(SEQ ID NO7所示mAb 5.9的重鏈變體的完整序列，其變體包含在SEQ IDNO7所示158位絲氨酸殘基替換了丙氨酸殘基)。此外，表達(dá)5.9和CHIR-12.12抗體的雜交瘤分別在ATCC中以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543保藏。
除了拮抗活性外，本發(fā)明的抗-CD40抗體優(yōu)選具有另一種抗腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)理。例如，天然5.9和CHIR-12.12抗體具有ADCC活性。或者，5.9和CHIR-12.12抗體的可變區(qū)可表達(dá)在具有ADCC活性的另一種抗體同種型上。如下文所述，也可將5.9或CHIR-12.12的天然形式、重組形式或其抗原結(jié)合片段偶聯(lián)于細(xì)胞毒素。
如流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)測定的那樣，在ELISA型測定中5.9和CHIR-12.12單克隆抗體與可溶性CD40結(jié)合、阻止了CD40-配體與細(xì)胞表面CD40結(jié)合并置換了先前結(jié)合的CD40-配體?？贵w5.9和CHIR-12.12可彼此競爭而不與15B8競爭結(jié)合CD40，15B8是2000年10月2日提交的名為“人抗-CD40抗體”的美國臨時申請系列號60/237,556和2001年10月2日提交的也名為“人抗-CD40抗體”的PCT國際申請?zhí)朠CT/US01/30857(代理人審理號PP 16092.003)中所述的抗-CD40單克隆抗體，該兩篇申請的內(nèi)容均全文納入引為參考。當(dāng)在體外測試對正常人對象的B細(xì)胞增殖的作用時，5.9和CHIR-12.12起拮抗性抗-CD40抗體作用。此外，5.9和CHIR-12.12不誘導(dǎo)正常人對象的淋巴細(xì)胞強(qiáng)增殖。這些抗體能通過依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)殺死CD40表達(dá)靶細(xì)胞。如BiacoreTM試驗(yàn)所測定的，5.9與人CD40的結(jié)合親和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12的結(jié)合親和力是5×10-10M。
用于本發(fā)明方法的合適的拮抗性抗-CD40抗體對CD40細(xì)胞表面抗原顯示強(qiáng)的單一位點(diǎn)結(jié)合親和力。采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，例如BiacoreTM測定本發(fā)明的單克隆抗體對CD40的解離平衡常數(shù)(KD)顯示為至少10-5M、至少3×10-5M、優(yōu)選至少10-6M-10-7M、更優(yōu)選至少10-8M-約10-12M。Biacore分析是本領(lǐng)域已知的并詳述于《BIA應(yīng)用手冊》(BIAapplications handbook)。WO 01/27160所述的方法用于調(diào)節(jié)結(jié)合親和力。
“CD40抗原”、“CD40細(xì)胞表面抗原”、“CD40受體”或“CD40”指屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的跨膜糖蛋白(參見，例如美國專利號5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等，(1989)EMBO 81403；Clark(1990)Tissue Antigens 3633；Barclay等，(1997)《白血球抗原手冊》(The LeucocyteAntigen Facts Book)(第二版；Academic Press，San Diego))。已鑒定到該基因交替剪接轉(zhuǎn)錄變體編碼的人CD40的兩種同種型。第一種同種型(也稱為“長同種型”或“同種型1”)表達(dá)為具有由前19個殘基代表的信號序列的277個氨基酸的前體多肽(SEQ ID NO12(首次報(bào)道為GenBank登錄號CAA43045，在GenBank登錄號NP_001241中鑒定為同種型1)，由SEQ ID NO11(參見GenBank登錄號X60592和NM_001250)編碼)。第二種同種型(也稱為“短同種型”或“同種型2”)表達(dá)為也具有由前19個殘基表示的信號序列的203個氨基酸的前體多肽(SEQ ID NO10(首次報(bào)道為GenBank登錄號NP_690593)，由SEQ ID NO9(GenBank登錄號NM_152854)編碼)。人CD40的這兩種同種型的前體多肽的前165個殘基相同(即，SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的殘基1-165)。短同種型的前體多肽(SEQ ID NO10所示)由缺乏編碼區(qū)段，導(dǎo)致翻譯讀框移位的轉(zhuǎn)錄物變體(SEQ ID NO9)編碼；與CD40長同種型所含有的(SEQ ID NO12的殘基166-277所示C-末端)相比，得到的CD40同種型含有較短且不同的C-末端(SEQ ID NO10的殘基166-203)。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“CD40抗原”、“CD40細(xì)胞表面抗原”、“CD40受體”或“CD40”包括CD40的短和長同種型。本發(fā)明的抗-CD40抗體可與下文所述該細(xì)胞表面抗原的短同種型或長同種型中相同位置的人CD40表位結(jié)合。
如本文別處所述，CD40抗原展示在各種類型細(xì)胞的表面?！罢故居诒砻妗焙汀氨磉_(dá)于表面”指全部或部分CD40抗原暴露于細(xì)胞的外部。展示或表達(dá)的CD40抗原可完全或部分糖基化。
“激動活性”指作為激動劑的物質(zhì)功能。激動劑與細(xì)胞受體的結(jié)合引起了與該受體的天然配體所引起的相似或相同的反應(yīng)或活性。例如，CD40激動劑可誘導(dǎo)任何或全部的下列應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞增殖和/或分化；抗體產(chǎn)生；胞內(nèi)粘附；B細(xì)胞記憶產(chǎn)生(memory generation)；同種型轉(zhuǎn)換、上調(diào)II類MHC和CD80/60的細(xì)胞表面表達(dá)；分泌促炎性細(xì)胞因子，例如IL-8、IL-12和TNF等。“拮抗活性”指作為拮抗劑的物質(zhì)功能。例如，CD40的拮抗劑可防止或降低通過CD40受體與激動性配體，特別是CD40L結(jié)合誘導(dǎo)的任何應(yīng)答。拮抗劑可使激動劑結(jié)合所誘導(dǎo)的一種或多種應(yīng)答降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、優(yōu)選40％、45％、50％、55％、60％、更優(yōu)選70％、80％、85％和最優(yōu)選90％、95％、99％或100％。檢測抗-CD40抗體和CD40-配體結(jié)合特異性與拮抗活性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)的競爭性結(jié)合試驗(yàn)、監(jiān)測B細(xì)胞分泌免疫球蛋白的試驗(yàn)、B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Banchereau樣B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、抗體產(chǎn)生的T細(xì)胞輔助試驗(yàn)、B細(xì)胞增殖的共同刺激試驗(yàn)和上調(diào)B細(xì)胞激活標(biāo)記的試驗(yàn)。參見，例如分別公開于以下專利或申請中的試驗(yàn)WO 00/75348；美國專利號6,087,329；和2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為“拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法”的待批臨時申請，以及轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，各申請的內(nèi)容均全文納入本文作為參考。
“明顯的”激動活性指在B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中所檢測的激動活性比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％?！懊黠@的”激動活性優(yōu)選在B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中檢測到的激動活性比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少2倍或3倍。因此，例如當(dāng)感興趣的B細(xì)胞應(yīng)答是B細(xì)胞增殖時，“明顯的”B細(xì)胞增殖指誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖水平比天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一個實(shí)施方案中，不結(jié)合CD40的非特異性免疫球蛋白，例如IgG1作為陰性對照?！盁o明顯激動活性”的物質(zhì)顯示在B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中檢測到的激動活性不高于天然物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的激動活性約25％，優(yōu)選不高約20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或甚至不高約0.1％。如上所述，當(dāng)與人細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時，本發(fā)明方法所用的拮抗性抗-CD40抗體無明顯的激動活性。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體在B細(xì)胞應(yīng)答中無明顯的激動活性。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體在多種細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中(例如，增殖和分化，或增殖、分化和抗體產(chǎn)生)無明顯的激動活性。
本文所用的“抗-CD40抗體”包括特能異性識別CD40B細(xì)胞表面抗原的抗體，包括多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體以及它們的片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了親代抗-CD40抗體的抗原結(jié)合功能的其它片段。對本發(fā)明而言，特別感興趣的是與上述單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12具有相同結(jié)合特性的本文公開的拮抗性抗-CD40抗體。這種抗體包括，但不限于以下抗體(1)分別以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543由ATCC保藏的，命名為131.2F8.5.9(本文稱為細(xì)胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文稱為細(xì)胞系12.12)的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體；(2)含有選自SEQ ID NO2所示、SEQ ID NO4所示、SEQ ID NO5所示氨基酸序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示，與同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的單克隆抗體；(3)含有選自SEQ ID NO6所示、SEQ ID NO7所示、SEQ ID NO8所示氨基酸序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示，與同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示氨基酸序列的單克隆抗體；(4)具有由選自含有SEQ ID NO1所示、SEQ ID NO3所示、同時含有SEQ IDNO1和SEQ ID NO3所示核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體；(5)能與雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合的表位相結(jié)合的單克隆抗體；(6)能結(jié)合含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示氨基酸序列的殘基82-87表位的單克隆抗體；(7)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；和(8)作為CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或前項(xiàng)(1)-(7)中所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合人CD40抗原的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，使用本領(lǐng)域已知和下文所述方法重組產(chǎn)生的本文公開的拮抗性抗體和這些抗體的抗原結(jié)合片段包括，例如已經(jīng)重組產(chǎn)生的單克隆抗體CHIR-5.9和CHIR-12.12。
制備拮抗性抗-CD40抗體用于本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備。因此，可通過常規(guī)方法制備多克隆血清。通常先用含CD40抗原的溶液免疫合適的動物，優(yōu)選小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可得到的血清體積多和可用已有的抗-家兔和抗-山羊標(biāo)記抗體，優(yōu)選用家兔和山羊制備多克隆血清。
可在轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選攜帶人免疫球蛋白基因座的小鼠中制備多克隆血清。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)CD40的SF9細(xì)胞用作免疫原。也可用鹽水，優(yōu)選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外(通常是皮下或肌肉內(nèi))注射該混合物或乳劑來免疫。每次注射50-200μg的劑量一般足夠。通常在2-6周后注射用鹽水配制，優(yōu)選用不完全弗氏佐劑配制的蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫一次或多次。或者可用本領(lǐng)域已知的方法體外免疫產(chǎn)生抗體，就本發(fā)明目的而言體外與體內(nèi)免疫等效。將免疫動物的血液放入玻璃或塑料容器25℃孵育該血液1小時，然后4℃孵育2-18小時獲得多克隆抗血清。離心(例如，1,000×g 10分鐘)回收血清。每次放血可自家兔獲得約20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))細(xì)胞的制備方法見納入本文作為參考的美國專利號6,004,552中所述。簡言之，將編碼人CD40的序列用轉(zhuǎn)移載體重組入桿狀病毒。將質(zhì)粒與野生型桿狀病毒DNA共同轉(zhuǎn)染入Sf9細(xì)胞。鑒定重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞并克隆純化。
優(yōu)選的抗體性質(zhì)上是單克隆抗體?！皢慰寺】贵w”指得自基本上均質(zhì)抗體群的抗體，即除了存在極少量天然發(fā)生的突變以外，組成該群的每個抗體是相同的。該術(shù)語不受限于抗體的種類或來源。該術(shù)語包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了抗體結(jié)合功能的其它片段。單克隆抗體是高度特異性的，針對一個的抗原性位點(diǎn)，即在本發(fā)明中為CD40細(xì)胞表面抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上一個決定簇。修飾詞“單克隆的”表示得自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體特性，不可理解為需要通過任何具體方法產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過Kohler等，(1975)Nature 256495首次描述的雜交瘤方法或重組DNA方法制備(參見，例如美國專利號4,816,567)。“單克隆抗體”也可用，例如Clackson等，(1991)Nature 352624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222581-597；和美國專利號5,514,548中所述技術(shù)自噬菌體抗體文庫分離得到。
“表位”指抗原性分子中能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體并結(jié)合該抗體的那一部分。表位可含有線性氨基酸殘基(即，表位內(nèi)的殘基以線性方式一個接一個順序排列)，非線性氨基酸殘基(本文稱為“非線性表位”；這些表位非順序排列)或線性與非線性氨基酸殘基。
可使用Kohler等，(1975)Nature 256495-496所述方法或其改進(jìn)形式制備單克隆抗體。通常用含抗原的溶液免疫小鼠。可用鹽水，優(yōu)選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外注射混合物或乳劑來免疫?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何免疫方法來獲得本發(fā)明的單克隆抗體。免疫動物后，取出脾臟(任選取出幾個大的淋巴結(jié))解離成為單個細(xì)胞。使細(xì)胞混懸液涂布于包被有感興趣抗原的板或孔來篩選脾細(xì)胞。表達(dá)抗原特異性膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞與板結(jié)合而不被洗掉。然后誘導(dǎo)得到的B細(xì)胞或所有分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤，用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。接種得到的細(xì)胞系列稀釋液并測定能特異性結(jié)合感興趣抗原的抗體(和不結(jié)合無關(guān)抗原的抗體)的產(chǎn)生。然后將分泌單克隆抗體(mAb)的選出的雜交瘤在體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠的腹水)培養(yǎng)。
當(dāng)用重組DNA方法制備本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體時，使用常規(guī)方法(例如，用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)不難分離得到并測序編碼單克隆抗體的DNA。本文所述的雜交瘤細(xì)胞是這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離后，可將此DNA置于表達(dá)載體中，然后將載體轉(zhuǎn)染入本身不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中從而獲得在該重組宿主細(xì)胞中合成的單克隆抗體。在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述性文章包括Skerra等，(1993)Curr.Opinion in Immunol.5256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130151?；蛘?，如納入本文作為參考的美國專利號5,545,403；5,545,405和5,998,144中所公開的，可在細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞系中制備抗體。簡言之，用能表達(dá)輕鏈和重鏈的載體分別轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系。嵌合性抗體可通過轉(zhuǎn)染不同載體上的兩種蛋白質(zhì)來制備。另一優(yōu)點(diǎn)是該抗體正確糖基化。
在一些實(shí)施方案中，用GS基因表達(dá)系統(tǒng)(Lonza Biologics，Portsmouth，New Hampshire)在CHO細(xì)胞中制備拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段，所述表達(dá)系統(tǒng)使用谷氨酰胺合成酶作為標(biāo)記。也參見其內(nèi)容全文納入本文作為參考的美國專利號5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216。
CD40的單克隆抗體是本領(lǐng)域已知的。參見，例如以下文獻(xiàn)中有關(guān)B-細(xì)胞抗原的章節(jié)，McMichael編，(1987；1989)《白細(xì)胞分型III和IV》(LeukocyteTyping III and IV)(牛津大學(xué)出版社，紐約)；美國專利號5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO 00/63395；國際公布號WO 02/28905和WO 02/28904；Gordon等，(1988)J.Immunol.1401425；Valle等，(1989)Eur.J.Immunol.191463；Clark等，(1986)PNAS 834494；Paulie等，(1989)J.Immunol.142590；Gordon等，(1987)Eur.J Immunol 171535；Jabara等，(1990)J.Exp.Med.1721861；Zhang等，(1991)J.Immunol.1461836；Gascan等，(1991)J.Immunol.1478；Banchereau等，(1991)Clin.Immunol.Spectrunt 38；和Banchereau等，(1991)Science 25170；所有文獻(xiàn)納入本文作為參考。本發(fā)明特別感興趣的是本文公開的與上述單克隆抗體5.9和CHIR-12.12具有相同結(jié)合特性的拮抗性抗-CD40抗體。
本文使用的術(shù)語“CD40-抗原表位”指除CD40抗原本身以外能與本發(fā)明的抗-CD40單克隆抗體起免疫反應(yīng)的分子。CD40-抗原表位包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、肽、碳水化合物、脂質(zhì)和其它分子，但就本發(fā)明的目的而言，最常用蛋白質(zhì)、短的寡肽、寡肽模擬物(即，能模擬CD40抗原的抗體結(jié)合性能的有機(jī)化合物)或它們的組合。PCT申請US 91/04282描述了合適的寡肽模擬物。
此外，本文使用的術(shù)語“抗-CD40抗體”包括嵌合性抗-CD40抗體；用于本發(fā)明方法的這種嵌合性抗-CD40抗體具有本文所述5.9和CHIR-12.12單克隆抗體的結(jié)合特性?！扒逗稀笨贵w指最好是用重組脫氧核糖核酸技術(shù)衍生的含有人(包括免疫“相關(guān)“種類，例如黑猩猩)和非人組分的抗體。因此，嵌合性抗體恒定區(qū)最好基本上與天然的人抗體恒定區(qū)相同；嵌合性抗體可變區(qū)最好衍生自非人來源并具有所需CD40細(xì)胞表面抗原的抗原性特異性。非人來源是可用來產(chǎn)生針對人CD40細(xì)胞表面抗原或含有人CD40細(xì)胞表面抗原物質(zhì)的抗體的任何脊椎動物來源。這種非人來源包括，但不限于嚙齒類(例如，家兔、大鼠、小鼠等；參見，例如，納入本文作為參考的美國專利號4,816,567)和非人靈長類(例如，古猴(Old World Monkey)，類人猿等；例如納入本文作為參考的美國專利號5,750,105和5,756,096)。當(dāng)本文所用的短語“免疫活性”指嵌合性抗-CD40抗體時，指能結(jié)合人CD40的嵌合性抗體。
本文所用的術(shù)語抗-CD40抗體也包括嵌合性與人源化抗-CD40抗體。嵌合性抗體含有衍生自不同種類的抗體的片段。Rituxan_是具有鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合性抗體例子。
“人源化”指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗-CD40抗體形式。就大部分序列而言，人源化抗體指其中受者的超變區(qū)殘基(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)被非人種類(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的超變區(qū)殘基取代的，具有所需特異性、親和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗體)。短語“互補(bǔ)決定區(qū)”指共同確定了天然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)域的結(jié)合親和力和特異性的氨基酸序列。參見，例如Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196901-917；Kabat等，(1991)美國健康與人類服務(wù)部(U.S.Dept.ofHealth and Human Services)，NIH公布號91-3242)。短語“恒定區(qū)”指抗體分子中賦予效應(yīng)器功能的那部分。在以前涉及產(chǎn)生用于治療人疾病的無免疫原性抗體的研究中，小鼠恒定區(qū)被人恒定區(qū)取代。所述人源化抗體的恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白。然而，這些人源化抗體仍能在人中引發(fā)有害且可能危險的免疫應(yīng)答并且喪失了親和力。用于本發(fā)明方法的人源化抗-CD40抗體具有類似于本文所述5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的結(jié)合特性。
人源化基本上可根據(jù)Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen等，(1988)Science2391534-1536)的方法通過用嚙齒類或突變型嚙齒類CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行。也參見納入本文作為參考的美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一個或多個可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)的殘基為對應(yīng)的非人殘基所取代(參見，例如美國專利號5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗體可含有在受者抗體或供體抗體中沒發(fā)現(xiàn)的殘基。制備這些修飾物可進(jìn)一步精制抗體的性能(例如，獲得所需的親和力)?？傮w上，人源化抗體基本上含有所有可變區(qū)、至少一個，通常兩個可變區(qū)，其中所有或基本上所有的超變區(qū)是對應(yīng)的非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架區(qū)是對應(yīng)的人免疫球蛋白序列。人源化抗體也任選包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。更多的細(xì)節(jié)見引作參考的Jones等，(1986)Nature 331522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2593-596。因此，這種“人源化”抗體可包括其中基本上小于完整的人可變區(qū)被非人種類的相應(yīng)序列取代的抗體。實(shí)際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些框架殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代的人抗體。參見，例如美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也參見美國專利號6,180,370，和國際公布號WO01/27160，其中公開了人源化抗體和產(chǎn)生對預(yù)定抗原具有改進(jìn)親和力的人源化抗體的技術(shù)。
術(shù)語抗-CD40抗體也包括非人哺乳動物宿主，更具體說是以滅活的內(nèi)源性免疫球蛋白(Ig)基因座為特征的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的異種或修飾的抗-CD40抗體。在這種轉(zhuǎn)基因動物中，使得表達(dá)宿主免疫球蛋白輕鏈和重鏈的活性內(nèi)源性基因無功能，并用同類人免疫球蛋白基因座取代。這些轉(zhuǎn)基因動物可產(chǎn)生基本上無宿主免疫球蛋白輕或重鏈亞基的人抗體。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號5,877,397和5,939,598。
針對CD40的完整人抗體優(yōu)選通過免疫轉(zhuǎn)基因小鼠獲得。這種小鼠可用XenoMouse_技術(shù)(Abgenix；Fremont，Califomia)獲得并公開于納入本文作為參考的美國專利號6,075,181；6,091,001和6,114,598中。為制備本文公開的抗體，用表達(dá)人CD40的Sf9細(xì)胞免疫具有人IgG1重鏈基因座和人K輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠也可以是其它同種型的轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明所用的完整人抗體的特征在于其結(jié)合特性與本文公開的5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的特征相似。
只要抗-CD40抗體的片段保留了所需的全長抗體的親和力，它們就適用于本發(fā)明的方法。因此，抗-CD40抗體的片段保留了結(jié)合CD40B細(xì)胞表面抗原的能力。這種片段的特征在于其性能與相應(yīng)的全長拮抗性抗-CD40抗體相似，即這種片段能特異性結(jié)合表達(dá)于人細(xì)胞表面的人CD40抗原，并且當(dāng)與人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時無明顯激動活性而顯示拮抗活性。本文將這種片段稱為“抗原結(jié)合”片段。
抗體的合適的抗原結(jié)合片段含有全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括，但不限于Fab、F(ab′)2、Fv片段和單鏈抗體分子?！癋ab”指由輕鏈或重鏈的一部分組成的免疫球蛋白的單價抗原結(jié)合片段。F(ab′)2指含有兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分的免疫球蛋白的二價抗原結(jié)合片段?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段指含有抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的片段，其中這些結(jié)構(gòu)域以一條多肽鏈的形式存在。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還含有一多肽接頭使sFv形成能與抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。sFv的綜述見Pluckthun(1994)《單克隆抗體的藥理學(xué)》(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編，(Springer-Verlag，New York)，269-315頁。如下文所述，本文公開的拮抗性抗-CD40抗體的抗原結(jié)合片段也可與細(xì)胞毒素偶連以起殺死靶癌細(xì)胞的作用。
可利用例如McCafferty等，(1990)Nature 348552-554(1990)和美國專利號5,514,548中描述的技術(shù)從抗體噬菌體文庫分離得到抗體或抗體片段。Clackson等，(1991)Nature 352624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Bird.222581-597分別描述了利用噬菌體文庫分離得到鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過構(gòu)建非常大的噬菌體文庫方案的鏈改組(Marks等，(1992)Bio/Technology10779-783)以及組合感染和體內(nèi)重組來產(chǎn)生高親和力(nM范圍)人抗體(Waterhouse等，(1993)Nucleic.Acids Res.212265-2266)。因此，這些技術(shù)是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。
已開發(fā)了各種技術(shù)來制備抗體片段。這些片段通過使完整抗體蛋白水解消化而獲得(參見，例如Morimoto等，(1992)Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24107-117(1992)和Brennan等，(1985)Science 22981)。然而，現(xiàn)在這些片段可通過重組宿主細(xì)胞直接制備。例如，可從上述噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘撸蓮拇竽c桿菌中直接回收Fab′-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter等，(1992)Bio/Technology 10163-167)。根據(jù)另一方法，可從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離得到F(ab′)2片段。其它制備抗體片段的技術(shù)是技術(shù)人員熟知的。
本發(fā)明方法所用的拮抗性抗-CD40抗體包括本文公開的5.9和CHIR-12.12單克隆抗體以及與該抗體不同但保留了CDR的抗體；具有一個或多個氨基酸添加、刪除或取代的抗體，可通過抑制B細(xì)胞增殖和/或分化來測定其拮抗活性。本發(fā)明也包括脫免疫的(de-immunized)拮抗性抗-CD40抗體，該抗體可按納入本文作為參考的國際公布號WO 98/52976和WO 0034317所述制備。本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體內(nèi)的殘基以該方式修飾而使得該抗體對人無免疫原性或較低，但卻保留了對人CD40表達(dá)細(xì)胞的拮抗活性，所述活性可用本文其它部分所述試驗(yàn)測定。權(quán)利要求的范圍也包括本領(lǐng)域已知的含有本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其片段的融合蛋白，所述融合蛋白可合成或從相應(yīng)的多核苷酸載體表達(dá)。參考下述抗體偶聯(lián)法所描述的這種融合蛋白。
本發(fā)明的抗體可具有用例如納入本文作為參考的專利公布號EP 0 983303A1、WO00/34317和WO98/52976中所述方法產(chǎn)生的序列變異。例如，CDR中的序列顯示可導(dǎo)致抗體與II型MHC結(jié)合并引發(fā)有害的輔助性T細(xì)胞應(yīng)答。保守取代可使得該抗體保留結(jié)合活性而喪失其引發(fā)有害T細(xì)胞應(yīng)答的能力。可用本領(lǐng)域已知，例如本文其它部分所述的方法進(jìn)行任何這種保守或非保守取代，得到的抗體屬于本發(fā)明的范圍。用本文所述方法常規(guī)測試變體抗體的拮抗活性、親和力和特異性。
如果上述任何方法或其它本文未公開的方法制備的抗體在體外和/或體內(nèi)擁有至少一種以下生物活性，其屬于本發(fā)明范圍抑制T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞增殖；抑制表達(dá)CD40L的細(xì)胞或可溶CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細(xì)胞增殖；抑制sCD40L或固態(tài)CD40L刺激的任何細(xì)胞中“存活性”抗-凋亡胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；抑制細(xì)胞與sCD40L或固態(tài)CD40L結(jié)合時的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；和抑制下述人惡性B細(xì)胞增殖。這些試驗(yàn)可如以下待批臨時申請所述進(jìn)行2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為“拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的使用方法”的待批臨時申請，以及轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，每篇文獻(xiàn)的內(nèi)容全文納入本文作為參考。也參見納入本文作為參考的以下文獻(xiàn)所述的試驗(yàn)Schultze等，(1998)，Proc.Natl.Sci.USA 928200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr.Transplant.26-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164688-697；Noelle等，(1998)，AgentsActions Suppl.4917-22；Lederman等，(1996)，Curr.Opin.Hematol.377-86；Coligan等，(1991)，《當(dāng)代免疫學(xué)方法》(Current Protocols in Immunology)1312；Kwekkeboom等，(1993)，Immunology 79439-444和美國專利號5,674,492和5,847,082。
檢測本文所鑒定的CD40-抗原表位特異性拮抗性抗-CD40抗體的代表性試驗(yàn)是“競爭性結(jié)合試驗(yàn)”。競爭性結(jié)合試驗(yàn)是通過抑制標(biāo)記的已知配體和其特異抗體結(jié)合的能力來檢測和定量未知物的血清學(xué)試驗(yàn)。也稱為競爭性抑制試驗(yàn)。在代表性的競爭性結(jié)合試驗(yàn)中，標(biāo)記的CD40多肽與樣品中的候選抗體，例如與針對本發(fā)明單克隆抗體的一種或多種表位而產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合而沉淀。可通過篩選針對CD40蛋白或含有感興趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制備的一系列抗體來鑒定能與感興趣某表位特異性反應(yīng)的抗-CD40抗體。例如，就人CD40而言，感興趣的表位包括含有以下同種型的線性和/或非線性氨基酸殘基的表位如圖4B所示(SEQ ID NO10)的由圖4A所示序列(SEQ IDNO9；也參見GenBank登錄號NM_152854)編碼的人CD40短同種型(見GenBank登錄號NP_690593)，或如圖4D所示(SEQ ID NO12)由圖4C所示序列(SEQ ID NO11；參見GenBank登錄號X60592和NM_001250)編碼的人CD40長同種型(參見GenBank登錄號CAA43045和NP001241)?；蛘?，可用以前鑒定的合適的拮抗性抗-CD40抗體進(jìn)行競爭性結(jié)合試驗(yàn)來選擇與以前鑒定的抗體相當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w。
這種免疫試驗(yàn)采用的抗體可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的。未標(biāo)記的抗體可用于凝結(jié)試驗(yàn)；采用各種各樣標(biāo)記物的標(biāo)記抗體可用于各種試驗(yàn)。通過使抗體與可檢測物質(zhì)連接有助于檢測抗-CD40抗體與感興趣表位之間形成的抗體-抗原復(fù)合物。合適的檢測方式包括使用例如放射性核素、酶、輔酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、色原、酶底物或輔助因子、酶抑制劑、輔基復(fù)合物、自由基、顆粒、染料等標(biāo)記。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子是魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。這種標(biāo)記的試劑可用于各種熟知的試驗(yàn)，例如放射性免疫試驗(yàn)，酶免疫試驗(yàn)如ELISA、熒光免疫試驗(yàn)等。參見，例如美國專利號3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
可將任何前述的拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗體片段偶聯(lián)然后用于本發(fā)明方法。制備偶聯(lián)抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。因此，可用間接標(biāo)記或間接標(biāo)記方法來標(biāo)記抗-CD40抗體?！伴g接標(biāo)記”或“間接標(biāo)記方法”指將螯合劑共價偶聯(lián)于抗體并且將至少一種放射性核素插入該螯合劑中。例如，參見納入本文作為參考的Srivagtava和Mease，(1991)Nucl.Med.Bio.18589-603中所述的螯合劑和放射性核素。合適的標(biāo)記包括熒光基團(tuán)、生色團(tuán)、放射性原子(特別是32P和125I)、電子密集試劑(electron-dense reagent)、酶和具有特異性結(jié)合伴侶(partner)的配體。一般通過其活性來檢測酶。例如，常通過將3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎梅止夤舛扔?jì)定量的藍(lán)色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶?！疤禺愋越Y(jié)合伴侶”指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì)，例如抗原和其特異性單克隆抗體。其它特異性結(jié)合伴侶包括生物素和親和素或鏈霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。因?yàn)橄嗤臉?biāo)記可以幾種不同模式使用，以上描述應(yīng)該理解為不是要將各種標(biāo)記歸為截然不同的種類。例如，125I可用作放射性標(biāo)記或作為電子密集試劑。HRP可用作酶或mAb的抗原。此外，可為所需的作用組合各種標(biāo)記。例如，mAb與親和素在實(shí)施本發(fā)明中也需要標(biāo)記因此，可用生物素標(biāo)記mAb，然后用標(biāo)記125I的親和素或用標(biāo)記HRP的抗-生物素mAb檢測其存在。其它預(yù)先(制備)的突變與可能性對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難理解，應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的等價物。
或者，抗-CD40抗體可使用放射性核素與抗體直接共價相連(一般通過氨基酸殘基)的“直接標(biāo)記”或“直接標(biāo)記方法”標(biāo)記。優(yōu)選的核素見Srivagtava和Mease(1991)，同上。特別優(yōu)選間接標(biāo)記方法。也參見，例如國際公布號WO 00/52031和WO 00/52473，其中接頭用于連接放射性標(biāo)記與抗體；抗-CD40抗體的受標(biāo)記形式描述于納入本文作為參考的美國專利號6,015,542。
此外，抗體(或其片段)可與治療性部分，例如細(xì)胞毒素、治療性藥物或放射性金屬離子或放射性同位素偶聯(lián)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒藥物包括對細(xì)胞有害的任何藥物。例子包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、足葉乙苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、道諾紅菌素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及它們的類似物或同系物。治療性藥物包括，但不限于抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪(decarbazine))、烷化劑(例如，氮芥、thioepachlorambucil、美法侖、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類(例如，道諾紅菌素(曾用名道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素D(曾用名放線菌素)、博萊霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、和抗有絲分裂藥物(例如，長春新堿和長春堿)。放射性同位素包括，但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。本發(fā)明的偶聯(lián)物可用于修飾給定的生物應(yīng)答；此類藥物部分不應(yīng)理解為限制于典型的化學(xué)治療劑。例如，此類藥物部分可以是擁有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括，例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子、干擾素-α、干擾素-β、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物；或生物應(yīng)答修飾劑，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
將這種治療性部分偶聯(lián)于抗體的技術(shù)是熟知的。參見，例如《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中的Arnon等，(1985)，“癌癥治療中用于藥物的免疫靶向的單克隆抗體”(Monoclonal Antibodies forImmunotargeting of Drugs in Cancer Therapy)，Reisfeld等編，(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256頁；Hellstrom等，(1987)，《受控藥物遞送》(Controlled Drug Delivery)中的“用于藥物遞送的抗體”(Antidodies for Drug Delivery)，Robinson等編，(第二版；MarcelDekker，Inc.)，第623-653頁；《單克隆抗體’84生物學(xué)和臨床應(yīng)用》(Monoclonal Antibodies′84Biological and Clinical Applications)中的Thorpe，(1985)，“癌癥治療中細(xì)胞毒性藥物的抗體載體綜述”(Antibodycarriers of Cytoxic Agents in Cancer TherapyA review)，Pinchera等編，第475-506頁，(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；《癌癥診斷和治療的單克隆抗體》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)中的“在癌癥治療中治療性應(yīng)用放射性標(biāo)記抗體的分析、結(jié)果和前景”(Analysis，Results，andFuture Prospective of Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in CancerTherpy)，Baldwin等編，(Academic Press，New York，1985)，第303-316頁；和Thorpe等，(1982)Immunol.Rev.62119-158。
或者，可將抗體與二抗偶聯(lián)形成如美國專利號4,676,980所述的抗體雜合偶聯(lián)物。此外，可在標(biāo)記和本發(fā)明的抗體之間使用接頭(參見美國專利號4,831,175)?？贵w或其抗原結(jié)合片段可用放射性碘、銦、銥或本領(lǐng)域已知的其它放射性顆粒直接標(biāo)記(美國專利號5,595,721)。治療方案可由同時或依次給予偶聯(lián)和非偶聯(lián)抗體的組合治療方案構(gòu)成(WO 00/52031和WO 00/52473)。
拮抗性抗-CD40抗體的變體拮抗性抗-CD40抗體的合適的生物活性變體可用于本發(fā)明的方法。這種變體保留了親代拮抗性抗-CD40抗體的所需結(jié)合特性。制備抗體變體的方法一般是本領(lǐng)域可用的。
例如，拮抗性抗-CD40抗體，如本文所述的5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的氨基酸序列變體可通過突變克隆的編碼感興趣抗體的DNA序列來制備。誘變與核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，參見納入本文作為參考的Walker和Gaastra編，(1983)，《分子生物學(xué)技術(shù)》(Techniques in MolecularBiology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等，(1987)Methods Enzymol.154367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(冷泉港，紐約)；美國專利號4,873,192；和本文引用的參考文獻(xiàn)。適當(dāng)?shù)陌被崛〈挥绊懜信d趣多肽的生物活性的指南見納入本文作為參考的Dayhoff等，(1978)《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖》(Atlas of ProtezhSequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。優(yōu)選保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一個氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于Gly_Ala、Val_Ile_Leu、Asp_Glu、Lys_Arg、Asn_Gln和Phe_Trp_Tyr。
在構(gòu)建感興趣的拮抗性抗-CD40抗體多肽的變體過程中，進(jìn)行修飾使變體繼續(xù)具有所需活性，即相似的結(jié)合親和力并能特異性地結(jié)合表達(dá)于人細(xì)胞表面的人CD40抗原，并且當(dāng)與人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時無明顯的激動活性而顯示拮抗活性。編碼這種變體多肽的DNA中的任何突變顯然無須將其序列置于讀框外并且優(yōu)選不要生成可能產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見歐洲專利公布號75,444。
此外，可以許多方式使拮抗性抗-CD40抗體的恒定區(qū)突變而改變其效應(yīng)器功能。例如，參見美國專利號6,737,056B1和美國專利申請公布號2004/0132101A1所述的優(yōu)化抗體與Fc受體結(jié)合的Fc突變。
參比的拮抗性抗-CD40抗體的變體的氨基酸序列優(yōu)選與該參比拮抗性抗-CD40抗體分子，例如本文所述的5.9或CHIR-12.12單克隆抗體的氨基酸序列，或與該參比抗體分子的較短部分具有至少70％或75％序列相同性，優(yōu)選至少80％或85％序列相同性，更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。這些分子更優(yōu)選具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出于本發(fā)明的目的，可使用Smith-Waterman同源性檢索算法以相關(guān)空格(affinegap)檢索確定序列相同性百分比，所用參數(shù)為空格開放罰分12、空格延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說明見Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2482-489。例如，變體與參比的抗-CD40抗體有少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10個氨基酸殘基，如6-10，少至5個、少至4個、3個、2個、甚至1個氨基酸殘基的不同。
就兩條氨基酸序列的最佳比對而言，與參比氨基酸序列相比，變體氨基酸序列的毗連區(qū)段可具有額外的氨基酸殘基或刪除的氨基酸殘基。用于和參比氨基酸序列比較的毗連區(qū)段包括至少20個毗連氨基酸殘基，可以是30、40、50或更多個氨基酸殘基?？蓪εc保守殘基取代或空格相關(guān)的序列相同性進(jìn)行校正(參見Smith-Waterman同源性檢索算法)。
能特異性結(jié)合CD40并保留拮抗活性的多肽的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是當(dāng)與惡性B細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時取決于許多因素。由于分子中存在可電離的氨基和羧基，特定的多肽可以酸性鹽或堿性鹽，或以中性鹽形式獲得。在合適的環(huán)境中可保留它們的生物活性的所有這種制劑包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗體的定義中。此外，可通過使用糖組分衍生(糖基化)或通過其它補(bǔ)充分子，例如脂質(zhì)、磷酸、乙?；仍黾釉摱嚯牡囊患壈被嵝蛄?。也可通過和糖偶聯(lián)來增加該多肽的一級氨基酸序列。這種增加的某些方面可通過生產(chǎn)宿主的翻譯后加工系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)；可在體外引入其它這種修飾。在任何情況中，只要抗-CD40抗體的拮抗特性能未遭破壞，這種修飾就包括在本文所用的抗-CD40抗體的定義中。在各種試驗(yàn)中，期望這種修飾可通過提高或降低該多肽的活性來定量或定性地影響其活性。此外，可通過氧化、還原或其它衍生方式來修飾鏈中的各個氨基酸殘基，可切割該多肽得到保留活性的片段。這種不破壞拮抗活性的改變未將該多肽序列排除在本文所用感興趣的抗-CD40抗體的定義之外。
本領(lǐng)域?yàn)橛嘘P(guān)多肽變體的制備和使用提供了基本指南。在制備抗-CD40抗體變體過程中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于確定對天然蛋白質(zhì)的核苷酸或氨基酸序列的哪種修飾將導(dǎo)致適合用作本發(fā)明方法藥物組合物中治療性活性組分的變體。
采用本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的治療方法本發(fā)明的方法涉及用拮抗性抗-CD40抗體來治療具有多發(fā)性骨髓瘤的對象(即，患者)，其中該癌癥的細(xì)胞表達(dá)CD40抗原?！氨磉_(dá)CD40的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞”指表達(dá)CD40抗原的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。成功地治療多發(fā)性骨髓瘤取決于診斷時癌癥的發(fā)展階段、對象是否以前或即將聯(lián)合抗-CD40給藥接受其它治療方法。
許多標(biāo)準(zhǔn)可用于將多發(fā)性骨髓瘤分為不同的階段。本發(fā)明的方法可用于治療根據(jù)Durie-Salmon分類系統(tǒng)分類的包括3個階段的多發(fā)性骨髓瘤。根據(jù)該分類系統(tǒng)，患有階段I多發(fā)性骨髓瘤的對象具有低“M組分”，無貧血或高鈣血癥跡象、X-射線未檢測到骨病損或僅有一個病損?！癕組分”指一種免疫球蛋白類型的存在過多。隨著多發(fā)性骨髓瘤發(fā)展，對象產(chǎn)生IgA或IgG抗體的高M(jìn)組分和低水平的其它免疫球蛋白。階段II表示中級狀況，高于階段I，但仍缺乏階段III的性質(zhì)。當(dāng)檢測到以下一種或多種癥狀則達(dá)到了第三階段高鈣血癥、貧血、多發(fā)性骨病損或高度M組分。
Durie-Salmon分類系統(tǒng)可聯(lián)合對肌酐水平的測量以更精確地鑒定疾病狀態(tài)。多發(fā)性骨髓瘤對象的肌酐水平分為“A”或“B”，“B”結(jié)果表明比“A”更差的預(yù)后?！癇”表明肌酐水平高和腎功能衰竭。在這種方式中，多發(fā)性骨髓瘤的“階段IA”表明無貧血、高鈣血癥或其它癥狀以及肌酐水平低。作為評價預(yù)后的其它方式，上述標(biāo)準(zhǔn)可與監(jiān)測β-2-微球蛋白的血液水平聯(lián)用，所述β-2-微球蛋白由多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生。高水平的該蛋白表明存在大量的癌細(xì)胞。
本發(fā)明的方法適用于治療根據(jù)上述任何標(biāo)準(zhǔn)分類的多發(fā)性骨髓瘤。就是因?yàn)檫@些標(biāo)準(zhǔn)可用于鑒定該疾病的發(fā)展階段，可監(jiān)測這些相同的標(biāo)準(zhǔn)，即貧血、高鈣血癥、肌酐水平和β-2-微球蛋白水平、骨病損的數(shù)量和M組分來評價治療效果。
本文將“治療”定義為將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)用于或給予對象，或?qū)⑥卓剐钥?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)用于或給予對象的分離的組織或細(xì)胞系，所述對象患有多發(fā)性骨髓瘤，多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)癥狀，或多發(fā)性骨髓瘤的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤的任何相關(guān)癥狀、或多發(fā)性骨髓瘤的易感性。“治療”也指將含有拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物應(yīng)用于或給予對象，或?qū)⒑修卓剐钥?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物應(yīng)用于或給予對象的分離的組織或細(xì)胞系，所述對象患有多發(fā)性骨髓瘤，多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的癥狀，或多發(fā)性骨髓瘤的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤的任何相關(guān)癥狀、或多發(fā)性骨髓瘤的易感性。
“抗腫瘤活性”指降低惡性的CD40表達(dá)細(xì)胞增殖或積累的速率從而降低已存在的腫瘤或在治療期間產(chǎn)生的腫瘤的生長速率，和/或破壞已存在的致瘤性(腫瘤)細(xì)胞或新形成的致瘤性細(xì)胞從而減小治療期間腫瘤的總體積。用至少一種抗-CD40抗體(或其抗原結(jié)合片段)治療可導(dǎo)致治療多發(fā)性骨髓瘤的有益生理應(yīng)答，所述疾病包含表達(dá)CD40抗原的細(xì)胞。應(yīng)該知道本發(fā)明的方法可用于防止多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞在治療過程中的進(jìn)一步增殖和過度生長。
根據(jù)本發(fā)明的方法，至少一種本文它處所定義的拮抗性抗-CD40抗體(或其抗原結(jié)合片段)可用于促進(jìn)對治療和預(yù)防多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的陽性治療性應(yīng)答。癌癥治療相關(guān)的“陽性治療性應(yīng)答”指與這些抗體或其片段的抗腫瘤活性相關(guān)疾病的改善，和/或疾病相關(guān)癥狀的改善。即，可觀察到抗增殖作用、防止腫瘤進(jìn)一步過度增殖，腫瘤體積減小、腫瘤細(xì)胞數(shù)量降低、和/或CD40表達(dá)細(xì)胞激活所介導(dǎo)的一種或多種癥狀的減輕。因此，疾病改善的特征可以是完全的應(yīng)答?！巴耆膽?yīng)答”指任何以前異常的放射顯影研究、骨髓和腦脊髓液(CSF)正常化的臨床上無可檢測的疾病。用本發(fā)明的方法治療后這種應(yīng)答必須維持至少一個月?；蛘撸膊〉母纳瓶蓺w類為部分應(yīng)答?！安糠謶?yīng)答”指在無新的病損時，所有可檢測的腫瘤負(fù)荷(即，對象中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量)至少降低約50％并至少持續(xù)一個月。這種應(yīng)答僅適用于可檢測的腫瘤。
可用以下篩選技術(shù)評價腫瘤應(yīng)答所導(dǎo)致的腫瘤形態(tài)(即，總的腫瘤負(fù)荷、腫瘤體積等)變化例如磁共振成像(MRI)掃描、x-放射顯影成像、計(jì)算機(jī)化斷層顯像(CT)掃描、生物發(fā)光成像，如螢光素酶成像、骨掃描成像和包括抽取骨髓(BMA)的腫瘤活體組織取樣。除了這些陽性治療性應(yīng)答以外，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段治療的對象可經(jīng)歷疾病相關(guān)癥狀改善的有益作用。
“治療有效劑量或量”或“有效量”指給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段后，可導(dǎo)致與治療多發(fā)性骨髓瘤患者相關(guān)的陽性治療性應(yīng)答的量。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗-CD40抗體或其片段的治療有效量為約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。應(yīng)知道該治療方法可包括一次給予或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是將拮抗性抗-CD40抗體用作臨床測試過程的一部分來診斷性監(jiān)測組織中蛋白質(zhì)水平，例如用于檢測給定治療方案的有效性。將該抗體與可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)有助于檢測?？蓹z測物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。
拮抗性抗-CD40抗體可與已知的化療聯(lián)用、單獨(dú)使用或與骨髓移植、化療、類固醇和α-干擾素聯(lián)用來治療多發(fā)性骨髓瘤。以此方式，本文所述拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗原結(jié)合片段與至少一種其它癌癥療法聯(lián)用，所述其它療法包括，但不限于放療、化療、α-干擾素療法或類固醇療法，所述其它癌癥療法在抗-CD40抗體療法之前、期間或之后給予。因此，當(dāng)聯(lián)合治療包括聯(lián)合給予抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段和另一種治療性藥物時，例如與放療、化療或用α-干擾素和/或類固醇治療聯(lián)用，本發(fā)明的方法包括以分開的制劑或單一藥物制劑共同給予或以任一順序連續(xù)給予，其中優(yōu)選兩種(或所有)活性物質(zhì)在某時期內(nèi)同時施加它們的治療活性。當(dāng)本發(fā)明的方法包括聯(lián)合治療方案時，可同時進(jìn)行這些治療，即抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時給予或與其它治療相同的時間范圍內(nèi)給予(即，同時進(jìn)行治療，但抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段不是在正好與其它療法相同的時間給予)?；蛘?，本發(fā)明的抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段也可在其它療法之前或之后給予?？身樞蚪o予不同的療劑而不論受治療的對象是否對第一療程起反應(yīng)從而降低了病情緩解或復(fù)發(fā)的可能性。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本文所述的抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與化療、任選與自體骨髓移植聯(lián)合給予，其中抗體和治療性藥物可以任一順序依次給予或同時給予(即，同時或在相同的時間范圍內(nèi)給予)。合適的化療藥物包括，但不限于長春新堿、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、阿霉素和潑尼松或地塞米松。
因此，例如在一個實(shí)施方案中，抗-CD40抗體與美法侖(一種烷化藥物)和類固醇潑尼松(稱為MP)聯(lián)合給予。或者，烷化藥物環(huán)磷酰胺和瘤可寧可替代美法侖與類固醇和本發(fā)明的抗-CD40抗體聯(lián)合給予。當(dāng)對象對MP或其替代品無反應(yīng)或?qū)ο笤贛P治療后復(fù)發(fā)時，本發(fā)明的抗-CD40抗體可與化療方案聯(lián)合給予，所述化療方案包括給予長春新堿、阿霉素和高劑量的地塞米松(也稱為“VAD”)，還可包括共同給予環(huán)磷酰胺。在其它實(shí)施方案中，抗-CD40抗體可與具有抗血管生成性能的另一藥物，例如酞咪哌啶酮或α-干擾素聯(lián)合給予。當(dāng)對象對MP和/或VAD治療耐受時，后面的這些藥物可起作用。在另一個實(shí)施方案中，抗-CD40抗體可與蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米(VelcadeTM)聯(lián)合給予，其中后者給予應(yīng)用上述兩種治療方案后復(fù)發(fā)的和對他們的最后治療方案耐受的對象?；蛘撸?CD40抗體可與高劑量的化療聯(lián)合給予、單獨(dú)給予或與自體骨髓移植聯(lián)合給予對象。
本文所述的抗-CD40抗體還可用于提供試劑(regeant)，例如可用于例如鑒定表達(dá)CD40的細(xì)胞的標(biāo)記的抗體。這在確定未知樣品的細(xì)胞類型時非常有用?？墒褂枚嘟M單克隆抗體來鑒定組織的種類和/或器官類型。這些抗-CD40抗體可以類似的方式用于篩選組織培養(yǎng)細(xì)胞中的污染(即，篩選培養(yǎng)物中是否存在CD40表達(dá)細(xì)胞和非CD40表達(dá)細(xì)胞的混合物)。
藥物制劑和給藥方式本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的給藥濃度可在治療上有效預(yù)防或治療多發(fā)性骨髓瘤。為實(shí)現(xiàn)此目的，可用本領(lǐng)域已知的各種可接受的賦形劑配制此抗體。此抗體一般通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥。實(shí)現(xiàn)此種給藥的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。也可能獲得可局部或口服給藥，或能透過粘膜輸送的組合物。
取決于所施用的抗-CD40抗體，靜脈內(nèi)給藥優(yōu)選通過輸液在約1-10小時期間進(jìn)行，更優(yōu)選約1-8小時，甚至更優(yōu)選約2-7小時、還要優(yōu)選約4-6小時。該藥物組合物的最初輸液可在約4-6小時期間進(jìn)行，后續(xù)輸液可較快遞送。后續(xù)輸液可在約1-6小時期間，例如約1-4小時、約1-3小時或約1-2小時給予。
可將本發(fā)明的藥物組合物配制成與其要采用的給藥途徑相容?？赡艿慕o藥途徑的例子包括胃腸外(例如，靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)(IM)、真皮內(nèi)、皮下(SC)或輸液)、口服和肺部(例如，吸入)、鼻、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸給藥。用于胃腸外、真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可含有以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、不易揮發(fā)的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌試劑，例如芐醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)整張力的試劑，例如氯化鈉和葡萄糖。可用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。胃腸外制劑可包裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
抗-CD40抗體通常用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以藥學(xué)上可接受的緩沖劑提供，例如無菌鹽水、無菌緩沖水、丙二醇、上述物質(zhì)的組合等。納入本文作為參考的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版；Mack PublishingCompany，Eaton，Pennsylvania，1990)描述了制備可胃腸外給予藥物的方法。也參見，例如描述了適用于本發(fā)明方法的穩(wěn)定的抗體藥物制劑的WO98/56418。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不難確定待給予的至少一種抗-CD40抗體或其片段的量而無需過多實(shí)驗(yàn)。影響給藥方式和至少一種拮抗性抗-CD40抗體(或其片段)的各自用量的因素包括，但不限于所治療的具體疾病、疾病的嚴(yán)重性、病史、所治療個體的年齡、身高、體重、健康和身體狀況。類似地，待給予的拮抗性抗-CD40抗體或其片段的用量取決于給藥方式和對象是接受單劑量還是多劑量的該抗腫瘤藥物。隨著所治療患者體重的增加，一般優(yōu)選較高劑量的抗-CD40抗體或其片段。待給予的抗-CD40抗體或其片段的劑量為約0.003mg/kg-50mg/kg、優(yōu)選0.01mg/kg-約40mg/kg。因此，例如劑量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，該方法包括給予多劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其片段。該方法可包括給予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治療有效劑量的含拮抗性抗-CD40抗體或其片段的藥物組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定多劑量的含拮抗性抗-CD40抗體或其片段的藥物組合物的給藥頻率和持續(xù)時間而無需過多的實(shí)驗(yàn)。此外，用治療有效量的抗體治療對象包括單次治療，或優(yōu)選可包括一系列治療。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段以約0.1-20mg/kg體重，每周一次治療約1-10周，優(yōu)選約2-8周、更優(yōu)選約3-7周、甚至更優(yōu)選約4、5或6周。每年進(jìn)行治療以防復(fù)發(fā)或根據(jù)復(fù)發(fā)跡象進(jìn)行治療。也應(yīng)理解，用于治療的抗體或其抗原結(jié)合片段的有效劑量在具體治療期間可增加或降低。根據(jù)本文所述診斷試驗(yàn)的結(jié)果決定劑量的變化。因此，在一個實(shí)施方案中，給藥方案包括在治療期間的第1、7、14和21天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段。在另一個實(shí)施方案中，給藥方案包括在治療期間每周的第1、2、3、4、5、6和7天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段。其它實(shí)施方案包括在治療期間每周的第1、3、5和7天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的給藥方案；包括在治療期間每周的第1和3天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的給藥方案；和在治療期間每周的第1天先給予治療有效量的至少一種抗-CD40抗體或其片段的優(yōu)選給藥方案。治療時期可包括1周、2周、3周、1個月、3個月、6個月或1年。治療時期可連續(xù)或相互隔開1天、1周、2周、1個月、3個月、6個月或1年。
在一些實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量是約0.003mg/kg-50mg/kg、約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約0.5mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。因此，例如，任何一種拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，如抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或它們的抗原結(jié)合片段的劑量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg或在約0.003mg/kg-50mg/kg范圍內(nèi)的其它這種劑量。在整個抗體給藥的每周可給予相同治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。或者，可在治療期間采用不同的治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
在一些實(shí)施方案中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量可在較低的劑量范圍(即，約0.003mg/kg-20mg/kg)內(nèi)，后續(xù)的劑量可在較高的劑量范圍(即，約20mg/kg-50mg/kg)內(nèi)。
在其它實(shí)施方案中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量可在較高的劑量范圍(即，約20mg/kg-50mg/kg)內(nèi)，后續(xù)劑量可在較低的劑量范圍(即，約0.003mg/kg-20mg/kg)內(nèi)。因此，在一個實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量是約20mg/kg-35mg/kg，包括約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg和約35mg/kg，隨后的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量為約5mg/kg-15mg/kg，包括約5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg和約15mg/kg。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體治療先是給予需要拮抗性抗-CD40抗體治療的對象以“負(fù)荷劑量”的抗體或其抗原結(jié)合片段?！柏?fù)荷劑量”指給予對象的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的初始劑量，其中給予的抗體或其抗原結(jié)合片段的劑量在較高的劑量范圍內(nèi)(即，約20mg/kg-50mg/kg)。只要全部的“負(fù)荷劑量”在約24小時期間給予，該“負(fù)荷劑量”可以一次給藥，例如該抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)靜脈內(nèi)一次輸液；或可以多次給藥，例如該抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)靜脈內(nèi)多次輸液。給予“負(fù)荷劑量”后，可給予對象一次或多次額外治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。隨后可按，例如每周給藥時間表、或每兩周一次、每三周一次或每四周一次給予治療有效劑量。在這種實(shí)施方案中，后續(xù)的治療有效劑量在較低的劑量范圍內(nèi)(即，0.003mg/kg-約20mg/kg)。
或者，在一些實(shí)施方案中，給予“負(fù)荷劑量”后，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段按照“維持時間表”給予，其中治療有效劑量的抗體或其抗原結(jié)合片段按每月一次、每六周一次、每兩個月一次、每十周一次、每三個月一次、每十四周一次、每四個月一次、每十八周一次、每五個月一次、每二十二周一次、每六個月一次、每七個月一次、每八個月一次、每九個月一次、每十個月一次、每十一個月一次或每十二個月一次給藥。在這種實(shí)施方案中，特別是當(dāng)隨后的劑量以更高頻率的間隔給藥，例如每兩個月一次到每月一次時，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量在較低劑量范圍內(nèi)(即，0.003mg/kg-約20mg/kg)；或者特別是當(dāng)隨后的劑量以更低頻率的間隔給藥，例如約間隔一個月到約十二個月時，治療有效劑量在較高劑量范圍內(nèi)(即，約20mg/kg-50mg/kg)。
用于本發(fā)明方法的本文所述藥物組合物中的拮抗性抗-CD40抗體可以是天然的或通過重組技術(shù)獲得，可以是任何來源的，包括哺乳動物來源，例如小鼠、大鼠、家兔、靈長類、豬和人。這種多肽優(yōu)選得自人來源，更優(yōu)選得自雜交瘤細(xì)胞系的重組人蛋白。
本發(fā)明方法所用的藥物組合物包含本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的生物活性變體。這種變體應(yīng)該保留天然多肽的生物活性，從而使得當(dāng)將包含變體多肽的藥物組合物給予對象時具有與包含天然多肽的藥物組合物相同的治療作用。即，該變體抗-CD40抗體可以類似于天然拮抗性抗體，例如分別由雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12表達(dá)的5.9或CHIR-12.12觀察到的作用方式作為藥物組合物中的治療活性組分。本領(lǐng)域已建立了可用于確定變體抗-CD40抗體是否保留了所需生物活性從而可用作藥物組合物中治療活性組分的方法。可采用為檢測天然拮抗性抗體活性而特別設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，包括本發(fā)明所述的試驗(yàn)來測定抗體變體的生物活性。
任何包含具有本文所述結(jié)合特性的拮抗性抗-CD40抗體作為活性組分的藥物組合物可用于本發(fā)明的方法。因此，包含一種或多種本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的液體、凍干或噴霧干燥的組合物可根據(jù)本發(fā)明的方法制備用作隨后給予對象的水性或非水性溶液或混懸液。這些組合物中的每種包含至少一種本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體作為治療或預(yù)防活性組分?！爸委熁蝾A(yù)防活性組分”指特別引入該組合物中的抗-CD40抗體，當(dāng)將該藥物組合物給予對象時，可產(chǎn)生治療、預(yù)防或診斷對象疾病或病癥的所需治療性或預(yù)防性應(yīng)答。該藥物組合物優(yōu)選包含合適的穩(wěn)定劑、填充劑，或同時包含二者以最大程度降低制備和儲存期間與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性喪失相關(guān)的問題。
可在包含本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的藥物組合物中加入一些制劑(formulant)。這些制劑包括，但不限于油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖劑、白蛋白、表面活性劑或填充劑。碳水化合物優(yōu)選包括糖或糖醇，例如單糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、α和β環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素或它們的混合物?！疤谴肌倍x為具有羥基的C4-C8烴，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和阿拉伯糖醇。這些糖或糖醇可單獨(dú)或組合使用。糖或糖醇的濃度在1.0％和7％w/v之間，更優(yōu)選在2.0％和6.0％w/v之間。優(yōu)選的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒堿、精氨酸和甜菜堿；然而，也可加入其它氨基酸。優(yōu)選的聚合物包括平均分子量為2,000和3,000之間的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量為3,000和5,000之間的聚乙二醇(PEG)?？杉尤朐撝苿┑谋砻婊钚詣┮姎W洲專利號270,799和268,110。
此外，可通過例如與聚合物共價偶聯(lián)來化學(xué)修飾抗體以增加它們的循環(huán)半衰期。優(yōu)選的聚合物和連接肽的方法見全文納入本文作為參考的美國專利號4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546。優(yōu)選的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫可溶于水并如通式R(O--CH2--CH2)nO--R所示，其中R可以是氫或保護(hù)性基團(tuán)，如烷基或烷醇基團(tuán)。保護(hù)性基團(tuán)優(yōu)選具有1-8個碳原子，更優(yōu)選是甲基。符號n是優(yōu)選1-1,000之間，更優(yōu)選2-500之間的正整數(shù)。PEG優(yōu)選具有平均分子量1,000-40,000、更優(yōu)選2,000-20,000、最優(yōu)選3,000-12,000。PEG優(yōu)選具有至少一個羥基、更優(yōu)選是末端羥基。優(yōu)選激活該羥基以和抑制劑上的游離氨基反應(yīng)。然而，應(yīng)理解可改變反應(yīng)基團(tuán)的類型和數(shù)量以獲得共價偶聯(lián)的PEG/本發(fā)明的抗體。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本發(fā)明。它們包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)。優(yōu)選POG。原因之一是聚氧乙基化甘油的骨架與例如動物和人的單、二、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，該分支在體內(nèi)不會被視作外來物質(zhì)。POG的優(yōu)選分子量與PEG的相同。POG的結(jié)構(gòu)見Knauf等，(1988)，J.Bio.Chem.26315064-15070，美國專利號4,766,106描述了POG/IL-2偶聯(lián)物，兩篇文獻(xiàn)均全文納入本文作為參考。
另一種增加循環(huán)半衰期的藥物遞送系統(tǒng)是脂質(zhì)體。制備脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的方法見Gabizon等，(1982)，Cancer Research 424734；Cafiso(1981)，BiochemBiophys Acta 649129和Szoka(1980)，Ann.Rev.Bioplays.Eng.9467所述。本領(lǐng)域已知的其它藥物遞送系統(tǒng)描述見，例如Poznansky等，(1980)，《藥物遞送系統(tǒng)》(Drug Delivery Systems)，(R.L.Juliano編，Oxford，N.Y.)，第253-315頁；Poznansky，(1984)，Pharm Revs 36277。
引入藥物組合物中的制劑應(yīng)使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段穩(wěn)定。即，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)保留其物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性并具有所需生物活性，即，一種或多種本文以上定義的拮抗活性，包括但不限于抑制T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞存活和/或增殖；抑制CD40L表達(dá)細(xì)胞或可溶CD40配體(sCD40L)刺激的正常人外周B細(xì)胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固態(tài)CD40L刺激的任何細(xì)胞中“存活性”抗-凋亡胞內(nèi)信號；抑制結(jié)合sCD40L或固態(tài)CD40L后任何細(xì)胞中的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；和抑制本文它處所述人惡性B細(xì)胞的增殖。
監(jiān)測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如Jones，(1993)Adv.Drug Delivery Rev.1029-90；Lee編，(1991)，《肽和蛋白質(zhì)藥物遞送》(Peptide and Protein Drug Delivery)，(Marcel Dekker，Inc.，紐約，紐約)和本文公開的穩(wěn)定性試驗(yàn)。通常在所選擇的溫度下，測定蛋白質(zhì)在一段特定時期內(nèi)的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在室溫(約25℃)儲存至少1個月、至少3個月、或至少6個月，和/或在約2-8℃儲存至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月時，穩(wěn)定的抗體藥物制劑將使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段穩(wěn)定。
當(dāng)將某種蛋白質(zhì)，例如抗體配制入藥物組合物時，如果在該藥物組合物中未出現(xiàn)沉淀、凝聚和/或變性的可見跡象(即，變色或澄清度喪失)或可測跡象(例如，采用體積排阻層析(SEC)或紫外光散射法)時，則可認(rèn)為該蛋白質(zhì)在給定時間點(diǎn)保留了其物理穩(wěn)定性。就化學(xué)穩(wěn)定性而言，當(dāng)將某種蛋白質(zhì)，例如抗體配制入藥物組合物時，如果化學(xué)穩(wěn)定性的測定顯示該蛋白質(zhì)(即，抗體)在該藥物組合物中保留了其感興趣的生物活性，則可認(rèn)為該蛋白質(zhì)保留了其化學(xué)穩(wěn)定性。測定化學(xué)穩(wěn)定性變化的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于用例如SDS-PAGE、SEC和/或襯質(zhì)輔助激光解析與電離-飛行時間質(zhì)譜檢測因剪切所致蛋白質(zhì)的化學(xué)改變形式的方法；和用例如離子交換色譜檢測與分子荷電改變相關(guān)(例如，與脫氨基相關(guān))的降解的方法。參見，例如下文所述的方法。
當(dāng)將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段配制入藥物組合物時，如果在給定時間的所需生物活性處于該藥物組合物制備之時用所需生物活性的合適試驗(yàn)檢測到的所需生物活性的約30％以內(nèi)，優(yōu)選約20％以內(nèi)，則可認(rèn)為所述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在該時間點(diǎn)保留了所需生物活性。檢測拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的所需生物活性的試驗(yàn)可如本文的實(shí)施例所述進(jìn)行。也參見納入本文作為參考的以下文獻(xiàn)所述的試驗(yàn)Schutze等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928200-8204；Denton等，(1998)，PediatrTransplant.26-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164688-697；Noelle，(1998)，Agents Actions Suppl.4917-22；Lederman等，(1996)，CurrOpin.Hematol.377-86；Coligan等，(1991)，Current Protocols in Immunology1312；Kwekkeboom等，(1993)Immunology 79439-444；和美國專利號5,674,492和5,847,082。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段配制入液體藥物制劑中。拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段可用本領(lǐng)域已知的任何方法，包括上文公開的方法制備。在一個實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段在CHO細(xì)胞系中重組產(chǎn)生。
拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段制備和純化后可以本文所述方式配制為液體藥物制劑。當(dāng)拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在配制前要保存時，可在，例如≤-20℃冷凍，然后于室溫融化作進(jìn)一步配制。該液體藥物制劑含有治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。該制劑中的抗體或其抗原結(jié)合片段的用量要考慮給藥途徑和所需劑量體積。
在此方式中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段約0.1mg/ml-50.0mg/ml、約0.5mg/ml-40.0mg/ml、約1.0mg/ml-30.0mg/ml、約5.0mg/ml-25.0mg/ml、約5.0mg/ml-20.0mg/ml或約15.0mg/ml-25.0mg/ml。在一些實(shí)施方案中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段約0.1mg/ml-5.0mg/ml、約5.0mg/ml-10.0mg/ml、約10.0mg/ml-15.0mg/ml、約15.0mg/ml-20.0mg/ml、約20.0mg/ml-25.0mg/ml、約25.0mg/ml-30.0mg/ml、約30.0mg/ml-35.0mg/ml、約35.0mg/ml-40.0mg/ml、約40.0mg/ml-45.0mg/ml或約45.0mg/ml-50.0mg/ml。在其它實(shí)施方案中，該液體藥物組合物包含以下濃度的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段約15.0mg/ml、約16.0mg/ml、約17.0mg/ml、約18.0mg/ml、約19.0mg/ml、約20.0mg/ml、約21.0mg/ml、約22.0mg/ml、約23.0mg/ml、約24.0mg/ml或約25.0mg/ml。該液體藥物組合物包含拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段和維持該制劑的pH于約pH5.0-pH 7.0的緩沖劑，所述pH包括約pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0和約pH 5.0-pH 7.0范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑可維持制劑的pH于約pH 5.0-pH 6.5、約pH 5.0-pH 6.0、約pH 5.0-pH 5.5、約pH 5.5-7.0、約pH 5.5-pH 6.5或約pH 5.5-pH 6.0的范圍。
可在該制劑中采用維持液體抗-CD40抗體制劑的pH約pH 5.0-pH 7.0范圍的任何合適緩沖劑，只要所述抗體保留上述理化穩(wěn)定性和所需生物活性。合成的緩沖劑包括，但不限于常規(guī)的酸及它們的鹽，其中反荷離子可以是，例如鈉、鉀、銨、鈣或鎂。用于緩沖該液體藥物制劑的常規(guī)酸及它們的鹽的例子包括，但不限于琥珀酸或琥珀酸鹽、檸檬酸或檸檬酸鹽、乙酸或乙酸鹽、酒石酸或酒石酸鹽、磷酸或磷酸鹽、葡糖酸或葡糖酸鹽、谷氨酸或谷氨酸鹽、天冬氨酸或天冬氨酸鹽、馬來酸或馬來酸鹽和蘋果酸或蘋果酸鹽。該制劑中緩沖劑的濃度可以是約1mM-50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在約1mM-50mM范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，該制劑中緩沖劑的濃度可以是約5mM-15mM，包括約5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM或在約5mM-15mM范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和琥珀酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑，所述緩沖劑的濃度可維持該制劑的pH于約pH 5.0-pH 7.0、優(yōu)選約pH 5.0-pH 6.5。“琥珀酸鹽緩沖劑”或“檸檬酸鹽緩沖劑”指分別含有琥珀酸鹽或檸檬酸鹽的緩沖劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，琥珀酸鹽或檸檬酸鹽反荷離子分別是鈉陽離子，因此該緩沖劑分別是琥珀酸鈉或檸檬酸鈉。然而，預(yù)計(jì)任何陽離子均有效。其它可能的琥珀酸鹽或檸檬酸鹽陽離子包括，但不限于鉀、銨、鈣和鎂。如上所述，該制劑中琥珀酸鹽和檸檬酸鹽緩沖劑的濃度可以是約1mM-50mM，包括約1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或在約1mM-50mM范圍內(nèi)的其它這種數(shù)值。在一些實(shí)施方案中，該制劑中緩沖劑的濃度可以是約5mM-15mM，包括約5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或約15mM。在其它實(shí)施方案中，液體藥物組合物包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；和濃度為約1mM-20mM、約5mM-15mM，優(yōu)選約10mM的琥珀酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑，例如琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖劑。
該液體藥物制劑接近等滲是理想的，該液體藥物制劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和維持制劑的pH于約pH 5.0-pH 7.0內(nèi)的緩沖劑外，還可包含其量足以使得該制劑接近等滲的等滲劑?！敖咏葷B”指水性制劑具有以下重量克分子的滲透濃度約240mmol/kg-360mmol/kg、優(yōu)選約240-340mmol/kg、更優(yōu)選約250-330mmol/kg、再要優(yōu)選約260-320mmol/kg、還要優(yōu)選約270-310mmol/kg。確定溶液等滲性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見，例如Setnikar等，(1959)，J.Am.Pharm.Assoc.48628。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉用于提供藥物組合物等滲性的各種藥學(xué)上可接受的溶質(zhì)。等滲劑可以是能將本發(fā)明液體藥物制劑的滲透壓調(diào)節(jié)至與體液的滲透壓接近等值的任何試劑。使用生理上可接受的等滲劑是理想的。因此，該液體藥物制劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和維持制劑的pH于約pH 5.0-pH7.0內(nèi)的緩沖劑外，還可包含用于提供等滲性的組分，例如氯化鈉；氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)包括，但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘油、山梨醇和木糖醇；乙酸，其它有機(jī)酸或它們的鹽，和用量相對較少的檸檬酸鹽或磷酸鹽。普通技術(shù)人員知道適合提供該液體制劑最佳等滲性的其它試劑。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該液體藥物制劑除了包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段和維持制劑的pH于約pH 5.0-pH 7.0內(nèi)的緩沖劑外，還可包含作為等滲劑的氯化鈉。制劑中氯化鈉的濃度取決于其它組分對張力的作用。在一些實(shí)施方案中，氯化鈉的濃度是約50mM-300mM、約50mM-250mM、約50mM-200mM、約50mM-175mM、約50mM-150mM、約75mM-175mM、約75mM-150mM、約100mM-175mM、約100mM-200mM、約100mM-150mM、約125mM-175mM、約125mM-150mM、約130mM-170mM、約130mM-160mM、約135mM-155mM、約140mM-155mM或約145mM-155mM。在一個這樣的實(shí)施方案中，氯化鈉的濃度是約150mM。在其它這樣的實(shí)施方案中，氯化鈉的濃度是約150mM，緩沖劑是濃度為約5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖劑，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，該制劑的pH為約pH 5.0-pH 7.0、約pH 5.0-pH 6.0或約pH 5.5-pH 6.5。在其它實(shí)施方案中，該液體藥物制劑包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，約150mM的氯化鈉和約10mM的琥珀酸或檸檬酸鈉，pH為約pH 5.5。
可在制劑中加入表面活性劑以降低溶液-空氣界面的表面張力而抑制本發(fā)明液體藥物制劑在加工過程中由于凍融或機(jī)械剪切力所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)降解。因此，在一些實(shí)施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，維持制劑的pH于約pH 5.0-pH 7.0內(nèi)的緩沖劑，還包含表面活性劑。在其它實(shí)施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，維持制劑的pH于約pH 5.0-pH 7.0內(nèi)的緩沖劑，等滲劑，例如濃度為約50mM-300mM的氯化鈉，還包含表面活性劑。
采用的典型表面活性劑是非離子型表面活性劑，包括聚氧乙烯山梨醇酯，例如聚山梨酸酯80(吐溫80)和聚山梨酸酯20(吐溫20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，例如Brij 35；二甲硅油；聚乙二醇，例如PEG400；溶血磷脂酰膽堿；和聚氧乙烯-對-叔-辛酚，例如TritonX-100。表面活性劑或乳化劑經(jīng)典藥物穩(wěn)定作用的描述見，例如納入本文作為參考的Levine等，(1991)，J.Parenteral Sci.Technol.45(3)160-165。用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨酸酯80。當(dāng)制劑中包含表面活性劑時，一般按以下量加入約0.001％-1.0％(w/v)、約0.001％-0.5％、0.001％-0.4％、約0.001％-0.3％、約0.001％-0.2％、約0.005％-0.5％、約0.005％-0.2％、約0.01％-0.5％、約0.01％-0.2％、約0.03％-0.5％、約0.03％-0.3％、約0.05％-0.5％或約0.05％-0.2％。
因此，在一些實(shí)施方案中，該液體藥物制劑包含治療有效量的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；緩沖劑是濃度為約1mM-50mM、約5mM-25mM或約5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖劑；制劑的pH為約pH 5.0-pH 7.0、約pH 5.0-pH 6.0或約pH 5.5-pH 6.5；該制劑還包含用量為約0.001％-1.0％或約0.001％-0.5％的表面活性劑，例如聚山梨酸酯80。這種制劑任選可包含等滲劑，例如濃度為約50mM-300mM、約50mM-200mM或約50mM-150mM的氯化鈉。在其它實(shí)施方案中，該液體藥物制劑包含濃度為約0.1mg/ml-50.0mg/ml或約5.0mg/ml-25.0mg/ml，包括約20.0mg/ml的拮抗性抗-CD40抗體，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；約50mM-200mM的氯化鈉；約5mM-20mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉，包括約10mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉；濃度為約50mM-200mM的氯化鈉；和任選的用量為約0.001％-1.0％，包括約0.001％-0.5％的表面活性劑，例如聚山梨酸酯80；其中液體藥物制劑的pH為約pH 5.0-pH 7.0、約pH 5.0-pH 6.0、約pH5.0-pH 5.5、約pH 5.5-pH 6.5或約pH5.5-pH 6.0。
該液體藥物制劑可基本上不含任何防腐劑和其它載體、賦形劑或本文上述的穩(wěn)定劑?；蛘?，該制劑可包含一種或多種防腐劑，例如抗細(xì)菌劑，藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或本文上述的穩(wěn)定劑，前提是它們對拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的理化穩(wěn)定性無不利影響?？山邮艿妮d體、賦形劑和穩(wěn)定劑的例子包括，但不限于加入的緩沖試劑，助溶劑，表面活性劑，抗氧化劑，包括維生素C和甲硫氨酸，螯合劑，例如EDTA、金屬復(fù)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)和生物可降解的聚合物，例如聚酯。關(guān)于制劑和選擇藥學(xué)上可接受的載體、穩(wěn)定劑和等滲劑(isomolytes)的詳盡討論見納入本文作為參考的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s PharmaceuticalSciences)，(第18版；Mack Publishing Company，Eaton，Pennsylvania，1990)。
可凍干本文所述的液體藥物制劑或其它藥物組合物制備后以防降解。凍干液體組合物的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。使用前，組合物可用含有其它成分的無菌稀釋劑(例如林格溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重建。重建后，組合物優(yōu)選用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法給藥。
拮抗性抗-CD40抗體在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用本發(fā)明也提供拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療CLL對象的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與至少一種其它癌癥療法合作起作用?！昂献鳌敝杆鏊幬镌谟弥辽僖环N其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。其它癌癥療法的例子包括，但不限于手術(shù)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于氟達(dá)拉濱或鹽酸氟達(dá)拉濱、瘤可寧、長春新堿、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷(cladribine)、環(huán)磷酰胺、阿霉素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環(huán)類的方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)、VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用于化療的其它細(xì)胞毒性和/或治療性藥物，如米托蒽醌、道諾紅菌素、依達(dá)比星、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱；其它抗癌癥單克隆抗體療法(例如，阿來組單抗(alemtuzumab)(Campath_)或其它靶向惡性B細(xì)胞上CD52細(xì)胞表面糖蛋白的抗-CD52抗體；利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan_)、完整的人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗(tositumomab)/I-131托西莫單抗(Bexxar_)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)(Zevalin_)或任何其它靶向惡性B細(xì)胞上CD20抗原的治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(例如，MT103，雙特異性抗體)；抗-CD22抗體(例如，人源化單克隆抗體epratuzumab)；貝伐單抗(bevacizumab)(Avastinu_)或其它靶向人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的抗癌癥抗體；靶向惡性B細(xì)胞上CD22抗原的抗-CD22抗體(例如，單克隆抗體BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬細(xì)胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發(fā)性骨髓瘤中過度表達(dá)的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細(xì)胞上CD23抗原的抗-CD23抗體(例如，IDEC-152)；靶向惡性B細(xì)胞上CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達(dá)于惡性B細(xì)胞上主要組織相容性復(fù)合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細(xì)胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(例如，SGN-40)；和靶向表達(dá)于許多實(shí)體腫瘤和造血來源的腫瘤上腫瘤壞死因子相關(guān)促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)的抗體(例如，激動性人單克隆抗體HGS-ETR1))；基于小分子的癌癥療法，所述小分子包括但不限于微管和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀(dolastatin)和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL119；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達(dá)莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide_(酞咪哌啶酮)、酞咪哌啶酮的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白質(zhì)激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導(dǎo)惡性淋巴細(xì)胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱、癌細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)Bcl-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense_)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細(xì)胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox_(三氧化砷)和Xcytrin_(莫特沙芬釓)；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個性化的免疫療法或活性獨(dú)特型免疫療法(例如，MyVax_Personalized Immunothcrapy，以前命名為GTOP-99)、Promues_(CpG 7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動劑)、干擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；類固醇療法；或其它癌癥療法；其中用其它癌癥療法治療可在用包含上述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療對象之前、期間或之后給予。
因此，例如在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與化療治療合作起作用，所述化療藥物選自長春新堿、阿霉素、BCNU、美法侖、環(huán)磷酰胺、阿霉素和潑尼松或地塞米松。在一個實(shí)施方案中，化療是美法侖加潑尼松；在其它實(shí)施方案中，化療是VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與用至少一種選自以下的其它抗癌癥抗體的治療合作起作用完整的人抗體HuMax-CD20、靶向巨噬細(xì)胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發(fā)性骨髓瘤中過度表達(dá)的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細(xì)胞上CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達(dá)于惡性B細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細(xì)胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(例如，SGN-40)；靶向表達(dá)于許多造血來源的腫瘤上的腫瘤壞死因子相關(guān)促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)(例如，激動性人單克隆抗體HGS-ETR1)和TRAIL-R2的抗體；和它們的任何組合；其中所述藥物在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用；或者就多次組合治療而言，可在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。
在還有其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與用至少一種基于選自以下的小分子的癌癥療法的治療合作起作用Thalomide_(酞咪哌啶酮)、酞咪哌啶酮的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細(xì)胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox_(三氧化砷)；和它們的任何組合；其中所述藥物在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用；或者就多次組合治療而言，可在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。
本發(fā)明也提供拮抗性抗-CD40抗體，例如本文公開的單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物可用于已預(yù)先采用至少一種其它癌癥療法治療過的對象?！邦A(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物之前，對象已接受一種或多種其它癌癥療法(即，已用至少一種其它癌癥療法治療過)?！邦A(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗體，例如本文公開的單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原結(jié)合片段的藥物治療開始前的以下時間內(nèi)曾采用至少一種其它癌癥療法治療過的對象2年、18個月、1年、6個月、2個月、6周、1個月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。對象無需對先前一種或多種癌癥療法產(chǎn)生反應(yīng)。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物的對象可以對先前癌癥療法或一種或多種先前癌癥療法(當(dāng)預(yù)先治療由多種療法組成時)產(chǎn)生反應(yīng)或不產(chǎn)生反應(yīng)(即，癌癥難控制)。對象在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物之前可接受的其它癌癥療法的例子包括，但不限于手術(shù)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于上文所列的藥物；其它抗癌癥單克隆抗體療法，包括但不限于上文所列的抗癌癥抗體；基于小分子的癌癥療法，包括但不限于上文所列的小分子；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于上文所列的；類固醇療法；其它癌癥療法；或它們的任何組合。
本文將合作使用本文所述的藥物和一種或多種本文定義的其它癌癥療法的“治療”定義為將所述藥物或其它癌癥療法應(yīng)用于或給予對象，或?qū)⑺鏊幬锘蚱渌┌Y療法應(yīng)用于或給予對象的分離的組織或細(xì)胞系，所述對象患有多發(fā)性骨髓瘤、具有這種癌癥相關(guān)的癥狀，或患這種癌癥的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響癌癥、癌癥相關(guān)癥狀、或發(fā)生癌癥的易感性。
提供以下實(shí)施例是為了說明，絕非限制。
實(shí)驗(yàn)導(dǎo)言用于以下實(shí)施例的拮抗性抗-CD40抗體是5.9和CHIR-12.12。5.9和CHIR-12.12抗-CD40抗體是通過免疫攜帶人IgG1重鏈基因座和人K輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠(XenoMouse_technology(Abgenix；Fremont，California))產(chǎn)生的人IgG1亞型抗-人CD40單克隆抗體(mAb)。表達(dá)CD40胞外結(jié)構(gòu)域的SF9昆蟲細(xì)胞用作免疫原。
簡言之，如先前de Boer等，(1988)，J.Immunol.Meth.113143所述，用50％聚乙二醇使免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0或P3×63Ag8.653鼠骨髓瘤細(xì)胞以10∶1的比例融合。將融合細(xì)胞重懸于添加了次黃嘌呤(0.1mM)、氨基喋呤(0.01mM)、胸苷(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)的完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)基中。然后將融合細(xì)胞分置于96-孔組織培養(yǎng)板的孔中，平均每孔含有一個生長中的雜交瘤(細(xì)胞)。
10-14天后，篩選雜交瘤細(xì)胞群的上清液看其有無特異性抗體產(chǎn)生。為篩選雜交瘤克隆產(chǎn)生的特異性抗體，合并各孔上清液并先用ELISA檢測抗-CD40特異性活性。然后將陽性(雜交瘤細(xì)胞)用標(biāo)準(zhǔn)FACS試驗(yàn)作EBV-轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的熒光細(xì)胞染色。通過用含有0.5ng/ml hIL-6的IMDM/FBS作有限稀釋克隆陽性雜交瘤細(xì)胞兩次。
總共31個小鼠脾(細(xì)胞)與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合得到895個在ELISA中能識別重組CD40的抗體。使用Abgenix XenoMouse_技術(shù)(Abgenix；Fremont，California))產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞平均約10％含有小鼠λ輕鏈替代了人κ鏈。選出含有小鼠輕λ鏈的抗體。選出同樣顯示能與細(xì)胞表面CD40結(jié)合的260個抗體亞組用于進(jìn)一步分析。將在一系列亞克隆過程中選出的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞用于結(jié)合和功能試驗(yàn)作進(jìn)一步鑒定。該選擇方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，可分別參見2003年11月4日，2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為“拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的用法”的待批臨時申請，和轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))，60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，它們的內(nèi)容均納入本文作為參考。
7個其它雜交瘤的克隆經(jīng)鑒定具有拮抗活性。根據(jù)它們的相對拮抗能力和ADCC活性，選出兩個雜交瘤細(xì)胞克隆作進(jìn)一步評價(下表1)。它們命名為131.2F8.5.9(5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(12.12)。
表1.抗-CD40IgG1抗體5.9和CHIR-12.12的最初一組數(shù)據(jù)小結(jié)
小鼠雜交瘤細(xì)胞系131.2F8.5.9(CMCC#；12047)和雜交瘤細(xì)胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#；12056)由美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC；10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209(USA))分別以專利保藏號PTA-5542和PTA-5543保藏。
將編碼該候選抗體可變區(qū)的cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、克隆和測序。CHIR-12.12抗體輕鏈和重鏈的氨基酸序列分別示于圖1A和1B。也參見SEQ ID NO2(mAb CHIR-12.12的輕鏈)和SEQ ID NO4(mAb CHIR-12.12的重鏈)。mAb CHIR-12.12重鏈的變體示于圖1B(也參見SEQ ID NO5)，其與SEQ ID NO4的區(qū)別在于SEQ ID NO4的153位用絲氨酸殘基取代了丙氨酸殘基。編碼CHIR-12.12抗體的輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別示于圖2A和2B。也參見SEQ ID NO1(mAb CHIR-12.12輕鏈的編碼序列)和SEQID NO3(mAb CHIR-12.12重鏈的編碼序列)。5.9抗體輕鏈和重鏈的氨基酸序列分別示于圖3A和3B。也參見SEQ ID NO6(mAb CHIR-5.9的輕鏈)和SEQ ID NO7(mAb CHIR-5.9的重鏈)。mAb 5.9重鏈的變體示于圖3B(也參見SEQ ID NO8)，其與SEQ ID NO7的區(qū)別在于在SEQ ID NO7的158位用絲氨酸殘基取代了丙氨酸殘基。
得自獨(dú)立雜交瘤的抗體如預(yù)計(jì)的那樣在互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列中有本質(zhì)的改變。據(jù)信，VH的CDR3區(qū)中的多樣性對決定抗體特異性最重要。
如FACS分析所示，5.9和CHIR-12.12能特異性結(jié)合人CD40并阻止CD40-配體結(jié)合。這兩種mAb均能競爭去除預(yù)先和細(xì)胞表面CD40結(jié)合的CD40-配體。5.9與人CD40的結(jié)合親和力是1.2×10-8M，CHIR-12.12與人CD40的結(jié)合親和力是5×10-10M。
CHIR-12.12和5.9單克隆抗體是強(qiáng)拮抗劑，在體外能抑制CD40配體-介導(dǎo)的正常B細(xì)胞增殖以及在體外抑制CD40配體-介導(dǎo)的NHL和CLL患者的癌細(xì)胞增殖。在體外，兩種抗體通過ADCC殺傷NHL患者的初級(primary)癌細(xì)胞。在異種移植人淋巴瘤模型中觀察到劑量依賴的抗腫瘤活性。對這些結(jié)果和獲得這些結(jié)果所用試驗(yàn)的更詳細(xì)描述可分別參見2003年11月4日，2003年11月26日和2004年4月27日提交的名為“拮抗性抗-CD40單克隆抗體及它們的用法”的待批臨時申請，和轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理人審理號PP20107.001(035784/258442))，60/525,579(代理人審理號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人審理號PP20107.003(035784/277214))，它們的內(nèi)容均全文納入本文作為參考。
進(jìn)行了一些研究來確定拮抗性抗-CD40mAb 5.9和CHIR-12.12是否顯示以下性能(1)與多發(fā)性骨髓瘤患者細(xì)胞結(jié)合(采用流式細(xì)胞術(shù)測定)；(2)通過阻斷CD40-配體誘導(dǎo)的存活信號促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤患者細(xì)胞的細(xì)胞死亡；(3)自身對多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞具有刺激/抑制活性；和/或(4)介導(dǎo)ADCC作為一種作用方式。
實(shí)施例1mAb 5.9和CHIR-12.12與MM患者的CD40+多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞結(jié)合FITC標(biāo)記的抗-CD40 mAb 5.9和CHIR-12.12與對照FITC-標(biāo)記的人IgG1作多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞染色。得自8位患者的CD40+MM細(xì)胞與FITC-標(biāo)記的抗-CD40 mAb 5.9或CHIR-12.12或FITC-標(biāo)記的人IgG1孵育。用FACSCAN V(Becton Dickinson，San Jose，California)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。
實(shí)施例2抗-CD40 mAb 5.9和CHIR-12.12阻斷多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞中CD40配體-介導(dǎo)的存活信號得自8位患者的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞在以下條件下獨(dú)立地與拮抗性抗-CD40 mAb 5.9或CHIR-12.12和對照人IgG1培養(yǎng)
72小時后按照以下步驟分析培養(yǎng)物·通過PI和Annexine V染色計(jì)數(shù)存活的細(xì)胞并測定細(xì)胞死亡·用氚化的胸苷脈沖過夜來測定增殖實(shí)施例3評價抗-CD40mAb對多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞的刺激/抑制活性8位患者的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞在存在抗-CD40 mAb CHIR-12.12或5.9時，使用IgG作為對照，按以下條件培養(yǎng)
72小時后按照以下步驟分析培養(yǎng)物·通過PI和Annexine V染色計(jì)數(shù)存活細(xì)胞并測定細(xì)胞死亡·用氚化的胸苷脈沖過夜來測定增殖實(shí)施例4抗-CD40 mAb CHIR-12.12和5.9通過抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)裂解患者的多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞的能力8位患者的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞在以下條件下獨(dú)立地與拮抗性抗-CD40mAb 5.9或CHIR-12.12和對照人IgG1培養(yǎng)
4小時后，通過檢測釋放的51Cr或熒光染料的水平計(jì)算特異性細(xì)胞裂解。
實(shí)施例5與15B8相比，5.9和CHIR-12.12和CD40上的不同表位結(jié)合候選單克隆抗體5.9和CHIR-12.12能互相競爭與CD40的結(jié)合，但不與15B8，一種IgG2抗-CD40 mAb(參見國際公布號WO02/28904)競爭。利用CM5生物傳感器芯片設(shè)計(jì)了使用Biacore的抗體競爭結(jié)合試驗(yàn)，所述芯片含有經(jīng)氨基偶聯(lián)而固定的蛋白質(zhì)A用于捕捉抗-CD40、CHIR-12.12或15B8。用不同濃度的CD40-his觀察到正常的締合/解離結(jié)合曲線(數(shù)據(jù)未顯示)。就競爭研究而言，CHIR-12.12或15B8均被捕捉于蛋白質(zhì)A表面。然后使不同濃度的CD40-his/5.9 Fab復(fù)合物(100nM CD401μM 5.9Fab)流過該修飾的表面。就CHIR-12.12而言，未觀察到復(fù)合物的締合，表明5.9阻斷了CHIR-12.12與CD40-his的結(jié)合。就15B8而言，觀察到Fab 5.9復(fù)合物的締合，表明5.9不阻斷15B8與CD40結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。然而，該復(fù)合物的解離速率(off rate)顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
也證明了15B8和CHIR-12.12不競爭與CD40-his結(jié)合。該實(shí)驗(yàn)步驟如下用蛋白質(zhì)A生物傳感器芯片捕捉CHIR-12.12、用對照IgG1封閉殘留的蛋白質(zhì)A位點(diǎn)、結(jié)合CD40-his然后使15B8流過該修飾的表面。15B8在這些條件下確實(shí)有結(jié)合，表明CHIR-12.12不阻斷15B8與CD40的結(jié)合。
實(shí)施例6CHIR-12.12和5.9mAb的結(jié)合性能將蛋白質(zhì)A經(jīng)氨基偶聯(lián)而固定于CM5生物傳感器芯片上。將1.5μg/ml的人抗-CD40單克隆抗體在1.5分鐘內(nèi)以10μl/分鐘(流過)被捕捉在此修飾的生物傳感器表面上。使不同濃度的重組可溶性CD40-his流過該生物傳感器表面。用0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性劑P20(HBS-EP)稀釋抗體和抗原。用Biaevaluation軟件以1∶1相互作用模型/球形擬合(global fit)測定動力學(xué)和親和力常數(shù)。
如下表2所示，5.9和CHIR-12.12的解離速率有121倍差異，這導(dǎo)致CHIR-12.12的親和力高24倍。
實(shí)施例7單克隆抗體CHIR-12.12和5.9表位的鑒定為確定單克隆抗體CHIR-12.12和5.9識別的CD40表位的位置，進(jìn)行了SDS-PAGE和Western印跡分析。在還原和非還原條件下在4-12％NUPAGE凝膠上分離純化的CD40(0.5μg)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用10μg/ml濃度的單克隆抗體檢測。印跡以堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗-人IgG檢測并用堿性磷酸酶的Western BlueR穩(wěn)定底物(Promega)顯色。
結(jié)果表明抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12同時識別非還原和還原形式CD40上的表位，與非還原形式的CD40結(jié)合的強(qiáng)度顯著高于還原形式的CD40(表3；印跡未顯示)。兩種形式的CD40的識別均是陽性表明該抗體能與部分是線性序列的構(gòu)象表位相互作用。單克隆抗體5.9主要識別非還原形式的CD40，提示該抗體主要與構(gòu)象表位相互作用(表3；印跡未顯示)。
表3.結(jié)構(gòu)域鑒定
為勘察CD40上的抗原性區(qū)域，克隆了CD40的4個胞外結(jié)構(gòu)域并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)為GST融合蛋白。GP67分泌信號肽保證了這四個結(jié)構(gòu)域的分泌。昆蟲細(xì)胞上清液經(jīng)SDS-PAGE和Western印跡來鑒定到含有表位的結(jié)構(gòu)域。
單克隆抗體CHIR-12.12能在還原和非還原條件下識別結(jié)構(gòu)域2上的一個表位(表4；印跡未顯示)。相反，單克隆抗體5.9顯示對結(jié)構(gòu)域2的識別非常微弱(表4；印跡未顯示)。在該項(xiàng)分析中，這些抗體均不識別結(jié)構(gòu)域1、3或4。
表4.結(jié)構(gòu)域2分析
為精確地確定mAb CHIR-12.12所識別的表位，合成了對應(yīng)于以下序列的CD40的胞外結(jié)構(gòu)域2的肽PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基61-104)。制備了含有35個10mer肽和1-氨基酸旁支(offset)的SPOT膜(Sigma)。用mAb CHIR-12.12和抗-人IgGβ-半乳糖苷酶作為二抗進(jìn)行Western印跡分析。剝下印跡用mAb 5.9再檢測來確定該抗體識別的區(qū)域。
用10μg/ml的抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12檢測作SPOT分析，點(diǎn)18-22得到陽性反應(yīng)。這些肽覆蓋區(qū)域的序列示于表5。
表5.用抗-CD40單克隆抗體CHIR-12.12檢測作SPOT分析的結(jié)果
這些結(jié)果對應(yīng)于線性表位YCDPNL(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基82-87)。該表位含有預(yù)計(jì)參與CD40-CD40配體相互作用的Y82、D84和N86。
用mAb 5.9作SPOT分析顯示，其對表6所示點(diǎn)20-22代表的肽識別弱，提示區(qū)域YCDPNLGL(SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示序列的殘基82-89)參與了mAb 5.9與CD40的結(jié)合。應(yīng)注意的是，在BIACORE分析中mAbs CHIR-12.12和5.9可相互競爭與CD40的結(jié)合。
表6.用抗-CD40單克隆抗體5.9檢測的SPOT的結(jié)果
SPOT分析鑒定到的線性表位位于CD40 B1模塊中。CD40 B1模塊的該序列是HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC(SEQ ID NO10或12的殘基80-103)。
在此線性表位中CHIR-12.12鑒定的是C83。已知該半胱氨酸殘基與C103形成二硫鍵。CHIR-12.12 mAb識別的構(gòu)象表位可能含有該二硫鍵(C83-C103)和/或構(gòu)象上接近C103的環(huán)繞氨基酸。
實(shí)施例8CHIR-12.12阻斷正常人B細(xì)胞中CD40L-介導(dǎo)的CD40存活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可溶性CD40配體(CD40L)能激活B細(xì)胞誘導(dǎo)各種功能性應(yīng)答，包括提高存活和增殖，激活NFκB、ERK/MAPK、PI3K/Akt，和p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外，CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激通過減少正常B細(xì)胞中切割的PARP和誘導(dǎo)抗凋亡蛋白、XIAP和Mcl-1提供存活信號。CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激也募集TRAF2和TRAF3結(jié)合CD40胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
以下研究證明CHIR-12.12能直接抑制對正常B細(xì)胞的所有這些作用。例如，CHIR-12.12處理以時間和劑量依賴方式導(dǎo)致胱冬酶-9、胱冬酶-3和PARP切割增加以及XIAP和Mcl-1減少，恢復(fù)B細(xì)胞凋亡。用CHIR-12.12處理在對CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激的反應(yīng)中也抑制IκB激酶(IKK)α和β(NFκB途徑)、ERK、Akt和p38的磷酸化。此外，發(fā)現(xiàn)沒有最初的CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激時，CHIR-12.12不激發(fā)這些凋亡作用。
CHIR-12.12通過誘導(dǎo)PARP切割抑制CD40配體介導(dǎo)的存活在這些實(shí)驗(yàn)中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻(xiàn)血者(donor)的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。于0、20分鐘、2小時、6小時、18小時和26小時收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中切割的胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3、切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，觀察到CD40L-介導(dǎo)的CD40刺激提供了存活信號，因?yàn)槲磳?dǎo)致胱冬酶-9、切割的胱冬酶-3或切割的PARP隨時間而增加，表明細(xì)胞未經(jīng)歷凋亡。然而，用CHIR-12.12處理導(dǎo)致這些切割產(chǎn)物增加，表明CHIR-12.12處理消除了CD40L結(jié)合對sCD40L-刺激的正常B細(xì)胞中存活信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，恢復(fù)了B細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12抑制“存活”性抗凋亡蛋白的表達(dá)在這些實(shí)驗(yàn)中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。于0、20分鐘、2小時、6小時、18小時和26小時收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中Mcl-1、XIAP、CD40和β肌動蛋白對照。簡言之，sCD40L刺激導(dǎo)致Mcl-1和XIAP隨時間而持續(xù)表達(dá)。然而，用CHIR-12.12處理sCD40L-刺激的細(xì)胞導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)隨時間表達(dá)減少(數(shù)據(jù)未顯示)。由于Mcl-1和XIAP是能阻斷凋亡途徑的“存活”信號，這些結(jié)果證明CHIR-12.12處理消除了sCD40L-刺激的正常B細(xì)胞中凋亡的阻斷。
CHIR-12.12處理抑制了正常B細(xì)胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)的磷酸化在這些實(shí)驗(yàn)中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激1.0×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG。于0和20分鐘收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中磷酸化的IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)與總的IKKβ對照。
簡言之，sCD40L刺激導(dǎo)致IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser 181)隨時間而磷酸化；然而，用CHIR-12.12處理消除了正常B細(xì)胞對sCD40L-刺激的此應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12處理以劑量依賴方式抑制CD40配體介導(dǎo)的存活在這些實(shí)驗(yàn)中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.01、0.1、0.2、0.5、1.0μg/ml)和對照IgG。24小時后收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，CHIR-12.12處理以劑量依賴方式導(dǎo)致sCD40L-刺激的細(xì)胞中PARP切割增加，因此消除了sCD40L-刺激的正常B細(xì)胞中的存活信號途徑(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12以劑量依賴方式抑制“存活”性抗-凋亡蛋白的表達(dá)在這些實(shí)驗(yàn)中，用1μg/ml sCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激0.6×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)。然后加入CHIR-12.12(0.5、2和10μg/ml)和對照IgG。22小時后收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中Mcl-1、XIAP、切割的PARP和β肌動蛋白對照。
簡言之，CHIR-12.12處理以劑量依賴方式減少了sCD40L-刺激細(xì)胞中的Mcl-1和XIAP表達(dá)并增加了切割的PARP表達(dá)，因此消除了對sCD40L-刺激的正常B細(xì)胞中凋亡途徑的阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)。
在不存在可溶性CD40L信號時，CHIR-12.12不影響抗-凋亡蛋白、切割的PARP和XIAP的表達(dá)在這些實(shí)驗(yàn)中，僅用CHIR-12.12(10μg/ml)和對照IgG(即，在加入抗體之前，細(xì)胞未用sCD40L預(yù)刺激)處理1.0×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)。于0、4、14和16小時收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中XIAP、切割的PARP和β-肌動蛋白對照。
簡言之，這些結(jié)果顯示無sCD40L刺激時，IgG處理的對照細(xì)胞和CHIR-12.12處理的細(xì)胞中，細(xì)胞表達(dá)的切割的PARP濃度增加，而XIAP表達(dá)維持恒定(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，沒有CD40L刺激時，CHIR-12.12不激發(fā)正常人B細(xì)胞凋亡。
CHIR-12.12抑制正常B細(xì)胞中IKKα(Ser180)和IKKβ(Ser181)、Akt、ERK和p38的磷酸化在這些實(shí)驗(yàn)中，1.0×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養(yǎng)基中血清饑餓(serum starve)并用1μg/mlsCD40L(Alexis Corp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。細(xì)胞用CHIR-12.12(1和10μg/ml)和對照IgG處理培養(yǎng)物。于0和20分鐘收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中磷酸-IKKα、磷酸-IKKβ、總的IKKβ、磷酸-ERK、總的ERK、磷酸-Akt、總的Akt、磷酸-p38和總的p38。
簡言之，sCD40L刺激導(dǎo)致IKKα/β磷酸化、ERK磷酸化、Akt磷酸化和p38磷酸化增加，導(dǎo)致細(xì)胞的存活和增殖。用CHIR-12.12處理細(xì)胞消除了正常B細(xì)胞中sCD40L-刺激對這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12抑制多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如CD40信號級聯(lián)反應(yīng)中的PI3K和MEK/ERK在這些實(shí)驗(yàn)中，1.0×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養(yǎng)基中血清饑餓并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激。培養(yǎng)物也用CHIR-12.12(1和10μg/ml)、Wortmanin(一種PI3K/Akt抑制劑；1和10μM)、LY 294002(一種PI3K/Akt抑制劑；10和30μM)和PD 98095(一種MEK抑制劑；10和30μg/ml)處理。于0和20分鐘收集細(xì)胞。通過Western印跡檢測細(xì)胞裂解物中磷酸-ERK、磷酸-Akt、總的Akt、磷酸-IKKα/β和各自總含量。
簡言之，這些結(jié)果顯示CHIR-12.12消除了所有這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑顯示只特異性消除信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明CHIR-12.12可能抑制CD40L刺激介導(dǎo)的這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的上游途徑(數(shù)據(jù)未顯示)。
CHIR-12.12抑制正常B細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TRAF2和TRAF3與CD40胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合在這些實(shí)驗(yàn)中，4.0×106個健康獻(xiàn)血者的正常人B細(xì)胞(純度百分比為85-95％)在含有1％FBS的培養(yǎng)基中血清饑餓并用1μg/ml sCD40L(AlexisCorp.，Bingham，Nottinghamshire，UK)刺激20分鐘。于0和20分鐘收集細(xì)胞。用多克隆抗-CD40(Santa Cruz Biotechnology，CA)免疫沉淀CD40，在Western印跡中用抗-TRAF2 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)、抗-TRAF3 mAb(Santa Cruz Biotechnology，CA)和抗-CD40 mAb(Santa CruzBiotechnology，CA)檢測。
簡言之，這些結(jié)果顯示sCD40L刺激后TRAF2和TRAF3與CD40共同沉淀。相反，用CHIR-12.12處理消除了sCD40L-刺激的正常B細(xì)胞中CD40-TRAF2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成。CD40的表達(dá)沒有變化(數(shù)據(jù)未顯示)。
不受理論的束縛，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和上述實(shí)施例的結(jié)果表明CHIR-12.12抗體是具有獨(dú)特組合特性的雙重作用拮抗性抗-CD40單克隆抗體。該完全的人單克隆抗體能阻斷B細(xì)胞存活和增殖的CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；該拮抗作用最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。CHIR-12.12也能介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的識別和結(jié)合，啟動抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。一旦CHIR-12.12與效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，釋放溶細(xì)胞酶，導(dǎo)致B細(xì)胞凋亡和裂解。當(dāng)在臨床前腫瘤模型中比較時，CHIR-12.12是比利妥昔單抗更有效的抗腫瘤抗體。
實(shí)施例9CHIR-12.12在多發(fā)性骨髓瘤動物模型中的抗腫瘤活性當(dāng)CHIR-12.12經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)每周給藥1次，總共3周時，其明顯以劑量依賴方式抑制侵襲性分階段和不非階段的多發(fā)性骨髓瘤生長。聯(lián)合用硼替佐米(VELCADE_)的抗體治療可進(jìn)一步提高效力。
IM-9多發(fā)性骨髓瘤異種移植模型SCID小鼠以每只小鼠5×106個細(xì)胞皮下接種50％MATRIGELTM配制的IM-9腫瘤細(xì)胞(表達(dá)CD40和CD20的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系)。在不分階段模型中，在腫瘤植入后一天開始治療。在分階段模型中，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到150-200mm3時開始治療。荷瘤小鼠以所示劑量腹膜內(nèi)(i.p.)每周注射一次抗-CD40 mAb。數(shù)據(jù)使用對數(shù)分級測試來進(jìn)行分析。
在不分階段的條件化存活模型中，CHIR-12.12明顯以劑量依賴方式延長了荷瘤小鼠的存活時間，在第56天，0.1mg/kg CHIR-12.12處理組中存活率是60％，1和10mg/kg CHIR-12.12處理組中存活率是80％(分別是p＜0.01和p＜0.001)(數(shù)據(jù)未顯示)。由于腫瘤生長相關(guān)的疾病，對照IgG和硼替佐米處理組中所有動物在第18和26天無痛處死。
在分階段的皮下模型中，以0.1、1和10mg/kg每周給藥的CHIR-12.12明顯抑制腫瘤生長，分別將腫瘤體積減小17％(p＞0.05；數(shù)據(jù)未顯示)、34％(p＜0.01；圖A)和44％(p＜0.001；數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)測試以0.5mg/kg每周給藥兩次時，硼替佐米不抑制腫瘤生長(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖A所示，當(dāng)以最大耐受劑量(MTD)1mg/kg，每周給藥兩次時，硼替佐米抑制腫瘤生長達(dá)30％(p＜0.01)。然而，當(dāng)CHIR-12.12(1mg/kg)聯(lián)合最大耐受劑量的硼替佐米每周給藥1次時，觀察到腫瘤體積減少超過50％(p＜0.001)。
總之，在實(shí)驗(yàn)性多發(fā)性骨髓瘤模型中，抗-CD40mAb CHIR-12.12明顯抑制腫瘤生長。此外，CHIR-12.12和硼替佐米聯(lián)合治療的效果高于任何單一的治療。這些數(shù)據(jù)提示抗-CD40mAb CHIR-12.12具有強(qiáng)抗腫瘤活性，單獨(dú)使用或和其它化療藥物聯(lián)用可臨床有效地治療多發(fā)性骨髓瘤。
實(shí)施例10用5.9和CHIR-12.12做的臨床研究臨床目標(biāo)總目標(biāo)是通過用抗-CD40 IgG1靶向多發(fā)性骨髓瘤癌細(xì)胞來提供對多發(fā)性骨髓瘤的有效療法。雖然可在I期獲得對活性的一些衡量，但這些疾病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在II期測定。該藥物首先作為單一藥物進(jìn)行研究，但在隨后的過程中聯(lián)用了其它藥物、化療和放療。
I期·在患多發(fā)性骨髓瘤的對象中評價安全性和藥代動力學(xué)-劑量遞增。
·根據(jù)安全性、耐受性和CD40的血清標(biāo)記變化選擇劑量。一般尋找MTD，但其它效力指標(biāo)(CD40+多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的消除等)也足夠確定劑量。
·考慮一種以上的劑量，其中一些在II期中可能需要。
·患者每周給藥并進(jìn)行實(shí)時藥代動力學(xué)(Pk)取樣。最初的4周周期進(jìn)行最大給藥。Pk依據(jù)所研究的疾病、CD40密度等可能有很大不同。
·該試驗(yàn)對多發(fā)性骨髓瘤患者公開。
·根據(jù)安全性、劑量和抗腫瘤活性的初步證據(jù)決定終止還是繼續(xù)研究。
·在II期測定應(yīng)答速率所確定的藥物活性。
·鑒定II期的劑量。
II期在多發(fā)性骨髓瘤患者中進(jìn)行幾項(xiàng)試驗(yàn)。在隨機(jī)化的II期方法中可能測試多種劑量或多種給藥時間方案。
·靶向不符合當(dāng)前當(dāng)前護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的多發(fā)性骨髓瘤(患者)群(化療失敗)√根據(jù)II期治療概念的證據(jù)決定終止還是繼續(xù)研究√決定替代標(biāo)記是否可用作臨床效力的早期指標(biāo)√鑒定III期的劑量III期III期取決于II期中在何處檢測到信號與何種競爭性療法可認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的。如果信號是在無治療標(biāo)準(zhǔn)的疾病階段，則單臂(single arm)、良好控制的研究可用作關(guān)鍵性試驗(yàn)。如果存在認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的競爭性藥物，則可進(jìn)行一對一(head-to-head)的研究。
實(shí)施例11拮抗性抗-CD40抗體的液體藥物制劑為選擇拮抗性抗-CD40抗體CHIR-12.12的最佳溶液環(huán)境，本項(xiàng)研究的目的是通過生物物理和生物化學(xué)方法檢測溶液pH對該抗體穩(wěn)定性的作用。示差掃描量熱法(DSC)結(jié)果顯示CHIR-12.12在pH 5.5-6.5的制劑中構(gòu)象穩(wěn)定性最佳?；赟DS-PAGE、體積排阻HPLC(SEC-HPLC)和離子交換HPLC(CEX-HPLC)分析的綜合結(jié)果，CHIR-12.12在約pH 5.0-5.5時的理化穩(wěn)定性最佳。鑒于這些結(jié)果，含有該抗體的一種推薦的液體藥物制劑是用約10mM琥珀酸鈉、約150mM氯化鈉配制，pH約5.5、含有濃度約20mg/ml的CHIR-12.12的制劑。
材料與方法用于制劑研究的CHIR-12.12抗體是通過CHO細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生的人單克隆抗體。該mAb的分子量為150kDa，由二硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈組成。其靶向表達(dá)CD40的細(xì)胞，包括正常和惡性B細(xì)胞上的CD40細(xì)胞表面受體，可治療各種癌癥和自身免疫/炎性疾病。
用于本項(xiàng)研究的抗-CD40藥物是散裝的，得自CHO的純化抗-CD40(CHIR-12.12)。該藥物組合物是用10mM琥珀酸鈉、150mM氯化鈉配制，pH約6.5、濃度約9.7mg/ml的CHIR-12.12。該研究的對照樣品是接受的藥物，經(jīng)≤-60℃凍結(jié)后在室溫融化并在預(yù)定的時間點(diǎn)連同穩(wěn)定性樣品一起測試。如表7所示，用不同pH溶液透析該藥物來制備穩(wěn)定性樣品并用UV280測定各樣品的CHIR-12.12濃度。
表7.CHIR-12.12制劑
使用以下方案測定各種制劑中CHIR-12.12抗體的理化穩(wěn)定性。
示差掃描量熱法(DSC)用MicroCal VP-DSC按1℃/分鐘速度從15℃加熱至90℃檢測不同制劑樣品的構(gòu)象穩(wěn)定性。
SDS-PAGE用4-20％Tris-甘氨酸凝膠在非還原和還原條件下評估斷裂和聚集。通過考馬斯亮藍(lán)染色法檢測蛋白質(zhì)。
體積排阻色譜(SEC-HPLC)也通過Water Alliance HPLC檢測蛋白質(zhì)的斷裂和聚集，所述HPLC使用Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL柱，100mM磷酸鈉、pH 7.0作為流動相，流速0.7ml/分鐘。
離子交換色譜(CEX-HPLC)用Waters 600s HPLC系統(tǒng)檢測降解相關(guān)的荷電變化，所述HPLC系統(tǒng)使用Dionex Propac WCX-10柱，以50mM HEPE，pH 7.3作為流動相A和含有500mM NaCl的50mM HEPE，pH 7.3作為流動相B，流速0.5℃/分鐘進(jìn)行。
結(jié)果與討論構(gòu)象穩(wěn)定性研究CHIR-12.12的熱去折疊表明至少有兩次熱轉(zhuǎn)換，可能分別代表Fab和Fc結(jié)構(gòu)域的去折疊解鏈。在較高溫度下，該蛋白質(zhì)可能凝聚導(dǎo)致DSC信號喪失。出于制劑篩選目的，本項(xiàng)研究中將最低的熱轉(zhuǎn)換溫度定義為解鏈溫度，Tm。圖6顯示了作為制劑pH函數(shù)的熱解鏈溫度。較高的熱解鏈溫度表明pH 5.5-6.5的該制劑使得抗-CD40具有較高的構(gòu)象穩(wěn)定性。
SDS-PAGE分析pH 4.5-9.0的CHIR-12.12制劑樣品于40℃孵育2個月，以SDS-PAGE分析(數(shù)據(jù)未顯示)。在非還原條件下，在pH大于5.5的制劑中觀察到分子量(MW)為23kDa和27kDa的(抗體)種類，在所有制劑中均觀察到MW為51kDa的(抗體)種類，但在pH5.0-5.5的制劑中明顯減少。pH 7.5和pH 9.0的制劑中可見MW為100kDa的(抗體)種類。
在還原條件下，CHIR-12.12還原為MW分別為50kDa和24kDa的游離重鏈和輕鏈。100kDa的(抗體)種類似乎不能完全被還原并隨著溶液pH的增加而增多，提示在這些分子中可能發(fā)生非二硫共價鍵結(jié)合。由于SDS-PAGE上存在身份未知的其它分子，各制劑的穩(wěn)定性比較根據(jù)CHIR-12.12的剩余純度。pH 5.0-6.0的制劑為CHIR-12.12提供了更穩(wěn)定的環(huán)境。SDS-PAGE幾乎沒檢測到凝聚(數(shù)據(jù)未顯示)。
SEC-HPLC分析SEC-HPLC分析檢測到作為主峰(抗體)種類的完整CHIR-12.12，與該主峰分離開的前峰抗體是凝聚的(抗體)種類，大片段(抗體)種類位于主峰后部的肩峰，小片段(抗體)種類在主峰后檢測到。5℃和25℃溫育3個月后，在上述制劑中檢測到其量可忽略不計(jì)的蛋白質(zhì)片段和凝聚物(＜1.0％)，CHIR-12.12主峰抗體純度保持在99％以上(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，儲存于40℃時，蛋白質(zhì)片段逐步增加，如表8所示，更多的片段在pH 4.5和pH 6.5-9.0時形成。CHIR-12.12制劑40℃溫育3個月后，在pH 7.5和pH 9.0的制劑中檢測到約2-3％的凝聚物，而在其它pH的制劑中檢測到不到1％的凝聚物(數(shù)據(jù)未顯示)。SEC-HPLC結(jié)果表明CHIR-12.12在約pH 5.0-6.0時更穩(wěn)定。
表8.CHIR-12.12穩(wěn)定性樣品在實(shí)時和加速儲存條件下的SEC-HPLC結(jié)果
CEX-HPLC分析CEX-HPLC分析檢測到作為主峰(抗體)種類的完整的CHR-12.12，酸性變體早于主峰(抗體)種類洗脫，C-末端添加了賴氨酸的變體在主峰(抗體)種類之后洗脫。表9顯示剩余的主峰CHIR-12.12(抗體)種類和酸性變體的百分比取決于溶液的pH。可能由于早期發(fā)酵和純化方法所致，對照樣品已經(jīng)含有高比例的酸性(抗體)種類(約33％)。CHIR-12.12對pH較高的溶液敏感有兩個事實(shí)證明。首先，pH 9.0的最初制劑樣品(t＝0)已經(jīng)比對照多產(chǎn)生了12％的酸性(抗體)種類。其次，隨著pH上升酸性抗體的百分比急劇增加?？赡苡捎诿摪被饔脤?dǎo)致荷電變化相關(guān)的降解。上述數(shù)據(jù)表明CHIR-12.12的該類型的降解在約pH 5.0-5.5處最少。
表9.在實(shí)時和加速儲存條件下不同pH制劑中CHIR-12.12的CEX-HPLC峰面積百分比
結(jié)論pH對CHIR-12.12的構(gòu)象和理化穩(wěn)定性有顯著影響。荷電變化相關(guān)的降解確定為CHIR-12.12的主要降解途徑，該降解在pH 5.0-5.5時最少。根據(jù)總的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，一種含有該抗體的推薦的液體藥物制劑是用約10mM琥珀酸鈉、約150mM氯化鈉配制的pH約5.5、含有約20mg/ml的CHIR-12.12的制劑。
本文所述發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可從本文的描述和相關(guān)附圖中獲益進(jìn)而可對本發(fā)明作出許多改進(jìn)和其它實(shí)施方案。因此，應(yīng)理解本發(fā)明不受限于以上公開的具體實(shí)施方案，所述改進(jìn)和其它實(shí)施方案均包括在附加權(quán)利要求所確定的范圍內(nèi)和本文所公開的實(shí)施方案內(nèi)。雖然本文使用了特定的術(shù)語，但它們僅是一般性和描述性地使用并非出于限制的目的。
說明書中述及的所有出版物和專利申請表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。如同每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾執(zhí)囟ㄇ要?dú)立地用作參考一樣，所有出版物和專利申請納入本文作為參考。
關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
03年-11月-4日來自-知識產(chǎn)權(quán)部510-654-4873T-197 P 003/003 F-592ATCC10801 大學(xué)大道 馬納斯，弗吉尼亞 20110-2209；電話700-065-2700；傳真703-365-2745；國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約國際表依照第7.3條頒布的原始保存物的保存證明和依照第10條頒布的存活性證明至(交存人或代理人姓名或地址)希龍公司代理人K V Noto4560 Horton大街艾莫利維爾(Emeryville)，加利福尼亞 94608代表希龍公司保存交存人給的分類號 專利保存號小鼠雜交瘤131.2F8.5.9CMCC#12047 PTA-5542小鼠雜交瘤153.8E2.D10.D6.12.12CMCC#12056 PTA-5543保存物伴有科學(xué)描述；給出的以上分類描述。保存物由本國際保存單位于2003年9月17日收到并接受。
根據(jù)你方要求×我們通知你方要求保存菌株30年如果簽署布達(dá)佩斯條約的專利局證實(shí)某人接收的權(quán)利，或者如果引用該菌株的美國專利授權(quán)，并且ATCC收到美國專利和商標(biāo)局或教存人的指令來發(fā)放所述菌株，則該菌株對公眾可用。
如果在保存的有效時期內(nèi)培養(yǎng)物死亡或破壞，你方應(yīng)用相同的活培養(yǎng)物替換它們。
該菌株將自保存之日起維持至少30年，或需要最新的樣品，無論哪個更長。美國和許多其它國家簽署了布達(dá)佩斯條約。
上述培養(yǎng)物的活性于2003年9月23日測試。在該日，培養(yǎng)物是存活的。
國家保存單位美國模式培養(yǎng)物保藏所，馬納斯，弗吉尼亞20110-2209美國。
有權(quán)代表ATCC者的簽名瑪利亞 哈里斯(Marie Harris)，專利專員，ATCC專利保存 日期2003年10月2日CC利莎 亞歷山大(Lisa Alexander)Ref審理或案件號P20107.0012003年11月3日收到來自510 923 4766 至 知識產(chǎn)權(quán) 002頁序列表序列表<110>L.隆(Long，Li)M.盧克曼(Luqman，Mohammad)A.亞巴娜發(fā)(Yabannavar，Asha)I.扎羅(Zaror，Isabel)<120>使用拮抗性抗-CD40單克隆抗體治療多發(fā)性骨髓瘤<130>PP22589.002(282915)<150>60/565,709<151>2004-04-26<150>60/565,710<151>2004-04-27<150>60/525,579<151>2003-11-26<150>60/517,337<151>2003-11-04<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>720<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的輕鏈的編碼序列<221>CDS<222>(1)...(720)<400>1atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct 48Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser1 5 10 15
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agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa624Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag672Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag720Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys *225 230 235<210>2<211>239<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的輕鏈<400>2Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr20 25 30Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys50 55 60Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys115 120 125Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>3<211>2016<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的重鏈的編碼序列(包括內(nèi)含子)<400>3atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tcatatgagg aaagtaatag ataccatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagatcac gctgtatctg 300caaatgaaca gcctcagaac tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatgggggt 360atagcagcac ctgggcctga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagca 420agtaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcgcccgcta gcaagagcac ctctgggggc 480acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tggtgagagg 720ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 780tcccggctat gcagtcccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 840gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc 900tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc 960tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 1020ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc agattccagt 1080aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1140gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 1200agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt 1260cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1320acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1380
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<223>12.12人抗-CD40抗體的重鏈<400>4Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly1 5 10 15Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly130 135 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val165 170 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val195 200 205Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val210 215 220Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys225 230 235 240Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu245 250 255Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr260 265 270Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val275 280 285Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val290 295 300Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser305 310 315 320Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu325 330 335Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala340 345 350Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro355 360 365Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln370 375 380Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala385 390 395 400Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr405 410 415Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu420 425 430Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser435 440 445Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser450 455 460Leu Ser Pro Gly Lys465<210>5<211>469<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗體的變體的重鏈<400>5Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly1 5 10 15Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr115 120 125Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly130 135 140Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val165 170 175Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe180 185 190Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val195 200 205Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val210 215 220Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys225 230 235 240Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu245 250 255Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr260 265 270Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val275 280 285Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val290 295 300Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu325 330 335Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala340 345 350Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro355 360 365Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln370 375 380Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala385 390 395 400Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr405 410 415Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu420 425 430Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser435 440 445Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser450 455 460Leu Ser Pro Gly Lys465<210>6<211>239<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>5.9人抗-CD40抗體<400>6Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro20 25 30Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg50 55 60Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg115 120 125Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>7<211>474<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>5.9人抗-CD40抗體的重鏈<400>7Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly1 5 10 15Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe35 40 45Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser65 70 75 80Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp G1y Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys145 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser180 185 190Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser195 200 205Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr210 215 220Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys225 230 235 240Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys245 250 255Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro260 265 270Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys275 280 285Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp290 295 300Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu305 310 315 320Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu325 330 335His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn340 345 350Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly355 360 365Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu370 375 380Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr385 390 395 400Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn405 410 415Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe420 425 430Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn435 440 445Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr450 455 460Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470
<210>8<211>474<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>5.9人抗-CD40抗體的變體的重鏈<400>8Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly1 5 10 15Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe35 40 45Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser65 70 75 80Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr115 120 125Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys145 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser180 185 190Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser195 200 205Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr210 215 220Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys225 230 235 240Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro260 265 270Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys275 280 285Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp290 295 300Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu305 310 315 320Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu325 330 335His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn340 345 350Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly355 360 365Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu370 375 380Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr385 390 395 400Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn405 410 415Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe420 425 430Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn435 440 445Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr450 455 460Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470<210>9<211>612<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(612)<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>人CD40的短同種型的編碼序列<400>9
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta 96Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa192Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac240Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc288Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg336Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc384Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag432Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa480Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt528Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly165 170 175
gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt576Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly180 185 190ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa612Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln *195 200<210>10<211>203<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly165 170 175Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly180 185 190Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln195 200<210>11
<211>834<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(834)<221>misc_feature<222>(0)...(0)<223>人CD40的長同種型的編碼序列<400>11atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta 96Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg144Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa192Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac240Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc288Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg336Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc384Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag432Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa480Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160tgt cac cct tgg aca agc tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag528Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln165 170 175gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg576Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu180 185 190aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc624Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile195 200 205ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat672Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn210 215 220aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac720Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp225 230 235 240gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat768Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His245 250 255gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca816Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser260 265 270gtg cag gag aga cag tga834Val Gln Glu Arg Gln *275<210>12<211>277
<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>12Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu20 25 30Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val35 40 45Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu50 55 60Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His65 70 75 80Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr85 90 95Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr100 105 110Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly115 120 125Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu130 135 140Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys145 150 155 160Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln165 170 175Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu180 185 190Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile195 200 205Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn210 215 220Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp225 230 235 240Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His245 250 255Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser260 265 270Val Gln Glu Arg Gln27權(quán)利要求
1.一種治療人對象的多發(fā)性骨髓瘤的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的能特異性結(jié)合表達(dá)于人CD40表達(dá)細(xì)胞表面上的人CD40抗原的人抗-CD40單克隆抗體，所述單克隆抗體無明顯的激動活性，藉此，當(dāng)所述單克隆抗體結(jié)合所述細(xì)胞表面表達(dá)的CD40抗原時，抑制所述細(xì)胞的生長或分化，所述人抗-CD40單克隆抗體選自a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；b)雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；c)含有選自以下的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQ ID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示序列，和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；d)含有選自以下的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列，和同時含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示序列；f)與能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位相結(jié)合的單克隆抗體；g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；i)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；j)前項(xiàng)a)所述的單克隆抗體或前項(xiàng)c)-i)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和k)為前項(xiàng)a)-j)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
4.一種治療人對象的多發(fā)性骨髓瘤的方法，包括給予所述對象有效量的特異性結(jié)合人CD40抗原結(jié)構(gòu)域2的拮抗性抗-CD40單克隆抗體，其中所述抗體當(dāng)與人CD40抗原結(jié)構(gòu)域2結(jié)合時無明顯的激動活性。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗體是人抗體。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗體具有選自以下的抗體的結(jié)合特異性雜交瘤細(xì)胞系5.9產(chǎn)生的抗體和雜交瘤細(xì)胞系12.12產(chǎn)生的抗體。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗體選自專利保藏號為PTA-5542的ATCC保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體和專利保藏號為PTA-5543的ATCC保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗體具有單克隆抗體CHIR-12.12或5.9的結(jié)合特異性。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗體與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結(jié)合。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗體選自a)含有選自以下的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；b)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQID NO1和SEQ ID NO3所示序列；c)與能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位相結(jié)合的單克隆抗體；d)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；e)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；f)前項(xiàng)a)-e)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和g)為CHIR-12.12單克隆抗體的抗原結(jié)合片段或前項(xiàng)a)-f)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
11.一種抑制表達(dá)CD40抗原的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的能特異性結(jié)合所述CD40抗原的人抗-CD40單克隆抗體接觸，所述單克隆抗體當(dāng)結(jié)合CD40抗原時無明顯的激動活性，所述抗體選自a)單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12；b)雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體；c)含有選自以下的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO6所示序列、SEQ ID NO7所示序列、SEQ ID NO8所示序列、同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示序列和同時含有SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示序列；d)含有選自以下的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；e)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQID NO1和SEQ ID NO3所示序列；f)與能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系5.9或12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位相結(jié)合的單克隆抗體；g)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；h)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-89的表位相結(jié)合的單克隆抗體；i)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-5.9或CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；j)前項(xiàng)a)所述的單克隆抗體或前項(xiàng)c)-i)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和k)為前項(xiàng)a)-j)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體以至少約10-6M-10-12M的親和力(KD)與所述人CD40抗原結(jié)合。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
14.一種抑制表達(dá)CD40抗原的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的特異性結(jié)合人CD40抗原的結(jié)構(gòu)域2的拮抗性抗-CD40單克隆抗體接觸，其中所述抗體當(dāng)與人CD40抗原的結(jié)構(gòu)域2結(jié)合時無明顯的激動活性。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體是人抗體。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體具有選自以下的抗體的結(jié)合特異性雜交瘤細(xì)胞系5.9產(chǎn)生的抗體和雜交瘤細(xì)胞系12.12產(chǎn)生的抗體。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體選自專利保藏號為PTA-5542的ATCC保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體和專利保藏號為PTA-5543的ATCC保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體具有單克隆抗體CHIR-12.12或5.9的結(jié)合特異性。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體與含有SEQ IDNO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位結(jié)合。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗體選自a)含有選自以下的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO4所示序列、SEQ ID NO5所示序列、同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示序列，和同時含有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5所示序列；b)具有由含有選自以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的單克隆抗體SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO3所示序列和同時含有SEQID NO1和SEQ ID NO3所示序列；c)與能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系12.12產(chǎn)生的單克隆抗體的表位相結(jié)合的單克隆抗體；d)與含有SEQ ID NO10或SEQ ID NO12所示人CD40序列的殘基82-87的表位相結(jié)合的單克隆抗體；e)在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中與單克隆抗體CHIR-12.12競爭的單克隆抗體；f)前項(xiàng)a)-e)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中所述抗體是重組產(chǎn)生的；和g)為CHIR-12.12單克隆抗體的抗原結(jié)合片段或前項(xiàng)a)-f)中任一項(xiàng)所述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段的單克隆抗體，其中所述片段保留了特異性結(jié)合所述人CD40抗原的能力。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療對象的多發(fā)性骨髓瘤的方法。所述方法包括將治療有效量的拮抗性抗－CD40抗體或其抗原結(jié)合片段給予需要它的患者。當(dāng)所述抗體結(jié)合人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原時，所述拮抗性抗－CD40抗體或其抗原結(jié)合片段無明顯的激動活性，而顯示拮抗活性。抗－CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的拮抗活性有益地抑制表達(dá)人CD40的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖和/或分化。
文檔編號C07K16/28GK1901937SQ200480039766
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者L·隆, M·盧克曼, A·亞巴娜發(fā), I·扎羅 申請人:希龍公司