專利名稱：抑制發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝作用的方法和藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝作用的藥劑，以及預(yù)防或治療由發(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用介導(dǎo)的疾病或病癥的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物的細(xì)胞從細(xì)胞外吸收養(yǎng)分，并通過細(xì)胞內(nèi)攝作用使細(xì)胞膜再循環(huán)，其中包括在胞漿膜內(nèi)形成大量的小囊泡。小囊泡大小不一，大到大的吞噬體，其次是包涵素包裹的囊泡，小到微小的突觸囊泡(SV)。細(xì)胞內(nèi)攝的機(jī)理對(duì)許多細(xì)胞功能的發(fā)揮都有幫助，包括對(duì)細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取，細(xì)胞表面受體表達(dá)和信號(hào)發(fā)送的調(diào)節(jié)，抗原表達(dá)和突觸傳遞的維持。
細(xì)胞內(nèi)攝途徑有兩個(gè)具有顯著的生物化學(xué)特征。第一是快速突觸囊泡內(nèi)攝作用(SVE)，其是在囊泡在神經(jīng)末梢的細(xì)胞外排之后。SVE并不是特異地與受體活性相聯(lián)系的，其作用于空的SVs之后再填充的恢復(fù)，并需要發(fā)動(dòng)蛋白I的酶的活性。第二是受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝作用(RME)，起始于與細(xì)胞表面受體相結(jié)合的配體，并經(jīng)所有細(xì)胞的包涵素包裹的凹點(diǎn)發(fā)生，包括神經(jīng)末梢。RME提供了主要的為胞漿膜成分(例如受體-配體復(fù)合物和細(xì)胞膜脂質(zhì)體)或細(xì)胞外液體進(jìn)入細(xì)胞的入口并涉及發(fā)動(dòng)蛋白II的活性。RME和SVE作用于相同的神經(jīng)元，但作用機(jī)理卻不同。
雖然它們有類似的基礎(chǔ)蛋白結(jié)構(gòu)，但RME和SVE卻屬相同蛋白的不同異構(gòu)。RME和SVE都存在多個(gè)亞型。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞內(nèi)化作用是通過RME介導(dǎo)的，并依賴于發(fā)動(dòng)蛋白的活性，但是只有前者是對(duì)酪氨酸激酶(TK)抑制劑敏感，說明了對(duì)兩種活性受體的RME的不同的生化需求。細(xì)胞內(nèi)攝作用在人類包括神經(jīng)疾病的病理情況中起著多重作用，更好地理解如何控制細(xì)胞內(nèi)攝作用在臨床上是非常重要的。
發(fā)動(dòng)蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)攝作用終末期的關(guān)鍵酶(Brodin等人，2000)。除發(fā)動(dòng)蛋白外，細(xì)胞內(nèi)攝作用的分子學(xué)機(jī)制包括許多蛋白質(zhì)和脂類輔助因子，其導(dǎo)致發(fā)動(dòng)蛋白的聚集和激活(Cousin和Robinson.，2001)。內(nèi)攝的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)攝作用中連續(xù)發(fā)揮作用，有至少4個(gè)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)上分類的分期，盡管一些蛋白在傳遞途徑中涉及多個(gè)期。這些形態(tài)學(xué)和生化學(xué)的分類包括1.成核期在SV上的突觸前末梢突觸結(jié)合蛋白發(fā)揮作為細(xì)胞外排和細(xì)胞內(nèi)攝的聯(lián)系功能，方式是補(bǔ)充AP-2銜接蛋白復(fù)合物外排的成核位置上。AP-2補(bǔ)充包涵素以形成囊泡包衣和隨后的amphiphysin。
2.內(nèi)陷期Amphiphysin是一種對(duì)接分子，其能夠補(bǔ)充剩余的大多數(shù)內(nèi)攝蛋白(發(fā)動(dòng)蛋白、內(nèi)韌蛋白和synaptojanin)，是囊泡內(nèi)陷所需要的。
3.分裂期發(fā)動(dòng)蛋白、amphiphysin和/或內(nèi)韌蛋白裝配成環(huán)，形成如螺旋狀的內(nèi)陷囊泡頸部的領(lǐng)圈。所有這三個(gè)蛋白都能夠在體外自我裝配成環(huán)。囊泡頸部的分裂導(dǎo)致囊泡的釋放，需要發(fā)動(dòng)蛋白的GTP酶的活性。GTP水解引起螺旋結(jié)構(gòu)的突然膨脹，引起胞漿膜的囊泡的擠出，或者引起環(huán)狀縮窄。在果蠅種族shibire中，發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶區(qū)域的突變(不阻斷GTP的結(jié)合但阻斷GTP的水解)使得發(fā)動(dòng)蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的裝配而在其形成后阻斷SV的分裂(Koenig和Ikeda.，1989)。這可以鑒別發(fā)動(dòng)蛋白環(huán)反應(yīng)的GTP結(jié)合和GTP水解的步驟，并說明表示GTP的水解，即GTP酶活性，是囊泡分裂前的最后的步驟。發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶的缺損的突變體的過度表達(dá)抑制了RME和SVE(Brodin等人，2000)。
4.脫殼SV脫殼并在外排之前填充神經(jīng)遞質(zhì)。
因此，發(fā)動(dòng)蛋白是一種在外排之后回復(fù)突觸囊泡的GTP酶，具有通過刺激在突觸囊泡凹陷頸部的螺旋結(jié)構(gòu)的裝配的功能(Brodin等人，2000；Cousin和Robinson.，2001)。發(fā)動(dòng)蛋白還是一種磷蛋白，可以被蛋白激酶C(PKC)在體外磷酸化，和被細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶(Cdk5)在體內(nèi)磷酸化。它很快地被神經(jīng)鈣蛋白通過去極化作用和鈣內(nèi)流刺激細(xì)胞內(nèi)攝而去磷酸化，并且阻斷脫磷酸會(huì)防止神經(jīng)末梢的細(xì)胞內(nèi)攝。在多數(shù)囊泡的細(xì)胞內(nèi)攝期間保持著去磷酸作用并在細(xì)胞內(nèi)攝完成后重新磷酸化。因此，發(fā)動(dòng)蛋白的去磷酸化不在細(xì)胞內(nèi)攝中起作用，但是可能是細(xì)胞內(nèi)攝前的啟動(dòng)步驟。
發(fā)動(dòng)蛋白I有三個(gè)發(fā)動(dòng)蛋白基因在神經(jīng)元中表達(dá)，而發(fā)動(dòng)蛋白II則在所有位置表達(dá)。發(fā)動(dòng)蛋白III在神經(jīng)元中表達(dá)并大量存在于睪丸中。所有發(fā)動(dòng)蛋白都有四個(gè)主要的區(qū)域，稱作GTP酶區(qū)域，普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(PH)區(qū)域，GTP酶效應(yīng)器區(qū)域(GED)，和富含脯氨酸區(qū)域(PRD)。
GTP酶區(qū)域有顯著低的對(duì)GTP的親和力(10-25μm)并且相比于其它GTP酶有非常高的更新速率。它是囊泡分裂所需要的。來自Dictyostelium基因的發(fā)動(dòng)蛋白該區(qū)域的晶型結(jié)構(gòu)近來被發(fā)現(xiàn)(Niemann等人，2001)。該球狀結(jié)構(gòu)包含G-蛋白核心折疊，其正常的六線片層通過插入單獨(dú)的55個(gè)氨基酸延伸至八線結(jié)構(gòu)。
普列克底物蛋白同源(PH)區(qū)域既是靶向區(qū)域，也是可能的GTP酶抑制作用的因素，是內(nèi)攝作用所需要的。發(fā)動(dòng)蛋白與脂類經(jīng)該區(qū)域相互作用，并且與含有二磷酸化的磷脂酰肌醇(PtdIns(4，5)P2)的nanotubules結(jié)合的發(fā)動(dòng)蛋白明顯地刺激了GTP酶的活性(Stowell等人，1999)。PH區(qū)域不需要自裝配或具有GTP酶活性，除去它(delta-PH區(qū)域)會(huì)很大程度地增加內(nèi)在的GTP酶活性。
GTP酶效應(yīng)器區(qū)域(GED)控制發(fā)動(dòng)蛋白之間的相互作用并把發(fā)動(dòng)蛋白裝配成四聚體構(gòu)型。大約28-32四聚體聯(lián)合自我裝配為單環(huán)或含有PtdIns(4，5)P2的脂類混合物周邊的螺旋結(jié)構(gòu)。GED說明了結(jié)合GTP酶區(qū)域的四聚體自聯(lián)作用。GED的變異影響細(xì)胞內(nèi)攝作用，部分降低，而部分(令人驚奇地)增加了內(nèi)攝作用。GED的作用就象刺激GTP酶活性的GTP酶效應(yīng)蛋白。
在發(fā)動(dòng)蛋白C末端的富含脯氨酸區(qū)域(PRD)和多數(shù)含有蛋白和神經(jīng)鈣蛋白的SH3區(qū)域相互作用，其是體內(nèi)發(fā)動(dòng)蛋白磷酸化的位置。
多種細(xì)胞內(nèi)攝抑制劑和細(xì)胞內(nèi)攝作用的抑制方法都存在，如陽離子兩性藥物(例如氯丙嗪)，刀豆素A，氧化苯砷，丹磺酰戊二胺，細(xì)胞內(nèi)鉀缺乏，細(xì)胞內(nèi)酸化和介質(zhì)溫度降低至4℃。每種特異性都較弱，作用有限。雖然如此，它們還是對(duì)細(xì)胞內(nèi)攝有些作用。部分證明了可阻斷細(xì)胞內(nèi)攝作用的已經(jīng)用于人類的臨床上了(Atwood，2001)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方式
涉及能夠抑制發(fā)動(dòng)蛋白的GTP酶活性的化合物，以及這些化合物在抑制發(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用中的用途。特別地，至少發(fā)現(xiàn)有一些二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)能夠抑制由發(fā)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝作用。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種抑制細(xì)胞內(nèi)發(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用的方法，該方法包括用有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽處理細(xì)胞，其中通式I為M-Sp-M’通式I其中M和M’分別獨(dú)立為通式II所示的結(jié)構(gòu)部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區(qū)； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團(tuán)；并Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫(sulfur)、未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或
W、V和Y與Z基團(tuán)稠合形成取代或未取代的5員或6員雜環(huán)，或是碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，如果雜環(huán)或碳環(huán)有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫、或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)的至少一種，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區(qū)上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子；(b)非取代的含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的碳環(huán)；(c)含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代基、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；?；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，被至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；幕鶊F(tuán)取代；和(d)含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的碳環(huán)，在W是CH或一連接基團(tuán)時(shí)，或W、V和Y形成非取代的碳環(huán)時(shí)有至少兩個(gè)取代基，或者在W、V和Y形成雜環(huán)時(shí)，有至少一個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；?；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，有至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代基、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；娜〈?；其中當(dāng)M或M′中的一個(gè)Z選自(b)時(shí)，而另一個(gè)M或M′中的Z選自(a)、(c)和(d)。
優(yōu)選的是，通式I的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
本發(fā)明還涉及通過抑制發(fā)動(dòng)蛋白依賴的細(xì)胞內(nèi)攝作用來預(yù)防或治療相關(guān)的疾病或病癥的方法。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中由發(fā)動(dòng)蛋白依賴的細(xì)胞內(nèi)攝作用介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽或前藥。
本發(fā)明的另一方面是提供一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中由發(fā)動(dòng)蛋白蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用介導(dǎo)的疾病或病癥，該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的能夠結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白并因此抑制發(fā)動(dòng)蛋白的GTP酶活性的二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其生理上可接受的鹽，或其類似物，或其前藥。
用通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物處理細(xì)胞或哺乳動(dòng)物，是指給予在體內(nèi)可以二聚化產(chǎn)生通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物，它們?cè)隗w內(nèi)能夠結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白，抑制其蛋白GTP酶的活性，和在體內(nèi)能夠生成具有結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白，抑制其蛋白GTP酶的活性的通式I的化合物或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物的前藥。
在本發(fā)明進(jìn)一步的方面是提供通式I的化合物或其生理上可接受的鹽在制備用于預(yù)防或治療由發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝作用介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的藥物的用途。
本發(fā)明的另一方面，則是提供二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑，其生理可接受的鹽，或其類似物，或其前藥在制備用于預(yù)防或治療由發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝作用介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的藥物的用途，所述的二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或類似物能夠結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白并抑制發(fā)動(dòng)蛋白的GTP酶活性。
本發(fā)明的另一方面是提供如通式III的化合物或其生理可接受的鹽，其中M-Sp-M’ 通式III其中M和M’分別獨(dú)立為通式IV所示的結(jié)構(gòu)部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區(qū)； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團(tuán)；并Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫、未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y與Z基團(tuán)稠合形成取代或未取代的5員或6員雜環(huán)，或是碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，如果雜環(huán)或碳環(huán)有取代基，取代基是選自氰基、NH、硝基、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫、或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)的至少一種，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區(qū)上的NH、O或S；和
Z是選自(a)非取代的含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子；(b)非取代的含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的碳環(huán)；(c)含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的酰基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，被至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代基、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；幕鶊F(tuán)取代；和(d)含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)的碳環(huán)，在W是CH或一連接基團(tuán)時(shí)，或W、V和Y形成非取代的碳環(huán)時(shí)有至少兩個(gè)取代基，或者在W、V和Y形成雜環(huán)時(shí)，有至少一個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；?；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，有至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的酰基的取代基；其中當(dāng)M或M′中的一個(gè)Z選自(b)時(shí)，而另一個(gè)M或M′中的Z選自(a)、(c)和(d)，并且條件是當(dāng)R是CXR’，X是O，R’是鍵合在間隔區(qū)上的NH，V是C，W是CH，Y是氰基時(shí)，M和M′中至少一個(gè)的Z不是如通式IVa所示的芐基基團(tuán)，
R1、R2和R5是H，R3和R4是羥基；或者當(dāng)Sp是C2-C4的烷基間隔時(shí)，R1和R5是H，R2至R4是羥基；其中Z’是與W基團(tuán)相連接的碳原子。
優(yōu)選的是，當(dāng)本發(fā)明或根據(jù)本發(fā)明給藥的化合物的M或M′的一個(gè)Y取代基是氫時(shí)，M或M′的另一個(gè)取代基則不是氫。典型的是，M和M′的至少一個(gè)的Z不是2，3-二取代的羧酸環(huán)基團(tuán)。優(yōu)選的是，M和M′的至少一個(gè)的Z包括當(dāng)Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團(tuán)時(shí)，至少有兩個(gè)鄰位取代基；或當(dāng)Z是選自(c)的雜環(huán)時(shí)，該取代基或取代基之一在與該雜原子或雜原子之一相鄰的碳原子上；或當(dāng)W、V和Y形成與Z稠合的雜環(huán)時(shí)，在碳原子上的該取代基或取代基之一與雜環(huán)至少有一個(gè)鍵長(zhǎng)。
本發(fā)明的另一方面是提供通式I或通式III的化合物的前藥。
本發(fā)明的另一方面是提供含有通式III化合物，或其生理可接受鹽，或其前藥以及生理可接受的賦形劑、載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面是提供篩選具有結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白及抑制發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性能力的二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物的方法，該方法包括將發(fā)動(dòng)蛋白或具有發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性的物質(zhì)與二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物一起培養(yǎng)以提供檢測(cè)數(shù)據(jù)；并在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上確定這些二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物是否具有抑制發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性。
具有發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性的分子可以是發(fā)動(dòng)蛋白的一個(gè)片段，該片段能夠保持GTP酶的活性，或者是，例如發(fā)動(dòng)蛋白的同系物、衍生物或類似物，它們?cè)跈z測(cè)中作為發(fā)動(dòng)蛋白的替代物。
在本說明書中的所有提及的出版物都引用于此作為參考。在本發(fā)明的說明書中，任何對(duì)文獻(xiàn)、所用物質(zhì)、設(shè)備、物品等的討論都僅僅是為了對(duì)本發(fā)明的目的的說明。所有這些形成了部分現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)或是與本發(fā)明相關(guān)的公知常識(shí)，即如同它們?cè)诒旧暾?qǐng)優(yōu)先權(quán)日之前在澳大利亞或其它地域已經(jīng)存在，并不需要許可。
在本說明書中，術(shù)語“包括”應(yīng)當(dāng)理解為是對(duì)一定的要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組合的包含，但并不排除其它要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組合。
本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式和附圖中更為詳細(xì)地加以說明。
附圖簡(jiǎn)要說明附

圖1顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47(a，b)抑制發(fā)動(dòng)蛋白I和發(fā)動(dòng)蛋白II的GTP酶的活性的圖表。0.2μg發(fā)動(dòng)蛋白I(c，d)和發(fā)動(dòng)蛋白II(e，f)的GTP酶活性的測(cè)量是使用1.3Ci 在存在或不存在二-酪氨酸磷酸化抑制劑(c，e)或酪氨酸磷酸化抑制劑A47(d，f)的情況下進(jìn)行?；净钚?開環(huán))和磷脂-應(yīng)激活性(固環(huán))進(jìn)行比較；附圖2硝基纖維素膜的自動(dòng)射線相片，說明結(jié)合在發(fā)動(dòng)蛋白I和發(fā)動(dòng)蛋白II上的[α-32P]-GTP不受加入的二-酪氨酸磷酸化抑制劑或酪氨酸磷酸化抑制劑A47(a，b)的影響。數(shù)據(jù)在表(c)和(d)上顯示；附圖3(a)圖表顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑沒有在發(fā)動(dòng)蛋白I的PH區(qū)域發(fā)揮作用，因?yàn)榛衔镆廊灰种迫鄙龠@一區(qū)域(″發(fā)動(dòng)蛋白I-Delta PH″)的重組發(fā)動(dòng)蛋白突變體GTP酶活性；(b)考馬斯藍(lán)染色的SDS凝膠照片，其顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑不阻斷發(fā)動(dòng)蛋白結(jié)合到脂類，發(fā)動(dòng)蛋白保留在藥丸(P)中而不是在上清液(S)中；附圖4在分離的神經(jīng)末梢(突觸體)進(jìn)行的細(xì)胞外攝(a，c)和細(xì)胞內(nèi)攝(b，d)的熒光檢測(cè)顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑而不是酪氨酸磷酸化抑制劑A47特別能夠降低細(xì)胞內(nèi)攝作用?；厥招苁窍鄬?duì)于前面的外排量細(xì)胞內(nèi)攝的更精確量度，二-酪氨酸磷酸化抑制劑對(duì)回收效能(e)有明顯的阻斷作用。
附圖5分離的大鼠腦神經(jīng)末梢(突觸體)的電子顯微照片顯示在加入二-酪氨酸磷酸化抑制劑后，通過去極化刺激(a，b)和囊泡卷曲凹陷(c-h)的積累，突觸囊泡在末梢的缺失；和附圖6圖表顯示德克薩斯紅標(biāo)記的鐵傳遞蛋白進(jìn)入Swiss 3T3細(xì)胞(a-d)或HER14細(xì)胞的內(nèi)化作用(e-h)在用100μM二-酪氨酸磷酸化抑制劑預(yù)孵化處理15分鐘后受到抑制。DAPI(藍(lán))染色的部分是細(xì)胞核。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明術(shù)語“烷基”包含直鏈或支鏈飽和脂肪基團(tuán)。術(shù)語“C1-C2的烷基”意思是烷基鏈的長(zhǎng)度。這樣的烷基基團(tuán)包括甲基、乙基、1-甲基-乙基和1，1-二甲基-乙基基團(tuán)。
術(shù)語“C1-C2的基團(tuán)”或“C1-C3的基團(tuán)”包括具有一定數(shù)量碳原子的飽和或不飽和的脂肪族基團(tuán)，可以是有支鏈的，也可以是沒有支鏈的。這樣的基團(tuán)包括烷基和烯基基團(tuán)。烯基基團(tuán)包括至少一個(gè)雙鍵。C1-C3的基團(tuán)的例子包括甲基、乙基、丙基、異丙基、1，3-二甲基丙基、1-甲基-3-乙基丙基、乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基和2-甲基-1-丙烯基。
術(shù)語“C1-C2”烯基基團(tuán)包括通過雙鍵與Z的雜環(huán)或碳環(huán)基團(tuán)相連接的C1基團(tuán)。
術(shù)語“C1-C2的烷氧基”包括由一定數(shù)量碳原子組成的一定長(zhǎng)度的烷氧基基團(tuán)。烷氧基基團(tuán)可以含有一個(gè)碳碳雙鍵。
術(shù)語“碳環(huán)基團(tuán)”包括由碳原子組成的一個(gè)或多個(gè)環(huán)基團(tuán)。碳環(huán)或環(huán)中的至少一個(gè)含有一個(gè)或多個(gè)多重鍵。在W、V和Y在通式I或通式III中成環(huán)時(shí)，形成的碳環(huán)優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。
術(shù)語“雜環(huán)基團(tuán)”包括含有一個(gè)或多個(gè)環(huán)的基團(tuán)，其中至少一個(gè)環(huán)存在雜原子，選自O(shè)、N和S。至少一個(gè)環(huán)可以含有一個(gè)或多個(gè)多重鍵。
術(shù)語“二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑”表示包含兩個(gè)酪氨酸磷酸化抑制劑部分的化合物，這兩個(gè)部分通過一個(gè)間隔區(qū)相連接，兩個(gè)酪氨酸磷酸化抑制劑部分可以相同或不同。典型的是，酪氨酸磷酸化抑制劑部分是相同的。最優(yōu)選的是，酪氨酸磷酸化抑制劑部分是benzylidenemalonitrile基團(tuán)。二-酪氨酸磷酸化抑制劑是一種二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)它能夠結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白并抑制該蛋白的GTP酶的活性。
優(yōu)選的是，通式I或通式III的化合物中的M和M′分別獨(dú)立為通式V表示的基團(tuán)。
其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y與Z稠合形成5員或6員的取代或非取代的雜環(huán)，或碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且如果碳環(huán)或雜環(huán)有取代的話，至少有一個(gè)取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫、或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫；并R′是鍵合至間隔區(qū)的NH、O或S；并Z是如通式II中說明的基團(tuán)。
優(yōu)選的是，當(dāng)W、V和Y不環(huán)合時(shí)，Y是氰基、硝基、氨基、羥基、羧基或硫代羧基。最優(yōu)選的是，Y是氰基。
優(yōu)選的是，R是CXR′，其中X是O或S，并R′是NH、O或S。更優(yōu)選的是，X是O或S，并R′是NH。
當(dāng)Z是碳環(huán)基團(tuán)時(shí)，它可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。碳環(huán)基團(tuán)可以是例如，環(huán)烷基基團(tuán)，芳基基團(tuán)如苯基或萘基，或聚苯基團(tuán)如聯(lián)苯基。當(dāng)碳環(huán)基團(tuán)包含兩個(gè)環(huán)時(shí)，直接連在W上的環(huán)優(yōu)選含有所有的取代基，或在W是CH或連接基團(tuán)時(shí)，有至少兩個(gè)取代基，或在W、V和Y成環(huán)時(shí)，有至少一個(gè)取代基。優(yōu)選的是，Z是選自如下基團(tuán)(i)含有一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員的雜環(huán)，包括不多于3個(gè)的獨(dú)立選自O(shè)、N和S的雜原子；(ii)含有一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員的雜環(huán)，包括不多于3個(gè)的獨(dú)立選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)含有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述的取代基獨(dú)立選自硝基、NH、鹵素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基；和(iii)含有一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員環(huán)的碳環(huán)，含有至少兩個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、NH、氨基、鹵素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
優(yōu)選的是，當(dāng)Z基團(tuán)是碳環(huán)并有鹵素、氰基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；〈鶗r(shí)，Z基團(tuán)通常還含有至少兩個(gè)其它取代基，優(yōu)選獨(dú)立選自硝基、NH、氨基、羥基、羧基、氧代和硫，最優(yōu)選為硝基、NH、氨基、羥基和羧基。優(yōu)選的是，碳環(huán)基團(tuán)是芳基基團(tuán)，最優(yōu)選的是，取代的芐基基團(tuán)。
優(yōu)選的是，當(dāng)Z基團(tuán)是雜環(huán)時(shí)，它有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員的環(huán)，雜原子數(shù)不超過3個(gè)，選自O(shè)和N，其中雜環(huán)有一個(gè)或多個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、NH、氨基、鹵素、羥基、羧基和氧代，或是一個(gè)芳基基團(tuán)，具有一個(gè)5或6員的單環(huán)，并至少兩個(gè)取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基和羧基。優(yōu)選的是，芳基基團(tuán)是取代的苯基基團(tuán)。
優(yōu)選的是，雜環(huán)是取代或未取代的imadazolyl、吡喃基、異芐基呋喃基、呋喃基、苯并吡喃基、吡咯基、2H-吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、中氮茚基、異吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、pthalazinyl、萘啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、噻吩基、或苯并噻吩基。最優(yōu)選的是，雜環(huán)基團(tuán)是取代的上述基團(tuán)。
在W、V和Y形成與Z稠合的5或6員雜環(huán)的情況下，所得與Z結(jié)合的基團(tuán)典型地是取代或未取代的兩個(gè)環(huán)的雜環(huán)基團(tuán)。所得基團(tuán)可以是例如取代或未取代的雜環(huán)基團(tuán)，選自imadazolyl、苯并吡喃基、中氮茚基、異吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、pthalazinyl、萘啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、苯并噻吩基，和異苯并呋喃基。優(yōu)選的是，所得基團(tuán)是取代或未取代的苯并吡喃基、吲哚基或異喹啉基。再者，由W、V和Y環(huán)合形成的雜環(huán)基團(tuán)優(yōu)選是取代的基團(tuán)。
最優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物或根據(jù)本發(fā)明的方法給予哺乳動(dòng)物的化合物是下述化合物，其中M和M′分別獨(dú)立是通式VI所述的化合物，它們可以相同或不同，并 X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或
R1和Y形成5或6員的取代或未取代的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)含有1或2個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且無論是雜環(huán)還是碳環(huán)，至少一個(gè)取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫；并且R2至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；?；或R1至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；?；或R是與Sp間隔區(qū)連接的NH、O和S；并其中至少M(fèi)和M′中的一個(gè)特征如下R1至R5的至少兩個(gè)不是氫，且當(dāng)R1至R2不是氫時(shí)，R3至R5也不是氫，或者當(dāng)R1和Y形成未取代的碳環(huán)時(shí)，R2至R5的至少兩個(gè)不是氫，當(dāng)Y與R1形成雜環(huán)時(shí)，R2至R5的至少一個(gè)不是氫。
最優(yōu)選的是，當(dāng)Y與R1不環(huán)合并且R1和R2不是氫時(shí)，R3也不是氫。典型的是，R1-R5的至少兩個(gè)是鄰位取代。當(dāng)化合物有三個(gè)取代基時(shí)，優(yōu)選取代基彼此相鄰。優(yōu)選的是，在這種情況下，R1-R3均不為氫，或R2-R5均不是氫。
當(dāng)R1-R5或R2-R5中的至少一個(gè)是鹵素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；?，另外的取代基的至少一個(gè)選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，R1和Y形成雜環(huán)，或者至少兩個(gè)其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基而R1和Y不成環(huán)或形成未取代的碳環(huán)。
鹵素的取代典型的是選自氟、氯、溴和碘。優(yōu)選的是，鹵素的取代選自氟和氯。
優(yōu)選的是，通式I或通式III的連接基團(tuán)包含單個(gè)原子或不超過3個(gè)原子長(zhǎng)度的鏈，其中一個(gè)或多個(gè)原子是除碳原子外的其它原子，如N、O或S。優(yōu)選的是，連接基團(tuán)是C1-C3的基團(tuán)。連接基團(tuán)可以是取代或未取代的，可包括一個(gè)或多個(gè)雙鍵。取代基可選自羥基、氨基、鹵素、硝基或其它不會(huì)影響化合物活性的基團(tuán)。最優(yōu)選的是，連接基團(tuán)是未取代的。
優(yōu)選的是，本發(fā)明或根據(jù)本發(fā)明對(duì)哺乳動(dòng)物給藥的化合物的間隔區(qū)部分Sp允許化合物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。最優(yōu)選的是，間隔區(qū)部分是取代或未取代的1-7個(gè)原子的鏈，其可以包含一個(gè)或多個(gè)非碳原子，如N、O或S，以及一個(gè)或多個(gè)雙鍵。然而，任何適當(dāng)?shù)拈g隔區(qū)都應(yīng)該保證化合物的發(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用的抑制性能。間隔區(qū)可以被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述取代基選自羥基、氨基、鹵素和硝基，或其它不影響分子鏈的構(gòu)象和彈性的基團(tuán)。最優(yōu)選的是，間隔區(qū)部分是取代或未取代的烷烴鏈。典型的是，該間隔區(qū)是具有下述結(jié)構(gòu)的非取代烷烴鏈-CH2(CH2)nCH2-其中n是1-5的整數(shù)，通常是2或3。
適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽和氨基酸加成鹽，酯和酰胺，在合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比例范圍內(nèi)，具有藥學(xué)上的效果，與動(dòng)物組織接觸不存在毒性、刺激性、過敏性反應(yīng)。代表性的鹽包括鹽酸鹽、硫酸鹽、重硫酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、草酸鹽和硼酸鹽。這些鹽可以通過例如是將相應(yīng)的酸與通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物混和而制備。該鹽可以包括堿金屬或堿土金屬陽離子例如鈉、鈣、鎂和鉀，以及銨鹽和胺陽離子。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受的鹽的例子在下述文獻(xiàn)中有記載S.M Berge等人的J.PharmaceuticalSciences(1997)，661-19，其內(nèi)容全文引用于此作為參考。有代表性的酯包括C1-C7的烷基酯、苯基酯和苯基(C1-6)烷基酯。優(yōu)選的酯包括甲酯。
通式I和通式III的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑及其類似物的前藥，包括那些選自碳酸鹽、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯的組，其共價(jià)的與化合物、二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑及其類似物的自由氨基、酰氨基、羥基或羧基基團(tuán)相連接。適宜的前藥還包括磷酸鹽衍生物如酸、酸的鹽或酯，通過磷氧鍵與自由羥基或其它通式I或通式III的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑及其類似物相連接。前藥在施用時(shí)可以是非活化的，其在體內(nèi)通過修飾成為能夠結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白而產(chǎn)生活性的化合物，如抑制蛋白的GTP酶活性，方式可以是在施用后鍵的裂解或水解，或其它的方式。優(yōu)選的是，活性化合物的前藥形式具有比活性化合物更強(qiáng)的細(xì)胞膜滲透性能，能夠增強(qiáng)活性化合物的效能。前藥還可能設(shè)計(jì)成體內(nèi)水解時(shí)在細(xì)胞外部避免過早發(fā)生效力的形式，如為達(dá)到最佳細(xì)胞作用效果及化合物的全身性應(yīng)用的適當(dāng)?shù)募?xì)胞膜滲透性能。
細(xì)胞內(nèi)攝作用是各種人群疾病的直接或主要的原因。一類特定的小囊泡運(yùn)輸性疾病已經(jīng)公布，參見Aridor and Hannan 2000，Traffic1836-851 and Aridor and Hannan 2002，3781-790，這些文獻(xiàn)全文引用于此作為參考。因此，本發(fā)明的方法能夠用于預(yù)防或治療癌癥、眼科疾病、免疫缺陷病、胃腸道疾病、病毒及細(xì)菌感染、其它致病性感染、神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和腎病和病癥，以及其它涉及發(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用的疾病，或?qū)Πl(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用的抑制作用敏感的疾病。
例如，眾所周知，人類多瘤病毒JCV是進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病的致病體，該病是一種致命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)脫髓鞘疾病，該致病體對(duì)神經(jīng)元的入侵，由細(xì)胞內(nèi)攝作用抑制劑所阻斷，此種抑制劑的例子如氯丙嗪(Atwood W.，2001)。類似地，HIV感染(Wyss S.et al.，2001)，流感病毒(Roy A.，et al.2000)以及腺伴隨病毒(Duan D.etal.，1999)是通過細(xì)胞內(nèi)攝作用起效的，其對(duì)細(xì)胞內(nèi)攝作用抑制劑敏感。
另外，生長(zhǎng)因子受體(如E(GF-R)需要發(fā)動(dòng)蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化并維持通過指令的細(xì)胞生長(zhǎng)(Seto E.et al.，2002)。通過阻斷發(fā)動(dòng)蛋白的細(xì)胞內(nèi)攝作用來阻止細(xì)胞增殖有許多實(shí)例(Grieb T.etal.，2000)并且提供了證據(jù)，即發(fā)動(dòng)蛋白II(非神經(jīng)元形式)抑制劑具備抗癌活性。Dent′s疾病(多囊性腎病)也涉及C1C-5氯化物途徑的細(xì)胞內(nèi)攝作用，并且細(xì)胞內(nèi)攝作用阻斷劑阻止細(xì)胞內(nèi)攝(Schwake M.etal.，2001)。
發(fā)動(dòng)蛋白是所有從細(xì)胞表面、高爾基體、內(nèi)含體和線粒體進(jìn)行內(nèi)攝運(yùn)輸?shù)暮诵?。一些神?jīng)變性疾病與這些運(yùn)輸通道有關(guān)。兩個(gè)涉及到β-淀粉狀蛋白的產(chǎn)生的形式被稱為內(nèi)攝作用和分泌途徑(Aridor&Hannan 2000)。在腦部，細(xì)胞內(nèi)攝作用扮演重要角色的疾病和病癥包括阿爾茨海默病、亨廷頓氏病(HD)、僵直性綜合征、Lewy體病和Niemann-Pick細(xì)胞C型病(Cateldo et al.，2001；Metzler et al，2001；Ong et al.，2001；Smith et al.，2000)。
在阿爾茨海默病中β-淀粉狀蛋白的前體蛋白(APP)從軸突細(xì)胞表面內(nèi)攝至包涵素包裹的小囊泡中并在再循環(huán)的突觸泡中分揀，轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)含體和細(xì)胞質(zhì)中(Marquez-Sterling N.etal.，1997)。內(nèi)含體是APP或ApoE內(nèi)攝后發(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝通道的第一個(gè)隔室(Smythies J.，2000)并且在阿爾茨海默病病人的腦中的錐形神經(jīng)元中有明顯的改變(Cataldo A.et al.，1997)。在APP存在下和β-淀粉狀蛋白形成時(shí)細(xì)胞內(nèi)攝途徑的活性顯著，并且是一些阿爾茨海默病患者腦部易損區(qū)域神經(jīng)元的早期特征(Cataldo A.et al.，2001)。
亨廷頓氏病(HD)是一種神經(jīng)變性疾病，主要影響紋狀體神經(jīng)元，雖然突變體基因產(chǎn)物亨廷頓不是腦中特有的物質(zhì)。亨廷頓強(qiáng)烈作用于亨廷頓作用蛋白1(HIP1)的同族成員。亨廷頓-HIP1的相互作用受到腦的限制，并其影響與亨廷頓的聚谷氨酰胺長(zhǎng)度成反比。正常亨廷頓-HIP1的缺失會(huì)導(dǎo)致腦中膜細(xì)胞支架的完整性的缺損。HIP1是發(fā)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝裝置的基本組成(Metzler M.et al.，2001)。因此，大量的報(bào)導(dǎo)都是關(guān)于細(xì)胞內(nèi)攝異常的HD神經(jīng)缺損的(Aridor &Hannan，2000；Metzler M.etal.，2001)。
另一個(gè)例子是突觸前瘢痕形成蛋白(synuclein protein)，該蛋白是Lewy體病病因的笫一候選因素，包括帕金森氏病、Lewy體癡呆和Lewy體AD變異。外源性瘢痕形成由于細(xì)胞內(nèi)攝作用和胞漿內(nèi)包涵物的形成而引起神經(jīng)細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡和α-瘢痕聚集是人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)攝作用的直接結(jié)果(Sung J.et al.，2001)。細(xì)胞內(nèi)攝作用還涉及到癲癇的發(fā)生。例如，靶向斷裂雙側(cè)內(nèi)攝蛋白synaptojanin(SJ)及兩棲植物內(nèi)攝蛋白的大鼠降低了SVE并死于癲癇的發(fā)作(DiPaolo et al.，2002)，顯示其在神經(jīng)元興奮性上的作用并與癲癇有關(guān)聯(lián)。
細(xì)胞內(nèi)攝的途徑也會(huì)被病毒、毒素和共生的微生物所利用以進(jìn)入細(xì)胞。例如，肉毒桿菌神經(jīng)毒素和破傷風(fēng)神經(jīng)毒素都是細(xì)菌蛋白，能夠抑制特異突觸的遞質(zhì)釋放，并引起兩種嚴(yán)重的神經(jīng)性麻痹疾病，破傷風(fēng)和肉素桿菌申毒。它們的行為依賴于其向神經(jīng)末梢的細(xì)胞內(nèi)攝作用(Humeau et al.，2000)。因此，靶向的細(xì)胞內(nèi)攝作用的抑制可用于臨床。
因此，本發(fā)明的方法應(yīng)用的預(yù)防或治療的特定疾病包括但不限于多灶性白質(zhì)腦病、多囊性腎病、β-淀粉樣蛋白相關(guān)的疾病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、僵直綜合征、Lewy體病、Lewy體衰(dimentias)、帕金森氏病、癲癇、破傷風(fēng)、肉毒桿菌中毒、HIV感染、流行性感冒和粘脂病。
優(yōu)選的是，本發(fā)明施用于哺乳動(dòng)物的通式I的化合物是二聚的benzylidenemalonitrile酪氨酸磷酸化抑制劑或其前藥。最優(yōu)選的是，二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑是二-酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物。已知二-酪氨酸磷酸化抑制劑或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑的特征和/或基團(tuán)能夠提供結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白的能力并抑制發(fā)動(dòng)蛋白的活性，其類似物更具體地說模擬物可以設(shè)計(jì)成結(jié)構(gòu)不同，而活性能夠保留。本文所述方法中二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑類似物和特定的二-酪氨酸磷酸化抑制劑類似物的應(yīng)用也包括在本發(fā)明當(dāng)中。
術(shù)語“類似物”包括分子結(jié)構(gòu)不同于二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑但保持了一個(gè)或多個(gè)二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑的生物學(xué)性能或活性特征的相似。類似物具有基本上與二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑完全相似的結(jié)構(gòu)特征，或包括一個(gè)或多個(gè)二聚酪氨酸磷酸化抑制劑提供生物學(xué)性能或活性特征的區(qū)域，或其另涉及提供生物學(xué)性能或活性。二-酪氨酸磷酸化抑制劑的類似物可以通過在化合物的一個(gè)或兩個(gè)芳香基團(tuán)上以其它適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)或許多不同的合適基團(tuán)取代一個(gè)或兩個(gè)羥基取代基而得到。另外，化合物的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)也可以被消去、修飾或替換。
類似物的設(shè)計(jì)典型的包括確定原始化合物的物理性質(zhì)，如分子大小、電荷分布和三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或鑒定化合物是否保留結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白的能力。特別是，原始的化合物要考慮其立體化學(xué)結(jié)構(gòu)和利用x-射線衍射、核磁共振以及商購計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)軟件確定的物理性質(zhì)。優(yōu)選的是，模型應(yīng)考慮化合物與發(fā)動(dòng)蛋白的相互作用，由于相互作用引起的構(gòu)象的任何變化都應(yīng)當(dāng)在類似物設(shè)計(jì)時(shí)加以考慮。這樣的模型設(shè)計(jì)技術(shù)是公知的技術(shù)，是在普通技術(shù)人員能夠知曉的范圍內(nèi)。適宜的模擬技術(shù)包括Accelrys Catalyse_Pharmacore Development和AccelrysCerius 4.8 LigandFit_ protocols(Accelrys Inc.，San Diego，California，USA)的應(yīng)用。更為適宜的模擬技術(shù)包括MacSpartan ProVersion 1.1 protocols(Wave Function Inc，Irvine，California，USA)的應(yīng)用。
類似物還可以選擇或衍生自模板分子，其上含有化學(xué)基團(tuán)，可提供分子所需的物理化學(xué)性質(zhì)，或者是為得到所需的物理化學(xué)性質(zhì)便利的化學(xué)反應(yīng)。模板分子和化學(xué)基團(tuán)的選擇是基于化學(xué)合成的容易程度，在體內(nèi)降解的潛在危險(xiǎn)，穩(wěn)定性和在施用后保持生物學(xué)活性的能力。技術(shù)人員容易理解的是，藥學(xué)上可接受性等也同樣在設(shè)計(jì)中加以考慮。
根據(jù)本發(fā)明施用的化合物可以和一種或多種其它化合物或藥用一同施用。例如，一個(gè)化合物可以與化學(xué)療法藥物聯(lián)合或結(jié)合共同給予哺乳動(dòng)物，所述化學(xué)療法藥物是常規(guī)的用于預(yù)防或治療特定的哺乳動(dòng)物疾病或病癥的藥物。術(shù)語“共同給予”意思是以同樣的劑型或兩種不同的劑型以相同或不相同的途徑同時(shí)給藥，或以相同或不相同的途徑順序給藥。術(shù)語“順序給藥”意思是在一定的時(shí)間間隔內(nèi)化合物和其它藥物順序給予，時(shí)間間隔從很短的時(shí)間至幾個(gè)小時(shí)或是幾天。
適宜的藥物組合物包括適于注射的溶液劑。這樣的可注射的組合物是具有注射能力的流體，典型的是在生產(chǎn)后能夠至少貯存幾個(gè)月保持穩(wěn)定。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括一種或多種表面活性劑、生理鹽水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等等)、植物油和它們的混和物。
對(duì)于口服給藥，化合物可以加入適于口服的惰性稀釋劑、可同化的食用載體配制，或者例如包封于硬制或軟制的明膠膠囊中?？蛇x擇的，可以直接加入到食物當(dāng)中。而且，化合物可以與一種或多種賦形劑、崩解劑共同給予，賦形劑的例子是磷酸二鈣，崩解劑的例子是玉米淀粉、土豆淀粉或海藻酸，劑型可以是可吸收的片劑、口含片、糖錠、膠囊、酏劑、混懸劑和糖漿劑。
片劑、丸劑等還可以含有一種或多種粘合劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑和芳香劑，粘合劑的例子是西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠，潤(rùn)滑劑的例子是硬脂酸鎂，甜味劑的例子是蔗糖、乳糖、糖精。當(dāng)劑型是膠囊時(shí)，除了一種或多種上述成分還可以含有液體載體。多種其它成分可以存在于包衣中。另外，化合物可以存在于任何適當(dāng)?shù)某掷m(xù)釋放的劑型當(dāng)中。
化合物可以典型的配制成為特定個(gè)體給藥的含有藥學(xué)可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。任何確信的常規(guī)載體稀釋劑和賦形劑都可以使用。適宜的藥學(xué)可接受的載體和賦形劑包括公知的溶劑、分散介質(zhì)和等滲溶液。這些成分和介質(zhì)的藥用是公知的。典型的是，本發(fā)明的組合物還可以結(jié)合一種或多種防腐劑，如對(duì)羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸和thimersal。用于本發(fā)明組合物的適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受載體和制劑的例子在常規(guī)的手冊(cè)或教科書當(dāng)中都有描述，例如“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(MackPublishing Co.，1995)”，該文獻(xiàn)的內(nèi)容全文引用于此作為參考。
特別優(yōu)選的劑型是單元?jiǎng)┬偷姆俏改c道組合物，其容易給藥且劑量均勻。這里的單元?jiǎng)┬椭傅氖墙o予患者適度的單元?jiǎng)┝浚恳粏卧蓄A(yù)定量的經(jīng)計(jì)算能夠產(chǎn)生需要的預(yù)防或治療效果的活性物質(zhì)，和選擇的載體和/或賦形劑。
化合物的劑量依賴于許多因素，包括化合物的預(yù)防或治療目的、給藥的條件、病癥的嚴(yán)重程度、患者的年齡以及其它一些相關(guān)因素，比如體重和一般由醫(yī)師和護(hù)理人員按通常的原則確定的健康狀況。例如，可以在最初給予低劑量，而后在評(píng)估患者的反應(yīng)后再逐漸增加。類似地，給藥的頻率也可以用相同的方法確定，即在每次給藥之間連續(xù)監(jiān)測(cè)患者的反應(yīng)，如果需要的話，可增加給藥的頻率，或減低給藥的頻率。
藥物組合物給藥途徑也依賴于將給予組合物的疾病或病癥的本質(zhì)。適當(dāng)?shù)慕o藥途徑包括但不限于呼吸系統(tǒng)、氣管內(nèi)、鼻腔內(nèi)、靜脈、腹膜內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、輸注、口服、經(jīng)直腸、局部及緩釋植入。對(duì)于靜脈給藥途徑，特別適合的是注射入腫瘤或特定治療的器官的血管內(nèi)?；衔镞€可以釋放至體腔中，例如胸膜腔或腹膜腔內(nèi)，或直接注射至腫瘤或患病組織中。
為了更好地理解本發(fā)明，將借助以下非限定性的實(shí)施例描述本發(fā)明的優(yōu)選形式。
實(shí)施例1發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性的酪氨酸磷酸化抑制劑的抑制作用的鑒定1.1材料和方法磷脂酰絲氨酸、1，2-甘油二油酸酯、鈣調(diào)節(jié)素、ATP、GTP、亮肽酶素、苯甲基磺酰氟化物、吐溫80、二(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸鹽(BS3)和谷胱甘肽瓊脂糖得自Sigma。木瓜蛋白酶和抗痛素二鹽酸化物得自Boehringer Mannheim(德意志聯(lián)邦共和國(guó))。凝膠電泳試劑和裝置來源于Bio-Rad。 (3000 Ci/mmol)和 (25μCi/mmol)得自Amersham plc，UK。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記器和色譜樹脂來源于Pharmacia。所有其它試劑都是分析純級(jí)或更好的。
1.1.1蛋白質(zhì)的制備GST-Amph2-SH3(肌肉Amph2)(Butler et al.，1997)的質(zhì)粒由Pieto DeCamilli，Yale，Conneticut，USA提供，置于pGEX2T載體中。質(zhì)粒在大腸桿菌中生長(zhǎng)，GST-Amph2-SH3融合蛋白在谷胱甘肽(GSH)-瓊脂糖中通過洗脫進(jìn)行純化，洗脫液為10mM還原型GSH的20mM Tris-HCl溶液，pH7.5，在不含有GSH的相同緩沖液中透析，并在4℃保存。從綿羊腦中純化發(fā)動(dòng)蛋白，方法是從整個(gè)腦的周邊膜部分進(jìn)行提取(Robinson et al.，1993)并如先前所述的在GST-Amph2-SH3-瓊脂糖進(jìn)行純化(Marks and McMahon.，1998)，從250g綿羊腦中得到8mg蛋白質(zhì)。重組發(fā)動(dòng)蛋白II在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，并得自Dr Sandra Schmid(Scripps，San Diego，CA)。缺少PH區(qū)域的重組發(fā)動(dòng)蛋白I(發(fā)動(dòng)蛋白PH，得自Robin Scaife)通過顆粒病毒感染在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)(Salim et al.，1996)。
1.1.2 GTP酶的檢測(cè)發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶的活性是通過水解 確定的，方法基本是先前所描述的方法(Robinson et al.，1993)。簡(jiǎn)單地說，純化的發(fā)動(dòng)蛋白I或發(fā)動(dòng)蛋白II(0.2μg/管)在GTP酶緩沖液(10mM Tris，10mM NaCl，2mM Mg2+，0.05％吐溫80，pH7.4，1μg/ml亮肽酶素和0.1mM PMSF)和含有0.3mM GTP和1.3 Ci 尾酒中在30℃下培養(yǎng)10分鐘，條件是含或不含不同濃度的抑制劑或DMSO介質(zhì)。最終檢測(cè)體積為40μl。發(fā)動(dòng)蛋白活性在基線及加入5μg/ml的L-磷脂酰絲氨酸的磷脂應(yīng)激下測(cè)定。反應(yīng)用100μl的GTP酶終止緩沖液(2％甲酸，8％乙酸，pH1.9)終止，而后加入600μl酸洗過的炭溶液(7％炭的酸性溶液(w/v))和100μl BSA(5mg/ml)。離心分離5分鐘后，(室溫下13,000rpm)，上層液取200μl在計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)從 的釋放的32Pi。
1.1.3[α-32P]-GTP結(jié)合的檢測(cè)[α-32P]-GTP結(jié)合的檢測(cè)是在96-孔微板上完成的。發(fā)動(dòng)蛋白(O.2μg/孔)加入到GTP酶緩沖液中，在4℃下黑暗處培養(yǎng)10分鐘。[α-32P]-GTP(2μCi/管)隨后加入到反應(yīng)體系中，在4℃下黑暗處進(jìn)一步培養(yǎng)10分鐘。微板隨后用短波長(zhǎng)的紫外燈在315nm下照射30分鐘，照射范圍為8cm。照相標(biāo)識(shí)的專屬性通過比較存在或不存在1mM冷的GTP的標(biāo)識(shí)加以確定。樣品隨即用抽吸法通過24孔板施用于硝基纖維素膜上。硝基纖維素用PBS洗三遍，干燥。聯(lián)合核苷酸通過磷光計(jì)加以測(cè)定(分子動(dòng)力學(xué))。
1.1.4磷脂結(jié)合和螺旋組合純化于綿羊全腦的發(fā)動(dòng)蛋白I(50μg/ml)與磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體(80μg/ml，在30mM Tris/HCl pH7.4中聲處理)一起在100μl組裝緩沖液(1mM EGTA，30mM Tris，100mM NaCl，1mM DTT，1mMPMSF，和完全蛋白酶抑制劑雞尾酒片劑(Roche))中培養(yǎng)，條件是存在或不存在1mM Mg/GTP，溫度25℃，時(shí)間一小時(shí)。樣品在14,000rpm離心處理15分鐘以分離脂類物質(zhì)結(jié)合(P)和游離(S)的發(fā)動(dòng)蛋白以及用凝膠電泳在12％SDS聚丙烯酰胺凝膠下分析的餾分。存在時(shí)，藥物(10μM和100μM)與磷脂在與發(fā)動(dòng)蛋白I培養(yǎng)之前預(yù)混。
1.1.5德克薩斯紅-鐵傳遞蛋白在細(xì)胞中的攝取鐵傳遞蛋白(Tf)的攝取通過用先前描述過的方法(van derBliek et al.，1993)在Swiss 3T3和HER14細(xì)胞上加以分析。簡(jiǎn)單地說，細(xì)胞置于在DMEM介質(zhì)中加入10％胎牛血清中，有60％的融合，細(xì)胞首先在不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)過夜(8-10小時(shí))。德克薩斯紅-鐵傳遞蛋白(Tf-TxR，Molecular Probes，Oregon)加入得到最終濃度為5μg/ml，細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)10分鐘。細(xì)胞表面的染色通過將細(xì)胞在冰浴酸洗的溶液(0.2 M乙酸+0.5M NaCl，pH2.8)中培養(yǎng)15分鐘后去除。細(xì)胞快速地用4％的低聚甲醛固定10分鐘，用PBS洗三次。細(xì)胞核用DAPI(Molecular Probes，Oregon)染色。用DABCO裝載玻片，用Leica DMLB明視野顯微鏡和SPOT數(shù)字式照相機(jī)檢測(cè)熒光。在用抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，在加入Tf-TxR的15或60分鐘前，用DMEM補(bǔ)充二-酪氨酸磷酸化抑制劑。
1.1.6細(xì)胞內(nèi)攝作用分離的神經(jīng)末梢(突觸體)通過間斷硅石膠懸浮液梯度離心分離(Dunkley et al.，1986)得自大鼠的大腦皮層。餾份3和4混合并用于所有的實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用先前描述的攝取熒光染料FM2-10的方法(Cousin and Robinson 2000a)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)攝作用。突觸體(0.6mg/2ml)在37℃下加或不加Ca2+Krebs氏溶液的情況下進(jìn)行培養(yǎng)5分鐘。在用30mM KCl(S1)刺激的前1分鐘加入FM2-10(100M)。在FM2-10被囊泡經(jīng)內(nèi)攝作用在S1刺激期內(nèi)攝取時(shí)，突觸體在該期間與拮抗劑一起培養(yǎng)。特別地，突觸體和酪氨酸磷酸化抑制劑A47或二-酪氨酸磷酸化抑制劑在刺激前一起培養(yǎng)5分鐘。刺激后2分鐘，突觸體加入含有1mg/ml的胎牛血清的Ca2+溶液洗兩遍。洗滌步驟去除了沒有攝取的FM2-10和酪氨酸磷酸化抑制劑。洗滌過的突觸體加入Ca2+溶液在37℃下再懸浮，轉(zhuǎn)移至熒光容器中并用標(biāo)準(zhǔn)的30mM KCl(S2)激活。標(biāo)準(zhǔn)的S2激活釋放全部聚積的FM2-10，并通過染料釋放進(jìn)入溶液而導(dǎo)致的FM2-10熒光的減少測(cè)定內(nèi)攝作用(激發(fā)在488nm，發(fā)射在540nm)。
細(xì)胞內(nèi)攝作用的計(jì)算是通過用30mM KCl在S2期間熒光應(yīng)激的減少完成的。顯示的標(biāo)記表示FM2-10從突觸體釋放的平均值減去不含Ca2+的FM2-10的突觸體背景標(biāo)記的值?；厥招苡捎诳紤]到外排作用而能進(jìn)行更精確的對(duì)細(xì)胞內(nèi)攝進(jìn)行測(cè)量。回收效能的計(jì)算為內(nèi)攝/外排，其中內(nèi)攝作用的定義同上，外排作用是在應(yīng)激后2分鐘Ca2+依賴的谷氨酸的釋放?；厥招苤祵?duì)30 mM KCl規(guī)格化為比率1.0。
1.1.7谷氨酸釋放檢測(cè)谷氨酸釋放檢測(cè)是應(yīng)用谷氨酸釋放的酶聯(lián)熒光檢測(cè)(Cousin andRobinson.，2000a，b)完成的。簡(jiǎn)言之，突觸體(0.6mg/2ml)在37℃下加(1.2mM CaCl2)或不加(1mM EGTA)Ca2+Krebs氏溶液(118.5mM NaCl，4.7mM KCl，1.18mM MgCl2，0.1mM Na2HPO4，20mM Hepes，10mM葡萄糖，pH 7.4)的情況下進(jìn)行再懸浮。實(shí)驗(yàn)是在加入1mM NADP+后開始的。1分鐘后加入50U谷氨酸脫氫酶，突觸體懸浮液4分鐘后用30mM KCl激活。由于產(chǎn)生NADPH而導(dǎo)致熒光的增加通過Perkin-Elmer LS-50B熒光分光光度計(jì)在340nm激活和460nm發(fā)射的條件下加以測(cè)定。實(shí)驗(yàn)通過加入4nmol谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示Ca2+-依賴性谷氨酸的釋放，通過在相同應(yīng)激條件下加或不加Ca2+溶液的差異計(jì)算。在使用抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，在用KCl應(yīng)激前突觸體和酪氨酸磷酸化抑制劑A47或二-酪氨酸磷酸化抑制劑預(yù)孵化5分鐘。
1.1.8電子顯微鏡檢查突觸體在包括1.2mM Ca2+的Krebs氏溶液中培養(yǎng)5分鐘，然后用30mM KCl刺激2分鐘。突觸體用100μM二-酪氨酸磷酸化抑制劑預(yù)孵化5分鐘，在加入KCl前。刺激后，突觸體在微真菌中丸化1分鐘，條件是在室溫，然后在冰浴的含有5％的戊二醛的磷酸緩沖鹽下再懸浮加以固定。1小時(shí)后，在室溫下低速(2500rpm)離心5分鐘使突觸體小丸松散。小丸用MOPs緩沖液以低速旋轉(zhuǎn)(2500rpm)方式7分鐘共洗滌三次，然后在10％牛血清白蛋白(BSA)的水溶液中再懸浮，在室溫下穩(wěn)定20分鐘。突觸體然后再在低速下(2500rpm)離心7分鐘，用Karnovsky′s固定劑覆蓋并在4℃下培養(yǎng)過夜。小丸隨即漂洗，并在四氧化鋨緩沖溶液中固定3小時(shí)。突觸體然后再漂洗，并在2％的水性乙酸雙氧鈾中染色1小時(shí)，之前連續(xù)洗滌10分鐘并干燥，所用的溶液是50％乙醇加0.1％NaCl；70％乙醇加0.1％NaCl；95％乙醇加0.1％NaCl，100％乙醇加0.1％NaCl兩次及100％丙酮兩次。然后用丙酮/樹脂混和液(1∶1)浸潤(rùn)1小時(shí)，在70℃下用10分鐘時(shí)間用Spur′s環(huán)氧樹脂洗滌3次，再植入裝填Spur′s環(huán)氧樹脂的器皿中在70℃下保持10小時(shí)。
超薄切片機(jī)Ultracut-E(Reichert，Germany)用于得到0.5m的環(huán)氧樹脂。切割使用金剛石刀具(Diatome，Switzerland)，在水滴中懸浮，置于電子顯微鏡網(wǎng)格并雙重染色先用2％乙酸雙氧鈾的乙醇溶液15分鐘，再在Reynold′s檸檬酸鉛中4分鐘。網(wǎng)格用水洗滌，用濾紙吸干，并保存至電子顯微分析開始時(shí)。分析是在Phillips1L-BioTwin(Einhoven，Netherlands)電子顯微鏡上進(jìn)行的，圖片印制在電子顯微鏡平板膠片上(Kodak，4489，8.3cm×10.2cm)。
1.2結(jié)果1.2.1二-酪氨酸磷酸化抑制劑抑制發(fā)動(dòng)蛋白I和發(fā)動(dòng)蛋白II的GTP酶的活性發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性在細(xì)胞內(nèi)攝作用中從原生質(zhì)膜生成囊泡的過程中起著十分重要的作用。為最初找到神經(jīng)特異性發(fā)動(dòng)蛋白I抑制劑，許多蛋白激酶抑制劑和一些具有高的ATP酶活性位置抑制性能的脂質(zhì)激酶抑制劑都進(jìn)行了檢測(cè)。這些化合物的選擇是基于一種假設(shè)，即ATP酶活性位點(diǎn)類似于GTP酶的活性位點(diǎn)，一些ATP酶抑制劑還可以靶向發(fā)動(dòng)蛋白。所得結(jié)果表明具有較低的發(fā)動(dòng)蛋白I GTP酶活性抑制能力的抑制劑可以使用。
一系列酪氨酸磷酸化抑制劑隨即進(jìn)行評(píng)估，其中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)具有抑制能力，一個(gè)是酪氨酸磷酸化抑制劑A47(IC50＝100μM)，而最具潛力的抑制劑是二-酪氨酸磷酸化抑制劑，其IC50是2μM(參見附圖1c和1d)。
酪氨酸磷酸化抑制劑A47和二-酪氨酸磷酸化抑制劑進(jìn)行了測(cè)試，以評(píng)估其是否特別抑制發(fā)動(dòng)蛋白I，或是還可以影響普遍存在的發(fā)動(dòng)蛋白II。兩藥證明都對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白II更有效力參見附圖1e和1f)。更為特別地是，酪氨酸磷酸化抑制劑A47顯示對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白II的IC50為9M而二-酪氨酸磷酸化抑制劑的IC50僅為0.5μM。這說明藥物特別作用于發(fā)動(dòng)蛋白基因產(chǎn)物，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)攝作用的藥理控制進(jìn)行設(shè)計(jì)。
1.2.2二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47不能阻止發(fā)動(dòng)蛋白I或發(fā)動(dòng)蛋白II與GTP結(jié)合為評(píng)估二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47在阻止發(fā)動(dòng)蛋白的GTP的水解，對(duì)藥物進(jìn)行檢測(cè)，以看其是否能夠?qū)Πl(fā)動(dòng)蛋白上的GTP活性位點(diǎn)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。[α-32P]-GTP結(jié)合的檢測(cè)是通過可見光電子標(biāo)記的與發(fā)動(dòng)蛋白結(jié)合的GTP完成的，其過程含或不含二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47或BIM I(附圖2a-d)。對(duì)照組(不含藥物)顯示[α-32P]-GTP結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白。在存在藥物二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47，GTP的結(jié)合未見減少，但是，在高濃度時(shí)，則有明顯增加。特別是酪氨酸磷酸化抑制劑A47，在高濃度時(shí)對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白II的GTP結(jié)合有很大的增加。TGP酶抑制劑BIM I還發(fā)現(xiàn)能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白的GTP，發(fā)現(xiàn)了[α-32P]-GTP結(jié)合的減少。
這些藥物對(duì)GTP在4個(gè)小G蛋白(Rab3A，Ras，Arf2，RalA)的活性位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)也進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)藥物都不影響[α-32P]-GTP對(duì)蛋白的結(jié)合(沒有顯示數(shù)據(jù))。這表明二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47是對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白的活性特異的，且不對(duì)其它同樣存在于神經(jīng)末梢或細(xì)胞中的G蛋白特異。
1.2.3二-酪氨酸磷酸化抑制劑不在發(fā)動(dòng)蛋白I的PH區(qū)域起作用為證實(shí)二-酪氨酸磷酸化抑制劑是否是經(jīng)PH區(qū)域抑制發(fā)動(dòng)蛋白I的，用缺乏PH區(qū)域的重組二-酪氨酸磷酸化抑制劑(ΔPH，發(fā)動(dòng)蛋白I的區(qū)域)作對(duì)比實(shí)驗(yàn)(附圖3a)。發(fā)動(dòng)蛋白I的PH區(qū)域相當(dāng)于GTP酶活性的負(fù)性調(diào)節(jié)區(qū)域，ΔPH區(qū)域的發(fā)動(dòng)蛋白I有基本的活性且不受磷脂的影響。結(jié)果顯示二-酪氨酸磷酸化抑制劑仍能抑制ΔPH區(qū)域的發(fā)動(dòng)蛋白I的超過50％的水解，大約為10μM。說明PH區(qū)域不是二-酪氨酸磷酸化抑制劑對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白I的活性位點(diǎn)，說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑一定是對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白I分子變構(gòu)位點(diǎn)起抑制作用。然而，BIM I則失去了對(duì)缺失PH區(qū)域的發(fā)動(dòng)蛋白I的GTP酶活性的抑制作用，說明該藥物是通過PH區(qū)域阻止GTP水解的。
發(fā)動(dòng)蛋白與磷脂的相互作用通過誘導(dǎo)相關(guān)的發(fā)動(dòng)蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的裝配刺激了GTP酶的活性。裝配好的發(fā)動(dòng)蛋白容易地使用簡(jiǎn)單的沉淀方法進(jìn)行檢測(cè)，該特征可用于確定二-酪氨酸磷酸化抑制劑是否調(diào)節(jié)發(fā)動(dòng)蛋白螺旋裝配或磷脂的相互作用。單獨(dú)發(fā)動(dòng)蛋白在檢測(cè)中不形成沉淀，保留在上層清液中(附圖3b，行1-2)，但在PS脂質(zhì)體(行3-4)存在時(shí)則大量存在于沉淀顆粒中。有磷脂的結(jié)合，發(fā)動(dòng)蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的裝配成功，則完全不受10或100μM二-酪氨酸磷酸化抑制劑(行5-12)。加入Mg/GTP進(jìn)行檢測(cè)但不能改變結(jié)果。這說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑不能阻止與磷脂有關(guān)的發(fā)動(dòng)蛋白。因此，二-酪氨酸磷酸化抑制劑對(duì)任何變構(gòu)的位點(diǎn)都抑制發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性，它還可以在螺旋裝配形成后具有抑制作用。
1.2.4二-酪氨酸磷酸化抑制劑，而不是酪氨酸磷酸化抑制劑A47，能夠抑制發(fā)動(dòng)蛋白I介導(dǎo)的突觸囊泡復(fù)原，并在此過程形成發(fā)動(dòng)蛋白I的環(huán)熒光測(cè)定法用于確定二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47對(duì)OVE在群體大鼠的腦神經(jīng)末梢的影響(突觸體，附圖4)。二-酪氨酸磷酸化抑制劑和A47對(duì)細(xì)胞外攝作用沒有影響(Ca2+-依賴性谷氨酸的釋放，附圖4a和4b)。二-酪氨酸磷酸化抑制劑(100μM，10分鐘)顯著抑制SVE，而酪氨酸磷酸化抑制劑A47(100μM)則不能(附圖4c和d)。在該檢測(cè)中SVE的值取決于先前外排的程度，細(xì)胞內(nèi)攝的抑制可通過計(jì)算回收效能加以定量。該參數(shù)是細(xì)胞內(nèi)攝的量值除以外排的值的比率(Cousin et al.，2001)?；厥招?表示藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)攝沒有影響。酪氨酸磷酸化抑制劑A47的回收效能值為0.95(±0.05)，而二-酪氨酸磷酸化抑制劑是0.7(±0.05，附圖4e)。這說明用二-酪氨酸磷酸化抑制劑能顯著降低SVE。
由于二-酪氨酸磷酸化抑制劑抑制發(fā)動(dòng)蛋白I的GTP酶活性(附圖1)，但不與GTP結(jié)合(附圖2)，于是進(jìn)行研究以確定二-酪氨酸磷酸化抑制劑是否也能在SVE的特定期間捕獲發(fā)動(dòng)蛋白，其中發(fā)動(dòng)蛋白是在突觸囊泡生成的環(huán)結(jié)構(gòu)中。休眠狀態(tài)的突觸體或在41mM KCl(S1)中10秒一次去極化的突觸體顯示了在電子顯微(EM)下的正常的形態(tài)學(xué)(附圖5a-b)。神經(jīng)末梢的特征為i)平滑的密封的胞漿膜，ii)完全填充小的突觸囊泡中，和iii)總是包含一至三個(gè)正常線粒體并偶爾含有突觸體，并與突觸體密度相關(guān)。當(dāng)未刺激的突觸體用二-酪氨酸磷酸化抑制劑處理后，沒有顯示對(duì)形態(tài)學(xué)的任何影響(附圖5a)。然而，對(duì)于去極化的，有大量的囊泡的損耗(附圖5b)。一小部分胞漿膜凹陷也進(jìn)行檢測(cè)(附圖5e-f)，說明沒有細(xì)胞內(nèi)攝作用。阻礙TGP水解但不阻礙GTP結(jié)合GTP的預(yù)測(cè)，一定量的卷曲的核出現(xiàn)，囊泡的頸部清晰地被濃厚的頸圈環(huán)繞著(附圖5c，d，g和h)。
1.2.5二-酪氨酸磷酸化抑制劑阻斷發(fā)動(dòng)蛋白II介導(dǎo)的受體介導(dǎo)的向Swiss 3T3和HER14細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白的細(xì)胞內(nèi)攝作用轉(zhuǎn)鐵蛋白通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝過程轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，該過程是由發(fā)動(dòng)蛋白II介導(dǎo)的。檢測(cè)二-酪氨酸磷酸化抑制和酪氨酸磷酸化抑制劑A47對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)攝至非神經(jīng)細(xì)胞的影響(附圖6)。對(duì)照細(xì)胞顯示大比例的細(xì)胞質(zhì)染色(表a和e)，這表明轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)攝進(jìn)入了細(xì)胞。細(xì)胞核用DAPI染成藍(lán)色，表示了細(xì)胞體的位置(表b，d，f和h)。加入二-酪氨酸磷酸化抑制劑，會(huì)觀察到大量的轉(zhuǎn)鐵蛋白染色的減少。酪氨酸磷酸化抑制劑A47也會(huì)有這樣的效果，雖然不是象二-酪氨酸磷酸化抑制劑那樣顯著(未顯示)。還發(fā)現(xiàn)抑制作用是濃度依賴性的。介質(zhì)DMSO對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)攝沒有作用。
1.3討論由于首先證明了果蠅突變體染色shibire，阻斷發(fā)動(dòng)蛋白以及神經(jīng)末梢細(xì)胞內(nèi)攝作用導(dǎo)致了多數(shù)SVs的耗損。由于大量的SVs具有神經(jīng)末梢的形態(tài)學(xué)特征，其損耗是很明顯的。而且，胞漿膜的形態(tài)眾所周知可提供明顯的證明說明細(xì)胞內(nèi)攝的阻斷確實(shí)發(fā)生了。二-酪氨酸磷酸化抑制劑減少了多數(shù)SVs的神經(jīng)末梢并產(chǎn)生少量的胞漿膜上的凹陷的囊泡，帶有清晰的發(fā)動(dòng)蛋白的圈或環(huán)。這樣的結(jié)果顯示環(huán)修飾且開環(huán)之前的二-酪氨酸磷酸化抑制劑的活性位點(diǎn)。但是，令人驚奇的是，發(fā)動(dòng)蛋白頸圈是很少見的。這種復(fù)雜的情形說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑阻斷的是另一個(gè)位點(diǎn)，提示發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶的活性在SVE的機(jī)理中存在兩個(gè)顯著不同的位點(diǎn)。
三個(gè)發(fā)動(dòng)蛋白基因產(chǎn)物可以介導(dǎo)至少三種形式的細(xì)胞內(nèi)攝作用。發(fā)動(dòng)蛋白I介導(dǎo)SVE，發(fā)動(dòng)蛋白II介導(dǎo)RME，發(fā)動(dòng)蛋白III介導(dǎo)后突觸脊柱處的細(xì)胞內(nèi)攝(Gray et al.，2003)。進(jìn)一步的作用機(jī)理已知公知。發(fā)動(dòng)蛋白這種有差異的抑制作用給了這些細(xì)胞功能的鑒別能力。特別是，選擇性抑制劑是非常重要的識(shí)別不同類型的細(xì)胞內(nèi)攝作用的工具，并對(duì)基于不同形式的細(xì)胞內(nèi)攝作用的病理靶向具有臨床意義。
該結(jié)果進(jìn)一步說明二-酪氨酸磷酸化抑制劑(BisT或AG537)抑制發(fā)動(dòng)蛋白I和II的GTP酶活性，并均阻斷神經(jīng)末梢(突觸體)的SVE以及轉(zhuǎn)鐵蛋白向3T3或HER14細(xì)胞的內(nèi)攝的RME。其活性位點(diǎn)不是GTP結(jié)合位點(diǎn)，也不是PH區(qū)域，所以它是變構(gòu)體的抑制劑。由于它不影響GTP的結(jié)合，故也不影響發(fā)動(dòng)蛋白裝配成環(huán)。這便形成了裝配后靶向的發(fā)動(dòng)蛋白的獨(dú)特工具。二-酪氨酸磷酸化抑制劑原先發(fā)現(xiàn)能夠抑制EGFR-TK(IC50＝0.4M)和EGF-依賴性細(xì)胞增殖(IC50＝3M)(Gazit etal.，1996)。因此，可設(shè)計(jì)保持發(fā)動(dòng)蛋白抑制活性但失去對(duì)EGFR酪氨酸激酶作用的類似物(由于酪氨酸激酶的特定決定因素已是公知，Gazit et al.，1996)。
實(shí)施例2酪氨酸磷酸化抑制劑類似物的研制 二-酪氨酸磷酸化抑制劑(1)和酪氨酸磷酸化抑制劑A47(2)2.1類似物的研制二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47的結(jié)構(gòu)如上所示。這些3，4-二羥基苯的化合物結(jié)構(gòu)的相似性及氨腈或硫代酰胺結(jié)構(gòu)的存在說明這些基團(tuán)對(duì)于發(fā)動(dòng)蛋白抑制作用非常重要。這些特征可以解決程序庫研制合成的問題，并有兩個(gè)程序庫用于確定決定活性的芳香取代基的類型和數(shù)量，對(duì)稱合成(1vs2)的需要以及位于二-酪氨酸磷酸化抑制劑的兩個(gè)氨基部分間的中心烷烴間隔長(zhǎng)度的重要性這些程序庫稱為程序庫1(二聚化合物)和程序庫2(非對(duì)稱單聚化合物)。
2.2程序庫類似物的合成Knoevenagel化學(xué)的簡(jiǎn)單應(yīng)用和一系列適當(dāng)?shù)摩?，w-二胺快速地以很好的收率給予所需要的程序庫(方案1)產(chǎn)品。
方案1程序庫1的合成。R1-R5取代基和烷基間隔n如下表2中所定義這種應(yīng)用可以依據(jù)烷基間隔的n＝1-5快速生成程序庫1的5個(gè)產(chǎn)物。發(fā)動(dòng)蛋白I的GTP酶活性的最初的生物學(xué)篩選是在100μM下進(jìn)行的。更多的類似物隨后在一定范圍的濃度下進(jìn)行篩選，以確定它們的IC50值(表2)。在合成的80個(gè)類似物中發(fā)現(xiàn)小于等于100μM的IC50值的物質(zhì)有顯著的抑制作用。R1-R5取代基的定義如下表1中所述。
2.3二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的合成2.3.1一般介紹所有原料購自Aldrich Chemical Company和LancasterSynthesis。1H和13C色譜在Bruker Advance AMX 300 MHz分光計(jì)上分別在300.1315和75.4762MHz下記錄。相對(duì)于TMS的化學(xué)位移作為內(nèi)標(biāo)。
2.3.2合成方法化合物5a2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-乙基]-乙酰胺乙二胺(3a)(1.5g，25mmol)和甲基氰基乙酸鹽(5g，50mmol)在室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)。得到的白色固體隨即與10ml乙醇混合，過濾收集。用乙醇重結(jié)晶得到白色固體，6.3g(81％)。mp 182℃(Lit 183℃)29。
1H NMR(DMSO)8.25(2H，t，J＝5.5Hz)，3.56(4H，s)，3.13(4H，br s)。
13C NMR(DMSO)162.31，115.96，38.41，25.25。
化合物5b2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丙基]-乙酰胺丙基二胺(3b)(2.2g，30mmol)和甲基氰基乙酸鹽(6.4g，65mmol)在室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)。得到的白色固體與20ml乙醇混合。過濾收集。用乙醇重結(jié)晶得到4.995g白色固體(81％)。mp146℃(Lit148℃)29。
1H NMR(DMSO)8.21(2H，t，J＝5.5Hz)，3.59(4H，s)，3.07(4H，q，J＝6.7Hz)，1.53(2H，quin，＝6.7Hz)。
13C NMR(DMSO)162.45，116.64，39.28，28.90，25.67。
化合物5c2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丁基]-乙酰胺1，4-二氨基丁烷(3c)(3g，34mmol)和甲基氰基乙酸鹽(7g，70mmol)在室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)得到白色固體。固體與乙醇(10ml)混合，過濾收集固體。用乙醇重結(jié)晶得到白色固體，5.995g(78％)。mp145℃(Lit 145℃)。
1H NMR(DMSO)8.15(2H，t，J＝5.5Hz)，3.56(4H，s)，3.05(4H，br s)，1.38(4H，br s)。
13C NMR(DMSO)161.84，116.09，38.63，26.07，25.17。
化合物5d2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-戊基]-乙酰胺1，5-二氨基戊烷(3d)(2g，20mmol)和甲基氰基乙酸鹽(3.9g，40mmol)在室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)，得到白色固體。固體與乙醇(10ml)混合，過濾收集。用乙醇重結(jié)晶得到白色固體，4.62g(98％)。mp 125℃(Lit 125℃)1H NMR(DMSO)8.14(2H，t，J＝5.4Hz)，3.55(s，4H)，3.03(4H，q，J＝6.4Hz)，1.39(4H，quin，J＝7Hz)，1.23(2H，quin，＝7Hz)。
13C NMR(DMSO)161.79，116.11，38.84，28.26，25.17，23.43。
化合物5e2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-己基]-乙酰胺1，6-二氨基己烷(3e)(3g，26mmol)和甲基氰基乙酸鹽(6g，60mmol)在室溫下攪拌兩個(gè)小時(shí)，得到白色固體。固體與乙醇(10ml)混合，過濾收集。用乙醇重結(jié)晶得到白色固體，6.2g(95％)。mp141℃(Lit 140℃)1HNMR(DMSO)8.15(2H，t，J＝5.5Hz)，3.56(4H，s)，3.04(4H，q，J＝6.1Hz)，1.37(4H，quin，J＝5.9Hz)，1.24(4H，brs)。
13C NMR(DMSO)161.76，116.12，38.85，28.58，25. 82，25.16。
化合物92-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)丙烯酰氨基]-乙基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基-乙酰氨基)-乙基]-乙酰胺(5a)(0.3g，1.5mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.42g，3mmol)，3滴哌啶和乙醇(10ml)回流2小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(10ml)洗滌，得到黃綠色固體，0.54g(81％)。mp290℃(Lit 295℃)1H NMR(DMSO)8.32(2H，t，J＝5.5Hz)，7.92(2H，s)，7.53(2H，d，J＝2.1 Hz)，7.25(2H，dd，J＝8.2，2.1Hz)，6.85(2H，d，J＝2.1Hz)，3.45(4H，brs)。
13C NMR(DMSO)162.50，151.63，161.61，146.22，125.76，123.45，117.65，116.53，116.31，100.85，39.60。
化合物102-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰氨基]-乙基]-3-(3 4，5-三羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基-乙酰氨基)-乙基]-乙酰胺(5a)(0.056g，0.3mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.65mmol)和1滴哌啶和乙醇(2mL)回流1小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醇(10mL)洗滌，得到桔黃色固體，0.11g(82％)。mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.29(2H，t，J＝5.5 Hz)，7.79(2H，s)，6.99(4H，s)，3.32(4H，brs).
13C NMR(DMSO)162.15，150.7，145.96，140.24，121.26，117.30，109.97，99.76，39.40.
化合物112-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-4-甲氧基苯基)-丙烯酰氨基]-乙基-3-(3，4二羥基-5-甲氧苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基-乙酰氨基)-乙基]-乙酰胺(5a)(0.06g，3mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.6mmol)，1滴哌啶和2mL乙醇回流2小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醇(5mL)洗滌，得到桔黃色固體，0.101g(66％)。mp 274℃1H NMR(DMSO)8.34(2H，t，J＝5.5Hz)，7.93(1H，s)，7.20(2H，d，J＝1.92Hz)，7.13(2H，d，J＝1.92Hz)，3.77(6H，s)，3.35(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.90，150.85，148.03，145.83，139.90，121.76，117.20，111.09，107.20，100.83.
化合物222-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰氨基]-丙基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丙基]-乙酰胺(5b)(0.3g1.4mmol)，(0.4g，2.8mmol)3，4-二羥基苯甲醛，3滴哌啶和10mL乙醇回流兩個(gè)小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃綠色固體，0.55g(85％)。mp 274℃(Lit 277℃)1H NMR(DMSO)8.24(2H，t，J＝5.5Hz)，7.92(s，2H)，7.52(2H，d，J＝2.1Hz)，7.26(2H，dd，J＝8.2，2.1Hz)，6.85(2H，d，J＝8.2Hz)，3.23(4H，q，J＝6Hz)，1.70(2H，quin，J＝6.7Hz).
13C NMR(DMSO)161.50，150.60，150.50，125.10，123.21，117.10，116.00，115.80，100.50，37.27，28.82.
化合物232-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰氨基]-丙基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丙基]-乙酰胺(5b)(0.06g0.29mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和乙醇(10mL)回流2小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醇(10mL)洗滌，得到桔黃色固體，0.097g(70％).Mp＞300℃(Lit＞300℃)1H NMR(DMSO)8.18(2H，t，J＝5.5Hz)，7.78(2H，s)，6.99(4H，s)，3.21(4H，q，J＝6.8Hz)，1.68(2H，quin，J＝6.8Hz).
13C NMR(DMSO)161.80，150.70，145.95，140.30，121.22，117.30，109.90，99.50，38.20，28.90.
化合物242-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯酰氨基]-丙基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丙基]-乙酰胺(5b)(0.3g 1.4mmol)，0.44g3，4-二羥基-4-甲氧基苯甲醛，3滴哌啶和乙醇(10mL)回流兩個(gè)小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醇(5mL)洗滌得到桔黃色固體，0.31g(42％).mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.35(2H，t，J＝5.4Hz)，7.95(2H，s)，7.21(2H，d，J＝1.9Hz)，7.12(2H，d，J＝1.9Hz)，3.21(4H，q，J＝6.8Hz)，1.71(2H，quin，J＝6.8Hz).
13C NMR(DMSO)161.30，150.61，147.20，145.30，121.04，117.60，110.60，107.65，98.71，38.35，28.88.
化合物352-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰氨基]-丁基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丁基]-乙酰胺(5c)(0.3g，1.35mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.37g，2.7mmol)，3滴哌啶和乙醇(10mL)回流兩個(gè)小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃色固體，0.61g(97％)。mp 281℃(Lit 283℃)1H NMR(DMSO)8.25(2H，t，J＝5.5Hz)，7.91(2H，s)，7.53(2H，d，J＝1.9Hz)，7.26(2H，dd，J＝8.3，1.9Hz)，6.85(2H，d，J＝8.3Hz)，3.20(4H，br s)，1.49(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.52，150.86，150.42，145.65，125.23，123.09，117.20，115.81，100.51，39.31.
化合物362-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰氨基]-丁基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丁基]-乙酰胺(5c)(0.065g，0.3mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.6mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流1小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.121g(82％)。mp＞300℃(Lit＞310℃)291H NMR(DMSO)8.16(2H，t，J＝5.5Hz)，7.78(2H，s)，6.98(4H，s)，3.19(4H，br s)，1.48(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.70，150.56，145.90，140.20，121.30，117.30，109.90，99.80，39.26，26.37.
化合物372-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧苯基)-丙烯酰氨基]-丁基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-丁基]-乙酰胺(5c)(0.065g，0.3mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.6mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流1小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.110g(70％)。mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.09(2H，t，J＝5.5Hz)，7.86(2H，s)，7.18(2H，d，J＝1.9Hz)，7.10(2H，d，J＝1.9Hz)，3.75(6H，s)，3.19(4H，br s)，1.48(4H，br s)。
13C NMR(DMSO)161.71，150.23，148.70，146.24，120.25，117.51，109.50，106.80，98.81，55.76，39.31，26.64.
化合物482-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰氨基]-丁基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-戊基]-乙酰胺(5d)(0.2g，0.85mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.23g，1.7mmol)，3滴哌啶和7mL乙醇回流兩個(gè)小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃色固體，0.36g(90％)。mp 252℃(Lit 248℃)29
1H NMR(DMSO)8.15(2H，t，J＝5.5Hz)，7.85(2H，s)，7.50(2H，d，J＝2.1Hz)，7.20(2H，dd，J＝8.5Hz，2Hz)，6.75(2H，d，J＝8.5Hz)，3.16(4H，q，J＝6.2Hz)，1.50(4H，quin，J＝7.1Hz)，1.28(2H，quin，J＝6.9Hz)。
13C NMR(DMSO)161.85，153.88，150.34，146.28，126.16，121.47，117.70，115.71，114.65，98.40，39.46，28.63，23.73.
化合物492-氰基-N{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰氨基]-丁基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-戊基]-乙酰胺(5d)(0.068g，0.29mmol)，(0.1g，058mmol)3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和2mL乙醇回流1小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.123g(83％)。mp＞300℃321H NMR(DMSO)8.12(2H，t，J＝5.5Hz)，7.76(2H，s)，6.98(4H，s)，3.16(4H，br s)，1.50(4H，quin，J＝6.8Hz)，1.28(2H，quin，J＝6.7Hz).
13C NMR(DMSO)161.80，150.49，146.11，146.01，141.25，120.69，117.53，109.90，99.12，39.47，28.62，22.30.
化合物502-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯酰氨基]-戊基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-戊基]-乙酰胺(5d)(0.069g，0.29mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流一小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.126g(81％)。mp256℃1H NMR(DMSO)8.09(2H，t，J＝5.5Hz)，7.86(2H，s)，7.18(2H，d，J＝2Hz)，7.10(2H，d，J＝2Hz)3.75(6H，s)，3.17(4H，br s)，1.50(4H，quin，J＝6.8Hz)，1.28(4H，quin，J＝6.9Hz)。
13C NMR(DMSO)161.81，150.50，148.00，146.20，120.05，117.81，110.50，107.80，98.71，55.71，39.41，28.64，22.47。
化合物612-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰氨基]-己基}-3-(3，4-二羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-己基]-乙酰胺(5e)(0.3g，1.2mmol)，3，4-二羥基苯甲醛(0.33g，2.4mmol)，3滴哌啶和10mL乙醇回流兩小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(10mL)洗滌，得到黃色固體，0.52g(89％)。mp 263℃(Lit 260℃)1H NMR(DMSO)8.18(2H，t，J＝5.5Hz)，7.89(2H，s)，7.51(2H，d，J＝2Hz)，7.24(2H，dd，J＝2Hz，8.3Hz)，6.83(2H，d，J＝8.3Hz)，3.17(4H，q，J＝6.1Hz)，1.47(4H，quin，J＝6.1Hz)，1.28(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.52，151.18，150.30，145.72，125.22，122.91，117.24，115.80，115.72，100.38，39.48，28.78，25.98.
化合物622-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰氨基]-己基}-3-(3，4，5-三羥基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-己基]-乙酰胺(5e)(0.073g，0.29mmol)，3，4，5-三羥基苯甲醛(0.1g，0.58mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)一起回流1小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體，0.1g(67％)。mp＞300℃1H NMR(DMSO)8.11(2H，t，J＝5.5Hz)，7.76(2H，s)，6.98(4H，s)，3.16(4H，br s)，1.47(4H，quin，J＝6.1Hz)，1.28(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.80，150.46，145.99，141.19，120.71，117.53，109.89，99.15，39.68，28.84，26.01.
化合物632-氰基-N-{3-[2-氰基-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯酰氨基]-己基}-3-(3，4-二羥基-5-甲氧基苯基)-丙烯酰胺2-氰基-N-[3-(2-氰基乙酰氨基)-己基]-乙酰胺(5e)(0.069g，0.28mmol)，3，4-二羥基-5-甲氧基苯甲醛(0.1g，0.56mmol)，1滴哌啶和乙醇(2mL)回流一小時(shí)。冷卻，過濾并用冷的乙醚(5mL)洗滌，得到黃色固體。0.132g(86％)。mp 243℃1H NMR(DMSO)8.17(2H，t，J＝5.5Hz)，7.89(2H，s)，7.19(2H，d，J＝1.6Hz)，7.13(2H，d，J＝1.6Hz)，3.77(6H，s)，3.17(4H，br s)，1.48(4H，quin，J＝6.1Hz)，1.29(4H，br s).
13C NMR(DMSO)161.80，150.49，146.11，146.01，141.25，120.69，117.53，109.90，99.12，39.47，28.62，22.30。
2.3.2二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的活性表1程序庫1(二聚物)的化合物對(duì)發(fā)動(dòng)蛋白I的GTP酶活性的影響
單取代的芳香化合物不含取代基，或只含有單取代基，如單-OH(例如，R1或R2是OH)，-Cl(R2或R4是Cl)，-OMe(R2或R3是OMe)，或-COOH(R3是COOH)，這樣的化合物不顯示發(fā)動(dòng)蛋白抑制能力。而引入了第二個(gè)有抗氧能力的取代基后就具備了顯著的效果。3，4-二-OH(11，IC50＝5.1±0.6μM)物就顯示了類似化合物1的能力，被稱作二-酪氨酸磷酸化抑制劑(2，3-二-OH)。3，4，5-三-取代的芳香化合物(10)也有等同于化合物1的能力。同樣的情況也在不同鏈長(zhǎng)的化合物中存在。
烷基間隔鏈的延伸在n＞3時(shí)會(huì)對(duì)效能有一點(diǎn)影響。例如，鏈延長(zhǎng)類似物9(n＝0)，22(n＝1)，35(n＝2)，48(n＝3)，和61(n＝4)的IC50值分另別為5.1±0.6，1.7±0.2，3.2±1，5±1.4和26±1.5μM。本質(zhì)上說，酪氨酸激酶抑制方面原先則有相反的報(bào)導(dǎo)。對(duì)抗EGF受體酪氨酸激酶的聚GAT酶底物(Gazit等人)的檢測(cè)化合物具有抑制作用，并不依賴于鏈的長(zhǎng)度(Gazit等人，1996)。
R1和被氰基基團(tuán)(CN)占據(jù)的位置環(huán)合形成的類似物也可以使用。例如，當(dāng)R1是羥基時(shí)，羥基基團(tuán)能和氰基反應(yīng)形成imminochromene，如以下方案2所示。
方案2二-酪氨酸磷酸化抑制劑的imminochromene類似物的合成為解釋鏈延長(zhǎng)的類似物9在抑制值上的類似性，對(duì)所有5個(gè)烷烴間隔區(qū)類似物的模型進(jìn)行分析并顯示以下的MacSpartanPro低能量構(gòu)象異構(gòu)體的結(jié)果。如我們所見，所有5個(gè)類似物的低能量構(gòu)象異構(gòu)體都有發(fā)夾的構(gòu)象，達(dá)到末端苯環(huán)的pi-pi相互作用的最大值。因此，增加間隔區(qū)的長(zhǎng)度會(huì)限制效果直到內(nèi)攝作用開始形成于相對(duì)穩(wěn)定的發(fā)夾構(gòu)型(n≥5)。這與二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑對(duì)保留了延長(zhǎng)的構(gòu)型的酪氨酸激酶的效果進(jìn)行對(duì)比，并因此使它們適合于EGFR酪氨酸激酶的二聚中間體。
在表2中，二-酪氨酸磷酸化抑制劑如化合物9樣鑒定，其根據(jù)流程1合成。因此化合物1和9相同。
為研究潛在的H-結(jié)合的與1相關(guān)技術(shù)效果，化合物71得以研制。該化合物有相對(duì)堅(jiān)固的與1的大小類似的哌嗪連接。但是，它顯示在≤100μM時(shí)缺乏發(fā)動(dòng)蛋白抑制作用。類似地，在N-甲基化1的烷基間隔區(qū)得到N-甲基化的類似物72后也沒有觀察到抑制作用。這些觀察表明二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑的發(fā)夾結(jié)構(gòu)對(duì)抑制作用是可取的，支持模型觀察(發(fā)夾結(jié)構(gòu)而不是延長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu))，并且酰胺基取代基也在發(fā)動(dòng)蛋白結(jié)合中扮演重要角色。
成功開發(fā)了基于二-酪氨酸磷酸化抑制劑的一些μM有效的對(duì)稱類似物，研究了一個(gè)芳香核的修飾用于測(cè)定其在抑制發(fā)動(dòng)蛋白中的作用。因此，另一個(gè)基于酪氨酸磷酸化抑制劑A47(2)的化合物庫得以開發(fā)，如方案3所示，并檢查了該類似物抑制發(fā)動(dòng)蛋白I的GTP酶活性的能力。
方案3.庫2的合成令人驚奇的是，庫2化合物的篩選沒有顯示任何的發(fā)動(dòng)蛋白抑制≤100μM。更驚奇的是最初篩選的數(shù)據(jù)顯示酪氨酸磷酸化抑制劑A47(2)表明的發(fā)動(dòng)蛋白IC50＝70μM。
更進(jìn)一步的對(duì)酪氨酸磷酸化抑制劑A47的檢測(cè)給出了未檢測(cè)到庫2的化合物抑制活性的一個(gè)可能的解釋，即單-S可能有效的用于溶液中氧化成相應(yīng)二聚結(jié)構(gòu)。氧化后簡(jiǎn)單的互變異構(gòu)體產(chǎn)生相應(yīng)的二硫化物(121)(參見方案4)。2的新制備的溶液沒有顯示出抑制能力，而在室溫下保存24小時(shí)后則有弱的抑制能力。當(dāng)還原劑二硫蘇糖醇(2mM)存在于發(fā)動(dòng)蛋白檢測(cè)介質(zhì)中時(shí)，121的IC50值減至＞300μM。單獨(dú)應(yīng)用二硫蘇糖醇時(shí)，則缺乏發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。二聚的121在原位的生成給予類似的低能量構(gòu)象保有所需要的適當(dāng)布置的主要功能基團(tuán)，確保較好的發(fā)動(dòng)蛋白抑制作用。對(duì)于硫代吲哚一些類似的結(jié)果也被觀察到，它們是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，顯示對(duì)氧化的增加活性(Thompson等人，1993)。
方案42.4討論對(duì)抗GTP酶發(fā)動(dòng)蛋白的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系通過基于先導(dǎo)化合物二-酪氨酸磷酸化抑制劑和酪氨酸磷酸化抑制劑A47經(jīng)合成和篩選庫化合物而加以評(píng)估。從所得的結(jié)果看出，含有在3，4位有羥基取代的兩個(gè)芳環(huán)的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑化合物具有強(qiáng)抑制活性。對(duì)這些化合物的修飾可以通過改變功能基團(tuán)用于形成間隔區(qū)而容易完成。
實(shí)施例3前藥的開發(fā)二-酪氨酸磷酸化抑制劑的前藥及其類似物被開發(fā)以增加細(xì)胞膜的通透性能并因此增加藥物在細(xì)胞中的效能。提供二聚酪氨酸磷酸化抑制劑化合物前藥的適宜的反應(yīng)在方案5中有說明。二-酪氨酸磷酸化抑制劑是起始反應(yīng)劑的例子。二聚酪氨酸磷酸化抑制劑化合物與適當(dāng)?shù)乃狒蝓Ｂ?摩爾數(shù)過量)在吡啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中一起攪拌，并存在適當(dāng)?shù)拇呋瘎┤缍谆被拎?DMAP)。在某些情況下，溶液需要回流以使反應(yīng)完全。反應(yīng)完全后，酯化產(chǎn)物通過重結(jié)晶或色譜進(jìn)行純化。開發(fā)的前藥的例子如表2和表3中所示。
方案5.前藥的合成表2二-酪氨酸磷酸化抑制劑的前藥
表3二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的前藥形式
前藥Pro-BisT有4乙酰基酯基團(tuán)取代二-酪氨酸磷酸化抑制劑的4羥基基團(tuán)，并且評(píng)價(jià)其通過細(xì)胞的外細(xì)胞膜的能力。Pro-BisT在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成為活性物質(zhì)二-酪氨酸磷酸化抑制劑，其然后能夠結(jié)合發(fā)動(dòng)蛋白并因此抑制細(xì)胞內(nèi)攝作用。發(fā)現(xiàn)Pro-BisT抑制受體介導(dǎo)的細(xì)胞系Hela，HER14，COS7，Swiss 3T3，A431，B104和B35的轉(zhuǎn)鐵蛋白或EGF的細(xì)胞內(nèi)攝作用(RME)。Pro-BisT比二-酪氨酸磷酸化抑制劑有更顯著的效能(-30x)，能夠有效地阻斷所試驗(yàn)細(xì)胞系的RME，濃度為10-20μM下檢測(cè)，顯示較二-酪氨酸磷酸化抑制劑有相大改善的穿透細(xì)胞的能力。
前藥80-1在類似于Pro-BisT濃度(10-20μM)抑制RME，被開發(fā)用于降低該前藥在細(xì)胞外環(huán)境中進(jìn)入細(xì)胞前過早的水解。該前藥以粉末形式貯存時(shí)比較Pro-BisT有改善的貨架壽命。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)能夠理解各種對(duì)本發(fā)明的變化和/或修飾，而不背離本發(fā)明的精神或范圍。本發(fā)明的具體實(shí)施方式
是用于說明而不是限制本發(fā)明。
參考文獻(xiàn)1.Aridor，M.&Hannan，L.A.(2000)Traffic jamacompendium of human diseases that affect intracellulartransport processes.Traffic 1，836-851。
2.Aridor，M.&Hannan，L.A.(2002)Traffic jams IIanupdate of diseases of intracellular transport.Traffic3，781-790。
3.Atwood，W.J.(2001)A combination of low-dosechlorpromazine and neutralizing antibodies inhibits the spreadof JC virus(JCV)in a tissue culture modelImplications forprophylactic and therapeutic treatment of progressivemultifocal leukencephalopathy.JNeurovirol 7，307-310。
4.Berge，S M et al(1997)J.Pharmaceutical Sciences.661-19。
5.Brodin，L.，Low，P.&Shupliakov，O.(2000)Sequentialsteps in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis.Curr.Opin.Neurobiol.10，312-320.Cataldo A.et al.J.Neurosci.1997，176142。
6.Butler M.H.，David C.，Ochoa G.C.，F(xiàn)reyberg Z.，Daniell L.，Grabs D.，Cremona O.，and De Camilli P.(1997)Amphiphysin II(SH3P9；BIN1)，a member of the amphiphysin/rvsfamily，is concentrated in the cortical cytomatrix of axoninitial segments and nodes of ranvier in brain and around Ttubules in skeletal muscle.J Cell Biol 137，1355-1367。
7.Cataldo，A.，et al.，J. Neurosci.1997，176142。
8.Cataldo，A.，Rebeck，G.W.，Ghetri，B.，Hulette，C.，Lippa，C.，Van Broeckhoven，C.，van Duijn，C.，Cras，P.，Bogdanovic，N.，Bird，T.，Peterhoff，C. & Nixon，R.(2001)Endocytic disturbances distinguish among Subtypes ofAlzheimer′s disease and related disorders.Ann.Neurol.50，661-665。
9.Cousin M.A.and Robinson P.J.(2000a)Ca2+inhibitionof dynamin arrests synaptic vesicle recycling at the activezone.J.Neurosci.20，949-957。
10.Cousin M.A.and Robinson P.J.(2000b)Two mechanismsof Synaptic vesicle recycling in rat brain nerve terminals.J.Neurochem.75，1645-1653。
11.Cousin M.A.and Robinson P.J.(2001)The dephosphinsDephosphorylation by calcineurin triggers synaptic vesicleendocytosis.Trends Neurosci.24，659-665。
12.Di Paolo，G.，Sankaranarayanan，S.，Wenk，M.R.，Daniell，L.，Perucco，E.，Caldarone，B.J.，F(xiàn)lavell，R.，Picciotto，M.R.，Ryan，T.A.，Cremona，O.& De Camilli，P.(2002)Decreased synaptic vesicle recycling efficiency andcognitive deficits in amphiphysin 1 knockout mice. Neuron33，789-804。
13.Duan，D.，Li，Q.，Kao，A.W.，Yue，Y.，Pessin，J.E.& Engelhardt，J.F.(1999)Dynamin is required for recombinantadeno-associated virus type 2 infection.J.Virol.73，10371-10376。
14.Dunkley P.R.，Jarvie P.E.，HeathJ.W.，Kidd G.J.，and Rostas J.A.(1986)A rapid method for isolation ofsynaptosomes on Percoll gradients.Brain Res.372，115-129。
15.Gazit，A.，Osherov，N.，Gilon，C.& Levitzki，A.(1996)TyrphoStins.6.Dimeric benzylidenemalononitrile tyrophostinspotent inhibitors of EGF receptor tyrosine kinase in vitro.J.Med.Chem.39，4905-4911。
16.Gray，N.W.，F(xiàn)ourgeaud，L.，Huang，B.，Chen，J.，Cao，H.，Oswald，B.J.，Hemar，A.& McNiven，M.A.(2003)Dynamin3 is a component of the postsynapse，where it interacts withmGluR5 and homer.Curr.Biol.13，510-515。
17.Grieb，T.A.& Burgess，W.H.(2000)The mitogenicactivity of fibroblast growth factor-1 correlates with itsinternalization and limited proteolytic processing.J.Cell.Physiol.184，171-182。
18.Humeau，Y.，Doussau，F(xiàn).，Grant，N.J.& Poulain，B.(2000)How botulinum and tetanus neurotoxinS block neurotransmitterrelease.Biochimie 82，427-446。
19.Koenig，J.H.& Ikeda，K.(1989)Disappearance andreformation of synaptic vesicle membrane upon transmitterrelease observed under reversible blockage of membraneretrieval.J.Neurosci.9，3844-3860.Marquez-Sterling N.etal.J.Neurosci.1997，17140。
20.Marks B.and McMahon H.T.(1998)Calcium triggerscalcineurin-dependent synaptic vesicle recycling in mammaliannerve terminals.Curr.Biol.8，740-749。
21.Marquez-Sterling，N.R.，Lo，A.C.，Sisodia，S.S.& Koo，E.H.(1997)Trafficking of cell-surface b-amyloidprecursor proteinEvidence that a sorting intermediateparticipates in synaptic vesicle recycling.J.Neurosci.17，140-151。
22.McCluskey，A.，Hill，T.A.，Robinson，P.J.，Scott，J.L.& Edwards，J.K.(2002)Green chemistry approaches to theKnoevenagel condensationComparison of ethanol，water andsolvent free(dry grind)approaches.Tetrahedron Lett.43，3117-3120。
23.Metzler，M.，Legendre-Guillemin，V.，Gan，L.，Chopra，V.，Kwok，A.，McPherson，P.S.& Hayden，M.R.(2001)HIP1functions in clathrin-mediated endocytosis through binding toclathrin and AP2.J.Biol.Chem.276，39271-39276。
24.Niemann，H.H.，Knetsch，M.L.，Scherer，A.，Manstein，D.J.& Kull，F(xiàn).J.(2001)Crystal structure of a dynamin GTPasedomain in both nucleotide-free and GDP-bound forms.EMBO J.20，5813-5821。
25.Ong，W.Y.，Kumar，U.，Switzer，R.C.，Sidhu，A.，Suresh，G.，Hu，C.Y.& Patel，S.C.(2001)Neurodegeneration inNiemann-Pick type C disease mice.Exp.Brain Res.141，218-231。
26.RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(MackPublishing Co.，1995)。
27.Robinson P.J.，Sontag J.-M.，Liu J.P.，F(xiàn)ykse E.M.，Slaughter C.，McMahon H.T.，and Südhof T.C.(1993)Dynamin GTPase regulated by protein kinase C phosphorylationin nerve terminals.Nature.365，163-166。
28.Roy，A.M.，Parker，J.S.，Parrish，C.R.& Whittaker，G.R.(2000)Early stages of influenza virus entry into Mv-1lung cellsinvolvement of dynamin.Virology.267，17-28。
29.Schwake，M.，F(xiàn)riedrich，T.& Jentsch，T.J.(2001)Aninternalization signal in C1C-5，an endosomal C1--channelmutated in Dent′s disease.J.Biol. Chem.276，12049-12054。
30.Seto，E.S.，Bellen，H.J.& Lloyd，T.E.(2002)Whencell biology meets developmentendocytic regulation ofsignaling pathways.Genes Dev.16，1314-1336。
31.Sever，S.，Muhlberg，A.B.& Schmid，S.L.(1999)Impairment of dynamin′s GAP domain stimulatesreceptor-mediated endocytosis.Nature.398，481-486。
32. Smith，D.S.，Niethammer，M.，Ayala，R.，Zhou，Y.，Gambello，M.J.，Wynshaw-Boris，A.& Tsai，L.H.(2000)Regulation of cytoplasmic dynein behaviour and microtubuleorganization by mammalian Lisl.Nat.Cell Biol.2，767-775。
33.Smythies，J.(2000)What is the function of receptorand membrane endocytosis at the postsynaptic neuron？Proc.R.Soc.Lond.Biol.Sci.267，1363-1367。
34.Stowell，M.H.，Marks，B.，Wigge，P.& McMahon，H.T.(1999)Nucleotide-dependent conformational changes in dynaminevidence for a mechanochemical molecular spring.Nat.Cell Biol.1，27-32。
35.Sung，J.Y.，Kim，J.，Paik，S.R.，Park，J.H.，Ahn，Y.S.& Chung，K.C.(2001)Induction of neuronal cell deathby Rab5A-dependent endocytosis of alpha-synuclein.J.Biol.Chem.276，27441-27448。
36.Tan，T.C.，Valova，V.A.，Malladi，C.S.，Graham，M.E.，Berven，L.A.，Jupp，O.J.，Hansra，G.，McClure，S.J.，Sarcevic，B.，Boadle，R.A.，Larsen，M.R.，Cousin，M.A.& Robinson，P.J.(2003)Cdk5 is essential for synapticvesicle endocytosis. Nat. Cell Biol.5，701-710。
37.Thompson，M.；Rewcastle，G.W.；Tercel，M.；Dobrusin，E.M.；Fry，D.W.；Kraker A.J.；Denny，W.A.Tyrosine KinaseInhibitors.1.Structure-Activity Relationships for Inhibitionof Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Activityby 2，3-Dihydro-2-thioxo-1H-indole-3-alkanoic Acids and2，2′-Dithiobis(1H-indole-3-alkanoic acids).J.Med.Chem.1993，36，2459-2469。
38.van der Bliek A.M.，Redelmeier T.E.，Dam ke H.，Tisdale E.J.，MeyerowitzE.M.，and Schmid S.L.(1993)Mutations in human dynamin block an intermediate stage in coatedvesicle formation.J.Cell Biol.122，553-563。
39.Wang，L.-H.，Rothberg，K.G.& Anderson.G.(1993)Mis-assembly of clathrin lattices on endosomes reveals aregulatory switch for coated pit formation.J.Cell Biol.123，1107-1117。
40.Wyss，S.，Berlioz-Torrent，C.，Boge，M.，Blot，G.，Honing，S.，Benarous，R.& Thali，M.(2001)The highly conservedC-terminal dileucine motif in the cytosolic domain of the humanimmunodeficiency virus Type 1 envelope glycoprotein is criticalfor its association with the AP-1 clathrin adapter.J.Virol.75，2982-2992。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞內(nèi)發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝作用的方法，該方法包括用有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽處理所述細(xì)胞，其中M-Sp-M’ 通式I其中M和M’分別獨(dú)立為通式II所示的結(jié)構(gòu)部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區(qū)； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團(tuán)；并Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成與Z基團(tuán)稠合的取代或未取代的5員或6員雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，雜環(huán)或碳環(huán)如果有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)的至少一種，其中的取代C1-C3的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區(qū)上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子；(b)非取代的由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)；(c)由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；?；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，被至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；幕鶊F(tuán)取代；和(d)由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)，在W是CH或一連接基團(tuán)時(shí)，或W、V和Y形成非取代的碳環(huán)時(shí)至少兩個(gè)取代基，或者在W、V和Y形成雜環(huán)時(shí)，至少一個(gè)取代基，獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；缓?ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，有至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；娜〈?；其中當(dāng)M或M′中一個(gè)的Z選自(b)時(shí)，而M或M′中其它的Z選自(a)、(c)或(d)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且碳環(huán)或雜環(huán)如果有取代的話，至少有一個(gè)取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代C1-C2基團(tuán)的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代C1-C2基團(tuán)的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中Y是氰基、硝基、氨基、羧基、羥基、巰基、硫代羧基、取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基、硫代羧基；W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)含有1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且如果雜環(huán)或碳環(huán)有取代的話，含有至少一個(gè)取代基，所述取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基，或取代的C1-C2基團(tuán)，取代C1-C2基團(tuán)的取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基；并且R是CXR′。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中Z是選自(i)由一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，包括不多于3個(gè)的獨(dú)立選自O(shè)、N和S的雜原子；(ii)由一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，包括不多于3個(gè)的獨(dú)立選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)含有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述的取代基獨(dú)立選自硝基、NH、鹵素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基；和(iii)由一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)，含有至少兩個(gè)取代基，選自硝基、NH、氨基、鹵素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中M和M′中至少一個(gè)的Z不是2，3-二取代的碳環(huán)基團(tuán)。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中M和M′中至少一個(gè)的Z包括當(dāng)Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團(tuán)時(shí)，至少兩個(gè)取代基相互鄰位或在相鄰的取代位置；或當(dāng)Z是選自(c)的雜環(huán)時(shí)，碳原子上所述取代基或之一與雜原子或其之一相鄰；或當(dāng)W、V和Y環(huán)化形成與Z稠合的雜環(huán)時(shí)，在碳原子上的取代基或其之一與雜環(huán)至少有一個(gè)鍵長(zhǎng)間隔。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中M和M′中一個(gè)的Y取代基是氫，M和M′的另外一個(gè)的Y取代基則不是氫。
8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中W、V和Y形成5員或6員與Z稠合的雜環(huán)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中與Z稠合的雜環(huán)形成兩環(huán)雜環(huán)基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中包括芳基基團(tuán)，由一個(gè)或兩個(gè)環(huán)組成，所述環(huán)獨(dú)立為5或6員環(huán)，和至少兩個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、NH、氨基、鹵素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中Z包括由一個(gè)6員環(huán)組成的芳基基團(tuán)和至少兩個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、氰基、羥基、羧基和C1-C2烷氧基。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中芳基基團(tuán)至少有兩個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、氨基和羥基。
13.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中Z含有雜環(huán)基團(tuán)，所述雜環(huán)包括一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5或6員環(huán)，含有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中所述雜環(huán)含有一個(gè)或多個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、NH、鹵素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中雜環(huán)基團(tuán)含有一個(gè)或多個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、氨基和羥基。
15.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中M和M′分別獨(dú)立為下述基團(tuán)部分 其中X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或R1和Y環(huán)化形成5或6員的取代或未取代的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)含有1或2個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且當(dāng)取代時(shí)雜環(huán)或碳環(huán)具有至少一個(gè)選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫的取代基；并且R2至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的酰基；或R1至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、鹵素、C1-C2的烷氧基和C1-C2的酰基；和R是連到間隔基Sp上的NH、O或S；并其中M和M′中的至少一個(gè)特征在于R1至R5的至少兩個(gè)不是氫，且當(dāng)R1至R2不是氫時(shí)，R3至R5中至少一個(gè)也不是氫，或者當(dāng)R1和Y環(huán)化形成未取代的碳環(huán)時(shí)，R2至R5的至少兩個(gè)不是氫，或者當(dāng)R1與Y環(huán)化形成雜環(huán)時(shí)，R2至R5的至少一個(gè)不是氫。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中R1-R3不是氫。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中R1-R5的至少兩個(gè)在鄰位。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中M和M′中至少一個(gè)有三個(gè)取代基，并且取代基是相鄰的。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中R1-R3不是氫，或R2-R5不是氫。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中當(dāng)R1-R5或R2-R5中的至少一個(gè)是鹵素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；鶗r(shí)，至少一個(gè)另外的取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當(dāng)R1和Y環(huán)化并形成雜環(huán)時(shí)，或者至少兩個(gè)其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當(dāng)R1和Y不成環(huán)或形成未取代的碳環(huán)。
21.如權(quán)利要求15-20任一項(xiàng)所述的方法，其中Y是氰基，X是O并且R是NH。
22.如權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的方法，其中M和M′是相同的。
23.如權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的方法，其中間隔區(qū)Sp允許是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的化合物。
24.如權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)所述的方法，其中間隔區(qū)Sp包括未取代的烷烴鏈，結(jié)構(gòu)如下-CH2(CH2)nCH2-其中n是1-5的整數(shù)。
25.如權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所述的方法，其中所述通式I的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
26.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中由發(fā)動(dòng)蛋白依賴的細(xì)胞內(nèi)攝作用介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的通式I的化合物，或其生理上可接受的鹽或前藥，通式I的結(jié)構(gòu)為M-Sp-M’通式I其中M和M’分別獨(dú)立為通式II所示的結(jié)構(gòu)部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區(qū)； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團(tuán)；并Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成與Z基團(tuán)稠合的取代或未取代的5員或6員雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，如果雜環(huán)或碳環(huán)有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，其中的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區(qū)上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子；(b)非取代的由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)；(c)由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；?；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，被至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；幕鶊F(tuán)取代；和(d)由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)，在W是CH或一連接基團(tuán)時(shí)，或W、V和Y形成非取代的碳環(huán)時(shí)至少兩個(gè)取代基，或者在W、V和Y形成雜環(huán)時(shí)，至少一個(gè)取代基，獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的酰基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，有至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；娜〈黄渲挟?dāng)M或M′中一個(gè)的Z選自(b)時(shí)，而M或M′中其它的Z選自(a)、(c)或(d)。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且如果碳環(huán)或雜環(huán)有取代的話，至少有一個(gè)取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫；并R′是鍵合到間隔區(qū)上的NH、O或S。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中Y是氰基、硝基、氨基、羧基、羥基、巰基、硫代羧基、取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基、硫代羧基；W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)含有1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且如果雜環(huán)或碳環(huán)有取代的話，含有至少一個(gè)取代基，所述取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基，或取代的C1-C2基團(tuán)，取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基；并且R是CXR′。
29.如權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)所述的方法，其中M和M′中至少一個(gè)的Z不是2，3-二取代的碳環(huán)基團(tuán)。
30.如權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)所述的方法，其中M和M′中至少一個(gè)的Z包括當(dāng)Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團(tuán)時(shí)，至少有兩個(gè)鄰位取代基；或當(dāng)Z是選自(c)的雜環(huán)時(shí)，該取代基或取代基之一在與該雜原子或雜原子之一相鄰的碳原子上；或當(dāng)W、V和Y環(huán)化形成與Z稠合雜環(huán)時(shí)，在Z的碳原子上的該取代基或取代基之一與雜環(huán)至少有一個(gè)鍵長(zhǎng)。
31.如權(quán)利要求26-30任一項(xiàng)所述的方法，其中一個(gè)M或M’的Y取代基是氫，而其它的M或M’的Y取代基不是氫。
32.如權(quán)利要求26-31任一項(xiàng)所述的方法，其中M和M’獨(dú)立選自下述的基團(tuán)部分 其中X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或R1和Y環(huán)化形成5或6員的取代或未取代的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)含有1或2個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且當(dāng)取代時(shí)雜環(huán)或碳環(huán)具有至少一個(gè)選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫的取代基；并且R2至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；?；或R1至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、鹵素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；?；和R是連到間隔基Sp上的NH、O和S；并其中M和M′中的至少一個(gè)特征在于R1至R5的至少兩個(gè)不是氫，且當(dāng)R1至R2不是氫時(shí)，R3至R5中至少一個(gè)也不是氫，或者當(dāng)R1和Y環(huán)化形成未取代的碳環(huán)時(shí)，R2至R5的至少兩個(gè)不是氫，或者當(dāng)R1與Y形成雜環(huán)時(shí)，R2至R5的至少一個(gè)不是氫。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中R1-R3不是氫。
34.如權(quán)利要求26-31任一項(xiàng)所述的方法，其中R1-R5的至少兩個(gè)是鄰位取代。
35.如權(quán)利要求26-31任一項(xiàng)所述的方法，其中M和M′至少一個(gè)有三個(gè)取代基，并且取代基是相鄰的。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其中R1-R3均不為氫，或R2-R5均不是氫。
37.如權(quán)利要求26-32任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)R1-R5或R2-R5中的至少一個(gè)是鹵素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；鶗r(shí)，至少一個(gè)另外的取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當(dāng)R1和Y環(huán)化并形成雜環(huán)時(shí)，或者至少兩個(gè)其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當(dāng)R1和Y不成環(huán)或形成未取代的碳環(huán)。
38.如權(quán)利要求26-37任一項(xiàng)所述的方法，其中Y是氰基，X是O并且R是NH。
39.如權(quán)利要求26-38任一項(xiàng)所述的方法，其中M和M′是相同的。
40.如權(quán)利要求26-39任一項(xiàng)所述的方法，其中間隔區(qū)Sp允許是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的化合物。
41.如權(quán)利要求26-40任一項(xiàng)所述的方法，其中通式I的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
42.如權(quán)利要求26-41任一項(xiàng)所述的方法，其中所述疾病或病癥選自癌癥、眼科疾病、免疫缺陷病、胃腸道疾病、病原性感染、腎病、癲癇及神經(jīng)疾病、神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和病癥。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中神經(jīng)疾病、神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病癥選自脫髓鞘疾病、阿爾茨海默病、亨廷頓氏病、帕金森氏病和Lewy體病。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中疾病或病癥是癲癇。
45.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物由發(fā)動(dòng)蛋白依賴性細(xì)胞內(nèi)攝作用介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的抑制發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑，或該二聚酪氨酸磷酸化抑制劑的類似物、生理可接受的鹽，或前藥。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中二聚酪氨酸磷酸化抑制劑包括兩個(gè)酪氨酸磷酸化抑制劑的結(jié)構(gòu)部分，其通過一間隔部分相連，其中至少一個(gè)酪氨酸磷酸化抑制劑部分是亞芐基丙二腈部分。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中兩個(gè)酪氨酸磷酸化抑制劑部分均是亞芐基丙二腈部分。
48.權(quán)利要求46或47所述的方法，其中酪氨酸磷酸化抑制劑部分是相同的。
49.如權(quán)利要求45-48任一項(xiàng)所述的方法，其中二聚酪氨酸磷酸化抑制劑包括二-酪氨酸磷酸化抑制劑。
50.如權(quán)利要求45-49任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的疾病或病癥選自癌癥、眼科疾病、免疫缺陷病、胃腸道疾病、病原性感染、腎病、癲癇及神經(jīng)疾病、神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的疾病和病癥。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中神經(jīng)疾病、神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病癥選自脫髓鞘疾病、阿爾茨海默病、亨廷頓氏病、帕金森氏病和Lewy體病。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述疾病或病癥是癲癇。
53.一種鑒別二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物具有抑制發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性能力的方法，該方法包括將二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物與發(fā)動(dòng)蛋白或具有發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶活性的分子一起培養(yǎng)得到檢測(cè)數(shù)據(jù)；并在此檢測(cè)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，確定二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物是否具有抑制發(fā)動(dòng)蛋白的GTP酶活性的作用。
54.通過權(quán)利要求53所述的方法鑒定的二聚酪氨酸磷酸化抑制劑或其類似物在抑制細(xì)胞內(nèi)發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝作用中的應(yīng)用。
55.如下通式III所述的化合物或其生理上可接受的鹽，或前藥，其中M-Sp-M’通式III其中M和M’分別獨(dú)立為通式IV所示的結(jié)構(gòu)部分，可以相同或不同，Sp為一間隔區(qū)； 其中V是C或CH；W是CH或一連接基團(tuán)；并Y是氫、氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成與Z基團(tuán)稠合的取代或未取代的5員或6員雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，雜環(huán)或碳環(huán)如果有取代基，取代基是選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基、硫，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，其中取代C1-C3基團(tuán)的取代基選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X是O或S；X′是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C3的基團(tuán)或取代的C1-C3的基團(tuán)，所述取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；R′是連接在間隔區(qū)上的NH、O或S；和Z是選自(a)非取代的由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子；(b)非取代的由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)；(c)由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的酰基；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，被至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；幕鶊F(tuán)取代；和(d)由一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)，在W是CH或一連接基團(tuán)時(shí)，或W、V和Y形成非取代的碳環(huán)時(shí)至少兩個(gè)取代基，或者在W、V和Y形成雜環(huán)時(shí)，至少一個(gè)取代基，獨(dú)立選自(i)硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；?；和(ii)C1-C2的烷基或C1-C2的烯基基團(tuán)，有至少一個(gè)選自硝基、NH、氨基、氰基、鹵素、羥基、羧基、氧代、硫、巰基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；娜〈?；其中當(dāng)M或M′中一個(gè)的Z選自(b)時(shí)，而M或M′中其它的Z選自(a)、(c)或(d)。并且條件是當(dāng)R是CXR’，X是O，R’是鍵合在間隔上的NH，V是C，W是CH，Y是氰基且R1、R2和R5是H，R3和R4是羥基時(shí)，至少M(fèi)和M′中一個(gè)的Z不是如通式IVa所示的芐基基團(tuán)， 或者當(dāng)Sp是C2-C4的烷基間隔時(shí)，R1和R5是H，R2至R4是羥基；并且其中Z’是與W基團(tuán)相連接的碳原子。
56.如權(quán)利要求55的化合物，其中V是C；W是CH；Y是氫、氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；或W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)包括1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且碳環(huán)或雜環(huán)如果有取代的話，至少有一個(gè)取代基，選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中取代C1-C2基團(tuán)的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫的至少一種；和R是CH2R′、CXR′或CHX′R′；X is O或S；和X′是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基，或未取代的C1-C2的基團(tuán)或取代的C1-C2的基團(tuán)，其中取代C1-C2基團(tuán)的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基及硫。
57.如權(quán)利要求56的化合物，其中Y是氰基、硝基、氨基、羧基、羥基、巰基、硫代羧基、取代的C1-C2的基團(tuán)，其中的取代基獨(dú)立選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基、硫代羧基；W、V和Y形成5員或6員的取代或非取代的與Z稠合的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)含有1至3個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且如果雜環(huán)或碳環(huán)有取代的話，含有至少一個(gè)取代基，所述取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基，或取代的C1-C2基團(tuán)，取代C1-C2基團(tuán)取代基選自氰基、硝基、氨基、羥基、巰基、羧基和硫代羧基；并且R是CXR′。
58.如權(quán)利要求55-57任一項(xiàng)所述的化合物，其中Z選自(i)由一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，包括不多于3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子；(ii)由一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員環(huán)組成的雜環(huán)，包括不多于3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中雜環(huán)含有一個(gè)或多個(gè)取代基，所述的取代基獨(dú)立選自硝基、NH、鹵素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基；和(iii)由一或兩個(gè)獨(dú)立為5員或6員環(huán)組成的碳環(huán)，含有至少兩個(gè)取代基，選自硝基、NH、氨基、鹵素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
59.如權(quán)利要求55-58任一項(xiàng)所述的化合物，其中M和M′中至少一個(gè)的Z不是2，3-二取代的碳環(huán)基團(tuán)。
60.如權(quán)利要求55-59任一項(xiàng)的化合物，其中M和M′中至少一個(gè)的Z包括當(dāng)Z選自(d)且W是CH或C1-C3的連接基團(tuán)時(shí)，至少有兩個(gè)鄰位取代基；或當(dāng)Z是選自(c)的雜環(huán)時(shí)，該取代基或取代基之一在與該雜原子或雜原子之一相鄰的碳原子上；或當(dāng)W、V和Y環(huán)化形成與Z稠合雜環(huán)時(shí)，在碳原子上的該取代基或取代基之一與雜環(huán)至少有一個(gè)鍵長(zhǎng)。
61.如權(quán)利要求55-60任一項(xiàng)的化合物，其中M和M′中一個(gè)的Y取代基是氫，另外一個(gè)的Y取代基則不是氫。
62.如權(quán)利要求55-61任一項(xiàng)的化合物，其中W、V和Y形成與Z稠合的5員或6員的雜環(huán)。
63.如權(quán)利要求62所述的化合物，其中與Z形成的稠合雜環(huán)形成兩個(gè)環(huán)的雜環(huán)基團(tuán)。
64.如權(quán)利要求55-63任一項(xiàng)的化合物，其中Z包括芳基基團(tuán)，所述芳基由一個(gè)或兩個(gè)環(huán)組成，所述環(huán)獨(dú)立為5或6員環(huán)，和至少有兩個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、NH、氨基、鹵素、氰基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
65.如權(quán)利要求64所述的化合物，其中Z包括6員的芳基基團(tuán)，和至少有兩個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、氰基、羥基、羧基和C1-C2的烷氧基。
66.如權(quán)利要求65所述的化合物，其中芳基基團(tuán)至少有兩個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、氨基和羥基。
67.如權(quán)利要求55-62任一項(xiàng)的化合物，其中Z含有雜環(huán)基團(tuán)，所述雜環(huán)包括一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立的5或6員環(huán)，含有不超過3個(gè)的選自O(shè)、N和S的雜原子，其中所述雜環(huán)含有一個(gè)或多個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、NH、鹵素、氰基、氨基、羥基、羧基、氧代、硫和C1-C2的烷氧基。
68.如權(quán)利要求67所述的化合物，其中雜環(huán)基團(tuán)含有一個(gè)或多個(gè)取代基，獨(dú)立選自硝基、氨基和羥基。
69.如權(quán)利要求55-59任一項(xiàng)的化合物，其中M和M′分別獨(dú)立為下述基團(tuán)部分 其中X是O或S；Y是氰基、硝基、氨基、鹵素、羥基、巰基、羧基或硫代羧基；或R1和Y環(huán)化形成5或6員的取代或未取代的雜環(huán)或碳環(huán)，其中雜環(huán)含有1或2個(gè)選自O(shè)、N和S的雜原子，并且當(dāng)取代時(shí)雜環(huán)或碳環(huán)具有至少一個(gè)選自氰基、硝基、NH、氨基、氧代、鹵素、羥基、巰基、羧基、硫代羧基和硫的取代基；并且R2至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；换騌1至R5獨(dú)立為氫或某取代基，所述取代基獨(dú)立選自硝基、氨基、鹵素、羥基、羧基、巰基、硫代羧基、鹵素、C1-C2的烷氧基和C1-C2的?；缓蚏是連到間隔基Sp上的NH、O或S；并其中M和M′中的至少一個(gè)特征在于R1至R5的至少兩個(gè)不是氫，且當(dāng)R1至R2不是氫時(shí)，R3至R5中至少一個(gè)也不是氫，或者當(dāng)R1和Y環(huán)化形成未取代的碳環(huán)時(shí)，R2至R5的至少兩個(gè)不是氫，或者當(dāng)R1與Y環(huán)化形成雜環(huán)時(shí)，R2至R5的至少一個(gè)不是氫。
70.如權(quán)利要求69所述的化合物，其中R1-R3不是氫。
71.如權(quán)利要求69所述的化合物，其中R1-R5的至少兩個(gè)相互在鄰位。
72.如權(quán)利要求69所述的化合物，其中M和M′中至少一個(gè)有三個(gè)取代基，并且取代基是相鄰的。
73.如權(quán)利要求72所述的化合物，其中R1-R3不是氫，或R2-R5不是氫。
74.如權(quán)利要求69所述的化合物，其中當(dāng)R1-R5或R2-R5中的至少一個(gè)是鹵素、C1-C2的烷氧基或C1-C2的?；鶗r(shí)，至少一個(gè)另外的取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當(dāng)R1和Y環(huán)化形成雜環(huán)時(shí)，或者至少兩個(gè)其它取代基選自硝基、氨基、羥基、羧基和硫代羧基，當(dāng)R1和Y不成環(huán)或形成未取代的碳環(huán)時(shí)。
75.如權(quán)利要求69-74任一項(xiàng)所述的化合物，其中Y是氰基，X是O并且R是NH。
76.如權(quán)利要求55-75任一項(xiàng)所述的化合物，其中M和M′是相同的。
77.如權(quán)利要求55-76任一項(xiàng)所述的化合物，其中間隔區(qū)Sp允許是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的化合物。
78.如權(quán)利要求55-77任一項(xiàng)所述的化合物，其中間隔區(qū)Sp包括未取代的烷烴鏈，結(jié)構(gòu)如下-CH2(CH2)nCH2-其中n是1-5的整數(shù)。
79.根據(jù)權(quán)利要求1-78中的任一化合物，其中所述通式III的化合物是二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑。
80.一種藥物組合物，該組合物包含如權(quán)利要求55-58任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的化合物，以及生理上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明披露了抑制細(xì)胞內(nèi)發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝作用的方法，該方法包括用有效量的通式I的化合物，或二聚的酪氨酸磷酸化抑制劑，其生上可接受的鹽或前藥處理所述細(xì)胞。本發(fā)明還提供了在該方法中應(yīng)用的化合物。所述發(fā)動(dòng)蛋白依賴性的細(xì)胞內(nèi)攝的抑制作用可用于癲癇及神經(jīng)性疾病或病癥的治療。
文檔編號(hào)C07C255/34GK1938013SQ200480039977
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者A·麥克拉斯基, P·J·魯賓遜, T·A·希爾 申請(qǐng)人:紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)研究協(xié)會(huì)有限公司, 兒童醫(yī)學(xué)研究所