專利名稱:新的肌肉生長調(diào)節(jié)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種與調(diào)節(jié)肌肉生長有關(guān)的新的蛋白以及該新蛋白在調(diào)節(jié)或促進(jìn)肌肉生長和治療與肌肉生長或肌肉萎縮(muscle wasting)相關(guān)的疾病中的用途。
背景技術(shù):
肌肉組織包括大的、多核細(xì)胞。這些細(xì)胞中的大部分,大約三分之二,是肌原纖維(myofiril)或可收縮性單元(contractile unit)。肌原纖維由肌球蛋白粗肌絲(myosin th)和肌動(dòng)蛋白細(xì)肌絲(actin thin filament)組成。
肌細(xì)胞的發(fā)育開始于成肌細(xì)胞或前體細(xì)胞。成肌細(xì)胞經(jīng)過分化和融合過程形成肌管,其隨后進(jìn)一步分化成為肌纖維。
蛋白肌肉抑制素(myostatin)(或生長分化因子8)被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)肌肉生長和發(fā)育的主要因子。肌肉抑制素表現(xiàn)出對(duì)肌肉生長的負(fù)調(diào)節(jié)(Kambadur等1997)。已顯示肌肉抑制素中11bp的缺失在牛中導(dǎo)致Belgian Blue(比利時(shí)藍(lán))(或雙肌(double-muscled))表型。Belgian Blue牛在肌肉重量上增加了20%到30%。
肌肉抑制素延緩肌肉生長的準(zhǔn)確機(jī)理仍然有待闡明。
在長時(shí)間的停止使用(如臥床休息、太空飛行)的過程中,或者在肌肉萎縮疾病(如肌肉營養(yǎng)不良)的情況下,骨骼肌發(fā)生萎縮,其主要是由于肌蛋白的降解增強(qiáng)以及蛋白合成的減少。杜興肌營養(yǎng)不良(Duchenne musculardystrophy)是肌肉營養(yǎng)不良的最常見的形式之一。肌纖維發(fā)生壞死(necrosis)并且喪失了再生的能力。最近在mdx小鼠中顯示,一種杜興肌營養(yǎng)不良模型,肌肉無法再生是由于衛(wèi)星細(xì)胞的衰竭,更確切的說是纖維化所導(dǎo)致的。肌肉減少癥(sarcopenia)是與正常的年齡增長相關(guān)的肌肉重量和性能的降低。骨骼肌仍然能夠自我再生但是顯示老年肌肉中的環(huán)境對(duì)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和分化的支持較差。
許多生長因子涉及調(diào)節(jié)新生兒的骨骼肌生長和發(fā)育,例如IGF、HGF和FGF。沒有已知的生長因子對(duì)骨骼肌的發(fā)育具有比肌肉抑制素(GDF-8)更強(qiáng)的負(fù)效果。肌肉抑制素或生長和分化因子8(GDF-8)首先在小鼠中被表征。無肌肉抑制素小鼠顯示顯著增加的肌肉發(fā)育,比野生型小鼠重2到3倍。顯示肌肉重量的增加是由于肌肉增生(hyperplasia)和肥大(hypertrophy)。這些數(shù)據(jù)表明肌肉抑制素在控制肌肉重量中具有重要的作用以及肌肉抑制素是肌肉生長的強(qiáng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑。
因此,識(shí)別其它涉及調(diào)節(jié)肌肉生長的因子,包括能夠促進(jìn)肌肉生長的因子是有益的。至今,沒有鑒定出更多的能夠調(diào)節(jié)肌肉生長的因子。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于與促進(jìn)肌肉生長有關(guān)的多肽的識(shí)別。該肌肉生長促進(jìn)物被稱為“mighty”。術(shù)語mighty在整個(gè)說明書中使用以表示本發(fā)明所述的新的肌肉生長促進(jìn)物。
本發(fā)明還基于編碼mighty蛋白的DNA和相應(yīng)的mighty基因啟動(dòng)子的鑒定。
本發(fā)明提供含有選自SeQ ID No2或SEQ ID No4的序列的多肽。
本發(fā)明還提供多核苷酸序列,其編碼含有選自SeQ ID No2或SEQ ID No4的序列的多肽。該多核苷酸序列包括選自SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的序列。
本發(fā)明還提供多核苷酸,其含有選自下列的核苷酸序列a)SEQ ID No1或SEQ ID No3的互補(bǔ)序列,b)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向互補(bǔ)序列,和c)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向序列。
本發(fā)明的多核苷酸包含由于沉默取代或?qū)е滤a(chǎn)生氨基酸中保守取代的取代,而與SEQ ID No1或3不同的核苷酸序列。
本發(fā)明的多肽包括由本發(fā)明所述多核苷酸編碼的多肽。還提供含有至少一個(gè)多肽或其片段的融合蛋白。
本發(fā)明還提供一種或多種含有本發(fā)明序列的載體,以及一種或多種含有該載體的宿主細(xì)胞。該載體沿5’-3’方向含有a)基因啟動(dòng)子序列;b)本發(fā)明所述的多核苷酸序列;和c)基因終止序列。該多核苷酸可以處于有義或反義方向。
本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)肌肉生長的組合物。
一方面,該組合物包含下述任意一個(gè)a)包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸,b)(a)的片段或變體,c)與(a)有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸,d)(a)到(c)中任意一個(gè)的互補(bǔ)序列,e)(a)到(c)中任意一個(gè)的反向互補(bǔ)序列,f)(a)到(c)中任意一個(gè)的反義多核苷酸,g)由(a)到(c)中任意一個(gè)編碼的多肽,h)包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽,i)(g)或(h)的片段或變體,和j)相對(duì)(g)或(h)有至少95%,90%或70%序列同一性的多肽。
在另一方面,組合物可以包含mighty基因啟動(dòng)子,其包括SEQ ID No.5的序列、與SEQ ID No.5有至少95%、90%或70%同一性的多核苷酸、或其片段或變體。
在又一方面,組合物可以包含mighty基因表達(dá)或mighty蛋白活性的調(diào)節(jié)物。
mighty基因表達(dá)或mighty蛋白活性的調(diào)節(jié)物可以特異地結(jié)合于選自下列任意一個(gè)的多核苷酸a)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5,b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸,c)與(a)或(b)有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸,d)(a)到(c)中任意一個(gè)的互補(bǔ)序列,e)(a)到(c)中任意一個(gè)的反向互補(bǔ)序列,和f)(a)到(e)中任意一個(gè)的片段或變體。
mighty基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物可以是反義多核苷酸。mighty基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物也可以是干擾RNA分子。具體地,mighty基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物可以是RNAi或siRNA分子。
調(diào)節(jié)物也可以是肌肉抑制素或肌肉抑制素的模擬物(mimetic)。該模擬物可以是C-末端在氨基酸位置330和350或兩者之間截?cái)嗟募∪庖种扑仉摹T摻財(cái)嗫梢栽?30、335或350的任意一個(gè)位置。
在另一方面,本發(fā)明的組合物可以用于治療或預(yù)防與肌肉生長相關(guān)的疾病。該疾病可以是導(dǎo)致肌肉萎縮(muscle atrophy)的疾病。該疾病可以選自肌營養(yǎng)不良(muscular dystrophy)、肌肉惡病(muscle cachexia)、萎縮、肥大、與癌癥或HIV有關(guān)的肌肉萎縮、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateralsclerosis)(ALS)或與心肌生長相關(guān)的疾病,包括梗死(infarct)。該組合物還可以用于在肌肉損傷后促進(jìn)肌肉再生。
本發(fā)明還提供使用本發(fā)明所述的組合物調(diào)節(jié)或促進(jìn)肌肉生長、治療或預(yù)防與肌肉生長或損傷后肌肉再生相關(guān)的疾病的方法。該方法可用于生產(chǎn)具有增加的肌肉重量的動(dòng)物。
本發(fā)明的組合物還可以被用于生產(chǎn)調(diào)節(jié)肌肉生長、治療或預(yù)防與肌肉生長或損傷后肌肉再生相關(guān)的疾病的藥物。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明所述的組合物轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以導(dǎo)致具有增加的肌肉重量的動(dòng)物。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以選自綿羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠、魚或人。
本發(fā)明還提供預(yù)測(cè)動(dòng)物肌肉重量的方法,其包括如下步驟i)從動(dòng)物中獲得樣品,ii)測(cè)定具有序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸、與SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體的基因表達(dá)水平;或測(cè)定具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95%、90%或70%序列同一性的多肽、或其片段或變體的量。
iii)將基因表達(dá)水平或多肽的量與平均值進(jìn)行比較;和iv)預(yù)測(cè)所述動(dòng)物的肌肉重量。
基因表達(dá)水平可以使用RTPCR或northern分析進(jìn)行測(cè)定。多肽可以使用ELISA或Western印跡分析進(jìn)行測(cè)定。
在另一方面,本發(fā)明提供了檢測(cè)mighty變體的方法,其包括使用選自下列的核苷酸序列a)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5,b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸,c)與(a)或(b)有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸,d)(a)到(c)中任意一個(gè)的互補(bǔ)序列,
e)(a)到(c)中任意一個(gè)的反向互補(bǔ)序列,和f)(a)到(e)中任意一個(gè)的片段或變體,以從來自生物體的樣品中篩選mighty的變體。
mighty的變體可以是多態(tài)性(polymorphism)的,尤其可以是單核苷酸多態(tài)性的。mighty變體也可以與改變的肌肉表型相關(guān)。
本發(fā)明還提供改善動(dòng)物肌肉重量的方法,其包括如下步驟i)選擇一個(gè)或多個(gè)根據(jù)本發(fā)明預(yù)測(cè)具有增加的肌肉重量的動(dòng)物,和ii)繁殖一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)具有增加的肌肉重量的動(dòng)物以產(chǎn)生具有改善的肌肉重量的動(dòng)物。
本發(fā)明所述的動(dòng)物可以選自綿羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠、魚或人。
本發(fā)明還提供抗體,其優(yōu)先結(jié)合具有序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的多肽或與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95%、90%或70%序列同一性的多肽。
本發(fā)明還提供具有序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的多肽的抗原性片段在生產(chǎn)抗體中的應(yīng)用,所述抗體優(yōu)先結(jié)合具有序列SEQ ID NO.2或SEQID NO.4的多肽或與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95%、90%或70%序列同一性的多肽。
本發(fā)明還提供含有序列SEQ ID No5的分離的多核苷酸,其含有鼠類mighty基因的啟動(dòng)子區(qū)域,與SEQ ID No5有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸,或其片段或變體。
片段可以包含mighty起始位點(diǎn)上游至少200個(gè)核苷酸,可以包含mighty起始位點(diǎn)上游209、287、315、400、600、1000和2100個(gè)核苷酸中任意一個(gè)。
本發(fā)明還提供一種或多種載體,其含有SEQ ID No.5的多核苷酸、與SEQID No.5有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體,以及一種或多種含有該載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供篩選一種或多種在抑制或促進(jìn)肌肉生長中潛在有效的化合物的方法,其包括如下步驟i)將具有序列SEQ ID No5的多核苷酸、與SEQ ID No.5有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體插入到連接有合適的標(biāo)記基因的合適的載體中;
ii)用該載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞;iii)對(duì)該宿主細(xì)胞施用感興趣的化合物;和iv)測(cè)定標(biāo)記基因表達(dá)水平的任何差異。
載體可以包括任何合適的載體,而且可以包括原核質(zhì)粒、真核質(zhì)?;虿《据d體。標(biāo)記基因可以包括任何合適的標(biāo)記基因,而且可以包括編碼綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶或β-半乳糖苷酶的多核苷酸。
本發(fā)明還提供在肌細(xì)胞中表達(dá)所需蛋白的方法,其包括如下步驟i)分離編碼待表達(dá)的基因的多核苷酸序列;ii)將具有序列SEQ ID No5的多核苷酸、或與SEQ ID No.5有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體插入到載體中,其沿5’-3’的方向與待表達(dá)的蛋白的多核苷酸序列可操作地相連,和iii)將載體導(dǎo)入肌肉宿主細(xì)胞。
載體可以包括真核載體、病毒載體或任何適于基因治療的載體。
宿主細(xì)胞可以包括原代成肌細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的成肌細(xì)胞系或mighty啟動(dòng)子在其中有活性的任何細(xì)胞系。宿主細(xì)胞還可以包括宿主動(dòng)物的體內(nèi)骨骼肌或心肌細(xì)胞。
宿主動(dòng)物可以包括綿羊、母牛、鹿、公牛、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠、魚或人。
定義術(shù)語“多核苷酸”是應(yīng)當(dāng)理解為脫氧核糖核酸或核糖核酸的聚合物,包括單鏈和雙鏈聚合物,包括DNA、RNA、cDNA、基因組DNA、重組DNA和多核苷酸的所有其它已知形式。多核苷酸可以是從天然來源中分離的、使用重組或分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的、或者合成產(chǎn)生的。多核苷酸可以包括整個(gè)基因或其任意部分,并且不是必須具有開放讀碼框。
本發(fā)明的所有多核苷酸的使用都包括任意或所有的開放讀碼框。開放讀碼框可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)構(gòu)建。這些技術(shù)包括分析序列以鑒定已知的起始和終止密碼子。許多能夠?qū)崿F(xiàn)該功能的計(jì)算機(jī)軟件程序在本領(lǐng)域是公知的。
術(shù)語“多肽”應(yīng)當(dāng)理解為共價(jià)連接的氨基酸的聚合物。多肽包括從天然來源中分離的多肽、使用重組技術(shù)生產(chǎn)的多肽、或合成生產(chǎn)的多肽。可意識(shí)到的是含有在體外被切除的前導(dǎo)序列或前序列的多肽、或含有連接物或任何其它序列的多肽、或經(jīng)過翻譯后修飾的多肽被確定涵蓋在多肽的定義中。
術(shù)語“片段或變體”應(yīng)當(dāng)理解為任何部分序列或通過取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而修飾的序列,但是其具有基本相同的活性。
多核苷酸片段還包括足夠長并且其在嚴(yán)格條件下特異性地與SEQ ID No1或SEQ ID No3的序列雜交的多核苷酸片段?!皣?yán)格條件”的例子包括用5XSSC,0.2%SDS在65℃預(yù)雜交;在65℃于5X SSC,0.2%SDS中雜交過夜;用1X SSC,0.1%SDS在65℃洗滌兩次,每次30分鐘;而后進(jìn)一步用0.2X SSC,0.1%SDS在65℃洗滌兩次,仍然是每次30分鐘。
多肽片段還包括保留有mighty蛋白活性的片段。該片段可以具有增強(qiáng)的活性并且因此,當(dāng)導(dǎo)入或在細(xì)胞中表達(dá)時(shí),導(dǎo)致mighty蛋白活性的增加??蛇x地,片段可以具有顯著的負(fù)效果。
“Mighty基因”被定義為SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的多核苷酸,或與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3有95%、90%或70%同一性的多核苷酸或其片段。
“基因表達(dá)”被定義為轉(zhuǎn)錄的起始、mighty基因轉(zhuǎn)錄為mRNA以及mRNA翻譯為多肽。“mighty基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物”被定義為任何能夠?qū)е耺ighty基因表達(dá)增加或減少的化合物。
“Mighty蛋白”被定義為具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有95%、90%或70%同一性的多肽、或其片段或變體。
“Mighty蛋白活性”被定義為mighty蛋白刺激肌肉生長的能力。
“肌肉生長”被定義為肌細(xì)胞的分裂和/或分化并且包括任何肌肉前體細(xì)胞的分裂和/或分化。
“mighty蛋白活性的調(diào)節(jié)物”被定義為能夠增加或降低mighty蛋白活性的化合物。
“mighty基因啟動(dòng)子”被定義為SEQ ID No.5的多核苷酸,與SEQ ID No.5有95%、90%或70%同一性的多核苷酸、或其片段或變體。
通過如下僅作為實(shí)例給出的附圖及說明,本發(fā)明的其它方面將顯而易見。
本發(fā)明現(xiàn)在通過例示的方式僅參考下列附圖進(jìn)行說明圖1顯示來自雙肌牛和正常肌肉的牛的mighty的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖2(A)顯示來自正常肌肉的牛(wt,泳道1)和雙肌表型(BB,泳道2)的心臟組織的mighty的PCR擴(kuò)增結(jié)果。(B)顯示來自羊骨骼肌(泳道4)的mighty的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖3(A)和(B)顯示mighty啟動(dòng)子序列和鑒定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
圖4顯示成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞增殖中mighty的表達(dá)結(jié)果。
圖5顯示以MHC抗體對(duì)對(duì)照和mighty過表達(dá)肌管的免疫染色。
圖6顯示活躍生長的C2C12克隆7和11和lacZ對(duì)照的測(cè)量結(jié)果,測(cè)量是通過(A)細(xì)胞面積的定量顯像分析。(B)FACScan流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量前向角光散射(forward angle light scatter)(FALS)(在克隆7和克隆11中觀察到的右移表明了細(xì)胞尺寸的增大)以及通過定量顯像分析測(cè)量的含3個(gè)核的肌管的長度(C)、寬度(D)和面積(E)。
圖7顯示(A)將mighty過表達(dá)的C2C12克隆7和11、和對(duì)照的C2C12成肌細(xì)胞在分化培養(yǎng)基(DMEM 2%HS)中培養(yǎng)48、60和72小時(shí)。固定成肌細(xì)胞并用抗MHC抗體免疫染色,用Gills蘇木精(Gills haematoxylin)輕微復(fù)染。(B)mighty過表達(dá)的C2C12克隆7和11、和對(duì)照C2C12的Western印跡分析。成肌細(xì)胞在分化培養(yǎng)基(DMEM 2%HS)中培養(yǎng)0、24、48和72小時(shí)。從細(xì)胞中提取的總蛋白(15μg)用4-12%的SDS-PAGE分析,轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜,并用小鼠單克隆抗p21、兔多克隆抗MyoD或小鼠單克隆抗MHC抗體為探針探測(cè)。濾膜還用小鼠單克隆抗-α-微管蛋白抗體為探針探測(cè)以表明相等的加載(equal loading)。
圖8顯示在靜止(quiescent)和活性衛(wèi)星細(xì)胞中mighty蛋白的檢測(cè)。來自靜止和活性衛(wèi)星細(xì)胞的蛋白用SDS-PAGE分析并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜。通過兔抗mighty抗體檢測(cè)mighty蛋白。在活性衛(wèi)星細(xì)胞中可檢測(cè)到mighty蛋白,但是在靜止衛(wèi)星細(xì)胞沒有檢測(cè)到。
圖9顯示在骨骼肌再生的過程中mighty的表達(dá)。將虎蛇毒素(Notexin)注射到TA肌肉中以誘導(dǎo)肌肉損傷并且收集在損傷后第0、1、5、14和28天的TA肌肉以進(jìn)行mighty的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。(A)在第0天的無損傷對(duì)照TA肌肉。(B)損傷后第1天。(C)損傷后第5天。(D)損傷后第7天。(G)損傷后第28天。綠色,Mighty;藍(lán)色,DNA。
圖10顯示在梗死形成后(post-infarction)的心臟組織中mighty的表達(dá)。進(jìn)行在未梗死(第0天)和梗死形成后(第2天和第6天)的心臟組織中mighty的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。(A)未梗死對(duì)照心臟組織。B)梗死形成后第2天。(C)梗塞形成后第6天。
圖11顯示在mighty和對(duì)照轉(zhuǎn)染的人成肌細(xì)胞中MHC陽性肌管的數(shù)量。人成肌細(xì)胞用mighty-pcDNA3或僅用pcDNA3(對(duì)照)轉(zhuǎn)染,在分化條件下培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。然后進(jìn)行肌管中肌球蛋白重鏈(MHC)表達(dá)的免疫組織化學(xué)(ICC)。以穿過整孔的間隔拍攝連續(xù)無重疊的照片,并且計(jì)數(shù)MHC陽性肌管/孔的數(shù)目。
圖12顯示(A)每個(gè)肌管的肌核(myonuclei)頻率和(B)含有5,6,7,8和9個(gè)肌核的肌管寬度。用mighty-pcDNA3或僅用pcDNA3(對(duì)照)轉(zhuǎn)染人成肌細(xì)胞,在分化條件下培養(yǎng)12h,并進(jìn)行用于MHC表達(dá)的ICC。測(cè)量含有5,6,7,8和9個(gè)肌核(n=53)的MHC陽性肌管的最大寬度。
圖13顯示在條件培養(yǎng)基處理的人成肌細(xì)胞中肌核/MHC陽性肌管的數(shù)量。用來自mighty穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞或LacZ(對(duì)照)轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理人成肌細(xì)胞。細(xì)胞用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,然后進(jìn)行MHC表達(dá)的ICC。在每顯微區(qū)域(n=245個(gè)肌管)的5個(gè)肌管中計(jì)數(shù)肌核/MHC陽性肌管的數(shù)量。(A)具有1-3,4-6,和7-9個(gè)肌核的肌管的數(shù)量。(B)肌核/肌管的平均數(shù)。
圖14顯示條件培養(yǎng)基處理的含有8個(gè)肌核的肌管的寬度。用來自mighty穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞或LacZ(對(duì)照)轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理人成肌細(xì)胞。細(xì)胞用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,然后進(jìn)行用于MHC表達(dá)的ICC。測(cè)量含有8個(gè)肌核的MHC陽性肌管的最大寬度。
圖15顯示在條件培養(yǎng)基處理的人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞中MHC陽性肌管的數(shù)量。用來自mighty穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞或LacZ(對(duì)照)轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理人RD細(xì)胞。細(xì)胞用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)72h,然后進(jìn)行用于MHC表達(dá)的ICC。計(jì)數(shù)MHC陽性肌管/孔的數(shù)目。
圖16顯示鼠類mighty啟動(dòng)子在各種細(xì)胞系中具有活性。將(A)C2C12成肌細(xì)胞、原代羊成肌細(xì)胞、NIH3T3成纖維細(xì)胞、中華倉鼠卵巢(CHO)和(B)人RD(橫紋肌肉瘤)細(xì)胞用1kb mighty啟動(dòng)子/報(bào)道基因構(gòu)建體瞬間轉(zhuǎn)染24小時(shí)。然后在生長或分化培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。測(cè)定熒光素酶活性并根據(jù)來自共轉(zhuǎn)染的pCH110的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖17顯示mighty啟動(dòng)子被肌肉抑制素劑量依賴性地抑制。C2C12成肌細(xì)胞被用方法中所述的1kb啟動(dòng)子瞬間轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí),細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中用4和8μg/ml的重組肌肉抑制素處理。處理24小時(shí)后收獲細(xì)胞。根據(jù)β-半乳糖苷酶活性標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性。
圖18顯示肌肉抑制素模擬物(myostatin mimetics)能回復(fù)(rescue)肌肉抑制素介導(dǎo)的mighty啟動(dòng)子抑制。X-軸是根據(jù)β-半乳糖苷酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的mighty啟動(dòng)子的相對(duì)熒光素酶活性。Ctrl條表示對(duì)照羊成肌細(xì)胞;wt條表示用野生型肌肉抑制素(3μg)處理的羊成肌細(xì)胞;335條表示用15μg肌肉抑制素模擬物335處理的羊成肌細(xì)胞;335+wt表示用3μg肌肉抑制素和15μg肌肉抑制素模擬物處理的羊成肌細(xì)胞。
圖19.顯示mighty基因上游片段的啟動(dòng)子活性。C2C12成肌細(xì)胞用方法中所述的啟動(dòng)子片段報(bào)道基因構(gòu)建體瞬間轉(zhuǎn)染。然后在生長或分化培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)。測(cè)定熒光素酶活性并根據(jù)來自共轉(zhuǎn)染的pCH110的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖20顯示抗mighty蛋白抗體的應(yīng)用。泳道表示M,標(biāo)記;1,由肽特異性的mighty抗體識(shí)別的純化的重組小鼠mighty蛋白;2,由牛蛋白抗體識(shí)別的純化的重組牛mighty蛋白;3,從誘導(dǎo)mighty表達(dá)的含有mighty表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞中提取的蛋白(使用牛蛋白抗體);和4,從含有mighty表達(dá)質(zhì)粒(未誘導(dǎo))的大腸桿菌細(xì)胞中提取的蛋白(使用牛蛋白抗體)。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于涉及肌肉發(fā)育和再生的新蛋白。該蛋白稱為“mighty”。
已從羊(SEQ ID No1)和牛(SEQ ID No3)中鑒定并克隆了Mighty基因。在一個(gè)方面,本發(fā)明提供了從牛和綿羊中分離的mighty多核苷酸。具體地,本發(fā)明提供來自羊,SEQ ID No.1,和牛的SEQ ID No.3的多核苷酸序列,其包括反義多核苷酸和可操作的反義片段。
本發(fā)明還提供從牛和羊分離的多肽序列。具體地,本發(fā)明提供來自羊,SEQ ID No.2和牛SEQ ID No.4的多肽,以及編碼SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸。
可以理解,多核苷酸由于遺傳編碼的冗余可以包含沉默取代或在所得的氨基酸中導(dǎo)致保守取代的取代。此外,還預(yù)期基本上沒改變蛋白活性的本發(fā)明的多核苷酸和多肽的片段和變體。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明多核苷酸的載體。使用載體儲(chǔ)存(store)、復(fù)制和表達(dá)多核苷酸序列是本領(lǐng)域公知的。一般載體包括,以5’-3’方向基因啟動(dòng)子序列、本發(fā)明的多核苷酸序列、和基因終止序列。載體意指包括將本發(fā)明的序列并入質(zhì)粒和/或病毒中以幫助在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入和/或保持序列。宿主細(xì)胞可以包括原核或真核細(xì)胞。真核細(xì)胞可以是體內(nèi)的,或可以是原代或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。
本發(fā)明人已顯示mighty蛋白在雙肌的牛中高表達(dá)(參見圖1和圖2),其表明mighty在促進(jìn)肌肉生長中發(fā)揮作用。還顯示Mighty上調(diào)成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞的生長,其確定了mighty在促進(jìn)肌肉生長中的作用(圖4)。對(duì)過表達(dá)mighty的C2C12細(xì)胞的進(jìn)一步研究顯示mighty誘導(dǎo)肌細(xì)胞的肥大。這通過過表達(dá)mighty的細(xì)胞中核數(shù)量的增加(圖5)和細(xì)胞尺寸的增大(圖6)表明。此外,如圖7所示,過表達(dá)mighty的C2C12細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞更早分化。原代成肌細(xì)胞(活性衛(wèi)星細(xì)胞)也顯示出比衛(wèi)星細(xì)胞(靜止細(xì)胞)具有更高水平的mighty。
這些結(jié)果證實(shí)了mighty在肌肉生長和發(fā)育中的作用,并且表明mighty可以用于調(diào)節(jié)或促進(jìn)肌肉生長和發(fā)育。Mighty提供了用于生產(chǎn)具有增加的肌肉重量的動(dòng)物的有用工具,其具有農(nóng)業(yè)效益。另外,mighty提供了用于治療與肌肉生長和尤其是與肌肉萎縮相關(guān)的疾病的組合物開發(fā)。所述疾病包括,但不限于肌營養(yǎng)不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌癥或HIV有關(guān)的肌肉萎縮、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)或與心肌生長相關(guān)的疾病,包括梗死。
因此包括用于調(diào)節(jié)肌肉生長的組合物?!罢{(diào)節(jié)肌肉生長”意指包括肌肉生長和/或發(fā)育速度的任何改變并且包括任何肌前體細(xì)胞的生長和/或分化。這包括前體肌細(xì)胞分裂速度的任何改變,和/或前體肌細(xì)胞分化速度的任何改變。這種改變可以是增加或者降低。
該組合物是基于mighty基因序列,其包括來自羊SEQ ID No.1或牛SEQID No.3的序列,與SEQ ID No.1或SEQ ID No.5有至少95%、90%或75%序列同一性的多肽,或其片段或變體??梢酝ㄟ^并入啟動(dòng)子,mighty啟動(dòng)子(SEQ ID No5)或其它合適的啟動(dòng)子調(diào)控下的合適載體將序列導(dǎo)入細(xì)胞。啟動(dòng)子可用于導(dǎo)致mighty蛋白的表達(dá),從而增加細(xì)胞中基因的表達(dá)和mighty蛋白的活性。
組合物還可以包含與本發(fā)明多核苷酸序列有至少95%、90%或70%序列同一性的序列。序列同一性可以通過比對(duì)序列并檢測(cè)相同核苷酸的數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。已知許多計(jì)算機(jī)算法用于測(cè)定序列同一性,例如BLASTN算法。
組合物還可以包含本發(fā)明所述多核苷酸的互補(bǔ)、反向互補(bǔ)或反義多核苷酸。
組合物還可以包含本發(fā)明的mighty多肽。多肽可以來自羊SEQ ID No.2或牛SEQ ID No.4、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95%、90%或70%序列同一性的多肽、或其片段或變體。
組合物還可以包含與本發(fā)明多肽序列有至少95%、90%或70%序列同一性的序列。序列同一性可以通過比對(duì)序列并檢測(cè)相同殘基的數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。本領(lǐng)域已知有許多計(jì)算機(jī)算法用于測(cè)定序列同一性,例如BLASTP算法。
調(diào)節(jié)肌肉生長的組合物還可以包含mighty基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物。
調(diào)節(jié)肌肉生長的組合物還可以包含mighty蛋白活性的調(diào)節(jié)物。
Mighty基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物可以是能夠特異性結(jié)合于本發(fā)明所述多核苷酸的化合物。具體地,所述mighty基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物可以與mighty基因啟動(dòng)子結(jié)合,從而影響轉(zhuǎn)錄起始或維持的速度。可替換地,啟動(dòng)子或其片段可用于將特殊的改變引入細(xì)胞的天然啟動(dòng)子中以增強(qiáng)或者抑制野生型mighty基因的表達(dá)。改變可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、插入或缺失。
Mighty基因表達(dá)的另一種調(diào)節(jié)物也可以結(jié)合mighty基因,從而直接影響基因表達(dá)的速度。
Mighty基因表達(dá)的另一種調(diào)節(jié)物也可以通過結(jié)合到mighty基因并向序列中引入改變,例如通過同源重組來起作用,其可以影響基因表達(dá)的速度或者改變mighty蛋白的活性。序列的改變包括核苷酸的改變、插入或缺失,其能夠或者不能導(dǎo)致產(chǎn)生的多肽中氨基酸的改變、插入或缺失。改變的例子可以包括插入終止密碼子從而產(chǎn)生截短的多肽,或者改變一個(gè)或多個(gè)密碼子從而改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基??商鎿Q地,變異可以是刪除野生型mighty基因的一部分或者是插入一部分到mighty野生型基因中。產(chǎn)生這些改變的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。另外,將這些改變導(dǎo)入mighty基因中以及隨后測(cè)定mighty活性的改變都屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù),例如使用實(shí)施例4中所述的成肌細(xì)胞增殖試驗(yàn)。
還可以通過導(dǎo)入干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的多核苷酸改變mighty基因的表達(dá)。例如可以導(dǎo)入反義多核苷酸,其可以包括反義表達(dá)載體、反義寡脫氧核糖核苷酸、反義硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸、反義寡核糖核苷酸、反義硫代磷酸寡核苷酸,或任何其它本領(lǐng)域已知的方法,其包括使用化學(xué)修飾以增強(qiáng)反義多核苷酸的效率。
可以理解,任何反義多肽不需要與所述多核苷酸100%互補(bǔ),而只需要具有足夠的同一性以使得反義多核苷酸與基因或mRNA結(jié)合從而干擾基因表達(dá),并且基本不干擾其它基因的表達(dá)。還可以理解的是與基因互補(bǔ)的多核苷酸,包括5’非翻譯區(qū)域也可以用來干擾mighty蛋白的翻譯。同樣的,這些互補(bǔ)多核苷酸不需要100%互補(bǔ),而是足以結(jié)合mRNA和干擾翻譯,并且基本不干擾其它基因的翻譯即可。
基因表達(dá)的調(diào)節(jié)也可以包含使用本領(lǐng)域已知的干擾RNA分子,并包括RNA干擾(RNAi)和小分子干擾RNA(siRNA)。
基因表達(dá)的調(diào)節(jié)也可以通過使用催化性RNA分子或核酶獲得。本領(lǐng)域已知所述核酶可以被設(shè)計(jì)用于與特異靶向的RNA分子配對(duì)。核酶結(jié)合并裂解該靶向的RNA。
任何其它本領(lǐng)域已知的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的技術(shù)也可以用于調(diào)節(jié)mighty基因表達(dá)。
組合物還可以包含mighty活性的調(diào)節(jié)物。Mighty的調(diào)節(jié)物包括mighty蛋白的優(yōu)勢(shì)負(fù)突變體(dominant negative mutant)。當(dāng)突變體產(chǎn)生妨礙野生型蛋白生理學(xué)活性的效果時(shí),即表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)負(fù)效果。這可以通過優(yōu)勢(shì)負(fù)蛋白與受體結(jié)合但不激活受體,同時(shí)也阻止野生型蛋白結(jié)合而發(fā)生??商鎿Q地,優(yōu)勢(shì)負(fù)效果可以通過直接結(jié)合野生型蛋白并且使其失活而發(fā)生作用。
因此本發(fā)明的多核苷酸可用于制備合適的組合物,或用于設(shè)計(jì)合適的組合物,其調(diào)節(jié)mighty基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)肌肉生長。該技術(shù)可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi),例如原代或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中mighty基因的表達(dá),或者調(diào)節(jié)動(dòng)物的肌肉生長。
本發(fā)明組合物的一種可能的應(yīng)用是促進(jìn)或抑制肌細(xì)胞的生長和/或分化。肌細(xì)胞可以是原代或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系,或者細(xì)胞可以是宿主動(dòng)物的體內(nèi)細(xì)胞。合適的宿主動(dòng)物可以包括羊、母牛、公牛、鹿、家禽、豬、魚、馬、小鼠、大鼠或人。
本發(fā)明的組合物也可用于治療與肌肉組織相關(guān)的疾病。所述疾病或損傷包括肌營養(yǎng)不良、肌肉共濟(jì)失調(diào)(muscle ataxia)或與心肌生長相關(guān)的疾病。類似的,組合物也可以用于在肌肉損傷后促進(jìn)肌肉再生。
如圖9所示,肌肉受損后在肌肉再生過程中細(xì)胞內(nèi)的mighty表達(dá)增加。而且,顯示在梗死后羊心臟組織中的mighty表達(dá)增加(圖10)。這些結(jié)果表明mighty也參與肌肉再生。因此,組合物不僅可以用于治療與肌肉生長相關(guān)的疾病,還可以用于治療受傷后的肌肉損傷。
圖11到15的結(jié)果表明本發(fā)明的組合物也可用于刺激人類肌肉的生長和分化,進(jìn)一步證明了本發(fā)明在人類醫(yī)藥應(yīng)用中的潛力。
類似地,組合物可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。組合物可用于生產(chǎn)肌肉重量增加的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。合適的動(dòng)物可以包括羊、母牛、公牛、鹿、家禽、豬、魚、馬、小鼠、大鼠或人。可以使用本領(lǐng)域已知的許多用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù),和任何合適的方法。
本發(fā)明的另一應(yīng)用是預(yù)測(cè)動(dòng)物的肌肉重量。為此從動(dòng)物中獲得樣品。然后分析樣品的mighty基因表達(dá)或mighty蛋白的水平。本領(lǐng)域已知許多用于測(cè)量基因表達(dá)或蛋白量的技術(shù)。例如,基因表達(dá)可以使用定量RTPCR或northern分析進(jìn)行測(cè)定。蛋白含量可以使用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))或Western印跡分析進(jìn)行測(cè)定。
然后將mighty基因表達(dá)的水平、或mighty蛋白的量與平均值比較。Mighty基因表達(dá)的平均水平是從平均肌肉重量的動(dòng)物樣本中獲得的平均水平。類似地,mighty蛋白的平均量是在平均肌肉重量的動(dòng)物樣本中觀測(cè)到的蛋白量。
與平均值相比,增高水平的mighty基因表達(dá)或mighty蛋白是指動(dòng)物的肌肉重量將被預(yù)測(cè)為高于平均的肌肉重量。與平均值相比,降低水平的mighty基因表達(dá)或mighty蛋白是指動(dòng)物的肌肉重量將被預(yù)測(cè)為低于平均值。
可以理解,天然發(fā)生的mighty基因的變體可以存在。該變體可以包括多態(tài)性,例如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用本發(fā)明的序列篩選該變體。例如,序列可用于設(shè)計(jì)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中使用的合適引物以擴(kuò)增mighty基因或mighty基因的片段從而在各種不同的生物體中篩選該變體。篩選可能包括,例如直接測(cè)序或單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析(SSCP)的方法。還可理解的是mighty的變體可與生物體改變的肌肉重量相關(guān)。
上述測(cè)定mighty表達(dá)水平或檢測(cè)與改變的肌肉重量相關(guān)的mighty變體的方法可用于挑選參與繁殖程序的動(dòng)物,從而產(chǎn)生具有增加或減少的肌肉重量的后代。
發(fā)明還提供抗mighty蛋白的抗體。使用本說明書公開的序列,本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠產(chǎn)生抗mighty蛋白的抗體。如何產(chǎn)生抗體的實(shí)例,其中包括雜交瘤的生產(chǎn),可以在Eryl Liddell and Cryer(1996)或Javois(1999)中找到。還可理解的是抗體的結(jié)合區(qū)被認(rèn)為屬于抗體的定義。
如實(shí)施例16所描述以及圖20所示,可以在合適的動(dòng)物中產(chǎn)生抗整個(gè)mighty蛋白的多克隆抗體??商鎿Q地,抗原性片段可以用于產(chǎn)生特異的肽。這表明了本發(fā)明的抗體如何能夠使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生。
該抗體可以被用于檢測(cè)、和/或在樣本中定量mighty蛋白??商鎿Q地,本發(fā)明的抗體可用于結(jié)合和調(diào)節(jié)mighty活性。
可理解的是可產(chǎn)生其它類型的抗體和結(jié)合蛋白并預(yù)期為本發(fā)明的一部分。這些包括,但不限于,非哺乳動(dòng)物抗體,例如來自鯊魚的IgNAR類抗體;細(xì)菌免疫蛋白(bacterial immunity protein),例如來自大腸桿菌的IMM7免疫蛋白,或本領(lǐng)域已知的其它類型的結(jié)合蛋白。使用本說明書公開的序列,本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠產(chǎn)生該多肽或者篩選已知結(jié)合多肽的文庫以獲得優(yōu)選與本發(fā)明多肽結(jié)合的多肽。
也分離和克隆了小鼠mighty啟動(dòng)子(SEQ ID No5),并且也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還提供一種或多種含有小鼠mighty啟動(dòng)子的多核苷酸。mighty啟動(dòng)子是SEQ ID No5的多核苷酸、與SEQ ID No5有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸、或其片段或衍生物。
啟動(dòng)子序列的分析,圖3,顯示了已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
含有mighty基因啟動(dòng)子的載體可以使用已知的技術(shù)產(chǎn)生。載體意指包括將多核苷酸并入質(zhì)粒和/或病毒中以幫助將多核苷酸導(dǎo)入和/或保持在宿主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞、體內(nèi)或原代或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。
如圖16所示,mighty啟動(dòng)子可用于驅(qū)動(dòng)基因在包括人的各種細(xì)胞系中表達(dá)。而且,如圖19所示,小至mighty起始位點(diǎn)上游200個(gè)核苷酸的片段能夠驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。
mighty基因啟動(dòng)子可用于篩選能夠有效調(diào)節(jié)mighty基因表達(dá),并因而能夠有效調(diào)節(jié)肌肉生長的化合物。為此,可將mighty啟動(dòng)子置于帶有合適標(biāo)記基因的合適表達(dá)載體中?!皹?biāo)記基因”是表達(dá)產(chǎn)物可被識(shí)別和定量的基因。已知許多合適的標(biāo)記基因,并可包括例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶或β-半乳糖苷酶。
然后使用已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體置于合適的宿主細(xì)胞中。合適的宿主細(xì)胞包含細(xì)胞,其中mighty基因啟動(dòng)子被激活,導(dǎo)致標(biāo)記基因表達(dá),并且能夠檢測(cè)標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的水平。然后將目標(biāo)化合物施用于宿主細(xì)胞,檢測(cè)標(biāo)記基因中的任何改變。
與基線(base line)相比,標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物量的增加表明所述化合物能夠通過mighty基因啟動(dòng)子增強(qiáng)基因表達(dá),因而可用于促進(jìn)肌肉生長。與基線相比,標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物量的減少表明所述化合物能夠通過mighty基因啟動(dòng)子抑制基因表達(dá),因而可用于抑制肌肉生長。
如圖17所示,該方法能用于表明mighty啟動(dòng)子被肌肉抑制素調(diào)節(jié)。因?yàn)榧∪庖种扑厥且阎募∪庳?fù)調(diào)節(jié)物,該結(jié)果進(jìn)一步證明了mighty在促進(jìn)和調(diào)節(jié)肌肉生長和發(fā)育中的活性。肌肉抑制素的優(yōu)勢(shì)負(fù)模擬物也是已知的。WO01/53350,C末端截?cái)?在位置330和350之間)的肌肉抑制素肽產(chǎn)生具有優(yōu)勢(shì)負(fù)效果的肌肉抑制素模擬物。如圖18所示,肌肉抑制素模擬物335(在位置335截?cái)?能夠回復(fù)肌肉抑制素介導(dǎo)的mighty啟動(dòng)子抑制。結(jié)合來看,圖17和圖18顯示肌肉抑制素和肌肉抑制素模擬物能夠分別被用于下調(diào)或上調(diào)mighty表達(dá),并因而能夠在本發(fā)明的組合物中使用。
might基因啟動(dòng)子也可用于表達(dá)肌細(xì)胞中的指定基因。指定基因可以包含本發(fā)明的多核苷酸,或可以是任何其它多核苷酸,例如編碼肌肉抑制素蛋白的多核苷酸。為此,將mighty基因啟動(dòng)子連同目的基因插入合適的載體。本領(lǐng)域已知許多合適的載體,并可包括真核載體、病毒載體或任何適于基因治療的載體。
然后可使用已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。
合適的宿主細(xì)胞可為任何肌肉細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞,其中mighty啟動(dòng)子被激活。宿主細(xì)胞可包括,例如原代或成肌細(xì)胞系,或轉(zhuǎn)化的成肌細(xì)胞系,或宿主動(dòng)物的骨骼肌或心肌細(xì)胞。
可使用任何mighty啟動(dòng)子有活性的宿主動(dòng)物,而可以包括例如羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、魚、馬、小鼠、大鼠或人。
實(shí)施例1分離mighty cDNARNA純化根據(jù)制造商的規(guī)程使用TRIZOL(Invitrogen)從羊和牛的骨骼肌和心臟組織樣本中純化RNA。
mighty cDNA的擴(kuò)增mighty cDNA的擴(kuò)增通過聯(lián)合反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行。根據(jù)制造商的指示使用Superscript preamplification試劑盒(Invitrogen)在來自5μg總RNA的20μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物中合成第一鏈cDNA。用于擴(kuò)增的PCR條件和特異引物如下羊和牛骨骼肌mighty cDNA和牛心臟mighty cDNA的擴(kuò)增使用如下引物正向引物5’CACCATGGCGTGCGGGGCGACACTG 3’(SEQ ID No.6)反向引物5’GGATACATAGCTTGTTGGCCT 3’(SEQ ID No.7)PCR在存在Q溶液(Qiagen)的情況下進(jìn)行,并在94℃起始變性1分鐘,然后以下述步驟進(jìn)行35個(gè)循環(huán),94℃ 15秒,60℃ 45秒,72℃ 1分鐘,和最后延伸的1個(gè)循環(huán)72℃ 5分鐘。
來自Belgian Blue牛和正常肌肉的牛的mighty片段的PCR擴(kuò)增(圖1)。
使用的引物bcoo3291Fwd 5’TGAAGCGGCCCATGGAGTTC 3’(SEQ ID No.8)bcoo3291Rev2 5’GGTGGGCTGGTCCTTCTTCATC 3’(SEQ ID No.9)PCR在存在Q溶液(Qiagen)和Taq聚合酶的情況下進(jìn)行,開始94℃變性1秒鐘,然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的94℃ 15秒,62℃ 30秒,72℃ 45秒和最后延伸的1個(gè)循環(huán)72℃ 5分鐘。
PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳,用溴化乙錠染色和顯像。圖1的結(jié)果顯示與正常肌肉的動(dòng)物相比mighty在雙肌牛中過表達(dá)。該結(jié)果表明mighty在促進(jìn)肌肉生長中起作用。圖2的A部分顯示在雙肌動(dòng)物的心臟組織中mighty基因的表達(dá)也上調(diào),這表明mighty也能夠調(diào)節(jié)心肌生長和發(fā)育以及骨骼肌生長和發(fā)育。圖2的B部分顯示在羊骨骼肌中存在mighty表達(dá)。
PCR產(chǎn)物的純化在0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上電泳PCR反應(yīng)物,切下含有目的條帶的凝膠。使用Wizard PCR preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)從凝膠中純化DNA。
實(shí)施例2mighty cDNA的克隆根據(jù)制造商的規(guī)程將純化的cDNA連接到pGEM-T easy載體(Promega)中。根據(jù)制造商的規(guī)程將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌DH 5alpha細(xì)菌(Invitrogen)中。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌置于含有氨芐青霉素(50mg/升)、IPTG和X-gal的Lennox L broth(LB)瓊脂平板上。將白色菌落接種到LB加氨芐青霉素培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜。使用Qiagen mini質(zhì)粒試劑盒(Qiagen)從培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA。用限制性酶EcoRI消化質(zhì)粒DNA,并在瓊脂糖凝膠上分析。通過大小正確的片段的存在來鑒定陽性克隆。將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序以進(jìn)一步確認(rèn)。羊mighty多核苷酸序列在SEQ ID No.1中給出,相應(yīng)的多肽序列在SEQ ID No.2中給出。牛mighty多核苷酸序列在SEQ ID No.3中給出,相應(yīng)的多肽序列為SEQ ID No.4。
實(shí)施例3產(chǎn)生鼠類mighty穩(wěn)定細(xì)胞系用下列引物PCR擴(kuò)增鼠類mighty的ORFFwd 5’CACCATGGCGTGCGGGGCGACACTG 3’(SEQ ID No.6)Rev 5’GGATACATAGCTTGTTGGCCT 3’(SEQ ID No.7)根據(jù)制造商的建議,將Pwo聚合酶(Roche)、Q溶液(Qiagen)和作為模板的小鼠EST克隆(Resgene)用于PCR反應(yīng)。PCR條件如下35個(gè)循環(huán)的94℃ 20s,60℃ 30s,72℃ 1分鐘和一個(gè)循環(huán)的72℃ 5分鐘。
根據(jù)各制造商的規(guī)程,通過Wizard PCR preparations DNA純化系統(tǒng)(Promega)純化小鼠mighty基因的cDNA,將其克隆到pcDNA3.1D/V5HisTOPO載體(Invitrogen)的TOPO位點(diǎn)。重組體通過限制性消化進(jìn)行分析,并將陽性重組體測(cè)序。
為了用小鼠mighty構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞,將C2C12成肌細(xì)胞(1×107)在冰冷的1xHBS(140mM NaCl,0.77mM Na2HPO4,25mM Hepes(7.1))中洗滌兩次,重懸于0.5ml冰冷的1xHBS中,并轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的0.4cm間隙的小池(cuvette)(BioRad)中。加入10μg線性化的質(zhì)粒DNA(用Sca I線性化)。置于冰上5分鐘后,通過攪動(dòng)混合細(xì)胞,將小池以0.24kV 960μF電容及設(shè)為200Ω的電阻進(jìn)行脈沖。時(shí)間常數(shù)是平均36ms。細(xì)胞在冰上保溫10分鐘,轉(zhuǎn)移到10cm皿上的10ml DMEM 10%FBS中,上下研磨以破壞細(xì)胞碎片。用遺傳霉素(geneticin)(600μg/ml)選擇細(xì)胞,選擇單個(gè)克隆。表達(dá)轉(zhuǎn)基因的克隆通過質(zhì)粒中V5標(biāo)記的Western印跡進(jìn)行鑒定。
實(shí)施例4成肌細(xì)胞增殖試驗(yàn)在檢測(cè)C2C12細(xì)胞(Yaffe和Saxel)前,轉(zhuǎn)染的C2C12克隆在DMEM培養(yǎng)基(Life Technologies,Grand Island,NY.USA)中培養(yǎng),用NaHCO3(41.9mmol/l,Sigma Cell Culture Ltd,St Louis,MO,USA)和氣態(tài)CO2緩沖。酚紅(7.22hmol/l,Sigma)被用作pH指示劑。將青霉素(1×105IU/l)和鏈霉素(100mg/l,Sigma)常規(guī)地加入10%胎牛血清培養(yǎng)基(Life Technologies Ltd)。
細(xì)胞增殖試驗(yàn)在無涂層的96孔Nunc微量滴定板中進(jìn)行。C2C12培養(yǎng)物以3×103細(xì)胞/cm2接種到增殖培養(yǎng)基中。24小時(shí)的連接階段(attachmentperiod)后,倒出培養(yǎng)基,并將新鮮的增殖培養(yǎng)基重新加回平板。
然后在37℃和5%CO2的氣氛中溫育平皿。在培養(yǎng)基改變后的0、24、48和72個(gè)小時(shí)固定試驗(yàn)的平板,并通過Oliver等(1989)的方法測(cè)定增殖。簡要地,倒出生長培養(yǎng)基,將細(xì)胞用PBS洗一次,然后在10%甲醛鹽水(formolsaline)中固定30分鐘。固定的細(xì)胞在0.01M硼酸鹽緩沖液(pH8.5)中用10g/l的亞甲藍(lán)染色30分鐘。通過在硼酸鹽緩沖液連續(xù)洗滌四次除去多余的染料。然后通過加入100ml的1∶1(v/v)的乙醇和0.1M的HCl從固定細(xì)胞上洗脫亞甲藍(lán)。然后輕輕搖動(dòng)平皿,通過微板光度計(jì)(microplate photometer)(BioRadmodel 3550 microplate reader,BioRad,Hercules,CA,USA)測(cè)量每個(gè)孔在655nm的吸光率。
圖4的結(jié)果顯示,用mighty基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有更高的吸光度,這表示與正常C2C12細(xì)胞相比更快的生長速度。該結(jié)果顯示mighty上調(diào)成肌細(xì)胞的生長。
實(shí)施例5Mighty誘導(dǎo)的肥大為評(píng)價(jià)mighty在促進(jìn)肌發(fā)生中的功能,將穩(wěn)定表達(dá)mighty的成肌細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行分化。進(jìn)行MHC的免疫染色以評(píng)估肌管的形態(tài)學(xué)。
mighty過表達(dá)的細(xì)胞和親代細(xì)胞系;將在DMEM 2%馬血清中分化72小時(shí)的C2C12在PBS中洗一次,然后用70%的乙醇∶甲醛∶冰醋酸(20∶2∶1)固定30秒,再用PBS漂洗三次。然后將細(xì)胞在含有1%正常羊血清(NSS)的TBS中在4℃封閉過夜。將細(xì)胞與第一抗體(primary antibody),1∶100稀釋的抗MHC抗體在TBS/1%NSS中培養(yǎng)1小時(shí)。將細(xì)胞用TBST洗滌(3×5min)并與第二抗體(secondary antibody),1∶100稀釋的羊抗小鼠IgG在TBS/1%NSS中培養(yǎng)30分鐘。將細(xì)胞像前述一樣洗滌,并與第三抗體(tertiaryantibody),1∶100稀釋的抗生蛋白鏈菌素-生物素過氧化物酶復(fù)合物(RPN1051,Amersham)在TBS/1%NSS中培養(yǎng)30分鐘。將細(xì)胞然后像前述一樣再次洗滌。使用3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB;Invitrogen)顯現(xiàn)MHC免疫染色,其用0.0375%CoCl2增強(qiáng),然后用Gills蘇木精(Gills haematoxylin)復(fù)染、固定和拍照。
如圖5所示,mighty的表達(dá)導(dǎo)致肌核數(shù)量的增加,因而表明mighty也促進(jìn)肌細(xì)胞的肥大。
實(shí)施例6mighty誘導(dǎo)肥大的分析方法細(xì)胞培養(yǎng)將C2C12細(xì)胞或兩個(gè)Mighty過表達(dá)C2C12克??;克隆7和克隆11以15,000細(xì)胞/cm2置于permanox蓋玻片(Nunc)上DMEM 10%FB S(Invitrogen)中,用于分析活性生長的細(xì)胞,并以25,000細(xì)胞/cm2用于分化研究。
在5%CO2/37℃的氣氛中的24小時(shí)連接階段后,將培養(yǎng)基改變?yōu)樯L培養(yǎng)基(DMEM/10%FBS)或變?yōu)镈MEM/2%HS(分化培養(yǎng)基)(Invitrogen),并使細(xì)胞分化60和72小時(shí)。為了顯現(xiàn)細(xì)胞,將培養(yǎng)物在合適的時(shí)間點(diǎn)用20份的70%乙醇/2份的40%甲醛/1份的冰醋酸固定,然后用Gills蘇木精(1∶1)染色5分鐘,用1%曙紅(Eosin)染色1分鐘。然后將蓋玻片在100%乙醇中脫水、清潔并用DPX在載玻片上永久固定。
人成肌細(xì)胞培養(yǎng)從Clonetics,Cambrex NJ,USA獲得人骨骼肌成肌細(xì)胞。根據(jù)各制造商的說明,將細(xì)胞常規(guī)地在含有rhEGF、地塞米松(Dexamethasone)、FBS、Glutimine和GA-1000的SkGM-2培養(yǎng)基中生長。
為了轉(zhuǎn)染和條件培養(yǎng)基試驗(yàn),將細(xì)胞以30,000細(xì)胞/cm2的密度鋪平板。24小時(shí)連接階段后,將培養(yǎng)物用mighty-pCDNA3和對(duì)照載體轉(zhuǎn)染或者獲得條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基由DMEM/2%HS組成,其用mighty克隆11或?qū)φ占?xì)胞進(jìn)行48小時(shí)條件化。
轉(zhuǎn)染后24小時(shí),培養(yǎng)基改變?yōu)镈MEM/2%HS。培養(yǎng)物用20∶2∶1的固定液(fixative)在12、24、36、48小時(shí)固定。
C2C12克隆中肥大的定量在設(shè)置在Olympus顯微鏡上的SPOT RT相機(jī)上,使用為Windows和MAC設(shè)計(jì)的SPOT RT軟件v 3.5捕獲圖像。對(duì)于活性生長的細(xì)胞,以40x的放大倍率測(cè)量每個(gè)細(xì)胞系中40個(gè)隨機(jī)選擇的細(xì)胞的面積。對(duì)于肌管,也以40x的放大倍率測(cè)量每個(gè)細(xì)胞系40個(gè)隨機(jī)選擇的分別具有3個(gè)和4個(gè)核的肌管的面積、寬度和長度。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Deviation)。
FACS分析于10cm皿中的DMEM 10%FBS中培養(yǎng)Mighty過表達(dá)的C2C12克隆7和11,以及l(fā)acZ對(duì)照C2C12成肌細(xì)胞。使用胰蛋白酶(trypsin)收集細(xì)胞,然后離心并在800μl 70%乙醇/PBS中固定。在室溫下將固定的細(xì)胞重懸于50μlPBS+500μl DNA提取緩沖液(200mM Na2HPO4;100mM檸檬酸)中10分鐘。將DNA提取緩沖液替換為DNA染色緩沖液(PBS中50μg/ml碘化丙錠(propidium iodide);50μg/ml無DNase的RNase A),簡單旋轉(zhuǎn)以重懸細(xì)胞并在黑暗中在室溫培養(yǎng)30分鐘。然后用Becton-Dickinson FACScan流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton-Dickinson)檢測(cè)細(xì)胞的碘化丙錠熒光,用CellFit軟件(Becton-Dickinson)分析前向角光散射,一種細(xì)胞大小的量度,和DNA含量,用于細(xì)胞周期分析。
Western印跡在轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(DMEM 2%HS)中培養(yǎng)0、24、48、72和96個(gè)小時(shí)前,將mighty過表達(dá)的C2C12克隆7和11,以及l(fā)acZ表達(dá)C2C12成肌細(xì)胞在10cm皿中在DMEM 10%FBS中培養(yǎng)24小時(shí)。通過胰蛋白酶化收集細(xì)胞,并且重懸在300μl的裂解緩沖液中(50mM Tris(pH7.5);250mM NaCl;5mMEDTA;0.1%NP-40;1×蛋白酶抑制劑(Complete;Roche))。細(xì)胞提取物通過0.5mm注射器針頭十次,離心(14,000g 10分鐘)沉淀細(xì)胞碎片,并將上清用于Western印跡。使用Bio-Rad蛋白分析試劑(Bio-Rad)檢測(cè)蛋白濃度,15μg的蛋白在預(yù)制的NuPAGE 4-12%Bis-Tris凝膠(Invitrogen)中在45mA下電泳。然后使用Mini-ProteanII轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad)在50-60V下處理2小時(shí)將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到Trans-blot轉(zhuǎn)移膜(Bio-Rad)。將該膜在TBST中的5%牛奶中封閉過夜。在TBST中的5%牛奶中稀釋如下第一抗體p21,1∶400稀釋的純化的小鼠單克隆抗p21抗體(SX118;PharMingen);MyoD,1∶200稀釋的純化的兔多克隆抗MyoD抗體(sc-304;Santa Cruz);MHC,1∶2000稀釋的純化的小鼠多克隆抗MHC抗體(MF-20;Donald Fischman博士饋贈(zèng));α-微管蛋白,1∶4000稀釋的純化的小鼠單克隆抗α-微管蛋白抗體(DM1A;Sigma);并在室溫下培養(yǎng)3小時(shí)。將膜在TBST中洗滌5次每次5分鐘,進(jìn)一步在室溫下于TBST中的5%牛奶中培養(yǎng)1小時(shí),其中含有1∶2000稀釋的抗小鼠IgG HRP結(jié)合物(P0447;Dako)或抗兔IgG HRP結(jié)合物(P0448;Dako)。然后將膜在TBST中洗滌5次每次5分鐘,并使用Western Lightning ChemiluminescenceReagent Plus(Perkin Elmer)檢測(cè)HRP活性。
結(jié)果Mighty過表達(dá)的成肌細(xì)胞和肌管顯示比對(duì)照細(xì)胞肥大活性生長的mighty過表達(dá)克隆當(dāng)與對(duì)照細(xì)胞比較時(shí)顯示出肥大。使用定量圖像分析,活性生長的mighty過表達(dá)克隆具有比對(duì)照細(xì)胞明顯更大的面積(圖6A)。為確認(rèn)該結(jié)果,,通過流式細(xì)胞術(shù)采用前向角光散射測(cè)定成肌細(xì)胞肥大,或相對(duì)細(xì)胞大小。該分析表明克隆11和克隆7的細(xì)胞分別具有比對(duì)照細(xì)胞增加的細(xì)胞大小(圖6B)。
分化的mighty過表達(dá)克隆與對(duì)照細(xì)胞相比也顯示肥大。假定肥大的解釋可以是每個(gè)肌管融合細(xì)胞數(shù)量的增加,進(jìn)行分析比較mighty過表達(dá)克隆和對(duì)照細(xì)胞之間具有同樣數(shù)量核的肌管的大小。使用定量圖像分析,在mighty過表達(dá)克隆中明顯肌管肥大。比較三和四核肌管的肌管面積、寬度和長度。在三和四核肌管中mighty過表達(dá)克隆都顯示出比對(duì)照細(xì)胞在面積、寬度和長度上的增加(圖6C-6E)。
Mighty過表達(dá)克隆分化早于對(duì)照細(xì)胞使用MHC的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)mighty過表達(dá)克隆的分化表型以顯現(xiàn)肌管形成。將mighty過表達(dá)克隆轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基時(shí),60個(gè)小時(shí)后在mighty過表達(dá)克隆中明顯出現(xiàn)多核肌管,而對(duì)照培養(yǎng)物中直到72小時(shí)多核肌管也不明顯。72小時(shí)后mighty過表達(dá)顯示基本完全分化,而對(duì)照細(xì)胞顯示僅形成初生肌管(nascent myotube)(圖7A)。使用分化標(biāo)記的Western印跡證實(shí)了這些結(jié)果。早期、中期和晚期分化標(biāo)記p21、myoD和MHC分別用于研究肌原性(myogenic)分化基因表達(dá)(圖7B)。p21的表達(dá)在所有的時(shí)間點(diǎn)增加,表明p21表達(dá)在mighty過表達(dá)克隆中發(fā)生較早并且達(dá)到較高的程度。MyoD表達(dá)在mighty過表達(dá)克隆中增加較早,在分化的0、24和48小時(shí),myoD表達(dá)超過對(duì)照細(xì)胞。72小時(shí)后在所有細(xì)胞系中MyoD水平同樣高。在克隆11中24小時(shí)后出現(xiàn)MHC表達(dá),并在48小時(shí)其在兩個(gè)克隆中都表達(dá)到更高的水平。72小時(shí)后該表達(dá)在所有細(xì)胞中相同。肌原性分化標(biāo)記較早的和增加的表達(dá)是與組織化學(xué)結(jié)果同時(shí)發(fā)生的。該結(jié)果表明過表達(dá)mighty導(dǎo)致增強(qiáng)的分化表型。
實(shí)施例7肌肉發(fā)育中的mighty方法分離衛(wèi)星細(xì)胞(靜止的)通過Percoll密度離心從4周大的野生型小鼠的后肢肌肉中分離衛(wèi)星細(xì)胞(SC)。肌肉被切碎,在0.2%的膠原酶1A中消化90分鐘。通過輕柔的研碎和隨后的過濾(70μm)從基底層下釋放細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸浮液覆蓋在70%/40%的Percoll梯度上,并以1,600rpm離心20分鐘?;厥蘸行l(wèi)星細(xì)胞的70%和40%Percoll溶液之間的分界面,將細(xì)胞在PBS中洗滌。為提取用于Western印跡的蛋白,將細(xì)胞重懸于裂解緩沖液中,并通過0.45mm計(jì)量注射針(gaugeneedle)以裂解細(xì)胞。通過在10,000rpm離心10分鐘去除細(xì)胞碎片,并將獲得的蛋白溶液在-80℃保存。
分離原代成肌細(xì)胞(活化的衛(wèi)星細(xì)胞)從4周大小鼠上移除后肢肌肉,將其完全切碎,37℃下在DMEM(無血清)中用0.2%的膠原酶1A振蕩(70rpm)消化90分鐘。消化物用10ml吸液管反復(fù)粉碎直至看不見塊狀。然后將懸浮液通過100μm和隨后70μm的濾器過濾。過濾的緩沖液在4,000rpm離心10分鐘,并將沉淀在8ml溫暖的增殖培養(yǎng)基[DMEM,20%胎牛血清(FCS),10%馬血清(HS),1%雞胚胎提取物(CEE)]中重懸。將細(xì)胞懸浮物在無涂層的10cm的平板上預(yù)涂布1.5h,然后轉(zhuǎn)換到10%基質(zhì)膠(matrigel)平板,并在37℃培養(yǎng)48h。48h后將培養(yǎng)基換為DMEM+10%FCS?;钚陨L條件中24h后收集細(xì)胞。為提取用于蛋白質(zhì)印跡的蛋白,將細(xì)胞重懸于裂解緩沖液中,并通過0.45mm計(jì)量注射針以裂解細(xì)胞。通過在10,000rpm離心10分鐘去除細(xì)胞碎片,并將獲得的蛋白溶液在-80℃保存。
mighty的Western分析將預(yù)制的聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen,NuPage 4-12%Bis-Tris)用于蛋白分離。將15μg的蛋白通過SDS-PAGE(4-12%)分離并通過電印跡(electroblotting)轉(zhuǎn)換到硝化纖維膜。使用麗春紅S染料檢測(cè)硝化纖維膜上存在的蛋白以保證出現(xiàn)同等負(fù)載。將膜在RT在0.3%BSA/1%PVP/1%PEG/TBS-T中培養(yǎng)3h以阻斷非特異性抗體的結(jié)合。然后將膜與1∶5000稀釋的兔抗mighty抗體在0.3%BSA/1%PVP/1%PEG/TBS-T中在4℃輕微振蕩培養(yǎng)過夜。抗體培養(yǎng)之間將膜在TBS-T中洗滌5次每次5分鐘。然后將硝化纖維膜與1∶2000稀釋的與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔(HRP)(Amersham)在0.3%BSA/1%PVP/1%PEG/TBS-T中培養(yǎng)1h。用ECL試劑(Western LightningChemiluminescense Reagent Plus)測(cè)定HRP活性。
結(jié)果might在鼠類衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)為測(cè)定mighty蛋白表達(dá)的模式,從靜止的衛(wèi)星細(xì)胞、活性生長的成肌細(xì)胞中提取總蛋白。通過Western印跡分析mighty蛋白表達(dá)水平(圖8)。在靜止的衛(wèi)星細(xì)胞中,沒有檢測(cè)到mighty蛋白表達(dá)。然而,在活性生長的成肌細(xì)胞(活化的衛(wèi)星細(xì)胞)中檢測(cè)到mighty蛋白。
實(shí)施例8肌肉再生中的Mighty方法虎蛇毒素(Notexin)誘導(dǎo)的再生通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮(ketamine)/甲苯噻嗪(rompun)(鹽酸氯胺酮100mg/ml,鹽酸甲苯噻嗪20mg/m,以0.1ml/6gm體重)麻醉六周大的野生型小鼠。修剪毛皮,露出右脛骨前肌(TA)肌肉區(qū)域,并且在肌肉上做一小切口。使用100μl注射器(Hamilton Co.)將10μl的0.1μg虎蛇毒素(Notechis scutatus scutatus)(Venom Supplies Pty.Ltd.,Tanunda,South Aust)注射至右TA。切口用Michelle夾閉合。將小鼠在損傷后不同的天數(shù)通過CO2窒息無痛處死,然后脫頸(cervical dislocation)。右側(cè)和左側(cè)的TA肌肉被仔細(xì)剖開,稱重并且進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
mighty的免疫組織化學(xué)將小鼠TA肌肉和羊心臟組織分離,植入OCT中并且冷凍于液氮冷卻的異戊烷中。將冷凍部分(cryosection)在10μm切斷并且將載片在-20℃冷凍直至使用。這些部分在PBS,0.1%Triton X-100中在室溫下滲透30分鐘,并且與1∶100稀釋的第一抗mighty抗體在PBS,10%標(biāo)準(zhǔn)驢血清,1%BSA,0.1%Triton X-100中4℃培養(yǎng)過夜。在PBS中洗滌3x4分鐘后,將載片在PBS、5%標(biāo)準(zhǔn)驢血清,1%BSA,0.1%Triton X-100中溫育1小時(shí)以減少與第二抗體的非特異性結(jié)合。該部分與1∶300稀釋的生物素化的抗兔第二抗體(Amersham,UK)室溫培養(yǎng)1小時(shí)。在PBS中洗滌后,將該部分最后在抗生蛋白鏈菌素結(jié)合的Alexa fluor 488-標(biāo)記的第三抗體(Molecular Probes,USA)中在室溫溫育1小時(shí),在PBS中洗滌,用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,二氫氯化物,Molecular Probes,USA)復(fù)染,固定在DAKO熒光固定培養(yǎng)基中并且分析migty表達(dá)。對(duì)照部分與非第一抗體或者兔對(duì)照IgG溫育并且隨后如上所述進(jìn)行。
結(jié)果小鼠TA肌肉再生過程中mighty的表達(dá)為了調(diào)查在野生型大鼠的肌肉再生過程中mighty的表達(dá),通過注射虎蛇毒素至右脛骨前肌(TA)肌肉來誘導(dǎo)損傷。在注射后的各天,將小鼠無痛致死并且收集TA肌肉。為了確定mighty表達(dá)的模式,進(jìn)行免疫組織化學(xué)(圖9)。在受傷后的第一天,對(duì)肌肉纖維整體有大量的損傷,觀察到mighty表達(dá)的水平未發(fā)生變化。到第5天mighty表達(dá)水平相對(duì)于第0天已經(jīng)大量增加,在受傷后的第7天水平達(dá)到峰值。到在第28天mighty表達(dá)的水平可與對(duì)照的未受傷肌肉相比較。
實(shí)施例9在羊的梗死后心臟組織中表達(dá)Mighty方法通過Sharma等,1999中所述的公開方法誘導(dǎo)羊心臟中的心肌梗死。在梗死后第0天(無梗死)、第2天和第6天收集心臟組織。為了確定mighty表達(dá)的模式,如肌肉再生實(shí)施例(實(shí)施例8)中所述進(jìn)行心臟組織部分的免疫組織化學(xué)。
結(jié)果在無梗死心臟組織中,mighty的表達(dá)為均勻的并且限于位于心肌細(xì)胞周圍小間隙(interstitium)中的細(xì)胞。未顯示心肌細(xì)胞表達(dá)Mighty。梗死后兩天,mighty的表達(dá)與對(duì)照的心類似。到梗死后的第6天,浸潤性(infiltrating)細(xì)胞的數(shù)量主要在梗死區(qū)中大量增加。mighty的表達(dá)限于位于最接近壞死的心肌區(qū)域的浸潤性細(xì)胞。在浸潤性細(xì)胞鄰近存活心肌之處,表達(dá)水平仍保持與對(duì)照物相類似。遠(yuǎn)離梗死區(qū)域的浸潤性細(xì)胞不表達(dá)mighty(圖10)。
mighty在間隙成纖維細(xì)胞中以及壞死心肌區(qū)域中浸潤性細(xì)胞中的存在證實(shí)了mighty參與愈合(healing)的過程。
實(shí)施例10Mighty對(duì)于人成肌細(xì)胞的分化和肥大的影響結(jié)果在用mighty轉(zhuǎn)染的人成肌細(xì)胞中的分化增加為確定mighty過表達(dá)對(duì)于在人成肌細(xì)胞中分化的影響,使用mighty-pcDNA3或者單獨(dú)使用pcDNA3(對(duì)照)轉(zhuǎn)染人成肌細(xì)胞并且在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)。為了確定分化肌管的數(shù)量,使用肌球蛋白重鏈(MHC)特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)。在處于分化條件下12個(gè)小時(shí)后,與對(duì)照成肌細(xì)胞相比,在mighty轉(zhuǎn)染的人成肌細(xì)胞中MHC陽性肌管的數(shù)量更多(圖11)。
用Mighty轉(zhuǎn)染的人成肌細(xì)胞的肥大用Mighty-pcDNA3或單獨(dú)用pcDNA3(對(duì)照)轉(zhuǎn)染人成肌細(xì)胞并且在分化條件下培養(yǎng)12小時(shí)。為了確定肥大,使用肌球蛋白重鏈(MHC)特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué),并且計(jì)數(shù)每個(gè)MHC陽性肌管的肌核數(shù)量(圖12A)。結(jié)果顯示與對(duì)照相比,更少mighty轉(zhuǎn)染的人肌管只含有1-3個(gè)肌核,更多數(shù)量的肌管含有4-9個(gè)肌核。也通過測(cè)定含有5-9個(gè)肌核的肌管寬度來評(píng)估MHC表達(dá)肌管的肥大(圖12B)。mighty轉(zhuǎn)染的肌管的平均寬度與對(duì)照肌管相比更大(圖12B)。
用來自mighty過表達(dá)的C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的人成肌細(xì)胞的肥大為了證明由mighty引起的加速分化和肥大的現(xiàn)象,在分化條件下用來自Mighty過度表達(dá)C2C12細(xì)胞和LacZ(對(duì)照)C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人成肌細(xì)胞48小時(shí)。如上所述評(píng)估肥大的水平。用來自mighty過表達(dá)的C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的人成肌細(xì)胞與對(duì)照處理的成肌細(xì)胞相比含有更少的僅有1-5個(gè)肌核的肌管以及更大量帶有16-25個(gè)肌核的肌管(圖13A)。用來自mighty過表達(dá)的C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的人成肌細(xì)胞中,肌核的平均數(shù)與對(duì)照相比更多(圖13B)。
MHC表達(dá)肌管的肥大還通過測(cè)定肌管的寬度再次評(píng)估。測(cè)量含有8個(gè)肌核的MHC表達(dá)肌管(圖13)。用來自mighty過度表達(dá)的C2C12細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的肌管的平均寬度與對(duì)照肌管相比更大。
用來自mighty的條件培養(yǎng)基處理的人橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)(RD)細(xì)胞中的增加的分化方法從ATCC(Rockville,MD.)獲得人RD(人橫紋肌肉瘤)細(xì)胞。檢測(cè)前將RD細(xì)胞在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM;Invitrogen)中生長,用41.9mM的NaHCO3(Sigma Cell Culture Ltd)和5%氣態(tài)CO2緩沖。7.22nM的酚紅(Sigma)作為pH指示劑。在培養(yǎng)基中加入1×105IU/L青霉素(Sigma),100mg/L鏈霉素(Sigma)和10%胎牛血清(FBS;Invitrogen)。將RD細(xì)胞以30,000細(xì)胞/cm的密度置于permanox chamber玻片上。24小時(shí)后將它們?nèi)缢鰧?duì)人成肌細(xì)胞一樣用條件培養(yǎng)基處理(mighty克隆11)并將細(xì)胞在72小時(shí)后固定。進(jìn)行MHC的免疫組織化學(xué)。
結(jié)果用mighty條件培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基處理人RD細(xì)胞,并且進(jìn)行72小時(shí)的分化。將細(xì)胞對(duì)于MHC免疫染色以評(píng)估分化的程度。處理的細(xì)胞中的MHC陽性肌管的數(shù)量與對(duì)照細(xì)胞相比更高,這表明來自mighty過度表達(dá)克隆的條件培養(yǎng)基能夠加速分化(圖15)。
實(shí)施例11鼠類Mighty啟動(dòng)子的克隆方法用小鼠基因組DNA和下面的引物擴(kuò)增2.1kb的5’上游序列Rev 5’AGA TCT GAT CCA ACT CTT CAG CTA C 3’(SEQ ID No.10)Fwd 5’GCT AGC CCA CAT TCA CTG TGC AAG 3’ (SEQ ID No.11)根據(jù)制造商的規(guī)程,使用Q溶液(Qiagen)和Expand long DNA聚合酶(Roche)進(jìn)行PCR。PCR條件為,35個(gè)循環(huán)的95℃ 15s,52℃ 30s,68℃ 3min和最后延伸的1個(gè)循環(huán)68℃ 7min。
將PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上分析并且通過Wizard純化柱(Promega)純化。將純化的DNA片段如上所述克隆到pGEM-T easy載體中。通過限制性消化和測(cè)序選擇和分析陽性重組體。通過BglII和NheI酶從pGEM-T easy載體中切下2.1kb片段以克隆至熒光素酶報(bào)道載體pGL3B。用BglII和NheI消化pGL3B并且用T4連接酶將2.1kb mighty啟動(dòng)子片段與其連接。用連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α并涂布于LB瓊脂加氨芐青霉素平板。培養(yǎng)物在LB加氨芐青霉素培養(yǎng)基中生長并且如前所述純化質(zhì)粒DNA。通過限制性消化分析質(zhì)粒DNA并鑒定陽性重組體。通過測(cè)序被確認(rèn)陽性重組體(2.1構(gòu)建體)(SEQ ID No.5)。對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),使用Qiagen Maxi Prep試劑盒(Qiagen)純化DNA。
mighty啟動(dòng)子序列如SEQ ID No.5中所示。也分析了mighty啟動(dòng)子序列已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。這些位點(diǎn)顯示啟動(dòng)子序列的關(guān)鍵部分。
實(shí)施例12Mighty啟動(dòng)子活性在包括人的不同細(xì)胞系中的實(shí)例方法將1kb的mighty上游序列(2.1kb mighty啟動(dòng)子的片段)克隆至熒光素酶報(bào)道載體pGL3-basic(Promega)。通過限制性消化從2.1kb啟動(dòng)子序列中獲得1kb mighty啟動(dòng)子片段。在2.1mighty啟動(dòng)子構(gòu)建體上進(jìn)行Scal,BglII消化以切除該~1kb片段。然后將這個(gè)片段以正確方向克隆到pGL3b的多克隆位點(diǎn)中的SmaI和BglII位點(diǎn)從而驅(qū)動(dòng)熒光素酶的表達(dá)。
用2μg的該啟動(dòng)子構(gòu)建體和用于轉(zhuǎn)染效率標(biāo)準(zhǔn)化的0.5或1μg的β-半乳糖苷酶(β-gal)表達(dá)質(zhì)粒pCH110(Amersham)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的規(guī)程,使用LipofectAMINE 2000試劑(LF2000,Invitrogen)用上述載體轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞,NIH3T3,CHO,RD(人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系)以及原代羊成肌細(xì)胞。簡要地,在轉(zhuǎn)染之前將細(xì)胞系以15,000細(xì)胞/cm2涂布于6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿(Nunc)上合適的生長培養(yǎng)基中并且在37℃,在5%CO2中溫育過夜。每孔中將LF2000以5-8ul在250μl不含血清的DMEM中稀釋。然后將稀釋的DNA和LF2000混合并且在室溫溫育20分鐘。然后將DNA/LF2000混合物加入含有2ml適當(dāng)生長培養(yǎng)基中的細(xì)胞的孔中。將細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染混合物在37℃,在5%CO2中溫育過夜,之后用生長或者分化培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞以每孔5ml PBS漂洗兩次并且在300-500μl的報(bào)道裂解緩沖液(Promega)中裂解。10μl的細(xì)胞裂解物用于使用熒光素酶分析系統(tǒng)(Promega)根據(jù)每個(gè)制造商的規(guī)程探測(cè)熒光素酶活性。50μl的細(xì)胞裂解物用于使用含有報(bào)道裂解緩沖液(Promega)的β-半乳糖苷酶分析系統(tǒng)根據(jù)每個(gè)制造商的規(guī)程進(jìn)行β-gal分析。將熒光素酶值根據(jù)β-gal值以對(duì)于轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
結(jié)果將1kb的鼠類mighty上游序列轉(zhuǎn)染至各種細(xì)胞系。這些包括C2C12成肌細(xì)胞、原代羊成肌細(xì)胞、NIH3T3成纖維細(xì)胞、以及中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(圖16A)和人RD細(xì)胞(圖16B)。鼠類mighty啟動(dòng)子在所有這些細(xì)胞系中顯示出強(qiáng)烈活性。因此mighty啟動(dòng)子在源自不同組織類型和包括人在內(nèi)的物種的細(xì)胞系中顯示出強(qiáng)表達(dá)。
實(shí)施例13肌肉抑制素對(duì)Mighty啟動(dòng)子的劑量依賴性抑制方法在C2C12成肌細(xì)胞中mighty啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)染方法如上所述,除了用肌肉抑制素蛋白處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí),在生長培養(yǎng)基中用4和8μg/ml的重組肌肉抑制素處理細(xì)胞。處理24小時(shí)后收獲細(xì)胞。如上所述測(cè)定熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性。
結(jié)果將1kb鼠類mighty啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染至C2C12成肌細(xì)胞并且用增加濃度的4和8μg/ml的重組肌肉抑制素蛋白處理。1kb mighty啟動(dòng)子的活性在4和8μg/ml的肌肉抑制素蛋白(分別為39.23+/-0.99%和58.22+/-1.00%)的存在下被抑制。而且增加濃度的肌肉抑制素在更大程度上抑制mighty啟動(dòng)子(圖17)。因此肌肉抑制素以劑量依賴的方式抑制mighty啟動(dòng)子。
實(shí)施例14肌肉抑制素模擬物(335)回復(fù)肌肉抑制素對(duì)Mighty啟動(dòng)子的作用羊衛(wèi)星細(xì)胞的轉(zhuǎn)染如上所述將羊衛(wèi)星細(xì)胞在DMEM+10%FBS中生長。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明,在24孔板中用0.4μg 1kb小鼠mighty啟動(dòng)子構(gòu)建體和0.1μg的pCH110(SV40β-半乳糖苷酶對(duì)照載體,Amersham)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時(shí)后將培養(yǎng)基變?yōu)镈MEM+10%FBS+3μg/ml野生型重組肌肉抑制素或335(15mg),或者肌肉抑制素和335。在更換培養(yǎng)基24小時(shí)后,制備細(xì)胞提取物并按照確定的規(guī)程進(jìn)行熒光素酶試驗(yàn)(Promega)。按照規(guī)程(Promega)進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的試驗(yàn)。將熒光素酶活性根據(jù)β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
結(jié)果用1kb mighty啟動(dòng)子和β-半乳糖苷酶載體轉(zhuǎn)染羊成肌細(xì)胞,并且用肌肉抑制素或者肌肉抑制素模擬物或者二者共同進(jìn)行處理。如圖18中所示,對(duì)于用野生型肌肉抑制素的處理可以看到mighty啟動(dòng)子活性的33%的抑制。當(dāng)細(xì)胞用肌肉抑制素和5摩爾過量的優(yōu)勢(shì)負(fù)模擬物335處理時(shí),僅觀察到mighty啟動(dòng)子活性的19%的抑制。因此優(yōu)勢(shì)負(fù)肌肉抑制素模擬物335能夠回復(fù)mighty啟動(dòng)子的肌肉抑制素介導(dǎo)的抑制作用。
實(shí)施例15Mighty啟動(dòng)子的截?cái)喾治?Truncation Analysis)方法用含有NheI限制位點(diǎn)的正向引物5’-GCTAGCGTGATCCGATTAATGGCC-3’以及含有BglII限制位點(diǎn)的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’擴(kuò)增Mighty 0.6kb啟動(dòng)子。用含有NheI限制位點(diǎn)的正向引物5’-GCTAGCCCCTTTAGAATCACCTC-3’和含有BglII限制位點(diǎn)的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’擴(kuò)增Mighty 0.4kb啟動(dòng)子。用含有NheI限制位點(diǎn)的正向引物5’-GCTAGCCGCAGGTGCGAAAGACCTC-3’和含有BglII限制位點(diǎn)的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’擴(kuò)增Mighty 0.315kb啟動(dòng)子。用含有NheI限制位點(diǎn)的正向引物5’-GCTAGCTCCGGCAGAGAGCGTGAAG-3’和含有BglII限制位點(diǎn)的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’擴(kuò)增Mighty 0.287kb啟動(dòng)子。用含有NheI限制位點(diǎn)的正向引物5’-GCTAGCAGACCGGCCTACTTCTTC-3’和含有BglII限制位點(diǎn)的反向引物5’-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3’擴(kuò)增Mighty 0.209kb啟動(dòng)子。將這些截?cái)嗥?truncations)以正確方向克隆至pGL3b的NheI和BglII限制位點(diǎn)以驅(qū)動(dòng)熒光素酶的表達(dá)。
結(jié)果將mighty啟動(dòng)子片段(從0.2kb至2.1kb)轉(zhuǎn)染至C2C12成肌細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性。將熒光素酶活性根據(jù)β-半乳糖苷酶的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果如圖19(A和B)中所示,其表明從300bp至1kb的mighty啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性最大。顯示出在1kb和2.1kb之間的啟動(dòng)子活性有輕微降低。
實(shí)施例16Mighty抗體的生產(chǎn)方法在兔子中產(chǎn)生抗全長牛mighty蛋白的多克隆抗體。首先,將牛mightycDNA克隆至pRSET B載體(Invitrogen)中,并且最終按照制造商的規(guī)程轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 star(Invitrogen)。通過加入0.5mM IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)并且連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)半小時(shí)。通過離心收集細(xì)菌,重懸于40ml裂解緩沖液(6M鹽酸胍(guanidine HCl),20mM Tris pH8.1,5mM 2-巰基乙醇)中,然后進(jìn)行聲處理。將裂解產(chǎn)物在10,000g離心30分鐘,使用Ni-瓊脂糖親和操作(Qiagen,Valencia,CA)從上清液中純化重組蛋白。收集級(jí)分并且對(duì)兩個(gè)改變的含有200mM NaCl和5%甘油的50mM Tris pH8.0在4℃透析90分鐘。用Freund‘s佐劑乳化純化的mighty蛋白并注射至每個(gè)兔子(341□g/兔子)。隨后給予每只兔子含有170□g mighty蛋白/注射液的兩份加強(qiáng)劑量(booster dose)。
從接種兔子中采集血并且在4℃在2000rpm離心15分鐘。從凝血(clot)中分離血清。用2.5ml的蛋白-A瓊脂糖(Protein-AAgarose)裝填柱以純化抗體的IgG級(jí)分。用25ml 100mM Tris pH8.0洗滌柱子。用1/10體積的1.0M Tris(pH8.0)調(diào)節(jié)血清的pH,并且將5.5ml的血清流過柱子。將回收的級(jí)分再次流過柱子。接下來,用25ml的100mM Tris(pH8.0)洗滌柱子。用25ml的10mM Tris(pH8.0)第二次洗滌。用100mM甘氨酸(pH3.0)洗脫抗體。在含有50μl的1M Tris(pH8.0)的管中收集洗脫液并輕輕混合。通過使用Bradford方法鑒定含有免疫球蛋白的級(jí)分以用于蛋白評(píng)估。
肽特異性mighty抗體在我們的說明書中,通過QED Bioscience,Inc.,CA,USA產(chǎn)生抗18mermighty肽(173-190AA)的抗體。
Western印跡進(jìn)行Western印跡分析以驗(yàn)證產(chǎn)生的抗全長牛mighty蛋白和18mermighty肽(173-190)的抗體。具體地,將來自表達(dá)牛重組mighty蛋白的大腸桿菌細(xì)胞的蛋白提取物或純化的重組mighty蛋白按照制造商的說明在4-12%的NuPAGE(Invitrogen)凝膠上分析。mighty蛋白抗體以1∶10,000用于Western印跡,而1∶5000的稀釋用于肽抗體。
結(jié)果肽和mighty蛋白抗體在Western印跡中都特異性識(shí)別預(yù)期的35kd大小的蛋白條帶,這表明這些抗體對(duì)于mighty蛋白是特異的(圖20)。
其中,前述說明參考文獻(xiàn)已經(jīng)成為具有公知等同物的整體或者組成部分,并且將所述等同物在此并入如同單獨(dú)列出。
盡管本發(fā)明已通過實(shí)施例并參考其可能的實(shí)施方案進(jìn)行了描述,但是可以理解,在不背離其范圍的前提下可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和修飾。
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Ala Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp115 120 125Gln Pro Thr Phe Thr Leu Arg Gln Val Gly Ile Ile Cys Glu Arg Leu130 135 140Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Glu Gln Ile Leu145 150 155 160Asn Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ser Phe Val Lys Phe Thr His165 170 175Asp Gln Ile Met Arg Arg Tyr Gly Thr Arg Pro Thr Ser Tyr Val Ser180 185 190<210>3<211>576<212>DNA<213>牛(bovine)<400>3atggcgtgcg gggcgacact gaagcggccc atggagttcg aggcggcgct gctgagccct60ggctctccga agcgacggcg ctgcgcccct ctgtccggcc ccactccggg cctcaggccc120ccggacgccg aaccgccacc gctgcttcag acgcagatcc caccgccgac tctgcagcag180cccgccccgc ccggcagcga ccggcgcctt ccaactccgg agcaaatttt tcagaacata240aaacaagaat atagtcgtta tcagaggtgg agacatttag aagttgttct taatcagagt300gaagcttgta cttcggaaag tcagcctcac tcctcaacac tcacagcacc tagttctcca360ggttcctcct ggatgaaaaa ggaccagccc acctttacgc tccgacaagt tggaataata420tgtgagcgtc tcttaaaaga ctatgaagat aaaattcggg aggaatatga gcaaatcctc480aatactaaac tagcagaaca atatgaatct tttgtgaaat tcacacatga tcagattatg540cgacgatatg ggacaaggcc aacaagctat gtatcc 576<210>4<211>192<212>PRT<213>牛(boyine)<400>4Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Pro Met Glu Phe Glu Ala Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Lys Arg Arg Arg Cys Ala Pro Leu Ser20 25 30Gly Pro Thr Pro Gly Leu Arg Pro Pro Asp Ala Glu Pro Pro Pro Leu35 40 45Leu Gln Thr Gln Ile Pro Pro Pro Thr Leu Gln Gln Pro Ala Pro Pro50 55 60Gly Ser Asp Arg Arg Leu Pro Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn Ile65 70 75 80Lys Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Trp Arg His Leu Glu Val Val85 90 95Leu Asn Gln Ser Glu Ala Cys Thr Ser Glu Ser Gln Pro His Ser Ser100 105 110Thr Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp115 120 125
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1.含有選自SEQ ID No.2或者SEQ ID No.4的序列的多肽。
2.編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸。
3.權(quán)利要求2所述的多核苷酸,其選自SEQ ID No.1或者SEQ ID No.3。
4.含有選自下列的核苷酸序列的多核苷酸a)SEQ ID No1或SEQ ID No3的互補(bǔ)序列,b)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向互補(bǔ)序列,和c)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向序列。
5.多核苷酸,其包含由于沉默取代或?qū)е滤a(chǎn)生氨基酸中保守取代的取代而與SEQ ID No1或3不同的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求4或5的多核苷酸編碼的多肽。
7.含有至少一種權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述多肽或其片段的融合蛋白。
8.含有權(quán)利要求2至5中任意一個(gè)所述多核苷酸的載體。
9.一種載體,以5’-3’方向含有a)基因啟動(dòng)子序列;b)權(quán)利要求2至5任意一個(gè)所述的多核苷酸序列;以及c)基因終止序列。
10.權(quán)利要求8或者權(quán)利要求9所述的載體,其中多核苷酸為有義方向。
11.權(quán)利要求8或者權(quán)利要求9所述的載體,其中多核苷酸為反義方向。
12.含有權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述載體的宿主細(xì)胞。
13.用于調(diào)節(jié)肌肉生長的組合物,含有下述任一a)含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸,b)(a)的片段或變體,c)與(a)有至少95%,90%或70%序列同一性的多核苷酸,d)(a)至(c)中任意一個(gè)的互補(bǔ)序列,e)(a)至(c)中任意一個(gè)的反向互補(bǔ)序列,f)(a)至(c)中任意一個(gè)的反義多核苷酸,g)(a)至(c)中任意一個(gè)所編碼的多肽,h)含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽,i)(g)或(h)的片段或變體,和j)相對(duì)(g)或(h)有至少95%,90%或70%序列同一性的多肽。
14.調(diào)節(jié)肌肉生長的組合物,含有下述任意一種a)SEQ ID No.5的序列,b)與SEQ ID No.5有至少95%,90%或70%序列同一性的多核苷酸,和c)(a)或(b)的片段或變體。
15.調(diào)節(jié)mighty基因表達(dá)的組合物,含有能夠結(jié)合至選自下述任意一種的多核苷酸的化合物a)SEQ ID No.1,SEQ ID No.3,或SEQ ID No.5,b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸,c)與(a)或(b)有至少95%,90%或70%序列同一性的多核苷酸,d)(a)至(c)中任意一種的互補(bǔ)序列,e)(a)至(c)中任意一種的反向互補(bǔ)序列,和f)(a)至(c)中任意一種的片段或變體。
16.按照權(quán)利要求15的組合物,其中化合物為反義多核苷酸。
17.按照權(quán)利要求15或者權(quán)利要求16的組合物,其中化合物為干擾RNA分子。
18.按照權(quán)利要求17的組合物,其中干擾RNA分子為RNAi或siRNA分子。
19.按照權(quán)利要求15的組合物,其中化合物為肌肉抑制素。
20.按照權(quán)利要求15的組合物,其中化合物為肌肉抑制素類似物。
21.按照權(quán)利要求20的組合物,其中肌肉抑制素類似物為C-末端在氨基酸位置330和350或者在它們之間被截?cái)嗟募∪庖种扑仉摹?br>
22.按照權(quán)利要求20或者權(quán)利要求21的組合物,其中肌肉抑制素類似物為C-末端在氨基酸位置330、335和350中的任一位置被截?cái)嗟募∪庖种扑仉摹?br>
23.按照權(quán)利要求15的組合物,其中化合物為抗體。
24.按照權(quán)利要求13至23中任一的組合物,用于治療或預(yù)防與肌肉生長相關(guān)的疾病。
25.按照權(quán)利要求24的組合物,其中疾病與肌肉萎縮相關(guān)。
26.按照權(quán)利要求24或權(quán)利要求25的組合物,其中疾病選自肌營養(yǎng)不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌癥或HIV有關(guān)的肌肉萎縮、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS),或者與心肌生長相關(guān)的疾病,包括梗塞。
27.按照權(quán)利要求13至23中任意一種的組合物,用于在肌肉損傷后促進(jìn)肌肉再生。
28.調(diào)節(jié)生物體肌肉生長的方法,包括給藥至所述生物體權(quán)利要求13至權(quán)利要求23中任一項(xiàng)所述的組合物。
29.按照權(quán)利要求28的方法,用于生產(chǎn)具有增加的肌肉重量的動(dòng)物
30.按照權(quán)利要求28的方法,用于與肌肉增長相關(guān)的疾病的治療或預(yù)防。
31.按照權(quán)利要求30的方法,其中疾病與肌肉萎縮相關(guān)。
32.按照權(quán)利要求30或31的方法,其中疾病選自肌營養(yǎng)不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌癥或HIV有關(guān)的肌肉萎縮、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS),或者與心肌增長相關(guān)的疾病,包括梗塞。
33.按照權(quán)利要求28的方法,用于在肌肉損傷后促進(jìn)肌肉再生。
34.按照權(quán)利要求13至23中任意一種的組合物在制備調(diào)節(jié)肌肉生長的藥物中的應(yīng)用。
35.按照權(quán)利要求13至23中任一種的組合物在制備用于治療或預(yù)防與肌肉生長相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
36.按照權(quán)利要求35的應(yīng)用,其中疾病與肌肉萎縮相關(guān)。
37.按照權(quán)利要求35或權(quán)利要求36的應(yīng)用,其中疾病選自肌營養(yǎng)不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌癥或HIV有關(guān)的肌肉萎縮、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS),或者與心肌增長相關(guān)的疾病,包括梗塞。
38.按照權(quán)利要求13至23中任一種的組合物在制備用于在肌肉損傷后促進(jìn)肌肉再生的藥物中的應(yīng)用。
39.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其含有按照權(quán)利要求8至11任一種的載體,或者含有按照權(quán)利要求13至18中任一種的組合物。
40.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其中所述動(dòng)物具有增加的肌肉重量。
41.按照權(quán)利要求39或權(quán)利要求40的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,選自羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠或人類。
42.預(yù)測(cè)動(dòng)物肌肉重量的方法,包括步驟i)從動(dòng)物中獲取樣本,iv)測(cè)定具有序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸、與SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3有至少95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體的基因表達(dá)水平;或測(cè)定具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95%、90%或70%序列同一性的多肽、或其片段或變體的數(shù)量。v)將基因表達(dá)水平或多肽的量與平均值進(jìn)行比較;和vi)預(yù)測(cè)所述動(dòng)物的肌肉重量。
43.按照權(quán)利要求2的方法,其中用RTPCR或者northern分析測(cè)定基因表達(dá)的水平。
44.按照權(quán)利要求43的方法,其中用ELISA或者蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定多肽的量。
45.檢測(cè)mighty的變體的方法,包括使用選自下列的核苷酸序列a)SEQ ID No.1,SEQ ID No.3,或SEQ ID No.5,b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸,c)與(a)或(b)有至少95%,90%或70%序列同一性的多核苷酸,d)(a)至(c)中任意一種的互補(bǔ)序列,e)(a)至(c)中任意一種的反向互補(bǔ)序列,和f)(a)至(c)中任意一種的片段或變體,在從生物體獲得的樣品中篩選mighty的變體。
46.按照權(quán)利要求45的方法,其中變體具有多態(tài)性。
47.按照權(quán)利要求46的方法,其中多態(tài)性為單核苷酸多態(tài)性。
48.按照權(quán)利要求45至47的任意一種的方法,其中mighty的變體與改變的肌肉表型相關(guān)。
49.繁殖具有增長的肌肉重量的動(dòng)物的方法,包括步驟i)選擇采用按照權(quán)利要求42至44或48的任意一種方法預(yù)測(cè)肌肉重量有所增加的一種或多種動(dòng)物,和ii)繁殖該一個(gè)或多個(gè)被預(yù)測(cè)具有增加的肌肉重量的動(dòng)物以產(chǎn)生具有改善的肌肉重量的動(dòng)物。
50.按照權(quán)利要求49的方法,其中動(dòng)物選自羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠或人類。
51.優(yōu)先結(jié)合具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的序列的多肽或者與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95%、90%或70%序列同一性的多肽的抗體。
52.含有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的序列的多肽的抗原性片段,其用于制備優(yōu)先結(jié)合SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4序列或者與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95%、90%或70%序列同一性的多肽的抗體。
53.分離的多核苷酸,包含如下任一a)SEQ ID No5的序列,b)與SEQ ID No.5具有95%、90%或70%序列同一性的多核苷酸,c)其具有啟動(dòng)子活性的片段或變體。
55.按照權(quán)利要求54的分離的核苷酸,包含mighty起始位點(diǎn)上游至少200個(gè)核苷酸。
56.按照權(quán)利要求54或權(quán)利要求55的分離的多核苷酸,包含mighty起始位點(diǎn)上游209,287,315,400,600,1000和2100個(gè)核苷酸中任一片段。
57.含有按照權(quán)利要求54至56中任一種的多核苷酸的載體。
58.含有按照權(quán)利要求57的載體的宿主細(xì)胞。
59.篩選一種或多種在抑制或促進(jìn)肌肉生長中潛在有效的化合物的方法,包括步驟i)插入按照權(quán)利要求54至56中任一種的多核苷酸至連接有合適標(biāo)記基因的合適的載體中,ii)用載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞,iii)對(duì)該宿主細(xì)胞施用感興趣的化合物,和iv)測(cè)定標(biāo)記基因表達(dá)水平的任何差異。
60.按照權(quán)利要求59的方法,其中載體為原核質(zhì)粒、真核質(zhì)?;虿《据d體中的任意一種。
61.按照權(quán)利要求59或權(quán)利要求60的方法,其中標(biāo)記基因?yàn)榫幋a綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶,或者β半乳糖苷酶中任意一種的任一多核苷酸。
62.在肌細(xì)胞中表達(dá)預(yù)期的蛋白的方法,包括步驟i)分離編碼要表達(dá)的基因的多核苷酸序列;ii)插入按照權(quán)利要求54至56中任意一種的多核苷酸到合適的載體,其以5-3的方向可操作地與要表達(dá)的蛋白的多核苷酸序列連接,和iii)將載體導(dǎo)入肌肉宿主細(xì)胞。
63.按照權(quán)利要求62的方法,其中載體為真核載體、病毒載體,或者適用于基因治療的任意載體中的任意一種。
64.按照權(quán)利要求62或權(quán)利要求63的方法,其中宿主細(xì)胞為原代成肌細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的成肌細(xì)胞系或mighty啟動(dòng)子在其中有活性的任何細(xì)胞系。
65.按照權(quán)利要求62或權(quán)利要求63的方法,其中宿主細(xì)胞為宿主動(dòng)物的體內(nèi)骨骼肌或心肌細(xì)胞。
66.按照權(quán)利要求65的方法,其中宿主動(dòng)物為羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠或人中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的肌肉生長調(diào)節(jié)因子,包括多核苷酸和多肽序列,啟動(dòng)子序列,含有序列的構(gòu)建體,以及調(diào)節(jié)肌肉生長和治療與肌肉生長相關(guān)的疾病的組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述序列在識(shí)別具有改變的肌肉重量的動(dòng)物,以及用于選擇性育種程序以獲得具有改變的肌肉重量的動(dòng)物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1906211SQ200480041030
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者姆里杜拉·沙馬, 卡羅爾·貝里, 馬克·托馬斯, 拉維·坎巴德, 羅伯特·S·鮑爾 申請(qǐng)人:奧維塔有限公司