專利名稱：2型血管內(nèi)皮生長因子受體的抑制劑的制作方法
相關(guān)申請
本申請要求享有2003年12月5日提交的標(biāo)題為“Inhibitors ofVascular Endothelial Growth Factor Receptors”的美國臨時申請?zhí)?0/527,886的優(yōu)先權(quán)。上述申請的所有教導(dǎo)都特此引作參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及新的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFRs)-結(jié)合多肽和使用這些多肽抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的生物活性的方法。
血管生成是從先前存在的毛細管或毛細管后小靜脈形成新血管的過程；它是許多生理過程的重要組分，包括排卵，胚胎發(fā)育，傷口修復(fù)，和心肌中的側(cè)支血管生成。血管生成對于許多病理狀況也是重要的，例如腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，糖尿病視網(wǎng)膜病，和黃斑變性。在許多情況下，該過程從現(xiàn)有的血管內(nèi)皮細胞的活化開始，對許多細胞因子和生長因子作出響應(yīng)。在癌癥中，腫瘤釋放的細胞因子或血管生成因子會通過與特定的細胞表面受體的相互作用，刺激血管內(nèi)皮細胞。活化的內(nèi)皮細胞能分泌酶，后者能降解血管的基底膜，允許內(nèi)皮細胞向腫瘤組織中侵入。一旦定位，內(nèi)皮細胞會分化，形成先存血管的新血管側(cè)支。新血管能為腫瘤提供營養(yǎng)，促進進一步生長，并提供轉(zhuǎn)移途徑。
迄今，已經(jīng)鑒別出了許多血管生成因子，包括特別有效的因子VEGF。最初，從濾泡星形細胞(folliculostellate cell)的條件培養(yǎng)基和許多細胞系中純化出了VEGF。最近，已經(jīng)鑒別出了許多結(jié)構(gòu)同源物和可變剪接形式的VEGF。各種形式的VEGF能作為高親合力配體結(jié)合到一套VEGF受體(VEGFRs)上。VEGFRs是酪氨酸激酶受體，其中的許多是血管生成的重要調(diào)節(jié)劑。VEGFR家族包括3個主要的亞型VEGFR-1，VEGFR-2(在人類中，也稱作激酶插入結(jié)構(gòu)域受體，″KDR″)，和VEGFR-3。在VEGF形式中，已知VEGF-A，VEGF-C和VEGF-D能結(jié)合和活化VEGFR-2。
VEGF通過作用于它的相關(guān)受體，可以在血管生成過程中起內(nèi)皮特異性的有絲分裂原的作用。另外，已經(jīng)有實質(zhì)的證據(jù)證實，在特征在于不適當(dāng)?shù)难苌傻臓顩r，例如癌癥中，VEGF和VEGFR受到上調(diào)。結(jié)果，大量的研究已經(jīng)集中在能靶向和抑制VEGF或VEGFR的治療劑的鑒別上。
能靶向或抑制VEGF或VEGFR的當(dāng)前治療方案包括抗體，肽和小分子激酶抑制劑。其中，抗體被最廣泛地用于配體和細胞受體的體內(nèi)識別和抑制。高度特異性的抗體已經(jīng)用于阻斷受體-配體相互作用，從而中和組分的生物活性，還將毒劑特異性地送遞到能在表面表達相關(guān)受體的細胞。雖然有效，抗體是較大的復(fù)雜分子，其生成依賴于在重組哺乳動物細胞中的表達?？贵w還會造成許多經(jīng)常不合需要的副作用，包括補體途徑的活化和抗體-指導(dǎo)的細胞毒性。結(jié)果，仍然需要有效的治療劑，其可以特異性地抑制VEGF/VEGFR途徑，作為特征在于不適當(dāng)?shù)难苌傻牟“Y(例如癌癥)的治療。
發(fā)明簡述 部分地，本發(fā)明提供了新的單結(jié)構(gòu)域多肽，其結(jié)合VEGFR-2受體，尤其是人VEGFR-2(也稱作KDR)和小鼠VEGFR-2(也稱作Flk-1)。本文所述的VEGFR-2結(jié)合蛋白可以用于例如體內(nèi)或體外檢測VEGFR-2。另外，本文所述的某些VEGFR-2結(jié)合蛋白可以用于治療與VEGFR-2介導(dǎo)的生物活性有關(guān)的疾病。例如，KDR能介導(dǎo)VEGF的促血管生成作用，因此，本發(fā)明的某些KDR結(jié)合蛋白可以用于抑制人患者中的血管生成。本發(fā)明的某些VEGFR-2結(jié)合蛋白可以用于治療病癥例如癌癥，炎性疾病，自身免疫病和視網(wǎng)膜病。與組織細胞的過度增殖有關(guān)的許多病癥包括血管生成組分，因而預(yù)期本文所述的某些VEGFR-2結(jié)合蛋白可以用于治療這樣的病癥。
本文所述的單結(jié)構(gòu)域多肽通常是結(jié)合靶(例如VEGFR-2)的多肽，且其中靶結(jié)合活性位于單結(jié)構(gòu)域中，作為與例如抗體和單鏈抗體的區(qū)別，其中抗原結(jié)合活性通常由重鏈可變域和輕鏈可變域賦予。本發(fā)明還提供了更大的蛋白，其可以包含結(jié)合靶的單結(jié)構(gòu)域多肽。例如，可以連接許多單結(jié)構(gòu)域多肽，建立具有提高的抗體親抗原性的復(fù)合分子。同樣地，可以將單結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合(例如，作為融合蛋白)到任意數(shù)量的其它多肽上。在某些方面，單結(jié)構(gòu)域多肽可以包含至少5-7個β或β樣鏈，其分布在至少2個β折疊中，如免疫球蛋白和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域所示例的。β樣鏈?zhǔn)且淮被幔鋮⑴c穩(wěn)定單結(jié)構(gòu)域多肽，但不一定采用β鏈構(gòu)象。通過去除該串或改變該串的序列，并分析是否減少了蛋白穩(wěn)定性，可以判斷β樣鏈?zhǔn)欠駞⑴c穩(wěn)定蛋白。通過例如，熱變性和復(fù)性研究，可以判斷穩(wěn)定性。優(yōu)選地，單結(jié)構(gòu)域多肽包含不超過2個β樣鏈。β樣鏈通常不采用α-螺旋構(gòu)象，但是可以采用隨機的卷曲結(jié)構(gòu)。在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域中，β樣鏈最經(jīng)常存在于結(jié)構(gòu)中原本由大多數(shù)N-末端β鏈或大多數(shù)C-末端β鏈占據(jù)的位置。位于蛋白序列內(nèi)部時通常會形成β鏈的氨基酸串，當(dāng)位于更接近N-或C-末端的位置時，可以采取不是清楚的β鏈的構(gòu)象，其在本文中稱作β樣鏈。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合VEGFR-2的單結(jié)構(gòu)域多肽。優(yōu)選地，單結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合人KDR，小鼠Flk-1，或二者。單結(jié)構(gòu)域多肽可以包含約80-約150個氨基酸，其具有包含下組的結(jié)構(gòu)組織至少7個分布在至少2個β折疊中的β鏈或β樣鏈，和至少1個連接2個β鏈或β樣鏈的環(huán)部分，該環(huán)部分參與結(jié)合VEGFR-2。換而言之，環(huán)部分可以連接2個β鏈，2個β樣鏈或1個β鏈和1個β樣鏈。典型地，一個或多個環(huán)部分參與VEGFR-2結(jié)合，盡管一個或多個β或β樣鏈部分也可能參與VEGFR-2結(jié)合，尤其是最接近環(huán)部分的那些β或β樣鏈部分。單結(jié)構(gòu)域多肽可以包含一個結(jié)構(gòu)單元，它是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。單結(jié)構(gòu)域多肽可以結(jié)合VEGFR-2的任何部分，盡管優(yōu)選能結(jié)合VEGFR-2的胞外結(jié)構(gòu)域的多肽。根據(jù)平衡常數(shù)(例如，解離，KD)和動力學(xué)常數(shù)(例如，啟動速度常數(shù)kon和關(guān)閉速度常數(shù)koff)，可以評價結(jié)合。典型地，選擇單結(jié)構(gòu)域多肽，以小于10-6M，或小于10-7M，5×10-8M，10-8M或小于10-9M的KD結(jié)合VEGFR-2。VEGFR-2結(jié)合多肽可以與VEGF家族的2個或多個成員、尤其是VEGF-A，VEGF-C和VEGF-D競爭結(jié)合，且可以抑制一個或多個VEGFR-2-介導(dǎo)的生物事件，例如內(nèi)皮細胞的增殖，血管的通透性和在內(nèi)皮細胞中的提高的游動性。VEGFR-2結(jié)合多肽可以用于治療目的以及包含檢測或結(jié)合VEGFR-2的許多目的。用于治療用途的多肽通常具有小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD，盡管當(dāng)koff足夠低或kon足夠高時，可以耐受更高的KD值。在某些實施方案中，結(jié)合VEGFR-2的單結(jié)構(gòu)域多肽包含共有的VEGFR-2結(jié)合序列，其選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。優(yōu)選地，這樣的序列位于環(huán)中，尤其是FG環(huán)中。
在某些實施方案中，單結(jié)構(gòu)域多肽包含免疫球蛋白(Ig)可變域。Ig可變域可以例如選自人VL結(jié)構(gòu)域，人VH結(jié)構(gòu)域和camelid VHH結(jié)構(gòu)域。Ig可變域的1個、2個、3個或多個環(huán)可以參與結(jié)合VEGFR-2，典型地，稱作CDR1，CDR2或CDR3的環(huán)中的任一個會參與VEGFR-2結(jié)合。
在某些實施方案中，單結(jié)構(gòu)域多肽包含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的1個、2個、3個或多個環(huán)會參與結(jié)合VEGFR-2。優(yōu)選的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域是纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域。這樣的結(jié)構(gòu)域可以按從N-末端至C-末端的順序包含，β或β樣鏈，A；環(huán)，AB；β鏈，B；環(huán)，BC；β鏈 C；環(huán)CD；β鏈 D；環(huán) DE；β鏈 F；環(huán) FG；和β或β樣鏈G。關(guān)于結(jié)構(gòu)組織的實例，見圖22。任選地，任意的或所有的環(huán)AB，BC，CD，DE，EF和FG可以參與VEGFR-2結(jié)合，盡管優(yōu)選的環(huán)是BC，DE和FG。優(yōu)選的Fn3結(jié)構(gòu)域是源自人纖連蛋白的Fn3結(jié)構(gòu)域，尤其是纖連蛋白的第10個Fn3結(jié)構(gòu)域，稱作10Fn3。應(yīng)當(dāng)指出，本文所述的VEGFR-2結(jié)合多肽不具有與天然的10Fn3相同的氨基酸序列；已經(jīng)修飾了序列，以得到VEGFR-2結(jié)合蛋白，但是具有10Fn3的基本結(jié)構(gòu)特征的蛋白，尤其是保留與天然的10Fn3的可識別的序列同源性的那些，在本文中仍然稱作″10Fn3多肽″。該命名法類似于在抗體領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)的那些，其中例如，針對特定的靶蛋白產(chǎn)生的重組抗體VL結(jié)構(gòu)域不會與任何天然產(chǎn)生的VL結(jié)構(gòu)域相同，但是蛋白仍然可識別地是VL蛋白。10Fn3多肽可以與SEQ ID NO5所示的人10Fn3結(jié)構(gòu)域至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，或90％相同。在一個或多個環(huán)中，通常會存在大量的可變性。10Fn3多肽的每個β或β樣鏈可以基本上由與SEQ ID NO5的對應(yīng)β或β樣鏈的序列至少80％，85％，90％，95％或100％相同的氨基酸序列組成，條件是這樣的變化不會破壞多肽在生理條件下的穩(wěn)定性。10Fn3多肽可以具有在環(huán)AB，CD，和EF中的每一個的序列，其基本上由與SEQ ID NO5的對應(yīng)環(huán)的列至少80％，85％，90％，95％或100％相同的氨基酸序列組成。許多情況下，相對于SEQ ID NO5，任意的或所有的環(huán)BC，DE，和FG保守性差。例如，所有BC，DE，和FG環(huán)可以與它們在SEQ ID NO5中的對應(yīng)環(huán)小于20％，10％，或0％相同。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了非抗體多肽，其包含能結(jié)合VEGFR-2的具有免疫球蛋白樣折疊的結(jié)構(gòu)域。非抗體多肽可以具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，其通常源自(通過，例如，改變氨基酸序列)參照或″支架″蛋白，例如Fn3支架。非抗體多肽可以以小于10-6M，或小于10-7M，小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD結(jié)合VEGFR-2。未改變的參照蛋白不會有意義地結(jié)合VEGFR-2，或是以大于10-6M的KD結(jié)合。非抗體多肽可以抑制VEGF信號傳遞，尤其當(dāng)非抗體多肽具有小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD時，盡管當(dāng)koff足夠低(例如，小于5×10-4s-1)時，可以耐受更高的KD值。免疫球蛋白樣折疊可以是10Fn3多肽。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了多肽，其包含能結(jié)合VEGFR-2的具有免疫球蛋白折疊的單結(jié)構(gòu)域。多肽可以具有小于20kDa或小于15kDa的分子量，其通常源自(通過，例如，改變氨基酸序列)免疫球蛋白的可變域。多肽可以以小于10-6M，或小于10-7M，小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD結(jié)合VEGFR-2。多肽可以抑制VEGF信號傳遞，尤其當(dāng)多肽具有小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD時，盡管當(dāng)koff足夠低或kon足夠高時，可以耐受更高的KD值。在某些優(yōu)選的實施方案中，具有源自免疫球蛋白輕鏈可變域的免疫球蛋白折疊、且能結(jié)合VEGFR-2的單結(jié)構(gòu)域多肽可以包含選自SEQ IDNO241-310的氨基酸序列。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了VEGFR-2結(jié)合多肽，其包含SEQ ID NO192-194中的任一個的氨基酸序列。在包含SEQ IDNO194的氨基酸序列的多肽的情況下，PEG部分或其它目標(biāo)部分可以共價地結(jié)合到93位的半胱氨酸上。PEG部分也可以共價鍵合到多肽的胺部分上。胺部分可以是，例如，在多肽的N-末端的伯胺，或存在于氨基酸(例如賴氨酸或精氨酸)中的胺基。在某些實施方案中，PEG部分結(jié)合到選自下組的多肽位置a)N-末端；b)N-末端和大多數(shù)N-末端β鏈或β樣鏈之間；c)位于與靶結(jié)合位點相對的多肽面上的環(huán)；d)C-末端和大多數(shù)C-末端β鏈或β樣鏈之間；和e)C-末端。
在某些方面，本發(fā)明提供了能介導(dǎo)VEGFR-2結(jié)合的短肽序列。以分離的形式或當(dāng)插入特定蛋白結(jié)構(gòu)(例如免疫球蛋白或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域)中時，這樣的序列可以介導(dǎo)VEGFR-2結(jié)合。這樣的序列的實例包括SEQ ID NO1-4公開的那些，和與SEQ ID NO1-4至少85％，90％，或95％相同且能保留VEGFR-2結(jié)合活性的其它序列。因此，本發(fā)明提供了基本上純的多肽，其包含與SEQ ID NO1-4中的任一個序列至少85％相同的氨基酸序列，其中所述的多肽能結(jié)合VEGFR-2，并與VEGF類物質(zhì)競爭結(jié)合VEGFR-2。這樣的多肽的實例包括包含與SEQ ID NO6-183，186-197，和199中的任一個的序列至少85％相同的氨基酸序列至少80％，85％，90％，95％或100％相同的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，這樣的多肽會抑制VEGF的生物活性，且可以以小于10-6M，或小于10-7M，小于5×10-8M，小于10-8M或小于10-9M的KD結(jié)合VEGFR-2。
在某些實施方案中，本文所述的任一種VEGFR-2結(jié)合多肽可以結(jié)合一個或多個其它的部分，包括，例如，也能結(jié)合VEGFR-2的部分(例如，第二個相同的或不同的VEGFR-2結(jié)合多肽)，能結(jié)合不同的靶的部分(例如，為了建立雙-特異性結(jié)合劑)，標(biāo)記部分，有利于蛋白純化的部分，或能提供改進的藥物動力學(xué)的部分。根據(jù)察覺的治療需要，可以評價改進的藥物動力學(xué)。經(jīng)常需要提高生物利用度和/或增加給藥之間的時間，這可以通過增加給藥后蛋白在血清中保持可利用的時間來實現(xiàn)。在有些情況下，需要提高蛋白隨時間的血清濃度的連續(xù)性(例如，減少給藥后短時間和下次給藥前短時間的蛋白血清濃度的差異)。傾向于從血液緩慢清除蛋白的部分包括聚乙二醇，糖(例如唾液酸)，和較好耐受的蛋白部分(例如，F(xiàn)c片段或血清白蛋白)。單結(jié)構(gòu)域多肽可以結(jié)合到能使多肽在哺乳動物(例如，小鼠，大鼠，或人)中的清除速度比未修飾的多肽減少超過3倍的部分。改進的藥物動力學(xué)的其它措施可以包括血清半衰期，其經(jīng)常分成α階段和β階段。通過添加合適的部分，可以顯著改進任一個或2個階段。當(dāng)使用聚乙二醇時，可以將一個或多個PEG分子結(jié)合到蛋白中的不同位置，通過與胺、硫醇或其它合適的反應(yīng)基團的反應(yīng)，可以實現(xiàn)這樣的結(jié)合。通過定點聚乙二醇化可以實現(xiàn)聚乙二醇化，其中將合適的反應(yīng)部分導(dǎo)入蛋白中，建立能優(yōu)先發(fā)生聚乙二醇化的位點。在一個優(yōu)選的實施方案中，修飾蛋白，使其在需要的位置具有半胱氨酸，允許在半胱氨酸上的定點聚乙二醇化。PEG的分子量可以廣泛地變化，且可以是分支的或線性的。值得注意地，本發(fā)明確定，聚乙二醇化能與10Fn3多肽的靶結(jié)合活性相容，而且，聚乙二醇化確實能提高這樣的多肽的藥物動力學(xué)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了聚乙二醇化形式的10Fn3多肽，無論這樣的多肽是否能結(jié)合的靶。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了制劑，其包含本文所述的任意VEGFR-2結(jié)合多肽。制劑可以是治療制劑，其包含VEGFR-2結(jié)合多肽和藥學(xué)上可接受的載體。制劑也可以是組合制劑，其包含其它的活性劑，例如抗癌劑或抗血管生成劑。
在某些方面，本發(fā)明提供了使用VEGFR-2結(jié)合蛋白抑制細胞中的VEGF生物活性或抑制VEGFR-2介導(dǎo)的生物活性的方法。細胞可以位于體內(nèi)或體外，且可以是例如活生物的細胞，培養(yǎng)的細胞或組織樣品中的細胞。該方法可以包含，使所述細胞接觸本文所述的任一種VEGFR-2-抑制多肽，接觸量和時間足以抑制這樣的生物活性。
在某些方面，本發(fā)明提供了治療對象的方法，所述對象患有VEGF或VEGFR-2的抑制引起的狀況。這樣的方法可以包含，向所述對象施用有效量的任一種本文所述的VEGFR-2抑制多肽。狀況可以是特征在于不適當(dāng)?shù)难苌伞顩r可以是過度增殖的狀況。適于治療的狀況(或病癥)的實例包括自身免疫病癥，炎性病癥，視網(wǎng)膜病(尤其是增殖性視網(wǎng)膜病)，和癌癥。任一種本文所述的VEGFR-2抑制多肽可以用于制備用于治療病癥、尤其是選自下述的病癥的藥物自身免疫病癥，炎性病癥，視網(wǎng)膜病，和癌癥。
在某些方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中的VEGFR-2的方法。方法可以包含，使樣品接觸本文所述的VEGFR-2結(jié)合多肽，其中所述的接觸是在允許多肽-VEGFR-2復(fù)合物形成的條件下進行；和檢測所述的復(fù)合物，從而檢測所述樣品中的所述VEGFR-2。使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，例如，射線照相術(shù)，免疫測定，熒光檢測，質(zhì)譜，或表面等離振子共振，可以進行檢測。樣品經(jīng)常是生物樣品，例如活組織檢查樣品，尤其是腫瘤、懷疑的腫瘤或懷疑發(fā)生了不需要的血管生成的組織的活組織檢查樣品。樣品可以來自人或其它哺乳動物。VEGFR-2結(jié)合多肽可以標(biāo)記有標(biāo)記部分，例如放射性部分，熒光部分，發(fā)色部分，化學(xué)發(fā)光部分，或半抗原部分。VEGFR-2結(jié)合多肽可以固定在固體支持物上。
本發(fā)明的另一個方面涉及核酸，其包含編碼本文所述的多肽的核酸序列。在某些實施方案中，核酸可以包含編碼選自SEQ ID NO 6-183，186-197，199和241-528中的任一個的多肽的核酸序列。在某些實施方案中，核酸包含核酸序列，其在嚴格條件下與SEQ ID NO184的核酸序列雜交，且編碼以小于1×10-6M的KD結(jié)合人KDR的多肽。在具體的實施方案中，核酸可以包含選自SEQ ID NO184和SEQ IDNO185的核酸序列。
本發(fā)明的另一個方面涉及表達載體，其包含可操作地連接到啟動子上的核酸，其中核酸編碼本文所述的多肽。本發(fā)明的另一個方面涉及包含本文所述的核酸的細胞。還提供了生產(chǎn)能結(jié)合VEGFR-2例如KDR的多肽的方法，包含表達編碼本發(fā)明的多肽的核酸。在某些實施方案中，核酸可以包含編碼選自SEQ ID NO 6-183，186-197，199和241-528中的任一個的多肽的序列。在某些實施方案中，核酸包含能在嚴格條件下與SEQ ID NO184的核酸序列雜交的序列。在某些實施方案中，核酸包含選自SEQ ID NO184和SEQ ID NO185的核酸序列。在某些實施方案中，在細胞中表達核酸?；蛘?，在無細胞的系統(tǒng)中表達核酸。
在某些方面，本發(fā)明提供了可以用于任意的10Fn3多肽的發(fā)現(xiàn)，無論多肽工程化以結(jié)合的靶是什么。如上所述，本發(fā)明證實，PEG可以成功地用于提高10Fn3多肽的藥物動力學(xué)，且不會有意義地干擾靶結(jié)合。因此，本發(fā)明提供了聚乙二醇化的10Fn3多肽，其能結(jié)合靶，且具有比未-聚乙二醇化的多肽改進的藥物動力學(xué)。在另一個實施方案中，本發(fā)明證實，10Fn3多肽的前8個氨基酸的缺失，可以增加靶結(jié)合親合力。因此，本發(fā)明了提供了缺失起始8個氨基酸(參考SEQ ID No5的序列編號的氨基酸)的10Fn3多肽。應(yīng)當(dāng)理解，可以將1個或2個氨基酸加回缺失形式的多肽，以便促進翻譯和合適的加工。本發(fā)明證實，10Fn3多肽的皮下施用，會導(dǎo)致多肽向血流中的延遲釋放和10Fn3多肽的最大血清濃度降低。因此，本發(fā)明提供了通過皮下施用向患者施用10Fn3多肽的方法。該施用途徑可以用于實現(xiàn)相對于靜脈內(nèi)施用延遲的釋放，和/或使10Fn3多肽的最大血清濃度相對于靜脈內(nèi)施用等劑量實現(xiàn)的最大血清濃度減少至少25％或至少50％。施用的10Fn3多肽可以結(jié)合到能增加10Fn3多肽的血清半衰期(或減少清除速度，或類似地影響另一個藥物動力學(xué)參數(shù))的部分上，例如聚乙二醇部分。優(yōu)選地，施用的10Fn3多肽包含與SEQ ID NO5至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％相同的氨基酸序列。
在某些方面，本發(fā)明提供了單結(jié)構(gòu)域多肽，其能結(jié)合預(yù)選的來自第一種哺乳動物的靶蛋白和來自第二種哺乳動物的其同源物。當(dāng)?shù)谝环N哺乳動物是人且第二種哺乳動物是在其中進行臨床前測試的需要的哺乳動物，例如小鼠，大鼠，豚鼠，狗，或非-人靈長類動物時，這樣的單結(jié)構(gòu)域多肽特別有用。本發(fā)明證實，可以將單結(jié)構(gòu)域多肽工程化為具有這樣的雙特異性，且通過允許相同多肽在人細胞、人對象和動物模型中的測試，雙特異性能簡化藥物開發(fā)。優(yōu)選地，預(yù)選的第一種哺乳動物的靶蛋白和來自第二種哺乳動物的其同源物的氨基酸序列十分相似，以允許生成雙特異性多肽。例如，預(yù)選的靶蛋白和來自第二種哺乳動物的同源物可以在至少50個氨基酸的區(qū)域具有至少80％，90％，或95％同一性，且在膜蛋白的情況下，可以任選地在整個蛋白序列或胞外結(jié)構(gòu)域序列具有至少80％，90％，或95％同一性。具有該類型的雙特異性結(jié)合特征的單結(jié)構(gòu)域多肽可以包含免疫球蛋白或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，且優(yōu)選地，以小于1×10-6M，1×10-7M，5×10-8M，1×10-8M或1×10-9M的解離常數(shù)，結(jié)合預(yù)選的人靶蛋白和其同源物。
附圖簡述

圖1A-1D的圖和照片解釋了來自第6輪KDR選擇的KDR-結(jié)合單克隆的特征。圖1A的圖顯示了在放射平衡結(jié)合測定中分析的基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白與25nM KDR-Fc的特異性結(jié)合。圖1B的圖顯示了在100-倍過量的VEGF165存在下，KDR-Fc和選擇的基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白的特異性結(jié)合的抑制。如該圖所示，某些結(jié)合蛋白能與VEGF165競爭地結(jié)合KDR-Fc；而克隆8示例的其它蛋白不能與VEGF165競爭。圖1C的圖顯示了在有選擇的基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白存在下，在BIAcore中分析的KDR-Fc與固定化的VEGF165的相互作用的抑制。圖1D的照片顯示了通過免疫熒光檢測的VR28與KDR表達細胞和對照細胞的結(jié)合。
圖2的圖顯示了VR28KDR結(jié)合劑的親合力成熟的選擇曲線。左邊顯示了VR28克隆與KDR-Fc和Flk1-Fc的結(jié)合(非常低，未標(biāo)記的條)。中間顯示了粗誘變的合并物和后幾輪富集與KDR-Fc的結(jié)合。右邊顯示了進一步的幾輪富集與Flk-1-Fc的結(jié)合。在放射平衡結(jié)合測定中，使用1nM KDR-Fc或Flk1-Fc，將結(jié)合估計為輸入百分比。
圖3A和3B的圖解釋了來自VR28結(jié)合劑的抗-KDR親合力成熟的第4輪的KDR-結(jié)合單克隆的特征。圖3A顯示了在放射平衡結(jié)合測定中，VR28(-■-)和親合力成熟的K1(-▲-)，K6(-_-)，K9(-◆-)，K10(-●-)，K12(-□-)，K13(-△-)，K14(-_-)，K15(-◇-)與KDR-Fc的飽和結(jié)合。圖3B顯示了有和沒有N-末端缺失的克隆與KDR-Fc的結(jié)合?；诶w連蛋白的結(jié)合蛋白的N-末端的缺失Δ1-8能提高與KDR-Fc的結(jié)合。數(shù)據(jù)代表有和沒有N-末端缺失的23個獨立克隆的平均KDR-Fc結(jié)合。
圖4的圖顯示了選擇的克隆與KDR和Flk-1的結(jié)合。4輪親合力成熟后，VR28和選擇的克隆與人KDR(K克隆)的特異性結(jié)合，和7輪親合力成熟后，與人(KDR)和小鼠(flk-1)(E克隆)的結(jié)合。在放射平衡結(jié)合測定中，對比了VEGFR-2-Fc嵌合體。數(shù)據(jù)代表3個獨立實驗的平均值。如這里所示，針對小鼠和人VEGFR-2蛋白的成熟，會產(chǎn)生能結(jié)合2種蛋白的結(jié)合劑。
圖5A和5B的圖顯示了來自VR28結(jié)合劑的第7輪親合力成熟的VEGFR-2-結(jié)合單克隆的特征。在放射平衡結(jié)合測定中，測試了VR28(-■-)和特異性成熟的E3(-▲-)，E5(-_-)，E6(-◆-)，E9(-●-)，E18(-□-)，E19(-△-)，E25(-_-)，E26(-◇-)，E28(-○-)，E29(-X-)克隆與KDR(圖5A)和Flk1(圖5B)-Fc嵌合體的飽和結(jié)合。
圖6A和6B的圖顯示了通過來自VR28結(jié)合劑的第7輪親合力成熟的單克隆表征的VEGFR-2結(jié)合。圖6A證實了在具有對人和小鼠VEGFR-2的雙特異性的結(jié)合劑的位置79和82處的精氨酸對結(jié)合小鼠VEGFR-2(Flk1)的重要性。當(dāng)這些位置中的任一個被R(X79＝E，Q，W，P；X82＝L，K)以外的氨基酸替代時，會顯著減少與Flk1的結(jié)合，而非與KDR的結(jié)合。圖6B證實了基于KDR纖連蛋白的結(jié)合蛋白的所有3個可變環(huán)(BC，DE和FG)對與這些蛋白中的靶的結(jié)合的重要性。每個環(huán)中偶爾被NNS序列取代，會影響向KDR和Flk1的結(jié)合。結(jié)合數(shù)據(jù)是E6和E26克隆的平均值。
圖7A和7B的圖顯示了選擇的基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白與表達人KDR受體(圖7A)和EpoR-Flk1嵌合體(圖7B)的CHO細胞的結(jié)合。測試了E18(-●-)，E19(-▲-)，E26(-_-)，E29(-◆-)和WT(-□-)基于纖連蛋白的支架蛋白。沒有觀察到與對照CHO細胞的結(jié)合(未顯示數(shù)據(jù))。
圖8A和8B的圖顯示了在不同量的基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白存在下，表達KDR和Flk1的Ba/F3-KDR(圖8A)和Ba/F3-Flk1(圖8B)細胞的VEGF-誘導(dǎo)的增殖的抑制E18(-●-)，E19(-▲-)，E26(-_-)，E29(-◆-)，M5(-●-)，WT(-□-)和抗-KDR或抗-flk-1 Ab(-△-)。數(shù)據(jù)代表2個獨立實驗的平均值。
圖9的圖顯示了在不同量的基于纖連蛋白的支架蛋白存在下，HUVEC增殖測定的結(jié)果E18(-●-)，E19(-▲-)，E26(-_-)，E29(-◆-)，M5(-●-)，WT(-□-)。數(shù)據(jù)代表2個獨立實驗的平均值。如圖所示，KDR結(jié)合蛋白使增殖減少約40％。
圖10的一組圖顯示了M5FL在優(yōu)化的緩沖液中的可逆重新折疊。
圖11的圖顯示了聚乙二醇化形式的M5FL的SDS-PAGE分析。M，分子量標(biāo)記[Sea Blue Plus，Invitrogen]；-，單獨的M5FL；20，具有20kD PEG的M5FL；40，具有40kD PEG的M5FL。
圖12的圖顯示了分別具有不同量的M5FL(-◆-)，M5FL PEG20(-■-)和M5FL PEG40(-▲-)的Ba/F3-KDR細胞的VEGF-誘導(dǎo)的增殖的抑制。在該測定中，聚乙二醇化對M5FL活性具有較少影響或無影響。
圖13顯示了內(nèi)皮細胞中的VEGFR-2信號傳遞的蛋白分析。磷酸VEGFR-2——磷酸化的VEGFR-2的可視化。VEGFR-2——加樣對照。磷酸ERK1/2——磷酸化的ERK1/2(MAPK)的可視化。ERK1——加樣對照。結(jié)果證實，130pM CT-01能阻斷VEGFR-2活化和VEGF-A的信號傳遞。
圖14表明，各種10Fn3-衍生的分子(例如M5FL，F(xiàn)10，CT-01)可以阻止VEGF-A和VEGF-D信號傳遞。
圖15對比了靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施用的125I天然的、聚乙二醇化的CT-01。CT-01是12kDa蛋白。它能從血液中迅速清除。40kDa PEG的添加會降低它的清除速度，并使AUC增加10倍。在大鼠中16小時的半衰期相當(dāng)于在人中每周2次給藥。施用途徑腹膜內(nèi)。CT-01-PEG40具有僅僅是靜脈內(nèi)施用的50％的AUC。
圖16顯示了125I-CTOIPEG40在正常大鼠中的組織分布。125I-CTOIPEG40的組織分布指示著主要通過肝和其次通過腎的分泌。這是對高分子量PEG形式所預(yù)期的。沒有檢測到CT-O1PEG40的長期積累。
圖17是Miles測定的示意圖，其能測量血管通透性。
圖18表明，使用Miles測定，CT-01可以體內(nèi)阻斷VEGF。結(jié)果表明，5mg/kg CT01-PEG40能阻斷VEGF攻擊。
圖19表明，使用B16-F10鼠黑素瘤測定，CT-01能抑制腫瘤生長。
圖20表明，使用U87人成膠質(zhì)細胞瘤，CT-01能抑制腫瘤生長。
圖21A和21B顯示了VEGFR結(jié)合多肽的序列，其基于抗體輕鏈構(gòu)架/支架(SEQ ID NO241-310)。
圖22顯示了具有免疫球蛋白折疊的單結(jié)構(gòu)域多肽(免疫球蛋白的VH結(jié)構(gòu)域，左側(cè))和具有免疫球蛋白樣折疊的單結(jié)構(gòu)域多肽(10Fn3結(jié)構(gòu)域，右側(cè))的結(jié)構(gòu)組織。
發(fā)明詳述 1.綜述 本說明書尤其描述了新的能結(jié)合VEGFR-2受體的單結(jié)構(gòu)域多肽的鑒別和生產(chǎn)。VEGFR-2，在人中也稱作KDR，在小鼠中也稱作Flk-1，是VEGF信號傳遞的促血管生成作用的主要介質(zhì)。VEGF-A，VEGF-C和VEGF-D能結(jié)合和活化VEGFR-2。在內(nèi)皮細胞中，VEGFR-2活化能刺激細胞增殖和遷移，在體內(nèi)，VEGFR-2活化能觸發(fā)血管生成，并增加脈管系統(tǒng)的通透性。增強的血管生成被公認為腫瘤生長和各種視網(wǎng)膜病的重要特征，而增強的脈管系統(tǒng)的滲透性是許多炎性反應(yīng)中的顯著事件。
本發(fā)明提供了數(shù)百種能結(jié)合VEGFR-2的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中的許多表現(xiàn)出體外和/或體內(nèi)VEGF拮抗劑活性。具有VEGF拮抗劑活性的單結(jié)構(gòu)域多肽可以用于許多治療用途?？?KDR抗體已經(jīng)被確認為具有針對疾病和狀況的體內(nèi)效用，所述疾病和狀況從癌癥和由癌癥引起的并發(fā)癥到增殖性視網(wǎng)膜病，炎性病癥和纖維變性。基于這里所述的體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)，預(yù)期單結(jié)構(gòu)域多肽可以用于治療相同的病癥譜。
除了治療用途外，VEGFR-2-結(jié)合單結(jié)構(gòu)域多肽可以用于需要檢測VEGFR-2的所有情形。例如，許多干細胞能表達VEGFR-2，包括特別有用的造血系的細胞。KDR-結(jié)合多肽可以用于，尤其是以標(biāo)記的形式用于檢測干細胞和促進細胞篩分。在體內(nèi)，標(biāo)記的VEGFR-2-結(jié)合多肽可以用于將表達VEGFR-2的組織成像。升高的VEGFR-2表達可以是經(jīng)歷特別高水平的血管生成或炎性活性的組織的特征。組織樣品的組織學(xué)分析，也可以從VEGFR-2的檢測獲益。例如，可能需要檢測腫瘤活組織檢查樣品中的VEGFR-2表達，以判斷抗-VEGFR-2或抗-VEGF治療的可能的有效性。令人感興趣地，本文公開的許多VEGFR-2結(jié)合蛋白能以納摩爾解離常數(shù)結(jié)合VEGFR-2，且對VEGFR-2介導(dǎo)的生物學(xué)事件沒有顯著作用。因此，這樣的結(jié)合蛋白，可以用于體內(nèi)可視化技術(shù)或細胞標(biāo)記技術(shù)，其中經(jīng)常需要選擇性地標(biāo)記能表達VEGFR-2的細胞，而不對VEGFR-2介導(dǎo)的事件造成顯著干擾。
本發(fā)明描述了稱作PROfusionTM的體外顯示技術(shù)的應(yīng)用，其采用核酸-蛋白融合體(RNA-和DNA-蛋白融合體)來鑒別對結(jié)合VEGFR-2重要的新的單結(jié)構(gòu)域多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白融合技術(shù)是一種顯示技術(shù)，其將蛋白共價地偶聯(lián)到它的編碼遺傳信息。PROfusionTM技術(shù)用于篩選編碼單結(jié)構(gòu)域多肽的核酸的集合，所述單結(jié)構(gòu)域多肽使用基于人3型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(10Fn3)的支架構(gòu)建，或從抗體輕鏈的可變域構(gòu)建。篩選稱作支架蛋白“文庫”的表達的多肽中能以高親合力結(jié)合VEGFR-2的多肽。我們從該支架蛋白文庫分離了新的能結(jié)合VEGFR-2的單結(jié)構(gòu)域多肽，在有些情況下，其會抑制VEGF生物活性。而且，發(fā)現(xiàn)許多位于免疫球蛋白或免疫球蛋白樣支架中的獨立隨機化的環(huán)傾向于聚集到有關(guān)的參與VEGFR-2結(jié)合的共有序列組。因此，預(yù)期具有這些共有序列的多肽可以用作VEGFR-2結(jié)合劑，甚至當(dāng)從鑒別它們的蛋白環(huán)境分離出來時也是如此。見，例如，SEQ ID NO 1-4。這樣的多肽可以用作獨立的小肽VEGFR-2結(jié)合劑，或可以位于其它蛋白中，尤其是具有免疫球蛋白或免疫球蛋白樣折疊的蛋白。
如上所述，本發(fā)明證實，具有某些需要的性質(zhì)，例如對VEGFR-2的高親合力結(jié)合，針對一種或多種VEGF-A，-C或-D的拮抗劑作用，和提高的藥物動力學(xué)的單結(jié)構(gòu)域多肽，可以用作有效的抗癌劑。盡管預(yù)期這樣的多肽作為抗癌劑的有效性與癌癥中的血管生成作用有關(guān)，我們不希望受任何具體機理的約束。非?？赡艿兀締谓Y(jié)構(gòu)域多肽對由與血管生成過程無關(guān)的原因引起的癌癥是有效的。
據(jù)我們所知，本發(fā)明代表使用基于Fn3的多肽實現(xiàn)體內(nèi)治療作用首次成功的努力。在實現(xiàn)體內(nèi)有效性中作出的許多改進和發(fā)現(xiàn)，可以廣泛地適用于其它的基于Fn3的多肽。換句話說，盡管基于Fn3的多肽的配體結(jié)合性質(zhì)通常由相對小量的位于溶劑可到達的環(huán)區(qū)中的氨基酸決定，基于Fn3的多肽的其它特征，例如藥物動力學(xué)特征，傾向于由大多數(shù)特定蛋白決定，所述蛋白不直接參與配體結(jié)合，且在蛋白和蛋白之間是保守的，無論靶蛋白是什么。這已經(jīng)適用于抗體的情況，其中稱作CDR區(qū)的幾個環(huán)能介導(dǎo)抗原結(jié)合，而體內(nèi)抗體行為的其它特征主要由保守的構(gòu)架區(qū)和恒定結(jié)構(gòu)域決定。
“抑制”是指與未用多肽處理的對照樣品相比，現(xiàn)象的可測量的減少，該現(xiàn)象在本文中經(jīng)常用于指下述的任一項VEGF與VEGFR的相互作用，VEGF-或VEGFR-介導(dǎo)的血管生成，血管生成，血管生成的癥狀，含有VEGFR的細胞的存活率，VEGF-依賴性的Ba/F3細胞的存活率，或VEGF-或VEGFR-介導(dǎo)的細胞增殖。如果活性或相互作用的減少是至少10％，優(yōu)選地，20％，30％，40％，或50％，和更優(yōu)選地，60％，70％，80％，90％或更多，多肽會抑制VEGF-或VEGFR-2介導(dǎo)的活性。
“VEGF生物活性”是指通過任意的VEGF受體發(fā)揮作用、但特別是通過VEGFR-2受體進行信號傳遞的任何VEGF家族成員的任何功能。VEGF家族包括VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，和胎盤生長因子(PIGF)，以及各種可變剪接形式的VEGF，包括VEGF121，VEGF145，VEGF165，VEGF189，和VEGF206(Tischer等，J.Biol.Chem，26611947-11954，1991)。VEGFR家族的酪氨酸激酶受體包括VEGFR-1(也稱作Flt-1)，VEGFR-2(也稱作KDR(人形式)或Flk-1(小鼠形式))，和VEGFR-3(也稱作Flt-4)。VEGF配體能結(jié)合VEGF受體，以誘導(dǎo)，例如，血管生成，脈管生成，內(nèi)皮細胞增殖，血管舒張，和細胞遷移。VEGF配體也可以通過結(jié)合它們的相關(guān)受體，抑制細胞凋亡。認為VEGFR-2是主要參與血管生成的VEGFR。VEGFR-2或KDR-介導(dǎo)的生物活性是VEGFR-2或KDR顯著參與的任意的生物功能，所以VEGFR-2或KDR的拮抗會造成生物活性的可測量的減少。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定，可以測量VEGF和VEGFR的生物活性。實例包括配體結(jié)合測定和Scatchard圖分析；受體二聚測定；細胞磷酸化測定；酪氨酸激酶磷酸化測定(見例如Meyer等，Ann.N.Y.Acad.Sci.995200-207，2003)；內(nèi)皮細胞增殖測定例如BrdU標(biāo)記和細胞計數(shù)實驗；VEGF-依賴性的細胞增殖測定；和血管生成測定。用于測量血管生成的方法是標(biāo)準(zhǔn)的，且記載在，例如，Jain等(Nat.Rev.Cancer 2266-276，2002)。通過測量無分支的血管節(jié)段的數(shù)目(每單位面積的節(jié)段數(shù)目)，功能血管密度(每單位面積的灌注的血管的總長度)，血管直徑，血管通道的形成，或血管體積密度(每單位面積的基于每個節(jié)段的長度和直徑計算的總血管體積)，可以測定血管生成。VEGF-介導(dǎo)的增殖和血管生成的示例性的測定可以參見美國專利號6,559,126，Lyden等，Nature Medicine 71194(2001)，Jacob等，Exp.Pathol.151234(1978)和Bae等，J.Biol.Chem.27513588(2000)。使用純化的受體或配體或二者，可以進行這些測定，且可以體外或體內(nèi)地進行。使用遺傳導(dǎo)入的或天然產(chǎn)生的配體或受體或二者，也可以在細胞中進行這些測定。能抑制VEGF的生物活性的多肽，能使VEGF的生物活性降低至少10％，優(yōu)選地，20％，30％，40％，或50％，和更優(yōu)選地，60％，70％，80％，90％或更大的降低。通過IC50，也可以測量生物活性的抑制。優(yōu)選地，能抑制VEGF或VEGFR-2的生物活性的多肽，具有小于100nM、更優(yōu)選地小于10nM和最優(yōu)選地小于1nM的IC50。
2.多肽 本文所述的方法已經(jīng)成功地用于開發(fā)源自2組相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)的單結(jié)構(gòu)域VEGFR-2結(jié)合多肽具有免疫球蛋白折疊的那些蛋白和具有免疫球蛋白樣折疊的那些蛋白?！宥嚯摹迨侵溉我獾?個或多個氨基酸的序列，無論長度，翻譯后修飾或功能如何。“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換地使用。多肽可以包括天然的氨基酸和非天然的氨基酸，例如記載在美國專利號6,559,126中的那些，其在本文中引作參考。也可以通過眾多標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法之一來修飾多肽(例如，可以用保護基修飾氨基酸；可以在末端酰胺基中產(chǎn)生羧基-末端氨基酸；可以用部分修飾氨基-末端殘基，例如增強親脂性；或可以化學(xué)地糖基化或修飾多肽，以增加穩(wěn)定性或體內(nèi)半衰期)。多肽修飾可以包括另一個結(jié)構(gòu)(例如環(huán)狀化合物)或其它分子與多肽的結(jié)合，且也可以包括在改變的構(gòu)型(即，R或S；或，L或D)中含有一個或多個氨基酸的多肽。術(shù)語″單結(jié)構(gòu)域多肽″用于指，主題多肽的靶結(jié)合活性(例如，VEGFR-2結(jié)合活性)位于單結(jié)構(gòu)域中，以區(qū)別于例如抗體和單鏈抗體，其中抗原結(jié)合活性通常由重鏈可變域和輕鏈可變域賦予。預(yù)期可以連接許多本文所述類別的單結(jié)構(gòu)域多肽，以建立具有提高的抗體親抗原性的復(fù)合分子。同樣地，可以將單結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合(例如，作為融合蛋白)到任意數(shù)目的其它多肽上，例如熒光多肽，靶向多肽和具有不同的治療作用的多肽。
免疫球蛋白或免疫球蛋白樣支架的單結(jié)構(gòu)域多肽傾向于共有某些結(jié)構(gòu)特征。例如，多肽可以包含約80-約150個氨基酸，該氨基酸在結(jié)構(gòu)上組織成一套β或β樣鏈，形成β折疊，其中β或β樣鏈通過間插的環(huán)部分相連。重鏈可變域和10Fn3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)組織的實例如圖22所示。B折疊形成單結(jié)構(gòu)域多肽的穩(wěn)定核心，同時建立2個由連接β或β樣鏈的環(huán)組成的“面”。如本文所述，可以改變這些環(huán)，以建立定制的配體結(jié)合位點，并且，利用合適的控制，可以產(chǎn)生這樣的變化，而不破壞蛋白的總體穩(wěn)定性。在抗體中，這些環(huán)中的3個是眾所周知的互補性決定區(qū)(或″CDRs″)。
用于形成單結(jié)構(gòu)域多肽的支架應(yīng)當(dāng)在生理條件下是高度可溶的和穩(wěn)定的。免疫球蛋白支架的實例是單結(jié)構(gòu)域VH或VL支架，以及單結(jié)構(gòu)域camelid VHH結(jié)構(gòu)域(在camelid中發(fā)現(xiàn)的一種可變重結(jié)構(gòu)域)或天然地發(fā)現(xiàn)的或在實驗室中構(gòu)建的其它免疫球蛋白可變域。在本文公開的單結(jié)構(gòu)域形式中，為了實現(xiàn)結(jié)合活性，免疫球蛋白多肽不需要與第二個多肽形成二聚體。因此，可以改變所有這樣的天然地含有能介導(dǎo)與第二個蛋白的二硫鍵交聯(lián)的半胱氨酸的多肽，以消除半胱氨酸?；蛘?，可以保留半胱氨酸，用于將其它部分(例如PEG)綴合到單結(jié)構(gòu)域多肽上。
其它的支架可以是非抗體支架蛋白?！胺强贵w支架蛋白或結(jié)構(gòu)域”是指具有免疫球蛋白樣折疊的非抗體多肽。“免疫球蛋白樣折疊”是指約80-150個氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域，其包含2層反向平行的β-折疊，且其中2個β-折疊的扁平疏水面彼此相對地包裝。這樣的支架的一個實例是“基于纖連蛋白的支架蛋白”，它是指基于纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域(Fn3)的多肽。纖連蛋白是一種大蛋白，其在胞外基質(zhì)和細胞-細胞相互作用的形成中起重要作用；它構(gòu)成小結(jié)構(gòu)域的3種類型(I，II，和III型)的許多重復(fù)(Baron等，1991)。Fn3本身是大亞家族的范例，該大亞家族包括一部分細胞粘附分子，細胞表面激素和細胞因子受體，chaperoning，和碳水化合物-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。綜述見Bork & Doolittle，ProcNatl Acad Sci USA.1992 Oct 1；89(19)8990-4；Bork等，J Mol Biol.1994 Sep 30；242(4)309-20；Campbell & Spitzfaden，Structure.1994May 15；2(5)333-7；Harpez&Chothia，J Mol Biol.1994 May 13；238(4)528-39)。
優(yōu)選地，基于纖連蛋白的支架蛋白是“10Fn3”支架，它是指基于人纖連蛋白III型蛋白的第10個模塊的多肽變體，其中一個或多個溶劑可接近的環(huán)已經(jīng)被隨機化或突變，尤其是稱作BC環(huán)(氨基酸23-30)，DE環(huán)(氨基酸52-56)和FG環(huán)(氨基酸77-87)的3個環(huán)中的一個或多個(編號方案是基于人纖連蛋白的第10個III型結(jié)構(gòu)域的序列，氨基酸Val-Ser-Asp-Val-Pro代表氨基酸編號1-5)。人纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的野生型第10個模塊的氨基酸序列是VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO5)。因此，野生型BC環(huán)包含DAPAVTVR的序列；野生型DE環(huán)包含GSKST的序列；野生型FG環(huán)包含GRGDSPASSKP的序列。側(cè)翼于BC，DE，和FG環(huán)的序列也稱作構(gòu)架1，2，3，和4，例如，在表1-3中。
已經(jīng)鑒別出了許多改進的突變體10Fn3支架。修飾的Asp7，它被替換為不帶負電荷的氨基酸殘基(例如，Asn，Lys，等)。與野生型形式相比，這些突變都具有促進突變體10Fn3在中性pH的更大穩(wěn)定性的作用。已經(jīng)公開了10Fn3支架的許多有益的或中性的其它改變。見，例如，Batori等.Protein Eng.2002 Dec；15(12)1015-20；Koide等.，Biochemistry 2001 Aug 28；40(34)10326-33. 另外，在這里公開了10Fn3支架的幾種新的修飾。特別重要地，發(fā)現(xiàn)缺失野生型人10Fn3的前8個氨基酸，會導(dǎo)致大約提高3倍的VEGFR-2結(jié)合。因為前8個氨基酸傾向于折疊進鄰近BC，DE和FG環(huán)的位置，預(yù)期該突變也會提高在為結(jié)合不同的靶而選擇的其它10Fn3支架中的靶結(jié)合。因此，可以構(gòu)建編碼缺失前8個氨基酸的10Fn3支架的核酸文庫，并在該改進的文庫中進行篩選。
變體和野生型10Fn3蛋白的特征在于相同的結(jié)構(gòu)，即7個β-鏈結(jié)構(gòu)域序列(稱作A至G)和6個環(huán)區(qū)(AB環(huán)，BC環(huán)，CD環(huán)，DE環(huán)，EF環(huán)，和FG環(huán))，后者連接7個β-鏈結(jié)構(gòu)域序列，最接近N-和C-末端的β鏈在溶液中可以采取β樣構(gòu)象。在SEQ ID No5中，AB環(huán)對應(yīng)著殘基15-16，BC環(huán)對應(yīng)著殘基22-30，CD環(huán)對應(yīng)著殘基39-45，DE環(huán)對應(yīng)著殘基51-55，EF環(huán)對應(yīng)著殘基60-66，且FG環(huán)對應(yīng)著殘基76-87。如圖22所示，BC環(huán)，DE環(huán)，和FG環(huán)都位于多肽的相同末端。類似地，免疫球蛋白支架傾向于具有至少7個β或β樣鏈，經(jīng)常具有9個β或β樣鏈。
本文公開的單結(jié)構(gòu)域多肽可以具有至少5-7個分布在至少2個β折疊中的β或β樣鏈，和至少1個連接2個β或β樣鏈的環(huán)部分，該環(huán)部分參與結(jié)合VEGFR-2，尤其是KDR，結(jié)合特征在于小于1×10-6M，和優(yōu)選地小于1×10-8M的解離常數(shù)。如本文所述，對于抑制VEGF信號傳遞的體內(nèi)治療應(yīng)用，特別需要具有小于5×10-9M的解離常數(shù)的多肽。具有1×10-6M至5×10-9M之間的解離常數(shù)的多肽，可以用于離體或體內(nèi)檢測或標(biāo)記VEGFR-2蛋白。
任選地，相對于來自相同物種的其它有關(guān)蛋白，VEGFR-2結(jié)合蛋白能特異性地結(jié)合VEGFR-2?！疤禺愋缘亟Y(jié)合”是指能識別靶蛋白(例如，VEGFR-2)并與其相互作用的多肽，但是其基本上不能識別樣品(例如，生物樣品)中的其它分子并與其相互作用。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽能特異性地結(jié)合VEGFR，其KD至少緊密至500nM。優(yōu)選地，多肽能以1pM至500nM，更優(yōu)選地1pM至100nM，更優(yōu)選地1pM至10nM，和最優(yōu)選地，1pM至1nM或更低的KD特異性地結(jié)合VEGFR。
通常，篩選支架單結(jié)構(gòu)域多肽文庫，以鑒別能結(jié)合到選擇的靶上的特異性的多肽變體。這些文庫可以是，例如，噬菌體展示文庫，或PROfusionTM文庫。
在一個示例性的實施方案中，我們已經(jīng)開發(fā)了新的體外RNA-蛋白融合體展示技術(shù)，以分離能結(jié)合人(KDR)和小鼠(Flk-1)VEGFR-2的多肽，并抑制VEGF-依賴性的生物活性。這些多肽是從基于纖連蛋白的支架蛋白文庫(Koide等，JMB 2841141(1998))和VL結(jié)構(gòu)域文庫中鑒別出來，其中已經(jīng)通過用來自VH分子群體的CDR3結(jié)構(gòu)域交換，增加了CDR3的多樣性。10Fn3包含大約94個氨基酸殘基，如SEQ IDNO5所示。
另外，如上所述，也可以突變或去除10Fn3的N-末端的氨基酸序列。例如，在全長10Fn3中，或在具有1-8個N-末端氨基酸缺失或突變的10Fn3中，可以發(fā)生BC，DE，和FG環(huán)的隨機化。例如，在第8位的L可以突變成Q。隨機化以建立不同文庫后，基于纖連蛋白的支架蛋白可以用于篩選測定，以選擇對蛋白(在該情況下，VEGFR)具有高親合力的多肽(關(guān)于RNA-蛋白融合體技術(shù)和基于纖連蛋白的支架蛋白文庫篩選方法的詳細描述，見Szostak等，美國專利號6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT公開號WO00/34784；WO01/64942；WO 02/032925；和Roberts和Szostak，ProcNatl.Acad.Sci.9412297-12302，1997，在本文中引作參考)。
關(guān)于本文所述的初步選擇，隨機化在位置23-29，52-55和77-86處的10Fn3的3個區(qū)域，并用于針對人VEGFR-2的胞外結(jié)構(gòu)域(融合到人IgGlFc上的KDR的氨基酸1-764)的體外選擇。使用mRNA展示(RNA-蛋白融合體)和體外選擇，我們用大約10兆變體建立基于10Fn3的文庫。初步選擇鑒別出了具有中等親合力(KD＝10-200nM)的多肽，其能與VEGF競爭結(jié)合KDR(人VEGFR-2)。隨后，對來自初步選擇的單克隆(KD＝11-13nM)進行誘變和進一步選擇。該親合力成熟過程產(chǎn)生了新的VEGFR結(jié)合多肽，其解離常數(shù)為60pM至2nM。KDR結(jié)合劑顯示在表3中。另外，我們還分離了能結(jié)合Flk-1(小鼠KDR同源物)的多肽，其來自最初不具有可檢測的對Flk-1的結(jié)合親合力的KDR結(jié)合劑的誘變?nèi)后w，導(dǎo)致能表現(xiàn)出對人和小鼠VEGFR-2的雙特異性的多肽的分離。證實這些多肽能結(jié)合顯示出KDR或Flk-1胞外結(jié)構(gòu)域的細胞。在VEGF-依賴性的增殖測定中，它們也會抑制細胞生長。能結(jié)合KDR和Flk-1的多肽顯示在表2中，而優(yōu)選的KDR結(jié)合劑和KDR/Flk-1結(jié)合劑的選擇顯示在表1中。
使用在這些選擇中鑒別出的VEGFR-2結(jié)合多肽，我們確定了多肽與VEGFR-2的結(jié)合所需的FG環(huán)氨基酸共有序列。序列列在下面的SEQ ID NO1-4中。
可以單獨地(作為分離的肽)，作為10Fn3單結(jié)構(gòu)域多肽的一部分，作為全長纖連蛋白的一部分，(具有全長氨基末端或缺失的氨基末端)或其片段，在免疫球蛋白(尤其是單結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白)中，在具有免疫球蛋白樣折疊的另一種蛋白中，或在另一種無關(guān)的蛋白中，制備VEGFR-2結(jié)合多肽，例如SEQ ID NO1-4的那些。多肽也可以制成與異源蛋白的融合蛋白的一部分，該異源蛋白自身不會結(jié)合或有助于結(jié)合VEGFR。另外，本發(fā)明的多肽也可以融合到核酸上。多肽也可以工程化成單體、二聚體或多聚體。
優(yōu)選的共有的VEGFR-2結(jié)合肽的序列 SEQID NO1-(L/M)GXN(G/D)(H/R)EL(L/M)TP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替換的氨基酸] SEQ ID NO2-XERNGRXL(L/M/N)TP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替換的氨基酸] SEQ ID NO3-(D/E)GXNXRXXIP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替換的氨基酸] SEQ ID NO4-(D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)IP [X可以是任意的氨基酸；(/)代表相同位置的可替換的氨基酸] 優(yōu)選的VEGFR-2結(jié)合10Fn3多肽的序列 SEQ ID NO6 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTMGLYGHELLTPISINYRT SEQ ID NO7 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGENGQFLLVPISINYRT SEQ ID NO8 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTMGPNDNELLTPISINYRT SEQ ID NO9 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTAGWDDHELFIPISINYRT SEQ ID NO10 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTSGHNDHMLMIPISINYRT SEQ ID NO11 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTAGYNDQILMTPISINYRT SEQ ID NO12 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTFGLYGKELLIPISINYRT SEQ ID NO13 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTTGPNDRLLFVPISINYRT SEQ ID NO14 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDVYNDHEIKTPISINYRT SEQ ID NO15 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGKDGRVLLTPISINYRT SEQ ID NO16 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTEVHHDREIKTPISINYRT SEQ ID NO17 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTQAPNDRVLYTPISINYRT SEQ ID NO18 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTREENDHELLIPISINYRT SEQ ID NO19 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVTHNGHPLMTPISINYRT SEQ ID NO20 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLALKGHELLTPISINYRT SEQ ID NO21 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITGYAVTVAQNDHELITPISINYRT SEQ ID NO22 VSDVPRDL/QEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ PPAATISGLKPGVDYTITGYAVTMAQSGHELFTPISINYRT SEQ ID NO24 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNGRVLMTPISINYRT SEQ ID NO25 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNGRHLMTPISINYRT SEQ ID NO33 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLERNGRELMTPISINYRT SEQ ID NO45 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTEERNGRTLRTPISINYRT SEQ ID NO53 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNDRVLFTPISINYRT SEQ ID NO57 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNGRELMTPISINYRT SEQ ID NO62 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLERNGRELMVPISINYRT SEQ ID NO63 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGRNDRKLMVPISINYRT SEQ ID NO68 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGQNGRLLNVPISINYRT SEQ ID NO91 EVVAATPTSLLISWRHHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITGYAVTVHWNGRELMTPISINYRT SEQ ID NO92 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTEEWNGRVLMTPISINYRT SEQ ID NO93 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNGHTLMTPISINYRT SEQ ID NO94 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVEENGRQLMTPISINYRT SEQ ID NO95 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLERNGQVLFTPISINYRT SEQ ID NO96 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTVERNGQVLYTPISINYRT SEQ ID NO97 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTWGYKDHELLIPISINYRT SEQ ID NO98 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTLGRNDRELLTPISINYRT SEQ ID NO99 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITGYAVTDGPNDRLLNIPISINYRT SEQ ID NO100 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK 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VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP LATISGLKPGVDYTITG/VYAVTKERNGRELFTPISINYRT SEQ ID NO180 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQP TTATISGLKPGVDYTITGYAVTWERNGRELFTPISINYRT SEQ ID NO181 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQP TVATISGLKPGVDYTITGYAVTLERNDRELFTPISINYRT SEQ ID NO186 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ SEQ ID NO187 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ SEQ ID NO188 MVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ SEQ ID NO189 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTDGWNGRLLSIPISINYRT SEQ ID NO190 MGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT SEQ ID NO191 MVSDVPRDLEWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQ PPTATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT SEQ ID NO192(在本文中稱作CT-01的核心形式的多肽) EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT 上面的CT-01分子具有前8個氨基酸的缺失，且可以包括在N-或C-末端的其它氨基酸。例如，另一個MG序列可以位于N-末端。M通常會被剪切掉，剩下在N-末端的GEV...序列。在N-末端重新添加正常的8個氨基酸，也會生成具有需要的性質(zhì)的KDR結(jié)合蛋白。N-末端甲硫氨酸通常會被剪切，產(chǎn)生序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO193)。
本文公開的多肽可以被一個或多個保守取代修飾，尤其是在預(yù)期不與靶蛋白相互作用的蛋白部分。預(yù)期免疫球蛋白或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域中的多至5％，10％，20％或甚至30％或更多的氨基酸可以通過保守取代來改變，而不實質(zhì)上改變蛋白對靶的親合力。這樣的變化可能會改變多肽的體內(nèi)免疫原性，當(dāng)免疫原性會降低時，這樣的變化是需要的。如本文使用的，“保守取代”是物理上或功能上類似于對應(yīng)的參照殘基的殘基。也就是說，保守取代和它的參照殘基具有類似的大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵等的能力。優(yōu)選的保守取代是能滿足在Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure5345-352(1978 & Supp.)中為接受的點突變定義的標(biāo)準(zhǔn)的那些。保守取代的實例是下述組內(nèi)的取代(a)纈氨酸，甘氨酸；(b)甘氨酸，丙氨酸；(c)纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；(d)天冬氨酸，谷氨酸；(e)天冬酰胺，谷氨酰胺；(f)絲氨酸，蘇氨酸；(g)賴氨酸，精氨酸，甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸，酪氨酸。
也可以修飾本文公開的多肽，以提高效力，生物利用度，化學(xué)穩(wěn)定性，和/或功效。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，可以產(chǎn)生D-氨基酸肽，或反對映異構(gòu)肽序列，以提高多肽結(jié)構(gòu)的生物活性和化學(xué)穩(wěn)定性(見，例如，Juvvadi等，J.Am.Chem.Soc.1188989-8997，1996；Freidinger等，Science，210656-658，1980)。內(nèi)酰胺約束(見Freidinger，同上)，和/或作為二肽替代物的氮雜雙環(huán)烷氨基酸也可以用于提高天然肽的生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)(見，例如，Hanessian等，Tetrahedron 5312789-12854，1997)。
酰胺鍵替代物，例如硫代酰胺、仲胺和叔胺、雜環(huán)等(綜述見Spatola，A.F.in″Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins″Wenstein，B.Ed.Marcel Dekker，New York，1983 Vol.7，pp267-357)，也可以用于預(yù)防多肽主鏈的酶降解，從而導(dǎo)致提高的活性。線性多肽向環(huán)狀多肽類似物的轉(zhuǎn)化，也可以用于提高代謝穩(wěn)定性，因為環(huán)狀多肽對酶降解更不敏感(通常見，Veber，等Nature 29255-58，1981)。
使用封端為酯和酰胺的端基，也可以修飾多肽，以減慢或預(yù)防代謝和增強親脂性。通過各種連接物結(jié)合的肽的二聚體也可以增強活性和特異性(見例如Y.Shimohigashi等，in Peptide Chemistry 1988，Proceedings of the 26th Symposium on Peptide Chemistry，Tokyo，October 24-26，第47-50頁，1989)。關(guān)于多肽修飾的其它實例，例如非天然氨基酸，見美國專利號6,559,126。
為了體內(nèi)應(yīng)用，可以產(chǎn)生適用于聚乙二醇化的形式。例如，添加和表達包含半胱氨酸的C-末端尾，如下面關(guān)于缺少8個N-末端氨基酸的CT-01形式所示(EIDKPCQ添加在C-末端)。
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ(SEQ ID NO194)。將聚乙二醇化形式的該分子用于下述的體內(nèi)實驗中。也使用具有絲氨酸(而不是半胱氨酸)的對照形式 GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO195)。
相同的C-末端尾也可以添加到具有N-末端8個氨基酸的CT-01形式，例如SEQ ID NO193所示。分離了具有需要的KDR結(jié)合性質(zhì)的其它變體。下面的核心序列具有稍微不同的FG環(huán)，且可以與例如N-末端MG序列，能恢復(fù)8個缺失的氨基酸的N-末端序列，和/或C-末端尾一起表達，提供用于聚乙二醇化的半胱氨酸。
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO196)。
另一個這樣的變體具有核心序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO197)。
另外，通過類似的方法，分離了在VL構(gòu)架中的優(yōu)選的單結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白多肽，并公開在圖21中。
本發(fā)明還包括編碼任一種本文所述的多肽的核酸序列。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員能明白的，因為第三個堿基簡并，幾乎每個氨基酸都可以由編碼核苷酸序列中的超過一個三聯(lián)密碼子來代表。另外，微小的堿基對變化可以導(dǎo)致編碼的氨基酸序列的保守取代，但是預(yù)期不會實質(zhì)上改變基因產(chǎn)物的生物活性。因此，可以在序列中略微修飾編碼本文所述的多肽的核酸序列，且仍然編碼它各自的基因產(chǎn)物。
另外，本發(fā)明的多肽可以用作先導(dǎo)多肽，可以對其進一步突變和篩選得到能以甚至更高的親合力結(jié)合VEGFR的多肽。在一個實施例中，本文所述的多肽用作先導(dǎo)多肽，其被進一步突變或隨機化，以產(chǎn)生具有不同于先導(dǎo)多肽的氨基酸突變的多肽。進一步隨機化的多肽然后可以用于篩選如本文所述的能抑制VEGF生物活性的多肽(例如，結(jié)合VEGFR和阻斷VEGF與相同受體的結(jié)合)。
3.核酸和多肽的生產(chǎn) 使用本領(lǐng)域已知的任意的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在一個實施例中，通過將編碼多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入重組表達載體，并在能促進表達的條件下表達DNA序列，通過重組DNA方法生產(chǎn)多肽。編碼本文公開的CT-01多肽的核酸序列的實例是 SEQ ID NO184 atgggcgaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctggcgccacccgcacttcccgactagatattacaggat cacttacggagaaacaggaggaaatagccctgtccaggagttcactgtgcctctgcagccccccacagctaccatcagcgg ccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactgacggccggaacgggcgcctcctgagcatcccaatttcc attaattaccgcacagaaattgacaaaccatgccag SEQ ID NO185 Atgggcgaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctggcgccacccgcacttcccgactagatattacagga tcacttacggagaaacaggaggaaatagccctgtccaggagttcactgtgcctctgcagccccccacagctaccatcagcgg ccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactgacggccggaacgggcgcctcctgagcatcccaatttcc attaattaccgcaca 可以化學(xué)地合成編碼本文公開的各種多肽的核酸?？梢赃x擇密碼子選擇，以便提高在細胞中的表達。這樣的密碼子選擇取決于選擇的細胞類型。已經(jīng)為大腸桿菌和其它細菌，以及哺乳動物細胞，植物細胞，酵母細胞和昆蟲細胞開發(fā)了專門的密碼子選擇圖譜。見例如Mayfield等，Proc Natl Acad Sci USA.2003 Jan 21；100(2)438-42；Sinclair等.Protein Expr Purif.2002 Oct；26(1)96-105；Connell ND.Curr Opin Biotechnol.2001 Oct；12(5)446-9；Makrides等MicrobiolRev.1996 Sep；60(3)512-38；和Sharp等Yeast.1991 Oct；7(7)657-78。
關(guān)于核酸操縱的一般技術(shù)，記載在例如Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press，2ed.，1989，或F.Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(Green Publishing and Wiley-InterscienceNewYork，1987)和定期更新，在本文中引作參考。編碼多肽的DNA可操作地連接到合適的來自哺乳動物、病毒或昆蟲基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件上。這樣的調(diào)節(jié)元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子，任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列，編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列，和能控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。在宿主中復(fù)制的能力通常由復(fù)制起點來賦予，額外整合了用于促進轉(zhuǎn)化體的識別的選擇基因。
重組的DNA也可以包括任意類型的可以用于純化蛋白的蛋白標(biāo)志序列。蛋白標(biāo)志的實例包括但不限于組氨酸標(biāo)志，F(xiàn)LAG標(biāo)志，myc標(biāo)志，HA標(biāo)志，或GST標(biāo)志。用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的合適的克隆和表達載體，見Cloning VectorsA LaboratoryManual，(Elsevier，New York，1985)，其相關(guān)內(nèi)容在這里引作參考。
如本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白的，使用適合宿主細胞的方法，將表達構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞中。將核酸導(dǎo)入宿主細胞的許多方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，電穿孔；采用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微射彈轟擊；脂染；和感染(其中載體是感染劑)。
合適的宿主細胞包括原核生物，酵母，哺乳動物細胞，或細菌細胞。合適的細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如，大腸桿菌或芽孢桿菌種。酵母，優(yōu)選地來自糖酵母物種，例如啤酒糖酵母，也可以用于生產(chǎn)多肽。各種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達重組蛋白。Luckow和Summers綜述了用于在昆蟲細胞中生產(chǎn)異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)(Bio/Technology，647，1988)。合適的哺乳動物宿主細胞系的實例包括內(nèi)皮細胞，COS-7猴腎細胞，CV-1，L細胞，C127，3T3，中國倉鼠卵巢(CHO)，人胚腎細胞，HeLa，293，293T，和BHK細胞系。通過培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)來表達重組蛋白，制備了純化的多肽。對于許多應(yīng)用，本文公開的許多多肽的小尺寸使得在大腸桿菌中的表達成為優(yōu)選的表達方法。然后，從培養(yǎng)基或細胞提取物中純化蛋白。
使用細胞-翻譯系統(tǒng)，也可以生產(chǎn)本文公開的蛋白。為此，必須修飾編碼多肽的核酸，以允許進行生成mRNA的體外轉(zhuǎn)錄，并允許mRNA在使用的特定無細胞系統(tǒng)(真核生物的，例如哺乳動物或酵母無細胞翻譯系統(tǒng)或原核生物的，例如細菌無細胞翻譯系統(tǒng))中的無細胞翻譯。
通過化學(xué)合成(例如，通過Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，IL所述的方法)，也可以生產(chǎn)VEGFR-結(jié)合多肽。通過化學(xué)合成，也可以產(chǎn)生對蛋白的修飾。
通過蛋白化學(xué)領(lǐng)域普遍知道的蛋白分離/純化方法，可以純化本發(fā)明的多肽。非限制性的實例包括萃取，重結(jié)晶，鹽析(例如，用硫酸銨或硫酸鈉)，離心，滲析，超濾，吸附色譜，離子交換色譜，疏水色譜，正常相色譜，反相色譜，凝膠過濾，凝膠滲透色譜，親合色譜，電泳，逆流分布或它們的任意組合。純化后，多肽可以交換進不同的緩沖液中，和/或通過本領(lǐng)域已知的眾多方法中的任一種進行濃縮，包括但不限于，過濾和滲析。
純化的多肽優(yōu)選地至少85％純，更優(yōu)選地至少95％純，最優(yōu)選地至少98％純。無論純度的準(zhǔn)確數(shù)值，多肽對于用作藥物產(chǎn)品足夠純。
4.多肽的翻譯后修飾 在某些實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽還可以包含翻譯后修飾。示例性的翻譯后蛋白修飾包括磷酸化，乙?；?，甲基化，ADP-核糖基化，遍在蛋白化，糖基化，羰基化，蘇素化，生物素化或多肽側(cè)鏈或疏水基的添加。結(jié)果，修飾的可溶多肽可以含有非-氨基酸元件，例如脂類，多糖或單糖，和磷酸鹽。糖基化的優(yōu)選形式是唾液酸化，其能將一個或多個唾液酸部分綴合到多肽上。唾液酸部分能提高溶解度和血清半衰期，同時還減少蛋白的可能的免疫原性。見，例如，Raju等Biochemistry.2001 Jul 31；40(30)8868-76?？梢詼y試這樣的非-氨基酸元件對多肽功能性的作用，以確定其在VEGFR-2或VEGF功能中的拮抗作用，例如，它對血管生成或腫瘤生長的抑制作用。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，修飾形式的主題可溶多肽包含，將主題可溶多肽連接到非蛋白的聚合物上。在一個具體的實施方案中，聚合物是聚乙二醇(″PEG″)，聚丙二醇，或聚氧化烯，其方式如美國專利號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。本發(fā)明的修飾的多肽的實例包括聚乙二醇化的M5FL和聚乙二醇化的CT-01。
PEG是眾所周知的水溶性的聚合物，其可以在市場上買到，或可以根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，通過乙二醇的開環(huán)聚合制備(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，第138-161頁)。術(shù)語″PEG″廣泛地用于包括任何聚乙二醇分子，不考慮大小或在PEG末端的修飾，且可以由下式表示 X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH(1)，其中n是20-2300，且X是H或末端修飾，例如，C1-4烷基。在一個實施方案中，本發(fā)明的PEG終止于羥基或甲氧基，即，X是H或CH3(″甲氧基PEG″)。PEG可以含有結(jié)合反應(yīng)必需的其它化學(xué)部分；其源自分子的化學(xué)合成；或其是分子各部分的最佳距離的隔離物。另外，這樣的PEG可以由連接到一起的一個或多個PEG側(cè)鏈組成。具有超過一個PEG鏈的PEG稱作多臂的或分支的PEG。通過例如將聚環(huán)氧乙烷添加到各種多元醇，包括甘油，季戊四醇，和山梨醇，可以制備分支的PEG。例如，從季戊四醇和環(huán)氧乙烷，可以制備出的4臂分支PEG。分支的PEG記載在，例如，EP-A0 473 084和美國專利號5,932,462。一種形式的PEG包括2個PEG側(cè)鏈(PEG2)，它們通過賴氨酸的伯氨基相連(Monfardini，C.，等，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。
盡管PEG是眾所周知的，據(jù)我們所知，這是首次證實聚乙二醇化的10Fn3多肽可以被聚乙二醇化，并保留配體結(jié)合活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過定點聚乙二醇化，尤其是通過將PEG綴合到N-或C-末端的半胱氨酸部分上，生產(chǎn)了聚乙二醇化的10Fn3多肽。因此，本發(fā)明提供了具有改進的藥物動力學(xué)性質(zhì)的靶結(jié)合10Fn3多肽，該多肽包含具有約80至約150個氨基酸的10Fn3結(jié)構(gòu)域，其中所述10Fn3結(jié)構(gòu)域的至少一個環(huán)參與靶結(jié)合；和共價地結(jié)合的PEG部分，其中所述的10Fn3多肽能以小于100nM的KD結(jié)合靶，并具有在哺乳動物中小于30mL/hr/kg的清除速度。通過定點聚乙二醇化，例如通過向Cys殘基的結(jié)合，其中Cys殘基可以位于10Fn3多肽的N末端或N-末端和大多數(shù)N-末端β或β樣鏈之間，或10Fn3多肽的C-末端或C-端和大多數(shù)C-末端β或β樣鏈之間，PEG部分可以結(jié)合到10Fn3多肽上。Cys殘基也可以位于其它位置，尤其是不參與靶結(jié)合的任意環(huán)。PEG部分也可以通過其它化學(xué)方法結(jié)合，包括通過綴合到胺上。
PEG向肽或蛋白的綴合通常包含PEG的活化和活化的PEG-中間體直接向靶蛋白/肽或連接物的偶聯(lián)，后者隨后被活化，并偶聯(lián)到靶蛋白/肽(見Abuchowski，A.等，J.Biol.Chem.，252，3571(1977)和J.Biol.Chem.，252，3582(1977)，Zalipsky，等，和Harris等，inPoly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications；(J.M.Harris ed.)Plenum PressNew York，1992；Chap.21和22)。應(yīng)當(dāng)指出，含有PEG分子的結(jié)合多肽也稱作綴合的蛋白，而缺少結(jié)合的PEG分子的蛋白可以稱作未綴合的蛋白。
可以選擇許多分子量形式的PEG，例如，從約1,000道爾頓(Da)至100,000Da(n是20至2300)，用于綴合VEGFR-2結(jié)合多肽。PEG中的重復(fù)單元的數(shù)目″n″接近以道爾頓計的分子量。優(yōu)選地，活化的連接物上的PEG的組合分子量適用于藥物用途。因而，在一個實施方案中，PEG分子的分子量不超過100,000Da。例如，如果將3個PEG分子結(jié)合到連接物上，其中每個PEG分子具有相同的分子量12,000Da(每個n是約270)，則連接物上的PEG的總分子量是約36,000Da(總n是約820)。結(jié)合到連接物上的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在連接物上的3個分子中，2個PEG分子可以各自是5,000Da(每個n是約110)，1個PEG分子可以是12,000Da(n是約270)。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，VEGFR-2結(jié)合多肽共價地連接到一個下式的聚(乙二醇)基團上-CO-(CH2)x(OCH2CH2)m-OR，聚(乙二醇)基團的-CO(即羰基)與結(jié)合多肽的氨基之一形成酰胺鍵；R是低級烷基；x是2或3；m是約450-約950；且選擇n和m，使綴合物減去結(jié)合多肽的分子量是約10至40kDa。在一個實施方案中，賴氨酸的結(jié)合多肽的ε-氨基是可得到的(游離)氨基。
上面的綴合物可以更具體地表示為式(II)P-NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR(II)，其中P是如本文所述的結(jié)合多肽的基團，(即沒有能與式(II)所示的羰基形成酰胺鍵的一個或多個氨基；且其中R是低級烷基；x是2或3；m是約450至約950，并且經(jīng)過選擇使得綴合物減去結(jié)合多肽的分子量是約10至40kDa。如本文使用的，給定范圍的“m”具有定向含義。通過PEG部分的分子量，能在任何情況下準(zhǔn)確地確定“m”的范圍。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇合適的PEG分子量，例如，基于如何在治療上使用聚乙二醇化的結(jié)合多肽，需要的劑量，循環(huán)時間，對蛋白水解的抗性，免疫原性，和其它考慮。關(guān)于PEG的討論和它的增強蛋白性質(zhì)的應(yīng)用，見N.V.Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 1091-114(1993)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可以活化PEG分子，以與結(jié)合多肽上的氨基反應(yīng)，例如賴氨酸(Bencham C.O.等，Anal.Biochem.，131，25(1983)；Veronese，F(xiàn).M.等，Appl.Biochem.，11，141(1985)；Zalipsky，S.等，Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，adrs 9-110ACS Symposium Series 469(1999)；Zalipsky，S.等，Europ.Polym.J.，19，1177-1183(1983)；Delgado，C.等，Biotechnology and AppliedBiochemistry，12，119-128(1990))。
在一個具體的實施方案中，PEG的碳酸酯用于形成PEG-結(jié)合多肽綴合物。N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)可以用在與PEG的反應(yīng)中，形成有活性的混合的PEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯，其可以隨后與連接物的親核基團或結(jié)合多肽的氨基反應(yīng)(見美國專利號5,281,698和美國專利號5,932,462)。在類似類型的反應(yīng)中，1，1′-(二苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡啶基)碳酸酯可以與PEG反應(yīng)，分別形成PEG-苯并三唑基和PEG-吡啶基混合的碳酸酯(美國專利號5,382,657)。
根據(jù)本領(lǐng)域發(fā)展水平的方法，例如通過結(jié)合多肽與親電活性的PEGs(供應(yīng)商Shearwater Corp.，USA，www.shearwatercorp.com)的反應(yīng)，可以進行10Fn3多肽的聚乙二醇化。優(yōu)選的本發(fā)明的PEG試劑是，例如，N-羥基琥珀酰亞胺基丙酸酯(PEG-SPA)，丁酸酯(PEG-SBA)，PEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯或分支的N-羥基琥珀酰亞胺例如mPEG2-NHS(Monfardini，C.，等，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。這樣的方法可以用于聚乙二醇化結(jié)合多肽賴氨酸的ε-氨基或結(jié)合多肽的N-末端氨基。
在另一個實施方案中，PEG分子可以偶聯(lián)到結(jié)合多肽的巰基上(Sartore，L.，等，Appl.Biochem.Biotechnol.，27，45(1991)；Morpurgo等，Biocon.Chem.，7,363-368(1996)；Goodson等，Bio/Technology(1990)8，343；美國專利號5,766,897)。美國專利號6,610,281和5,766,897描述了可以偶聯(lián)到巰基上的示例性的反應(yīng)性PEG物質(zhì)。
在一些將PEG分子綴合到結(jié)合多肽的半胱氨酸殘基上的實施方案中，半胱氨酸殘基對結(jié)合多肽是天然的，而在其它的實施方案中，將一個或多個半胱氨酸殘基工程化進結(jié)合多肽中?？梢詫⑼蛔儗?dǎo)入結(jié)合多肽編碼序列，以產(chǎn)生半胱氨酸殘基。這可以通過例如將一個或多個氨基酸殘基突變成半胱氨酸來實現(xiàn)。優(yōu)選的用于突變成半胱氨酸殘基的氨基酸包括絲氨酸，蘇氨酸，丙氨酸和其它的親水殘基。優(yōu)選地，要突變成半胱氨酸的殘基是表面-暴露的殘基。本領(lǐng)域眾所周知基于一級序列或蛋白預(yù)測殘基的表面可達性的算法?；蛘?，在給定構(gòu)架的晶體結(jié)構(gòu)下，基于該構(gòu)架設(shè)計結(jié)合多肽，通過對比結(jié)合多肽的氨基酸序列，可以預(yù)測表面殘基，并已經(jīng)解決了進化(見Himanen等，Nature.(2001)20-27；414(6866)933-8)，從而鑒別出了表面-暴露的殘基。在一個實施方案中，將半胱氨酸殘基導(dǎo)入結(jié)合多肽的N-和/或C-末端或附近，或環(huán)區(qū)域內(nèi)。
在一些實施方案中，聚乙二醇化的結(jié)合多肽包含共價地結(jié)合到N-末端氨基酸的α氨基上的PEG分子。位點特異性的N-末端還原胺化記載在Pepinsky等，(2001)JPET，297，1059，和美國專利號5,824,784。PEG-醛在使用其它可得到的親核氨基的蛋白還原氨基化中的應(yīng)用，記載在美國專利號4,002,531，Wieder等，(1979)J.Biol.Chem.254，12579，和Chamow等，(1994)Bioconjugate Chem.5，133。
在另一個實施方案中，聚乙二醇化的結(jié)合多肽包含一個或多個PEG分子，其共價地結(jié)合到連接物上，后者又結(jié)合到在結(jié)合多肽的N-末端處的氨基酸殘基的α氨基。這樣的方案公開在美國專利公開號2002/0044921和WO94/01451。
在一個實施方案中，結(jié)合多肽在C-末端被聚乙二醇化。在一個具體的實施方案中，通過導(dǎo)入C-末端疊氮基-甲硫氨酸，并隨后通過Staudinger反應(yīng)綴合甲基-PEG-三芳基膦化合物，在C-末端聚乙二醇化蛋白。該C-末端綴合方法記載在Cazalis等，C-Terminal Site-SpecificPEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention ofFull Bioactivity，Bioconjug Chem.2004；15(5)1005-1009。
根據(jù)WO 94/01451描述的一般方法，也可以生產(chǎn)單聚乙二醇化的結(jié)合多肽。WO 94/01451描述了制備具有修飾的末端氨基酸α-碳反應(yīng)部分的重組多肽的方法。該方法的步驟包含，形成重組多肽，和用一個或多個在N-末端α-胺和C-末端α-羧基生物地添加的保護基保護它。然后，可以使多肽與化學(xué)保護劑反應(yīng)，以選擇性地保護反應(yīng)側(cè)鏈基團，從而預(yù)防側(cè)鏈基團被修飾。然后，用對生物保護基特異性的剪切試劑剪切多肽，形成未保護的末端氨基酸α-碳反應(yīng)基團。未保護的末端氨基酸α-碳反應(yīng)部分被化學(xué)修飾劑修飾。然后，在側(cè)鏈基團去保護側(cè)鏈保護的末端修飾的單拷貝多肽，形成末端修飾的重組單拷貝多肽?？梢愿淖冊摲椒ㄖ械牟襟E的數(shù)目和次序，以達到多肽的N-和/或C-末端氨基酸的選擇性修飾。
綴合反應(yīng)中結(jié)合多肽與活化的PEG的比例可以是約1∶0.5至1∶50，約1∶1至1∶30，或約1∶5至1∶15。在本方法中可以使用各種水性緩沖液，以催化PEG向結(jié)合多肽的共價添加。在一個實施方案中，使用的緩沖液的pH是約7.0至9.0。在另一個實施方案中，pH是在略微堿性的范圍，例如約7.5至8.5。可以使用具有接近中性pH范圍的pKa的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液。
本領(lǐng)域已知的常規(guī)分離和純化技術(shù)可以用于純化聚乙二醇化的結(jié)合多肽，例如尺寸排阻(例如凝膠過濾)和離子交換色譜。使用SDS-PAGE，也可以分離產(chǎn)物?？梢苑蛛x的產(chǎn)物包括單-，二-，三-，多-和未-聚乙二醇化的結(jié)合多肽，以及游離的PEG。通過匯合洗脫峰周圍的更寬范圍的級分，提高單-PEG在組合物中的百分比，可以控制單-PEG綴合物的百分比。約90％單-PEG綴合物代表產(chǎn)量和活性的良好平衡?？赡苄枰缰辽?2％或至少96％綴合物是單-PEG物質(zhì)的組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，單-PEG綴合物的百分比是90％-96％。
在一個實施方案中，本發(fā)明的聚乙二醇化的結(jié)合多肽含有1個、2個或多個PEG部分。在一個實施方案中，PEG部分結(jié)合到氨基酸殘基上，后者在蛋白表面上，和/或遠離接觸靶配體的表面。在一個實施方案中，PEG-結(jié)合多肽中的PEG的合并的或總的分子量是約3,000Da至60,000Da，任選地約10,000Da至36,000Da。在一個實施方案中，聚乙二醇化的結(jié)合多肽中的PEG基本上是線性的直鏈PEG。
在本發(fā)明的一個實施方案中，使用羥胺測定，例如，450mM羥胺(pH 6.5)，在室溫經(jīng)8-16小時，聚乙二醇化的結(jié)合多肽中的PEG未從聚乙二醇化的氨基酸殘基水解，因而是穩(wěn)定的。在一個實施方案中，超過80％的組合物是穩(wěn)定的單-PEG-結(jié)合多肽，更優(yōu)選地至少90％，和最優(yōu)選地至少95％。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的聚乙二醇化的結(jié)合多肽優(yōu)選地保留至少25％，50％，60％，70％，至少80％，85％，90％，95％或100％與未修飾的蛋白有關(guān)的生物活性。在一個實施方案中，生物活性指它的結(jié)合VEGFR-2的能力，如通過KD，Kon或koff所確定的。在一個具體的實施方案中，與未聚乙二醇化的結(jié)合多肽相比，聚乙二醇化的結(jié)合多肽蛋白表現(xiàn)出增強的與VEGFR的結(jié)合。
與未修飾的結(jié)合多肽的清除速度相比，PEG-修飾的多肽的血清清除速度可以降低約10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或甚至90％。PEG-修飾的多肽可以具有比未修飾的蛋白的半衰期增強的半衰期(t1/2)。與未修飾的結(jié)合多肽的半衰期相比，PEG-結(jié)合多肽的半衰期可以增加了至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，125％，150％，175％，200％，250％，300％，400％或500％，或甚至1000％。在一些實施方案中，體外地測定蛋白半衰期，例如在緩沖鹽水溶液中或在血清中。在其它的實施方案中，蛋白半衰期是體內(nèi)半衰期，例如蛋白在動物的血清或其它體液中的半衰期。
5.治療制劑和施用方式 本發(fā)明表征了治療狀況或預(yù)防前狀況的方法，其對VEGF生物活性的抑制作出響應(yīng)。優(yōu)選的實例是特征在于不適當(dāng)?shù)难苌傻臓顩r。施用的技術(shù)和劑量隨特定多肽的類型和待治療的特定狀況而變化，但是可以由熟練的技術(shù)人員容易地決定。通常，管理機構(gòu)要求配制要用作治療劑的蛋白試劑，以便具有可接受的低水平的熱原。因此，治療制劑通?？梢詤^(qū)別于其它制劑，因為它們基本上沒有熱原，或至少含有不超過可接受水平的熱原，如由適當(dāng)?shù)墓芾頇C構(gòu)(例如，F(xiàn)DA)確定的。
本發(fā)明的治療組合物可以與在單位劑型中的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起施用。施用可以是腸胃外的(例如，靜脈內(nèi)的，皮下的)，經(jīng)口服的，或局部的，作為非限制性的實例。另外，使用編碼本發(fā)明的多肽的核酸，可以使用所有的基因治療技術(shù)，例如裸DNA送遞，重組基因和載體，基于細胞的送遞，包括患者細胞的離體操縱等。
組合物可以是用于經(jīng)口服施用的丸劑，片劑，膠囊，液體，或持續(xù)釋放片劑形式；或用于靜脈內(nèi)的，皮下的或腸胃外的施用的液體；凝膠，洗劑，軟膏，乳劑，或聚合物或用于局部施用的其它持續(xù)釋放載體。
用于制備制劑的本領(lǐng)域眾所周知的方法見，例如，″RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy″(20th ed.，ed.A.R.Gennaro AR.，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)。用于腸胃外施用的制劑可以，例如，含有賦形劑，無菌水，鹽水，聚亞烷基二醇例如聚乙二醇，植物來源的油，或氫化萘。生物相容的，可生物降解的交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物可以用于控制化合物的釋放。納米顆粒制劑(例如，可生物降解的納米顆粒，固體液體納米顆粒，脂質(zhì)體)可以用于控制化合物的生物分布。其它潛在有用的腸胃外送遞系統(tǒng)包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒，滲透泵，可植入的輸注系統(tǒng)，和脂質(zhì)體。制劑中的化合物濃度隨許多因素而變化，包括要施用的藥物的劑量，和施用途徑。
任選地，多肽可以作為藥學(xué)上可接受的鹽來施用，例如無毒的酸加成鹽或金屬復(fù)合物，其經(jīng)常用于制藥工業(yè)中。酸加成鹽的實例包括有機酸例如醋酸，乳酸，pamoic acid，馬來酸，檸檬酸，蘋果酸，抗壞血酸，琥珀酸，苯甲酸，棕櫚酸，辛二酸，水楊酸，酒石酸，甲磺酸，甲苯磺酸，或三氟乙酸等；聚合酸例如丹寧酸，羧甲基纖維素，等；和無機酸例如鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，等。金屬復(fù)合物包括鋅，鐵，等。在一個實施例中，在有醋酸鈉存在下配制多肽，以提高熱穩(wěn)定性。
用于經(jīng)口服使用的制劑包括含有與無毒的藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合的活性成分的片劑。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖和山梨醇)，潤滑劑，助流劑，和抗粘劑(例如，硬脂酸鎂，硬脂酸鋅，硬脂酸，硅石，氫化植物油，或滑石)。
用于經(jīng)口服使用的制劑也可以提供為咀嚼片劑，或作為硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固體稀釋劑相混合，或作為軟明膠膠囊，其中活性成分與水或油介質(zhì)相混合。
治療上有效的劑量指能生成施用的治療作用的劑量。準(zhǔn)確劑量取決于要治療的病癥，本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知的技術(shù)可以確定。通常，以每天約0.01μg/kg-約50mg/kg，優(yōu)選地每天0.01mg/kg-約30mg/kg，最優(yōu)選地每天0.1mg/kg-約20mg/kg，施用多肽?？梢悦刻?例如，每天1次，2次，3次，或4次)或更低頻率地(例如，每隔1天1次，每周1次或2次，或每月)施用多肽.另外，如本領(lǐng)域已知的，針對年齡以及體重、總體健康、性別、飲食、施用時間、藥物相互作用和疾病的嚴重性的調(diào)節(jié)可能是必需的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用常規(guī)實驗可以確定。
6.示例性應(yīng)用 本文所述的VEGFR-2結(jié)合蛋白和它們的有關(guān)變體可以用于許多治療和診斷用途。它們包括通過競爭或阻斷與VEGFR-2的結(jié)合，以及細胞毒性或成像部分向細胞、優(yōu)選能表達VEGFR-2的細胞的送遞，抑制VEGF的生物活性。
關(guān)于藥物的生成、從身體迅速清除，這些分子的小尺寸和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)是特別有價值的，對于需要迅速清除或配制進新的送遞系統(tǒng)中的某些用途，使用具有這樣的特征的分子是合適的或提高的。
根據(jù)它們作為VEGF生物活性的抑制劑的效力，本發(fā)明的多肽對與不適當(dāng)?shù)难苌捎嘘P(guān)的許多狀況是有效的，包括但不限于自身免疫病癥(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸病或銀屑病)；心臟病癥(例如，動脈粥樣硬化或血管再狹窄)；視網(wǎng)膜病(例如，增殖性視網(wǎng)膜病，通常，糖尿病視網(wǎng)膜病，與年齡相關(guān)的黃斑退行性改變或新生血管性青光眼)，腎病(例如，糖尿病性腎病，惡性腎硬化，血栓性微血管病綜合征；移植排斥；炎性腎??；腎小球腎炎；膜增生性腎小球腎炎；溶血的-尿毒癥綜合征；和高血壓腎硬化)；成血管細胞瘤；血管瘤；甲狀腺增生；組織移植；慢性炎癥；梅格斯綜合征；心包積液；胸腔積液；自身免疫??；糖尿病；子宮內(nèi)膜異位；慢性哮喘；不希望的纖維變性(尤其是肝纖維變性)和癌癥，以及源自癌癥的并發(fā)癥，例如胸腔積液和腹水。優(yōu)選地，本發(fā)明的VEGFR-結(jié)合多肽可以用于治療或預(yù)防過度增殖性疾病或癌癥和癌癥的轉(zhuǎn)移擴散。癌癥的非限制性的實例包括膀胱，血液，骨，腦，乳腺，軟骨，結(jié)腸，腎，肝，肺，淋巴結(jié)，神經(jīng)組織，卵巢，胰腺，前列腺，骨骼肌，皮膚，脊髓，脾，胃，睪丸，胸腺，甲狀腺，氣管，生殖泌尿道，輸尿管，尿道，子宮或陰道癌。其它可治療的狀況見美國專利號6,524，583，在本文中引作參考。描述VEGFR-2結(jié)合多肽的用途的其它文獻包括McLeod DS等，Invest Ophthalmol VisSci.2002Feb；43(2)474-82；Watanabe等Exp Dermatol.2004 Nov；13(11)671-81；Yoshiji H等，Gut.2003 Sep；52(9)1347-54；Verheul等，Oncologist.2000；5 Suppl 145-50；Boldicke等，Stem Cell.2001；19(1)24-36。
如本文所述，血管生成相關(guān)的疾病包括但不限于，血管生成依賴性的癌癥，包括，例如，實體瘤，血液傳播瘤例如白血病，和腫瘤轉(zhuǎn)移；良性瘤，例如血管瘤，聽神經(jīng)瘤，神經(jīng)纖維瘤，沙眼，和膿性肉芽腫；炎性病癥例如免疫和非免疫炎癥；慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病和銀屑??；眼血管生成病，例如，糖尿病視網(wǎng)膜病，早發(fā)視網(wǎng)膜病，黃斑變性，角膜移植物排斥，新生血管性青光眼，晶狀體后纖維組織增生癥，潮紅；Osler-Webber綜合征；心肌血管生成；斑塊新血管形成；毛細血管擴張；血友病關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；和傷口顆粒化和傷口愈合；毛細血管擴張銀屑病硬皮病，膿性肉芽腫，冠狀動脈側(cè)枝形成，缺血性四肢血管生成，角膜病，潮紅，關(guān)節(jié)炎，糖尿病性新血管形成，骨折，血管發(fā)生，血細胞生成。
可以單獨地或與一種或多種其它療法組合地施用VEGFR-2結(jié)合多肽，例如化療，放療，免疫療法，外科手術(shù)，或它們的任意組合。長期治療同樣是可能的，如同在如上所述的其它治療方案上下文中的佐劑療法。
在這樣的方法的某些實施方案中，可以一起(同時)或在不同的時間(序貫)施用一種或多種多肽治療劑。另外，可以與用于治療癌癥或抑制血管生成的另一種類型的化合物一起施用多肽治療劑。
在某些實施方案中，可以單獨使用本發(fā)明的主題治療劑。或者，可以將主題試劑與旨在治療或預(yù)防增殖性病癥(例如，腫瘤)的其它常規(guī)抗癌治療方案組合使用。例如，這樣的方法可以用于預(yù)防性癌癥預(yù)防，手術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)防，和用作其它常規(guī)癌癥療法的佐劑。本文發(fā)明認為，通過使用主題多肽治療劑，可以增強常規(guī)癌癥療法(例如，化療，放療，光療，免疫療法，和手術(shù))的有效性。
已經(jīng)證實許多種類的常規(guī)化合物具有抗腫瘤活性。這些化合物已經(jīng)用作化療中的藥物，以縮小實體瘤，預(yù)防轉(zhuǎn)移和進一步生長，或減少白血病或骨髓惡性腫瘤中的惡性細胞的數(shù)目。盡管化療已經(jīng)有效地用于治療各種類型的惡性腫瘤，許多抗腫瘤化合物會誘導(dǎo)不希望的副作用。已經(jīng)證實，當(dāng)組合2種或多種不同的治療時，治療可以協(xié)同作用，并允許減少每種治療的劑量，從而減少更高劑量的每種化合物產(chǎn)生的有害副作用。在其它的情況下，難以治療的惡性腫瘤可以對2種或多種不同治療的聯(lián)合治療作出反應(yīng)。
當(dāng)與另一種常規(guī)抗腫瘤劑伴隨地或序貫地組合施用本發(fā)明的多肽治療劑時，會發(fā)現(xiàn)這樣的治療劑能增強抗腫瘤劑的治療作用，或克服對這樣的抗腫瘤劑的細胞抗性。這允許減少抗腫瘤劑的劑量，從而減少不希望的副作用，或恢復(fù)抗腫瘤劑在抗性細胞中的有效性。
可以用于聯(lián)合抗腫瘤療法的藥物化合物包括，僅僅示例氨魯米特，安吖啶，阿那曲唑，天冬酰胺酶，卡介苗，比卡魯胺，博來霉素，布舍瑞林，白消安，喜樹堿，卡培他濱，卡鉑，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，順鉑，克拉屈濱，氯膦酸鹽，秋水仙堿，環(huán)磷酰胺，環(huán)丙孕酮，阿糖胞苷，達卡巴嗪，放線菌素D，柔紅霉素，己二烯雌酚，己烯雌酚，多西他賽，多柔比星，表柔比星，雌二醇，雌莫司汀，依托泊苷，依西美坦，非格司亭，氟達拉濱，氟氫可的松，氟尿嘧啶，氟甲睪酮，氟他胺，吉西他濱，染料木黃酮，戈舍瑞林，羥基脲，伊達比星，異環(huán)磷酰胺，imatinib，干擾素，伊立替康，ironotecan，來曲唑，亞葉酸鈣，醋酸亮丙瑞林，左旋咪唑，洛莫司汀，氮芥，甲羥孕酮，甲地孕酮，美法侖，巰嘌呤，美司鈉，甲氨蝶呤，絲裂霉素，米托坦，米托蒽醌，尼魯米特，諾考達唑，奧曲肽，奧沙利鉑，紫杉醇，氨羥二磷酸二鈉，噴司他丁，普卡霉素，卟菲爾鈉，丙卡巴肼，雷替曲塞，利妥昔單抗，鏈佐星，蘇拉明，他莫昔芬，替莫唑胺，替尼泊苷，睪酮，硫鳥嘌呤，塞替派，二氯環(huán)戊二烯鈦，托泊替康，曲妥單抗，維甲酸，長春堿，長春新堿，長春地辛，和長春瑞濱。
根據(jù)它們的作用機理，可以將某些化療抗腫瘤化合物分類成，例如，下面的組抗-代謝產(chǎn)物/抗癌劑，例如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶，氟尿苷，卡培他濱，吉西他濱和阿糖胞苷)和嘌呤類似物，葉酸鹽拮抗劑和有關(guān)的抑制劑(巰嘌呤，硫鳥嘌呤，噴司他丁和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱))；抗增殖的/抗有絲分裂的試劑，包括天然產(chǎn)物例如長春花堿(長春堿，長春新堿，和長春瑞濱)，微管破壞劑例如紫杉烷(紫杉醇，多西他賽)，新長春堿，長春堿，諾考達唑，epothilones和長春瑞濱，epidipodophyllotoxins(依托泊苷，替尼泊苷)，DNA損傷劑(放射菌素，安吖啶，蒽環(huán)類抗生素，博來霉素，白消安，喜樹堿，卡鉑，苯丁酸氮芥，順鉑，環(huán)磷酰胺，環(huán)磷酰胺，放線菌素D，柔紅霉素，多柔比星，表柔比星，六甲蜜胺，奧沙利鉑，異環(huán)磷酰胺，美法侖，merchlorehtamine，絲裂霉素，米托蒽醌，亞硝基脲，普卡霉素，丙卡巴肼，紫杉醇，泰索帝，替尼泊苷，三亞乙基硫化磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素例如放線菌素D(放射菌素D)，柔紅霉素，多柔比星(阿霉素)，伊達比星，蒽環(huán)類抗生素，米托蒽醌，博來霉素，普卡霉素(普卡霉素)和絲裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其能全身地代謝L-天冬酰胺和除去不具有自己合成天冬酰胺能力的細胞)；抗血小板試劑；抗增殖的/抗有絲分裂的烷化劑例如氮芥(氮芥，環(huán)磷酰胺和類似物，美法侖，苯丁酸氮芥)，氮丙啶和甲密胺(六甲蜜胺和塞替派)，烷基磺酸酯-白消安，亞硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和類似物，鏈佐星)，trazenes-dacarbazinine(DTIC)；抗增殖的/抗有絲分裂的抗代謝產(chǎn)物例如葉酸類似物(甲氨蝶呤)；鉑配位絡(luò)合物(順鉑，卡鉑)，丙卡巴肼，羥基脲，米托坦，氨魯米特；激素，激素類似物(雌激素，他莫昔芬，戈舍瑞林，比卡魯胺，尼魯米特)和芳香酶抑制劑(來曲唑，阿那曲唑)；抗凝血劑(肝素，合成的肝素鹽和凝血酶的其它抑制劑)；纖維溶解劑(例如組織纖維蛋白溶酶原激活劑，鏈激酶和尿激酶)，阿司匹林，雙嘧達莫，噻氯匹啶，氯吡格雷，阿昔單抗；抗遷移劑；抗分泌劑(breveldin)；免疫抑制劑(環(huán)孢霉素A，他克莫司(FK-506)，西羅莫司(雷怕霉素)，硫唑嘌呤，麥考酚酸莫酯)；抗-血管生成化合物(TNP-470，染料木黃酮)和生長因子抑制劑(例如，VEGF抑制劑，成纖維細胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管緊張素受體阻滯劑；nitric oxide供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥單抗)；細胞周期抑制劑和分化誘導(dǎo)劑(維甲酸)；mTOR抑制劑，拓撲異構(gòu)酶抑制劑(多柔比星(阿霉素)，安吖啶，喜樹堿，柔紅霉素，放線菌素D，eniposide，表柔比星，依托泊苷，伊達比星和米托蒽醌，托泊替康，伊立替康)，皮質(zhì)激素(可的松，地塞米松，氫化可的松，methylpednisolone，潑尼松，和普瑞司坦)；生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶抑制劑；線粒體功能障礙誘導(dǎo)劑和半胱天冬酶激活劑；和染色質(zhì)破壞劑。
在某些實施方案中，可以用于聯(lián)合抗-血管生成療法的藥物化合物包括(1)“血管生成分子”例如bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)的釋放抑制劑；(2)血管生成分子的中和劑，例如抗-βbFGF抗體；和(3)對血管生成刺激作出響應(yīng)的內(nèi)皮細胞的抑制劑，包括膠原酶抑制劑，基底膜更新抑制劑，抑制血管的類固醇，真菌-衍生的血管生成抑制劑，血小板因子4，血小板反應(yīng)素，關(guān)節(jié)炎藥物例如D-青霉胺和硫代蘋果酸金，維生素D3類似物，α-干擾素，等。關(guān)于其它提及的血管生成抑制劑，見Blood等，Bioch.Biophys.Acta.，103289-118(1990)，Moses等，Science，2481408-1410(1990)，Ingber等.，Lab.Invest.，5944-51(1988)，和美國專利號5,092,885，5,112,946，5,192,744，5,202,352，和6573256。另外，存在廣泛種類的可以用于抑制血管生成的化合物，例如，內(nèi)皮他丁蛋白或衍生物，血管他丁的賴氨酸結(jié)合片段，黑色素或黑色素-促進化合物，纖溶酶原片段(例如，纖溶酶原的Kringles 1-3)，tropoin亞基，玻璃連蛋白αvβ3的拮抗劑，源自Saposin B的肽，抗生素或類似物(例如，四環(huán)素，或新霉素)，含有地諾孕素的組合物，包含偶聯(lián)到肽上的MetAP-2抑制核心的化合物，化合物EM-138，查耳酮和它的類似物，和naaladase抑制劑.見，例如，美國專利號6,395,718，6,462,075，6,465,431，6,475,784，6,482,802，6,482,810，6,500,431，6,500,924，6,518,298，6,521,439，6,525,019，6,538,103，6,544,758，6,544,947，6,548,477，6,559,126，和6,569,845。
根據(jù)聯(lián)合療法的性質(zhì)，可以繼續(xù)本發(fā)明的多肽治療劑的施用，并同時和/或此后施用其它療法。多肽治療劑的施用可以是在單劑或多劑中。在有些情況下，在常規(guī)療法之前至少幾天，開始多肽治療劑的施用，而在其它情況下，在施用常規(guī)療法之前立即或同時施用。
也可以可檢測地標(biāo)記本文所述的VEGFR-2結(jié)合蛋白，并用于接觸用于成像用途或診斷用途的能表達VEGFR-2的細胞。為了診斷目的，優(yōu)選地，將本發(fā)明的多肽固定到固體支持物上。優(yōu)選的固體支持物包括柱(例如，親合柱，例如基于瓊脂糖的親合柱)，微芯片，或珠子。
在診斷應(yīng)用的一個實例中，將來自懷疑具有特征在于不適當(dāng)?shù)难苌傻臓顩r的患者的生物樣品，例如血清或組織活組織檢查樣品，接觸可檢測地標(biāo)記的本發(fā)明的多肽，以檢測VEGFR-2的水平。然后，將測得的VEGFR-2水平與在也接觸標(biāo)記的多肽的正常樣品中測得的VEGFR-2水平相比較?？梢哉J為VEGFR-2水平增加至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％，是特征在于不適當(dāng)?shù)难苌傻臓顩r的診斷指示劑。
在某些實施方案中，本發(fā)明的VEGFR-2結(jié)合多肽進一步結(jié)合到能被檢測的標(biāo)記上(例如，該標(biāo)記可以是放射性同位素，熒光化合物，酶或酶輔因子)?；钚圆糠挚梢允欠派湫栽噭绶派湫灾亟饘倮玷F螯合物，釓或錳的放射性螯合物，氧、氮、鐵、碳或鎵的正電子發(fā)射器，43K，52Fe，57Co，67Cu，67Ga，68Ga，123I，125I，131I，132I，或99Tc。固定到這樣的部分上的結(jié)合劑可以用作成像劑，并以對于在哺乳動物(例如人)中的診斷應(yīng)用有效的量施用，然后檢測成像劑的定位和積累。通過放射性閃爍照相法，核磁共振顯影，計算機x線體層攝影術(shù)或正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)，可以檢測成像劑的定位和積累。使用針對VEGFR的VEGFR-2結(jié)合多肽的免疫閃爍成像術(shù)，可以用于檢測和/或診斷癌癥和脈管系統(tǒng)。例如，針對用99锝、111銦或125碘標(biāo)記的VEGFR-2標(biāo)志物的任一種結(jié)合多肽，可以有效地用于這樣的成像。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白的，要施用的放射性同位素的量取決于放射性同位素?；诮o定的用作活性部分的放射性核素的比活性和能量，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能容易地確定要施用的成像劑的量。典型地，每劑施用0.1-100毫居里成像劑，優(yōu)選1-10毫居里，最經(jīng)常2-5毫居里。因而，可以用作包含綴合到放射性部分上的靶向部分的成像劑的本發(fā)明的組合物包含0.1-100毫居里，在一些實施方案中，優(yōu)選1-10毫居里，在一些實施方案中，優(yōu)選2-5毫居里，在一些實施方案中，更優(yōu)選1-5毫居里。
本發(fā)明的VEGFR-2結(jié)合多肽也可以用于將其它治療劑(包括但不限于藥物化合物，化療化合物，和放療化合物)送遞到能表達VEGFR-2的細胞或組織中。在一個實施例中，將VEGFR-2結(jié)合多肽融合到用于將化療劑靶向送遞到能表達VEGFR-2的腫瘤細胞或組織的化療劑。
本發(fā)明的VEGFR-2結(jié)合多肽可以用于許多用途，包括研究、診斷和治療用途。例如，它們可以用于分離和/或純化受體或其部分，和研究受體結(jié)構(gòu)(例如，構(gòu)象)和功能。
在某些方面，本發(fā)明的各種結(jié)合多肽可以用于檢測或測量VEGFR-2的表達，例如，在內(nèi)皮細胞(例如，靜脈內(nèi)皮細胞)上，或在用VEGFR-2基因轉(zhuǎn)染的細胞上的表達。因而，它們也在用于診斷或研究目的的細胞篩分和成像等用途(例如，流式細胞術(shù)，和熒光活化的細胞篩分)中具有效用。
在某些實施方案中，為了診斷目的，可以標(biāo)記或不標(biāo)記結(jié)合多肽或其片段。典型地，診斷測定需要檢測由結(jié)合多肽向VEGFR-2的結(jié)合引起的復(fù)合物的形成。類似于抗體，可以直接標(biāo)記結(jié)合多肽或片段?？梢圆捎迷S多標(biāo)記，包括但不限于，放射性核素，熒光劑，酶，酶底物，酶輔因子，酶抑制劑和配體(例如，生物素，半抗原)。許多合適的免疫測定是熟練的技術(shù)人員已知的(見，例如，美國專利號3,817,827；3,850,752；3,901,654；和4,098,876)。當(dāng)不標(biāo)記時，結(jié)合多肽可以用于測定，例如凝集反應(yīng)測定。未標(biāo)記的結(jié)合多肽也可以與可以用于檢測結(jié)合多肽的其它(一種或多種)合適的試劑組合使用，所述試劑例如標(biāo)記的可以與結(jié)合多肽反應(yīng)的抗體或其它合適的試劑(例如，標(biāo)記的蛋白A)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以用于酶免疫測定，其中主題多肽綴合到酶上。當(dāng)包含VEGFR-2蛋白的生物樣品與主題結(jié)合多肽相組合時，結(jié)合多肽和VEGFR-2蛋白之間發(fā)生結(jié)合。在一個實施方案中，使含有能表達VEGFR蛋白的細胞(例如，內(nèi)皮細胞)的樣品與主題抗體相組合，結(jié)合多肽和攜帶能被該結(jié)合多肽識別的VEGFR-2蛋白的細胞之間發(fā)生結(jié)合?？梢詫⑦@些結(jié)合的細胞與未結(jié)合的試劑分開，并檢測特異性地結(jié)合到細胞上的結(jié)合多肽-酶綴合物的存在，例如，通過使樣品接觸酶的底物，其被酶作用時，會產(chǎn)生顏色或其它可檢測的變化。在另一個實施方案中，主題結(jié)合多肽可以是未標(biāo)記的，且可以添加能識別主題結(jié)合多肽的第二種標(biāo)記的多肽(例如，抗體)。
在某些方面，也可以制備用于檢測生物樣品中VEGFR-2蛋白的存在的試劑盒。這樣的試劑盒包括能結(jié)合VEGFR-2蛋白或所述受體的一部分的VEGFR-2結(jié)合多肽，以及一種或多種適用于檢測結(jié)合多肽和受體蛋白或其部分之間的復(fù)合物的存在的輔助試劑。本發(fā)明的多肽組合物也可以以單獨的或與對其它表位特異性的其它抗體相組合的凍干形式提供?？梢詫?biāo)記的或未標(biāo)記的結(jié)合多肽和/或抗體包含在含有輔助成分的試劑盒中(例如，緩沖液，例如Tris，磷酸鹽和碳酸鹽，穩(wěn)定劑，賦形劑，殺蟲劑和/或惰性蛋白，例如，牛血清白蛋白)。例如，結(jié)合多肽和/或抗體可以提供為與輔助成分的凍干混合物，或者可以分開地提供輔助成分，由用戶組合。通常，基于活性結(jié)合多肽或抗體的量，這些輔助材料以小于約5重量％存在，且基于多肽或抗體濃度，通常以至少約0.001重量％的總量存在。當(dāng)使用能結(jié)合結(jié)合多肽的第二抗體時，這樣的抗體可以提供在試劑盒中，例如在分開的小瓶或容器中。如果存在，第二抗體典型地是標(biāo)記的，且可以以與上述的抗體制劑類似的方式配制。
類似地，本發(fā)明也涉及檢測和/或定量VEGFR-2的表達的方法，其中在適于結(jié)合的條件下，使包含細胞或其極分(例如，膜極分)的組合物接觸能結(jié)合VEGFR-2或受體部分的結(jié)合多肽，并監(jiān)測結(jié)合。結(jié)合多肽的檢測，指示著結(jié)合多肽和VEGFR-2或其一部分之間的復(fù)合物的形成，能指示受體的存在。通過標(biāo)準(zhǔn)的方法，例如在工作實施例中描述的那些，可以檢測多肽與細胞的結(jié)合。該方法可以用于檢測VEGFR-2在來自個體的細胞上的表達。任選地，通過例如流式細胞術(shù)，可以評價內(nèi)皮細胞表面上的VEGFR-2的定量表達，且可以將染色密度與疾病易感性、進展或危險相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明也涉及檢測哺乳動物對某些疾病的易感性的方法。作為說明，該方法可以用于檢測哺乳動物對疾病的易感性，所述疾病基于哺乳動物中存在于細胞上的VEGFR-2的量和/或VEGFR-2-陽性的細胞的數(shù)目而進展。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及檢測哺乳動物對腫瘤的易感性的方法。在該實施方案中，在適于結(jié)合的條件下，使待測樣品接觸能結(jié)合VEGFR-2或其部分的結(jié)合多肽，其中所述樣品包含能在正常個體中表達VEGFR-2的細胞。檢測結(jié)合和/或結(jié)合的量，其指示著個體對腫瘤的易感性，其中更高的受體水平與個體對腫瘤的提高的易感性相關(guān)聯(lián)。
實施例 下面的實施例用于解釋本發(fā)明的目的，不應(yīng)當(dāng)理解為限制。
實施例1.KDR結(jié)合分子的初步鑒別 基于在位置23-29，52-55和77-86(氨基酸號參考SEQ ID NO5)具有3個隨機化區(qū)域的人纖連蛋白的第10個3型結(jié)構(gòu)域的支架，構(gòu)建了大約1013個RNA-蛋白融合體變體文庫(3環(huán)文庫；Xu等，Chemistry &Biology 9933-942，2002)。構(gòu)建了僅僅在位置23-29和77-86(2環(huán)文庫)或僅僅在位置77-86(1環(huán)文庫)含有隨機化的區(qū)域的類似文庫。這3個文庫的混合物用于針對人VEGFR-2的胞外結(jié)構(gòu)域(KDR，胞外結(jié)構(gòu)域，融合到人IgG1 Fc上的殘基1-764)的體外選擇。為了該應(yīng)用的目的，將該環(huán)的氨基酸位置定義為殘基23-30(BC環(huán))，52-56(DE環(huán))和77-87(FG環(huán))。6輪選擇后，通過DNA測序，分析靶結(jié)合群體，發(fā)現(xiàn)是不同的，有一些重復(fù)存在。篩選第15個獨立的克隆編碼的蛋白與KDR的結(jié)合(圖1A)，并隨后分析在有VEGF存在下，最佳結(jié)合劑對靶結(jié)合的抑制(圖1B)。鑒別出了多個能抑制KDR-VEGF結(jié)合的克隆，表明這些克隆在天然的配體(VEGF)結(jié)合位點處或附近結(jié)合KDR。使用固定化的VEGF和含有KDR-Fc(有或沒有選擇的結(jié)合蛋白)的流動相，在BIAcore測定中評價了2種結(jié)合分子(VR28和VR12)直接抑制VEGF-KDR相互作用的能力。VR28和VR12(程度較低)，但不是非競爭性的克隆(VR17)，會以劑量依賴性的方式抑制與VEGF的KDR結(jié)合(圖1C)。最后，除了與純化的重組KDR的結(jié)合外，VR28也表現(xiàn)出結(jié)合能表達KDR的重組CHO細胞，而不是對照CHO細胞(圖1D)。
VR28克隆的結(jié)合環(huán)的序列顯示在表4的第一行。
盡管VR28不是測序的結(jié)合群體中最豐富的克隆(28個測序的克隆中的一個拷貝)，它對KDR的結(jié)合親合力在來自該結(jié)合群體的測試克隆中是最好的，在放射性平衡結(jié)合測定(圖3和表5)和BIAcore測定(表7)中測得的解離常數(shù)為11-13nM。沒有來自分子的剩余支架部分中的野生型10Fn3的變化(在校正對結(jié)合沒有作用的69位的偶然的支架變化后)。但是，VR28在VEGF-依賴性的細胞增殖測定中，表現(xiàn)出很少的VEGF-KDR信號傳遞的抑制。因而，在選擇未接觸過抗原的文庫以得到能在生化結(jié)合研究中干擾VEGF和KDR之間的相互作用的抗體模擬物時，親合力提高可以用于生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)測定中的中和功能。
實施例2.克隆VR28的親合力成熟 采用目的在于改變僅僅在結(jié)合環(huán)中的序列的誘變策略。為了初步測試哪個環(huán)最可能導(dǎo)致改進，進行定環(huán)超突變PCR，以將最多達30％突變獨立地導(dǎo)入VR28的每個環(huán)中。針對KDR選擇3輪后，觀察到具有改進的與KDR-Fc的結(jié)合的多個克隆。選擇合并物的序列分析表明，大多數(shù)突變積累在FG環(huán)中，而BC和DE環(huán)基本上保持完整。該結(jié)果表明，F(xiàn)G環(huán)是用于進一步修飾的最合適的靶。
所以，使用寡核苷酸誘變，通過改變FG環(huán)中的VR28序列，構(gòu)建了大約1012個變體的新文庫。對于每個FG環(huán)位置(殘基77-86[VAQNDHELIT(SEQ ID NO198)]以及隨后的脯氨酸[殘基87])，將VR28-編碼DNA和NNS的50∶50混合物導(dǎo)入每個位置。大約80個克隆的隨機樣品的DNA序列分析揭示了如預(yù)期的每個克隆平均6個氨基酸變化。在選擇過程中，使用更低的KDR-Fc濃度，以賦予克隆更好的靶親合力。在4輪選擇過程中的靶結(jié)合譜顯示在圖2。4輪選擇后，將結(jié)合群體亞克隆并分析。表5和圖3A總結(jié)了各結(jié)合克隆的親合力測量。測得的對KDR-Fc的結(jié)合常數(shù)范圍從＜0.4至＜1.8nM，比VR28提高10-30倍(11nM)。
序列分析，其中的一些顯示在表4(K克隆)，表明，盡管結(jié)合群體是不同的，在克隆中可以鑒別出幾個共有的基序。最值得注意的是，在幾乎所有的克隆中發(fā)現(xiàn)了Pro87和Leu84(象在VR28)，表明這些殘基可能是結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)所必需的。似乎需要在82位處的帶正電荷的氨基酸，因為在測序的克隆中僅僅發(fā)現(xiàn)了H82K或H82R變化，且脂肪族氨基酸在位置78是顯著的。D81經(jīng)常突變成G，導(dǎo)致該位置的負電荷損失，并獲得柔性。另外，選擇的群體的總突變比例可以與選擇之前的合并物相比較，這表明FG環(huán)非常易于變化。
人纖連蛋白的10Fn3結(jié)構(gòu)域的N-末端的幾個殘基緊鄰FG環(huán)，如結(jié)構(gòu)測定所證實的(Main等，Cell 71671-678，1992)。2個區(qū)域的緊密靠近可以潛在地具有對靶結(jié)合的消極作用。在N-末端區(qū)域的2個偶然突變L8P和L8Q在許多選擇的克隆中導(dǎo)致向KDR更好的結(jié)合，推測是由于相對于FG環(huán)的N-末端的位置變化。為了進一步測試對N-末端的影響，我們?yōu)?3種不同的KDR結(jié)合劑建立了結(jié)合分子，其中去除了β-折疊之前的N-末端前8個殘基。然后，我們將靶結(jié)合與未去除的對應(yīng)物進行對比。平均地，有缺失時與KDR-Fc的結(jié)合好約3-倍，如圖3B所示。
實施例3.選擇具有對人(KDR)和小鼠(Flk-1)VEGFR-2的雙特異性的結(jié)合劑 VR28和大多數(shù)親合力成熟的變體(K克隆)不能結(jié)合KDR的小鼠同源物Flk1，如圖4所示。但是，由于KDR和Flk1具有高水平的序列同一性(85％，Claffey等，J.Biol.Chem.26716317-16322(1992)，Shima等，J.Biol.Chem.2713877-3883(1996))，可能分離能結(jié)合KDR和Flk1的抗體模擬物。這樣的雙結(jié)合劑是令人想要的，因為它們允許相同的分子在動物模型中并隨后在人中進行功能研究測試。
將FG環(huán)誘變和針對KDR選擇4輪后的克隆群體，進一步針對Flk1選擇另外3輪。如圖2所示，從第5輪至第7輪，觀察到了與Flk1的結(jié)合的增加，指示著Flk1結(jié)合劑的富集。多個克隆的結(jié)合分析表明，與僅僅針對KDR選擇的克隆(K克隆)不同，大多數(shù)源自針對Flk1的其它選擇的克隆(E克隆)能與KDR和Flk1相互作用。如使用放射性平衡結(jié)合測定(表6和圖5)和BIAcore(表7)測得的，向2種靶的結(jié)合常數(shù)表明，各克隆能以高親合力結(jié)合2種靶。
例如，E19對KDR的Kd為60pM，對Flk-1為340pM。這些結(jié)果表明，在選擇過程中簡單的靶轉(zhuǎn)換策略，可能通過2種靶施加的選擇壓力，已經(jīng)允許從VR28(一種不能結(jié)合Flk-1的中等KDR結(jié)合劑)的誘變的群體分離對KDR和Flk-1雙結(jié)合特異性的分子。選擇的基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白對VEGFR-2(KDR)是高度特異性的，在高靶濃度沒有觀察到與VEGFR1的實質(zhì)結(jié)合。
序列分析揭示了一些類似于在KDR結(jié)合劑合并物中觀察到的那些的基序(分別在殘基84和87處的Leu和Pro；在殘基82處的帶正電荷的氨基酸，主要是Arg)和一些沒有被維持的基序(在78位的脂肪族氨基酸)。另外，基序ERNGR(殘基78-82)存在于幾乎所有的結(jié)合Flk-1的克隆中(表4)；該基序在KDR結(jié)合合并物中幾乎不能辨別。R79和R82似乎對與Flk-1的高親合力結(jié)合特別重要，因為當(dāng)在該位置存在不同的殘基時，會極大地減少與Flk-1(而不是KDR)的結(jié)合(圖6A)。為了確定每個環(huán)在與KDR和Flk-1的結(jié)合中的重要性，顯示在表4中的克隆E6和E26的環(huán)，被NNS隨機化的序列一次取代一個環(huán)。如圖6B所示，取代后，蛋白不再能結(jié)合KDR或Flk-1。這些結(jié)果表明，向靶的結(jié)合需要每個環(huán)，表明所有3個環(huán)都協(xié)同參加與靶的相互作用。
獨立地采用替代性的誘變策略來生產(chǎn)能結(jié)合2種靶的克隆。選擇克隆159Q(8)L(表4)作為起點，它是能以高親合力結(jié)合KDR(Kd＝2nM；表7)并以低親合力結(jié)合Flk-1(Kd＞3000nM)的VR28的超突變PCR親合力成熟產(chǎn)物。充分隨機化了FG環(huán)的前6個氨基酸(NNS)，剩下下面的5個完整的殘基(ELFTP)。針對Flk-1選擇6輪后，在DE環(huán)(位置52-56)重新隨機化結(jié)合合并物，針對Flk-1選擇另外3輪，針對KDR選擇1輪。從而得到許多對KDR和Flk-1的高親合力結(jié)合分子(表4和圖4)。例如，克隆M5FL，在保留與KDR的高結(jié)合親合力的同時(Kd＝890pM)，可以以2.1nM的Kd結(jié)合Flk-1，該Kd比原始克隆高1000倍。令人感興趣地，在從VR28的誘變?nèi)后w中選擇的Flk-1結(jié)合分子中發(fā)現(xiàn)的ERNGR基序，也存在于源自克隆159Q(8)L誘變和選擇的多個克隆中，盡管FG環(huán)的該區(qū)域完全隨機化。類似的結(jié)合分子從2個獨立的文庫中的分離表明，親合力成熟過程是分離位于FG環(huán)的最佳Flk-1結(jié)合基序的基礎(chǔ)。
實施例4.細胞表面結(jié)合和VEGF體外活性的中和 用大腸桿菌生產(chǎn)的結(jié)合分子，評價了細胞培養(yǎng)模型系統(tǒng)中的KDR和Flk-1結(jié)合分子的功能性。使用由抗-His6標(biāo)志鼠抗體(與His標(biāo)志一起表達大腸桿菌表達的蛋白)和抗-鼠熒光標(biāo)記抗體組成的檢測系統(tǒng)，證實了結(jié)合分子能以低納摩爾EC50特異性地結(jié)合能表達KDR或Flk-1的哺乳動物細胞(圖7和表8)。
更重要地，使用能表達連接到促紅細胞生成素受體信號傳遞結(jié)構(gòu)域上的胞外KDR或Flk-1結(jié)構(gòu)域的重組的BA/F3細胞(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，這些分子能以劑量依賴性的方式抑制VEGF-刺激的細胞增殖，對KDR表達細胞的IC50是3-12nM，對Flk-1表達細胞是2-5nM。抑制效力似乎類似于對照抗-KDR和抗-Flk-1單克隆抗體，如圖8和表9所示。
進一步測試了許多克隆的HUVEC細胞(人臍靜脈內(nèi)皮細胞)生長的VEGF-抑制。HUVEC細胞是天然的人細胞，其與能對VEGF作出反應(yīng)的身體細胞密切相關(guān)。如圖9和表10所示，在該人-衍生的細胞系統(tǒng)中，基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白在抑制VEGF活性方面也是有活性的，而野生型基于纖連蛋白的支架蛋白是無活性的。
實施例5.M5FL蛋白的熱穩(wěn)定性和可逆重新折疊 使用差示掃描量熱法(DSC)，建立了KDR-結(jié)合劑M5FL的熱穩(wěn)定性。在標(biāo)準(zhǔn)的PBS緩沖液條件(磷酸鈉pH 7.4，150mM NaCl)下，發(fā)現(xiàn)M5FL在56℃具有單個的不可逆的熱熔解轉(zhuǎn)換。隨后，將醋酸鈉pH4.5鑒別為對M5FL蛋白溶解度有利的緩沖液。在該緩沖液(100mM)中的DSC實驗證實，M5FL在這些條件下更穩(wěn)定(Tm＝67-77℃)，且熔解轉(zhuǎn)換是可逆的(圖10)?？赡娴臒徂D(zhuǎn)換已經(jīng)用于鑒別能支持長期保存蛋白治療劑的有利條件(Remmele等，Biochemistry 385241(1999)，所以已經(jīng)將醋酸鈉pH 4.5鑒別為優(yōu)化的保存M5FL蛋白的緩沖液。
實施例6.聚乙二醇化的M5FL蛋白的體外結(jié)合和基于細胞的活性 在大腸桿菌表達系統(tǒng)中生產(chǎn)了具有C末端延伸的M5FL蛋白，以生產(chǎn)下面的蛋白序列(C-末端延伸加下劃線，CyslO0加陰影；生產(chǎn)了顯著百分比的去除了起始甲硫氨酸的蛋白) MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPLATISGLKPGVDYTITVYAVTKERNGRELFTPISINYRTEIDKPCQHH HHHH(SEQ ID NO199) 使用標(biāo)準(zhǔn)的馬來酰亞胺化學(xué)，用在位置100處的半胱氨酸殘基的單個巰基來偶聯(lián)PEG變體，以產(chǎn)生M5FL的2種不同的聚乙二醇化形式。線性的20kD PEG和分支的40kD PEG(Shearwater Corporation)都綴合到M5FL上，分別生成M5FL-PEG20和M5FL-PEG40。通過陽離子交換色譜，從未反應(yīng)的蛋白和PEG純化聚乙二醇化的蛋白形式。通過SDS-PAGE(圖11)和質(zhì)譜，證實了2種PEG形式的M5FL的共價鍵。
使用具有通過酰胺化學(xué)固定化到BIAcore芯片上的人和小鼠VEGF-受體靶蛋白的表面等離振子共振(SPR)(BIAcore)，進行體外親合力測量。對于2種靶蛋白，發(fā)現(xiàn)20和40kD聚乙二醇化的M5FL形式具有比未修飾的M5FL更低的啟動速度(ka)，對解離速度的影響較少(kd；表11)。
使用實施例4所述的Ba/F3系統(tǒng)，測試了聚乙二醇化的M5FL制品的功能性。圖12顯示了隨每種結(jié)合劑的濃度而變化的A490(代表細胞增殖的程度)的圖。曲線幾乎相同，表明聚乙二醇化對任一種聚乙二醇化形式的生物活性幾乎沒有作用。
對KDR-結(jié)合多肽的子集分析了kon，koff和KD，并與基于BaF3細胞的VEGF抑制測定的EC50相對比。散布圖表明，kon與EC50密切相關(guān)，而koff不太相關(guān)。超過90％的具有105s-1或更大的kon的KDR-結(jié)合蛋白具有10nM或更小的EC50。KD是kon和koff的比率，且如預(yù)期的，會表現(xiàn)出與EC50的中等程度的關(guān)聯(lián)。
評價了許多KDR-結(jié)合蛋白(包括CT-01)與VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3的結(jié)合。蛋白顯示出對VEGFR-2的高度選擇性。
實施例6制備能阻斷人內(nèi)皮細胞中的VEGFR-2信號傳遞的KDR結(jié)合蛋白CT-01 在前面實施例所述的方法以后，產(chǎn)生了其它的基于10Fn3的KDR結(jié)合蛋白。如上面實施例5中關(guān)于MSFL蛋白的開發(fā)所述，使用BIAcore結(jié)合測定，測試了蛋白對人KDR和小鼠Flk-1的KD，并在Ba/F3測定中測試了IC50。稱作CT-01的蛋白在每個測定中表現(xiàn)出了理想的性質(zhì)，用于進一步的分析。
CT-01的來源原始克隆具有序列 GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGWNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO200). FG環(huán)序列加了下劃線。
如上所述的親合力成熟生成了核心形式的CT-01 EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO192). 上面的CT-01分子具有前8個氨基酸的缺失，且可以在N-或C-末端包含其它的氨基酸。例如，其它的MG序列可以位于N-末端。M通常會被剪切掉，剩下在N-末端的GEV...序列。在N-末端重新添加正常的8個氨基酸，也會生成具有需要的性質(zhì)的KDR結(jié)合蛋白。N-末端甲硫氨酸通常會被剪切，產(chǎn)生序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO193). 為了體內(nèi)應(yīng)用，可以產(chǎn)生適用于聚乙二醇化的形式。例如，添加和表達包含半胱氨酸的C-末端尾，如下面關(guān)于缺少8個N-末端氨基酸的形式所示。
GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ(SEQ ID NO194). 在下述的體內(nèi)實驗中，使用該分子的聚乙二醇化形式。還使用了具有絲氨酸(而不是半胱氨酸)的對照形式 GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGL KPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO195). 相同的C-末端尾也可以添加到具有N-末端8個氨基酸的CT-01形式，例如如SEQ ID NO193所示。
分離了具有需要的KDR結(jié)合性質(zhì)的其它變體。下面的核心序列具有稍微不同的FG環(huán)，且可以與例如N-末端MG序列，能恢復(fù)8個缺失的氨基酸的N-末端序列，和/或C-末端尾巴一起表達，提供用于聚乙二醇化的半胱氨酸。
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLK PGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO196). 另一種這樣的變體具有核心序列 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPP TATISGLKPGVDYTITVYAVTEGPNERSLFIPISINYRT(SEQ ID NO197). 這些變體的對比證實了FG環(huán)的共有序列D/E)GXNXRXXIP(SEQID NO3)。更具體地，共有序列可以表示為(D/E)G(R/P)N(G/E)R(S/L)(S/F)IP(SEQ ID NO4)。
實施例7CT-01能阻斷人內(nèi)皮細胞中的FR-2信號傳遞 如圖13所示，通過VEGFR-2的VEGF-A信號傳遞，由VEGFR-2的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化介導(dǎo)，隨后被包含磷酸脂肪酶Cγ(PLCγ)，蛋白激酶C(PKC)，Raf-1，MEK1/2，ERK1/2的途徑活化，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞增殖。
為了評價本文公開的KDR結(jié)合劑是否能抑制該信號傳遞途徑的活化，用VEGFR結(jié)合多肽(例如，CT-01)處理人微血管內(nèi)皮細胞30min，并用VEGF-A刺激5min。使用對磷酸-VEGFR-2，非-磷酸-VEGFR-2，磷酸-ERK1/2和非-磷酸-ERK1/2特異性的抗體，通過SDS-PAGE和蛋白分析，分析了總細胞裂解物。
如圖13所示，130pM CT-01能抑制磷酸-VEGFR-2的形成，也能減少下游磷酸化的ERK1/2的形成。磷酸化的ERK1/2未被完全消除，可能是由于下述事實，即ERK1/2能接收來自許多其它信號傳遞途徑的信號。
實施例8基于纖連蛋白的KDR結(jié)合蛋白能破壞通過VEGF-A和VEGF-D的信號傳遞 VEGFR-2是3種VEGF(VEGF-A，VEGF-C和VEGFD)的受體。進行實驗來評價基于纖連蛋白的KDR結(jié)合蛋白對VEGF-A和VEGF-D介導(dǎo)的通過KDR的信號傳遞的作用。
產(chǎn)生了依賴于Flk-1介導(dǎo)的信號傳遞的Ba/F3細胞系。如圖14的左圖所示，通過用VEGF-A或VEGF-D處理細胞，可以維持細胞存活率，盡管需要明顯更高水平的VEGF-D。
如圖14的中圖所示，在有15ng/ml VEGF-A存在下維持細胞，并接觸本文公開的M5FL或CT-01蛋白，或DC-101抗-Flk-1抗體。每種試劑都能逆轉(zhuǎn)VEGF-A-介導(dǎo)的細胞存活率，表明阻斷了通過Flk-1的VEGF-A信號傳遞。
如圖14的右圖所示，在有300ng/ml VEGF-D存在下維持細胞，并接觸本文公開的M5FL或F10蛋白，或抗-VEGF-A抗體。M5FL和F10能逆轉(zhuǎn)VEGF-D-介導(dǎo)的細胞存活率，表明阻斷了通過Flk-1的VEGF-D信號傳遞。
抗-VEGF-A抗體沒有作用，證實了測定的特異性。
實施例9藥物動力學(xué) 藥物動力學(xué)研究用125I碘化了天然的CT-01或聚乙二醇化的形式(40kDa PEG，CT-01PEG40)。將10-20mCi碘化的蛋白靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射進成年雄性大鼠中，并在指定的時間檢測碘化的蛋白的水平。為了組織分布研究，在15min，2hr和6hr處死大鼠，并檢測放射活性水平。見圖15和16。未修飾的CT-01是能從血液中迅速清除的12kDa蛋白。曲線下面積(AUC)值是14.6hr*mg/mL，清除速度為69.9mL/hr/kg，最大血清濃度為9.1mg/ml。初始半衰期(α)是0.3小時，第二階段半衰期(β)是13.5小時。通過對比，靜脈內(nèi)施用的聚乙二醇化的CT-01在血液中顯著增加，主要是因為在清除初始階段的急劇減少。AUC增加了超過10倍，達到193，清除速度減少了超過10倍，達到5.2，Cmax是12.9mg/mL。α半衰期增加到1小時，β增加到16.2小時。在大鼠中的這些藥物動力學(xué)相當(dāng)于在人類中的每周2次給藥方案，該給藥速度恰恰在可接受的范圍內(nèi)。
聚乙二醇化的CT-01的腹膜內(nèi)(i.p.)施用，具有儲池樣藥物動力學(xué)。CT-01的血液濃度沒有始發(fā)尖峰。相反，CT-01的量更緩慢地積累，并緩慢地減少。當(dāng)關(guān)心靜脈內(nèi)施用后CT-01濃度的始發(fā)尖峰的副作用時，可能需要這樣的藥物動力學(xué)。其它基于10FN3的試劑在腹膜內(nèi)施用時可能也會表現(xiàn)出類似的行為。因此，這可能是用基于10FN3的試劑達到延時給藥效果的普通模式。
如圖16所示，肝臟是分泌聚乙二醇化形式的CT-01的主要途徑。沒有檢測到CT-01的長期積累。
使用綴合到20kDa PEG部分上的CT-01，得到了類似的結(jié)果。
實施例10CT-01的體內(nèi)效力 使用如圖17所示的Miles測定來評價用于腫瘤功效研究的劑量、方案和施用參數(shù)。在VEGF攻擊前4小時，以1，5和20mg/kg，給Balb/c雌性小鼠腹膜內(nèi)注射緩沖液或CT-O1PEG40。將VEGF-A皮內(nèi)局部施用進背部皮膚，會誘導(dǎo)伊文思藍染料的血管泄漏(圖17和18)。
用KDR結(jié)合劑處理的小鼠的VEGF-介導(dǎo)的血管泄漏水平表現(xiàn)出統(tǒng)計上顯著的減少。CT-01的5mg/kg和20mg/kg劑量表現(xiàn)出顯著的結(jié)果。因此，選擇5mg/kg劑量進行小鼠腫瘤模型研究。
實施例11CT-01能抑制腫瘤生長 B16-F10鼠黑素瘤測定 在第1天，將2×106B16-F10鼠黑素瘤細胞皮下植入C57/BL雄性小鼠。在第6天，檢測到可觸知的腫塊。在第8天，當(dāng)腫瘤是可測量的大小時，開始每天腹膜內(nèi)注射介質(zhì)對照，5，15，或40mg/kg CT-O1PEG40。最低劑量5mg/kg能減少腫瘤生長。在第18天，用15和40mg/kg處理的小鼠的腫瘤生長表現(xiàn)出了50％和66％減少。見圖19。
U87人成膠質(zhì)細胞瘤測定 將5×106U87人成膠質(zhì)細胞瘤腫瘤細胞皮下植入雄性裸鼠。當(dāng)腫瘤體積達到大約50mm3時，開始處理(第0天)。每隔一天(EOD)，靜脈內(nèi)注射介質(zhì)對照，3，10，或30mg/kg CT-O1PEG40。如關(guān)于它的最佳給藥方案所公開的，以40mg/kg注射抗-Flk-1抗體DC101，每周2次。最低劑量3mg/kg減少了腫瘤生長。在第12天，用10和30mg/kg處理的小鼠的腫瘤生長表現(xiàn)出50％減少。見圖20。有效性可與抗-Flk-1抗體相似。
下面的材料和方法用于實施例1-11所述的實驗。
重組蛋白 重組的人VEGFR165，小鼠VEGFR164，人神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(NT4)，人和小鼠血管內(nèi)皮生長因子受體-2Fc嵌合體(KDR-Fc和Flk-l-Fc)購自R&D Systems(Minneapolis，MN)。在有EZ-LinkTM硫代-NHS-LC-LC-生物素(Pierce，IL)存在下，在1xPBS中，在4℃進行靶蛋白的生物素化2小時。通過在lxPBS中滲析，去除多余的EZ-LinkTM硫代-NHS-LC-LC-生物素。通過質(zhì)譜檢測生物素化的水平，并使用考馬斯蛋白Plus測定(Pierce，IL)，檢測靶蛋白濃度。
引物 通過化學(xué)合成，制備了下面的寡核苷酸，最終用于文庫構(gòu)建和選擇的克隆的誘變。
T7 TMV Fn5’GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTTACA ATT ACA ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG 3’(SEQ ID NO201) T7 TMV N-末端缺失5’GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAATTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GAA GTT GTT GCT GCG ACC CCC ACCAGC CTA 3’(SEQ ID NO202) MK165-4 A205’TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGA TGC CTTGTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC 3’(SEQ ID NO203) N-末端正向5’ATG GTT TCT GAT GTT CCG AGG GAC CTG GAA GTTGTT GCT GCG ACC CCC ACC AGC CTA CTG ATC AGC TGG 3’(SEQ IDNO204) BCDE反向5’AGG CAC AGT GAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT TCC TCCTGT TTC TCC GTA AGT GAT CCT GTA ATA TCT 3’(SEQ ID NO205) BCDE正向5’AGA TAT TAC AGG ATC ACT TAC GGA GAA ACA GGAGGA AAT AGC CCT GTC CAG GAG TTC ACT GTG CCT 3’(SEQ ID NO206) DEFG反向5’AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC TCCAGG TTT AAG GCC GCT GAT GGT AGC TGT 3’(SEQ ID NO207) DEFG正向5’ACA GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGA GTT GATTAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 3’(SEQ ID NO208) C-末端polyA5’TTT TTT TTT TTT TTT TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTGTCG TCG TCG TCC TTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG GAA AT 3’(SEQID NO209) Hu3’FLAGSTOP5’TTT TAA ATA GCG GAT GCC TTG TCG TCG TCG TCCTTG TAG TCT GTT CGG TAA TTA ATG G 3’(SEQ ID NO210) VR28FG-505′GTG TAT GCT GTC ACT 123 145 463 665 165 465 163 425 625 645447 ATT TCC ATT AAT TAC 3′，(SEQ ID NO211)，其中1＝62.5％G+12.5％A+12.5％T+12.5％C；2＝2.5％G+12.5％A+62.5％T+12.5％C；3＝75％G+25％C；4＝12.5％G+12.5％A+12.5％T+62.5％C；5＝25％G+75％C；6＝12.5％G+62.5％A+12.5％T+12.5％C；725％G+50％A+25％C FIU25’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATTCTA TCA ATA CAA TGG TGT CTG ATG TG CCG 3’(SEQ ID NO212) F25’CCA GGA GAT CAG CAG GGA GGT CGG GGT GGC AGC CAC CAC TTCCAG GTC GCG CGG CAC ATC AGA CAC CAT TGT 3’(SEQ ID NO213) F31595’ACC TCC CTG CTG ATC TCC TGG CGC CAT CCG CAT TTT CCGACC CGC TAT TAC CGC ATC ACT TAC G 3’(SEQ ID NO214) F45’CAC AGT GAA CTC CTG GAC CGG GCT ATT GCC TCC TGT TTC GCCGTA AGT GAT GCG GTA ATA GCG 3’(SEQ ID NO215) F51595’CGG TCC AGG AGT TCA CTG TGC CGC TGC AGC CGC CGG CGGCTA CCA TCA GCG GCC TTA AAC C 3’(SEQ ID NO216) F5-X55’CG GTC CAG GAG TTC ACT GTG CCG NNS NNS NNS NNS NNS GCTACC ATC AGC GGC CTT AAA CC 3’(SEQ ID NO217) F65’AGT GAC AGC ATA CAC AGT GAT GGT ATA ATC AAC GCC AGG TTTAAG GCC GCT GAT GGT AG 3’(SEQ ID NO218) F7X61595’ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT NNS NNS NNS NNS NNSNNS GAA CTG TTT ACC CCA ATT TCC ATC AAC TAC CGC ACA GAC TACAAG 3’(SEQ ID NO219) F85’AAA TAG CGG ATG CGC GTT TGT TCT GAT CTT CCT TAT TTA TGTGAT GAT GGT GGT GAT GCT TGT CGT CGT CGT CCT TGT AGT CTG TGCGGTAGTTGAT 3’(SEQ ID NO220) C2asaiA205′TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGA TGC GCG TTTGTT CTG ATC TTC 3’(SEQ ID NO221) C2RT5’GCG CGT TTG TTC TGA TCT TCC 3’(SEQ ID NO222) hf01 BC反向5’TGCC TCC TGT TTC GCC GTA AGT GAT GCG GTA ATAGCG SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN CCA GCT GAT CAG CAG 3’(SEQ IDNO223) hf01 DE反向5’GAT GGT AGC TGT SNN SNN SNN SNN AGG CAC AGTGAA CTC CTG GAC AGG GCT ATT GCC TCC TGT TTC GCC 3’(SEQ IDNO224) hf01 FG反向5’GT GCG GTA ATT AAT GGA AAT TGG SNN SNN SNN SNNSNN SNN SNN SNN SNN SNN AGT GAC AGC ATA CAC 3’(SEQ ID NO225) BCDE反向5’CCT CCT GTT TCT CCG TAA GTG 3’(SEQ ID NO226) BCDE正向5’CAC TTA CGG AGA AAC AGG AGG 3’(SEQ ID NO227) hf01 DE-FG正向5’ACA GCT ACC ATC AGC GGC CTT AAA CCT GGC GTTGAT TAT ACC ATC ACT GTG TAT GCT GTC ACT 3’(SEQ ID NO228) Front FG反向5’AGT GAC AGC ATA CAC AGT 3’(SEQ ID NO229) hf01 RT Flag PolyA 反向5’TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AAT AGC GGATGC CTT GTC GTC GTC GTC CTT GTA GTC TGT GCG GTA ATT AAT GGA 3’(SEQ ID NO230) 5-RI-hKDR-1B5’TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAA GGT GCTG 3’(SEQ IDNO231) 3-EPO/hKDR-2312B5’AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGT TCC AAG TTCGTC TTT TCC 3’(SEQ ID NO232) 5-RI-mKDR-15’TAG AGA ATT CAT GGA GAG CAA GGC GCT G 3’(SEQ IDNO233) 3-EPO/mKDR-23125’AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGT TCC AAG TTGGTC TTT TCC 3’(SEQ ID NO234) 5-RI-hTrkB-15’TAG AGA ATT CAT GAT GTC GTC CTG GAT AAG GT 3’(SEQID NO235) 3-EpoR/hTrkB-13105’AGG GAG AGC GTC AGG ATG AGA TGT TCC CGACCG GTT TTA 3’(SEQ ID NO236) 5-hKDR/EPO-2274B5’GGA AAA GAC GAA CTT GGA ACT CAT CCT GACGCT CTC CCT 3’(SEQ ID NO237) 5-mKDR/EPO-22745’GGA AAA GAC CAA CTT GGA ACT CAT CCT GACGCT CTC CCT 3’(SEQ ID NO238) 3-XHO-EpoR-30665’TAG ACT CGA GTC AAG AGC AAG CCA CAT AGCT 3’(SEQ ID NO239) 5’hTrkB/EpoR-12745’TAA AAC CGG TCG GGA ACA TCT CAT CCT GAC GCTCTC CCT 3’(SEQ ID NO240) 緩沖液 在本文所述的實驗中，使用下面的緩沖液。緩沖液A(100mMTrisHCl，1M NaCl，0.05％Tween-20，pH 8.0)；緩沖液B(1X PBS，0.02％Triton X100)；緩沖液C(100mM TrisHCl，60mM EDTA，1M NaCl，0.05％Triton X100，pH 8.0)；緩沖液Ca(100mM TrisHCl，1M NaCl，0.05％ Triton X100，pH 8.0)；緩沖液D(2M NaCl，0.05％Triton)；緩沖液E(1X PBS，0.05％ Triton X100，pH 7.4)；緩沖液F(1X PBS，0.05％TritonX100，100mM咪唑，pH 7.4)；緩沖液G(50mM HEPES，150mM NaCl，0.02％ TritonX-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鮭精DNA，pH7.4)；緩沖液H(50mM HEPES，150mM NaCl，0.02％TritonX-100，pH7.4)；緩沖液I(lxPBS，0.02％Triton X-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鮭精DNA，pH 7.4)；緩沖液J(1xPBS，0.02％TritonX-100，pH 7.4)；緩沖液K(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，5mM CHAPS，25mM咪唑，lx CompleteTM蛋白酶抑制劑混合物(Roche)，pH 8.0)；緩沖液L(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，25mM咪唑，pH 8.0)；緩沖液M(1xPBS，pH 7.4，25mM咪唑，pH 7.4)；緩沖液N(1xPBS，250mM咪唑，pH 7.4)；緩沖液O(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween20，pH 7.4)。
一級文庫構(gòu)建 以前描述了使用人纖連蛋白的第10個結(jié)構(gòu)域作為支架的文庫的構(gòu)建(Xu等，2002，同上)。使用NNS(標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸混合物，其中N＝等摩爾的A，G，T，C混合物；S＝等摩爾的G和C混合物)作為編碼方案，隨機化了分別與位置23-29，52-55，和77-86相對應(yīng)的3個環(huán)區(qū)域。構(gòu)建了僅僅在位置23-29和77-86(2環(huán)文庫)或僅僅在位置77-86(1環(huán)文庫)含有隨機化的區(qū)域的類似文庫。這些文庫以大約等摩爾的量相混合。該混合的文庫含有約l×1013個克隆，并用于能識別VR28的KDR選擇。
誘變文庫構(gòu)建 超突變PCR。通過PCR(見下面)，將VR28克隆中的支架突變T(69)I校正回野生型序列，沒有觀察到VR28結(jié)合劑與KDR的結(jié)合特征的變化。使用前面描述的條件(Vartanian等，Nuc.Acid Res.242627-2631，1996)，將突變導(dǎo)入VR28的環(huán)區(qū)域。使用側(cè)翼于每個環(huán)的引物對(N-末端正向/BCDE反向，BCDE正向/DEFG反向，DEFG正向/C-末端polyA)，在VR28模板上進行3輪的超突變PCR。使用重疊延伸，裝配得到的片段，并使用側(cè)翼引物T7TMV Fn和MK165-4 A20進行PCR。來自最終PCR反應(yīng)的克隆的DNA測序證實了文庫的正確裝配。與在支架區(qū)域的1.5％相比，在環(huán)區(qū)域觀察到了最高達30％的誘變比率。
寡誘變。通過PCR的VR28的FG環(huán)的寡誘變，使用VR28FG-50引物，DEFG反向引物和側(cè)翼引物。在每個編碼FG環(huán)的核苷酸位置，引物VR28FG-50含有50％VR28核苷酸和50％所有4種核苷酸(N)或G或C(S)的等摩爾混合物。該方案設(shè)計用于導(dǎo)致，VR28FG環(huán)的大約67％的氨基酸被隨機地替換為另一種氨基酸，這可以通過DNA測序證實。
159(Q8L)隨機化的子文庫。進行克隆159(Q8L)克隆的FG環(huán)的寡誘變，三步延伸和擴增。為了第一次延伸，以相等的濃度(每次100pmol)混合引物對(aF1U2/F2，bF3159/F4，cF5159/F6，dF7X6159/F8)，并擴增10個循環(huán)。為了第二次延伸，合并第一次反應(yīng)的1/20(a/b和c/d)，并繼續(xù)擴增另外10個循環(huán)。為了使擴增偏向有利于延伸而不是重新退火完全互補的片段，使用50pmolF1U2正向引物(對于片段ab)或C2asaiA20反向引物(對于片段cd)，進行半構(gòu)建產(chǎn)物的線性擴增(每次0.5pmol)另外20個循環(huán)。最后，合并延伸的半構(gòu)建片段ab和cd，并擴增20個循環(huán)，不加入其它組分。引物F7X6159在克隆159(Q8L)的前6個編碼位置中的每一個處，含有NNS，且與克隆159(Q8L)其它位置相同。通過來自最終PCR反應(yīng)的克隆的DNA測序，證實了文庫159(Q8L)-FGX6的正確裝配。子文庫含有約l×109克隆。
為了隨機化159(Q8L)-FGX6文庫的第6輪后(PR6)選擇合并物的DE環(huán)，使用引物F1U2/F4和F5X5/C2asaiA20，通過PCR制備了2個半構(gòu)建片段。F5X5引物在DE環(huán)的4個位置以及56位含有NNS。然后，將延伸的片段ab和cd合并，并擴增20個循環(huán)，不加入其它組分。
點突變，缺失和隨機的(NNS)環(huán)序列向基于纖連蛋白的支架蛋白中的導(dǎo)入 使用VR28克隆作為模板，在2步PCR中，將VR28結(jié)合劑的支架突變T(69)I校正回野生型序列。合并用引物N-末端正向/DEFG反向和DEFG正向/C-末端polyA得到的半構(gòu)建片段，并使用引物T7TMV Fn和MK165-4A20，構(gòu)建完整的VR28(I69T)克隆(在本文中稱作VR28)。用引物N-末端正向/C-末端polvA，通過PCR校正克隆159中的N-末端突變(Q8至L)，隨后用引物T7TMV Fn和MK165-4 A20延伸。
使用引物T7 TMV N-末端缺失和MK165-4 A20，通過擴增，將缺失Δ1-8導(dǎo)入基于纖連蛋白的支架蛋白的N-末端。
通過2步PCR，進行含有NNS環(huán)序列的E克隆的嵌合體的構(gòu)建。使用引物T7 TMV N-末端缺失/BCDE反向(aE克隆的BC環(huán))；N-末端正向/hfOl BC反向(bBC NNS)；BCDE正向/Front FG反向(cE克隆的DE環(huán))；BCDE正向/hfUl DE反向(dDE NNS)；hfDl DE-FG正向/hfO1 RT-Flag PolyA反向(eE克隆的FG)；hfDl DE-FG正向/hfO1 FG反向(fFG NNS)，擴增環(huán)區(qū)域。合并片段b/c/e，a/d/e，a/c/f，通過延伸構(gòu)建完整的合并物，并使用引物T7Tmv N-末端缺失和hf01RTFlagPolyA反向擴增。
通過DNA測序，驗證和/或分析了所有的構(gòu)建體。所有的構(gòu)建體和誘變文庫在5′側(cè)翼區(qū)含有T7 TMV啟動子，在3′側(cè)翼區(qū)含有Flag標(biāo)志或His6標(biāo)志序列，其用于RNA-蛋白融合體體外生產(chǎn)和純化。
RNA-蛋白融合體生產(chǎn) 對于每輪的選擇PCR，使用MegaScript轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)，在37℃轉(zhuǎn)錄DNA 4小時。通過DNA酶I(Ambion)在37℃消化20分鐘，去除模板DNA。通過苯酚/氯仿萃取，隨后在NAP-25柱(Amersham)上凝膠過濾，純化RNA。如前所述(Kurz等，Nuc.Acid Res.2883，2000)，合成了嘌呤霉素接頭PEG6/10(5′Pso u agc gga ugc XXX XXXCC Pu3′，其中Pso＝C6-補骨脂素，u，a，g，c＝2′OMe-RNA，C＝標(biāo)準(zhǔn)的amidities，X間隔基亞磷酰胺9(9-O-二甲氧三苯甲基-三乙二醇，1-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺)；Pu＝嘌吟霉素-CPG)。在0.1MNaCl，25mM TrisHCl，pH 7.0中，通過從85℃至4℃的梯度溫度降低，將接頭退火至文庫RNA。然后，通過暴露于紫外線(365nm)15分鐘，交聯(lián)接頭和RNA。在有35S-標(biāo)記的甲硫氨酸存在下，使用兔網(wǎng)織紅細胞裂解物翻譯試劑盒(Ambion)，在30℃，將交聯(lián)的混合物(600pmolRNA)包含在體外翻譯反應(yīng)中60分鐘。為了增強融合體形成，將0.5MKCl和0.05M MgCl2加入反應(yīng)中，并在4℃溫育30分鐘。使用如下的寡-dT纖維素(Sigma)色譜，純化融合分子。將翻譯和融合混合物稀釋進緩沖液A(100mM TrisHCl，1M NaCl，0.05％Tween-20，pH 8.0)，并加入寡dT纖維素。在4℃旋轉(zhuǎn)料漿1小時，轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)柱。用10倍柱體積緩沖液A，洗滌在柱上的寡dT纖維素珠，并用3倍柱體積H2O洗脫。使用引物Hu3′FLAGSTOP，在42℃，用SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1小時。為了減少潛在的通過反應(yīng)性半胱氨酸的非-特異性結(jié)合，在選擇過程中，使巰基與1mM 2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)或N-己基馬來酰亞胺(NEM)交替地反應(yīng)。反應(yīng)在室溫進行1小時。使用M2瓊脂糖(Sigma)，通過抗-FLAG親合色譜，進一步純化融合分子。將M2珠子加入反應(yīng)，并在4℃，在緩沖液B(1X PBS，0.02％Triton X100)中旋轉(zhuǎn)1小時。然后，將珠子加樣到旋轉(zhuǎn)柱，用5柱體積緩沖液B洗滌，用3柱體積在緩沖液G中的100uM Flag肽DYKDDDDK(Sigma)洗脫融合分子?；谕ㄟ^樣品中的35S-甲硫氨酸的閃爍計數(shù)測得的比活性，計算融合體產(chǎn)率。
對于159(Q8L)隨機化的文庫，使用流水線的半自動化的方法，在KingfisherTM(ThermoLabSystems)中，制備了RNA-蛋白融合體。除了下述的幾個步驟外，步驟類似于上述的方法。在緩沖液C(100mMTrisHCl，60mM EDTA，1MNaCl，0.05％Triton X100，pH 8.0)中，在磁性的寡dT珠子(GenoVision)上，進行RNA-蛋白融合分子的純化。用10反應(yīng)體積緩沖液Ca(100mM Tris HCl，1M NaCl，0.05％ Triton X100，pH 8.0)洗滌珠子，用1體積H2O洗脫融合蛋白。使用引物C2RT進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。使用Ni-NTA磁珠(Qiagen)，通過His-tag親合色譜，進一步純化融合蛋白。在室溫，將RT反應(yīng)物與Ni-NTA珠子在緩沖液D(2M NaCl，0.05％Triton)中溫育20分鐘，然后，用10反應(yīng)體積緩沖液E(1X PBS，0.05％Triton X100，pH 7.4)洗滌珠子，用1體積緩沖液F(IX PBS，0.05％ Triton X100，100mM咪唑，pH 7.4)洗脫融合分子。
選擇 針對KDR的一級選擇。將融合體文庫(約1013個克隆，在1ml中)與150μl蛋白A珠子(Dynal)一起溫育，在選擇之前，該蛋白A珠子與200nM人IgG1一起在30℃預(yù)固定化1小時，以減少與蛋白A珠子和Fc蛋白的非-特異性結(jié)合(預(yù)清除)。然后，在30℃，在傾覆旋轉(zhuǎn)下，將上清液與KDR-Fc嵌合體一起在緩沖液G(50mM HEPES，150mM NaCl，0.02％ TritonX-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鮭精DNA，pH 7.4)中溫育1小時。KDR-Fc的終濃度是250nM(對于第1輪)，100nM(對于第2-4輪)和10nM(對于第5和6輪)。在30℃，在傾覆旋轉(zhuǎn)下，將靶捕獲到300μl蛋白A珠子(第1輪)或100μl蛋白A珠子(第2-6輪)上30分鐘，用1ml緩沖液G(50mMHEPES，150mM NaCl，0.02％TritonX-100，pH 7.4)洗滌珠子5次。用100μl 0.1M KOH，將結(jié)合的融合分子洗脫進50μl 1M TrisHCl，pH 8.0中。使用側(cè)接引物T7TMV Fn和MKl 65-4 A20，通過PCR，從洗脫物擴增DNA。
KDR結(jié)合劑VR28的親合力和特異性成熟。通過如上所述的超突變PCR或定向于寡核酸的誘變，誘變克隆VR28，并構(gòu)建融合體子文庫。在用蛋白A珠子預(yù)清除后，根據(jù)上述的方法，在緩沖液I(1xPBS，0.02％TritonX-100，1mg/ml牛血清白蛋白，0.1mg/ml鮭精DNA，pH 7.4)中選擇4輪。使用引物T7TMV Fn和MK165-4 A20，通過PCR，擴增洗脫的DNA。對于源自寡誘變的文庫，使用更低的靶濃度(對于前4輪選擇，0.1nM KDR)，然后，對于3輪其它的選擇，導(dǎo)入1nM小鼠VEGF-R2(Flk-1)。引物T7TMV N-末端缺失和MK165-4 A20用于最后3輪的PCR。
對于KDR結(jié)合劑159的特異性成熟，通過如上所述的PCR，隨機化克隆159Q(8)L的FG環(huán)的前6個位置。在室溫，在緩沖液I中，進行融合體子文庫與生物素化的小鼠VEGF-R2(70nM)的結(jié)合30分鐘。在KingfisherTM(ThermoLabSystems)中，繼續(xù)剩余的選擇步驟。將生物素化的靶捕獲到50μl抗生物素蛋白鏈菌素-包被的磁珠(Dynal)上，并用10體積緩沖液I和1體積緩沖液J(lxPBS，0.02％TritonX-100，pH 7.4)洗滌珠子。用100μl 0.1M KOH，將結(jié)合的融合分子洗脫進50μl 1M TrisHCl，pH 8.0中。使用引物F1U2和C2asaiA20，通過PCR，擴增洗脫的DNA。選擇4輪后，如下進行另外2輪針對7nM Flk-1的解離速度/重新結(jié)合選擇。使用生物素化的小鼠Flk-1的結(jié)合反應(yīng)已經(jīng)進行30分鐘后，加入100倍過量的未生物素化的Flk-1，繼續(xù)反應(yīng)另外6小時，進行弱結(jié)合劑解離的時間。將生物素化的靶捕獲到50μl抗生物素蛋白鏈菌素珠子(Dynal)上，并用1ml緩沖液J洗滌珠子5次。通過在75℃溫育5分鐘，洗脫結(jié)合的融合分子。將上清液重新結(jié)合到7nM Flk-1，并繼續(xù)標(biāo)準(zhǔn)的選擇步驟。對來自最后的洗脫合并物的DNA進行DE環(huán)隨機化(見上文)，并針對7nM小鼠VEGF-R2選擇融合體子文庫3個輪。在第4輪，利用與1nM人VEGF-R2的重新結(jié)合，進行解離速度選擇。使用引物F1U2和C2asaiA20，通過PCR，從洗脫物擴增最終的DNA。
放射平衡結(jié)合測定 為了制備用于分析的35S-標(biāo)記的結(jié)合蛋白，如上所述制備了用于RNA-蛋白融合體生產(chǎn)的mRNA，但是省略了接頭連接步驟。在有35S-標(biāo)記的Met存在下，使用兔網(wǎng)織紅細胞裂解物翻譯試劑盒(Ambion)，在30℃表達mRNA 1小時。在如上所述的M2-瓊脂糖Flag珠子(Sigma)上，純化表達的蛋白。該方法生產(chǎn)了沒有核酸尾的編碼的蛋白。在直接的結(jié)合測定中，將濃度范圍為0-200nM的VEGF-R2-Fc融合體加入恒定濃度的純化的蛋白(0.2或0.5nM)中，并在30℃，在緩沖液B中溫育1小時。使用KingfisherTM，使用蛋白A磁珠，在室溫捕獲受體-結(jié)合劑復(fù)合物另外10分鐘。用6倍反應(yīng)體積緩沖液B中洗滌珠子。用100μL 0.1M KOH，從珠子洗脫蛋白。在LumaPlate-96(Packard)上，干燥50μL反應(yīng)混合物和洗脫液，使用TopCount NXT裝置(Packard)，測量平板上的35S的量。將結(jié)合到靶上的基于纖連蛋白的支架蛋白的量，估計為從蛋白A磁珠洗脫的放射活性相對于反應(yīng)混合物中的放射活性的百分比。通過測量在沒有KDR-Fc的情況下的結(jié)合，檢測基于纖連蛋白的支架蛋白向珠子的非特異性結(jié)合，并代表小于1-2％輸入。通過從總結(jié)合減去非特異性結(jié)合，得到特異性結(jié)合。使用GraphPad Prizm軟件(GraphPad Software，Inc，San Diego，CA)，分析數(shù)據(jù)，使用單位點、非線性結(jié)合方程進行擬合。
可溶的基于纖連蛋白的支架蛋白結(jié)合劑的表達和純化 為了在大腸桿菌中表達，將后面跟隨His6標(biāo)志的每個克隆的殘基1-101克隆進pET9d-衍生的載體中，并在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細胞(Invitrogen)中表達。使用20ml過夜培養(yǎng)物接種1升含有50g/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37℃生長到A600 0.4-0.6。用1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG，Invitrogen)誘導(dǎo)后，培養(yǎng)物在37℃生長另外3小時，通過在3,000g、4℃離心30分鐘收獲。將細胞沉淀重新懸浮到50mL裂解緩沖液K(50mMNaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，5mM CHAPS，25mM咪唑，1xCompleteTM蛋白酶抑制劑混合物(Roche)，pH 8.0)中，以80W，4個間隔10秒間歇的15秒脈沖，在冰上超聲處理。通過在3,000g、4℃離心30分鐘，分離可溶級分。在4℃，用10mL洗滌緩沖液L(50mM NaH2PO4，0.5M NaCl，5％甘油，25mM咪唑，pH 8.0)預(yù)平衡的TALONTMSuperflowTM金屬親合樹脂(Clontech)，旋轉(zhuǎn)上清液1小時。然后，用10倍柱體積緩沖液L和30倍柱體積緩沖液M(1xPBS，pH 7.4，25mM咪唑，pH 7.4)洗滌樹脂。用5倍柱體積緩沖液N(1xPBS，250mM咪唑，pH 7.4)洗脫蛋白，并在4℃，在1xPBS中滲析。通過0.22μm(Millipore)過濾，去除所有沉淀。
可溶的基于纖連蛋白的支架蛋白的BIAcore分析 使用BIAcore2000生物傳感器(Pharmacia Biosensor)，測量了基于纖連蛋白的支架蛋白結(jié)合蛋白與靶的結(jié)合動力學(xué)。將人和小鼠VEGF-R2-Fc融合體固定到CM5傳感器芯片上，并以0-100nM的濃度范圍，注射在緩沖液O(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween 20，pH7.4)中的可溶的結(jié)合蛋白。在每個濃度得到傳感圖，并使用程序BIAEvaluation 2.0(BIAcore)評價，以確定速度常數(shù)ka(kon)和kd(koff)。從速度常數(shù)skoff/kon的比率，計算出親合常數(shù)KD。
為了抑制實驗，將人VEGF165固定化到CM-5芯片的表面上，在范圍為0-100nM的不同濃度的可溶結(jié)合蛋白存在下，以20nM的濃度注射KDR-Fc。在僅僅觀察到50％KDR-Fc與芯片的結(jié)合的濃度，檢測IC50。
VEGFR結(jié)合多肽的可逆重新折疊 在100mM醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)中的M5FL蛋白上，進行差示掃描量熱法(DSC)分析。通過以每分鐘1度的速度，使溫度從5升高到95℃，在N-DSC II熱量計(Calorimetry Sciences Corp)中進行初步的DSC運行(掃描1)，隨后反向掃描(未顯示)回10度，隨后二次運行(掃描2)。在這些條件下，使用2個轉(zhuǎn)換模型(Tm＝77℃和67℃，使用Orgin軟件(OrginLab Corp))，對數(shù)據(jù)進行最佳擬合。見圖10。
M5FL蛋白的聚乙二醇化 使用C100-形式的M5FL蛋白，其具有M5FL的完全序列，在100位的Ser突變成包含另外的C末端His-tag的半胱氨酸，來純化蛋白。通過綴合各種馬來酰亞胺-衍生的PEG形式(Shearwater)，在單個的半胱氨酸殘基修飾純化的M5FL-C 100蛋白。在4-12％聚丙烯酰胺凝膠上，對得到的反應(yīng)蛋白進行電泳(圖11)。
細胞系的構(gòu)建 質(zhì)粒構(gòu)建。通過2步PCR方法，構(gòu)建了質(zhì)粒，其編碼嵌合的受體，后者由融合到KDR，F(xiàn)lk-1，或人TrkB的胞外結(jié)構(gòu)域上的人促紅細胞生成素受體(EpoR)的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。從編碼完整受體基因的質(zhì)粒，擴增編碼胞外結(jié)構(gòu)域的PCR產(chǎn)物利用引物5-RI-hKDR-lB/3-EPO/hKDR-2312B，從克隆PR1371_H11(OriGene Technologies，Rockville，MD)衍生KDR(氨基酸1-764)，利用引物5-RI-mKDR-1/3-EPO/mKDR-2312，從克隆#4238984(IMAGE)衍生flk-1(氨基酸1-762)，利用引物5-RI-hTrkB-1/3-EpoR/hTrkB-1310，從克隆#X75958(Invitrogen Genestorm)衍生人TrkB(氨基酸1-430)。利用共同引物3-XHO-EpoR-3066和3個基因特異性的引物5-hKDR/EPO-2274B(KDR)，5-mKDR/EPO-2274(flk-1)，和5′hTrkB/EpoR-1274(人TrkB)之一，后者能添加與受體片段PCR產(chǎn)物末端互補的短序列，從克隆#M60459(Invitrogen Genestorm)擴增編碼EpoR跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸251-508)的PCR產(chǎn)物。其次，混合編碼2半嵌合基因的PCR產(chǎn)物，并用3-XHO-EpoR-3066和對在擴增的前面循環(huán)中使用的每個基因特異性的5′引物(5-RI-hKDR-lB，5-RI-mKDR-1，和5-RI-hTrkB-1)擴增。用EcoRI和XhoI消化得到的PCR產(chǎn)物，并克隆進pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，產(chǎn)生質(zhì)粒phKE8(人KDR/EpoR融合體)，pmKE2(flk-1/EpoR融合體)，和phTE(TrkB/EpoR融合體)。
用于流式細胞術(shù)的細胞系的構(gòu)建。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用單獨的pcDNA 3.1(Invitrogen)、單獨的pmKE2或pcDNA 3.1和編碼全長人KDR的質(zhì)粒(Origene Inc.，克隆PR1371-H11)的混合物，穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了CHO-K1細胞(American Type CultureCollection，Manassas，VA)。選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子，并在有0.5mg/ml遺傳霉素(Invitrogen)存在下維持。通過轉(zhuǎn)染的群體的熒光活化的細胞篩分，隨后用抗-KDR多克隆抗血清(R&D Systems)染色，得到了稱作CHO-KDR的人KDR-表達克隆和稱作CHO-Flk的鼠VEGFR-2/EpoR-嵌合體-表達群體。在補充了10％(v/v)胎牛血清(FBS)，0.5mg/ml遺傳霉素，100U/ml青霉素，0.25μg/ml兩性霉素B，100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM；Gibco)中，常規(guī)培養(yǎng)CHOKDR和CHO-Flk細胞系。
Ba/F3細胞系的構(gòu)建。通過用phKE8或pmKE2，由融合到人促紅細胞生成素受體的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上的人或鼠VEGFR-2胞外結(jié)構(gòu)域(見上文)組成的受體嵌合體轉(zhuǎn)染鼠前-B細胞系Ba/F3(DSMZ，Braunschweig，Germany)，構(gòu)建了能反應(yīng)于VEGFR-2的VEGF結(jié)合進行增殖的細胞系。將Ba/F3細胞維持在補充了來自作為基本生長因子來源的WEHI-3B細胞(DSMZ；在Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基(Gibco)/10％FBS/25μM β-巰基乙醇中生長)的10％條件培養(yǎng)基的基本Ba/F3培養(yǎng)基(RPMI-1640(Gibco)，含有10％FBS，100U/ml青霉素，0.25μg/ml兩性霉素B，100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺)中。用質(zhì)粒pmKE2或phKE8電穿孔后，在0.75mg/ml遺傳霉素中選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。將遺傳霉素-抗性的群體轉(zhuǎn)移到含有100ng/ml人VEGF165(R&D Systems)的基本Ba/F3培養(yǎng)基，將得到的VEGF-依賴性的群體稱作Ba/F3-Flk和Ba/F3-KDR。使用質(zhì)粒phTE和人NT-4(R&D Systems)，類似地構(gòu)建能表達嵌合的TrkB受體(Ba/F3-TrkB)的對照細胞系，該TrkB受體能對NT-4(TrkB的天然配體)的刺激作出反應(yīng)。
分析基于纖連蛋白的支架蛋白的細胞表面結(jié)合 通過流式細胞術(shù)，在VEGF-R2-表達和對照細胞上，同時分析了基于纖連蛋白的支架蛋白與細胞-表面KDR和Flk-1的結(jié)合。用胰蛋白酶EDTA，使CHO-pcDNA3細胞(對照)從它們的培養(yǎng)皿中釋放，在沒有鈣和鎂的Dulbecco氏PBS中(D-PBS-；Invitrogen)洗滌，并用1.5μMCMTMR(5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲?；?氨基)-四甲基若丹明)(Molecular Probes)在37℃染色30分鐘。在D-PBS-中洗滌細胞，并在37℃另外溫育30分鐘，然后重新懸浮到冰上的封閉緩沖液(D-PBS-/10％胎牛血清)中。同樣處理CHO-KDR或CHO-Flk細胞，只是省略CMTMR。在V-底96-孔平板的每個孔中，將75,000CMTMR-染色的CHO-pcDNA3細胞與相等數(shù)量的未染色的CHO-KDR或CHO-Flk細胞相混合。在25μl/孔的封閉緩沖液中，稀釋所有抗體和基于纖連蛋白的支架蛋白，每個處理在4℃進行1小時。用His6-標(biāo)記的基于纖連蛋白的支架蛋白對細胞混合物染色，用冷D-PBS-洗滌2次，然后用2.5μg/ml抗-His6 MAb(R&D Systems)處理，洗滌，并用4μg/ml Alexa熒光素488-綴合的抗-小鼠抗體(Molecular Probes)染色。對于用抗-KDR小鼠單克隆抗體(Accurate Chemical，Westbury，NY)或抗-flk-1山羊多克隆抗體(R&D Systems)處理的細胞，省略抗-His6步驟，并用對物質(zhì)合適的Alexa熒光素488綴合的第二抗體(Molecular Probes)檢測抗體結(jié)合。染色后，將細胞重新懸浮到200μl/孔D-PBS-/1％FBS/1μg/ml7-氨基放線菌素D(7-AAD；Molecular Probes)中，并在配備了488nM激光的FACSCalibur(Becton Dickinson，San Jose，CA)上，通過流式細胞術(shù)分析。門控排除死亡的細胞(7-AAD陽性)后，通過門控CMTMR-陰性或-陽性群體，分別獨立地測量了VEGFR-2-表達細胞和CHO-pcDNA3細胞的Alexa熒光素488熒光。對照實驗表明，用CMTMR染色不會干擾在染色的細胞表面上的Alexa熒光素488綴合的抗體的檢測。
還使用上述的第二抗體，通過熒光顯微術(shù)，評價了細胞表面結(jié)合。為了這些研究，在含有鈣和鎂的D-PBS(D-PBS+)/10％FBS中，稀釋抗體。在24或96-孔平板中培養(yǎng)細胞，染色后保持在D-PBS+中，用于反相熒光顯微鏡觀察。
Ba/F3細胞增殖測定 在基本Ba/F3培養(yǎng)基中，洗滌Ba/F3細胞3次，并重新懸浮到含有15.8ng/ml增殖因子(對于Ba/F3-KDR，Ba/F3-Flk，或Ba/F3-TrkB細胞，分別是人VEGFR165，鼠VEGFR164，或hNT-4)的相同培養(yǎng)基中，將含有5×104Ba/F3-KDR細胞或2×104Ba/F3-Flk或Ba/F3-TrkB細胞的95μl加入96-孔組織培養(yǎng)板的每個孔。將在PBS中的測試蛋白的5μ1系列稀釋液加入每個孔中，達到100μl Ba/F3培養(yǎng)基/5％PBS/15ng/ml生長因子的終體積。在37℃溫育72小時后，通過向每個孔中加入20μl CellTiter 96_Aqueous One Solution試劑(Promega)，測量增殖，在37℃溫育4小時，使用微量滴定板讀數(shù)器(Molecular Dynamics)，測量在490nm的吸光度。
HUVEC細胞增殖測定 在EGM-2培養(yǎng)基(Clonetics)中，培養(yǎng)來自2-6代的HUVEC細胞(Clonetics，Walkersville，MD)。將5000細胞/孔重新懸浮到200μl饑餓培養(yǎng)基(等體積的DMEM(Gibco)和F-12K培養(yǎng)基(ATCC)，補充了0.2％胎牛血清和1x青霉素/鏈霉素/fungizone溶液(Gibco))中，涂布96-孔組織培養(yǎng)板，溫育48小時。將基于纖連蛋白的結(jié)合蛋白加入孔中，在37℃溫育1小時，然后加入人VEGF165，至16ng/ml的終濃度。溫育48小時后，通過加入30μl/孔的1.9mg/ml CellTiter96_AQueousMTS試劑(Promega)和44μg/ml吩嗪硫酸甲酯(Sigma)的混合物，測量細胞存活率，并如上所述測量Ba/F3細胞在490nm的吸光度。
實施例12基于抗體輕鏈的VEGFR結(jié)合多肽 圖21A和21B顯示了基于抗體輕鏈可變區(qū)(VL)構(gòu)架/支架的VEGFR結(jié)合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO241-310)。
如上所述關(guān)于10Fn3-衍生的蛋白的使用，使用PROfusionTM系統(tǒng)，產(chǎn)生了輕鏈可變域蛋白。
在本文中引用的所有文獻都在這里整體引作參考。
表1優(yōu)選的特異性的肽序列 KDR和FLK結(jié)合劑 表2 KDR&FLK結(jié)合劑
表2 KDR&FLK結(jié)合劑
表2 KDR&FLK結(jié)合劑
表2 KDR&FLK結(jié)合劑
表3 KDR結(jié)合劑
表3 KDR結(jié)合劑
表3 KDR結(jié)合劑
表3 KDR結(jié)合劑
表3 KDR結(jié)合劑
表4表征的VEGF-R2結(jié)合克隆的序列
表5在放射平衡結(jié)合測定中測得的trinectin結(jié)合劑 與KDR-Fc的親合力 表6在放射平衡結(jié)合測定中測得的trinectin結(jié)合劑與 KDR和Flk-1的親和力 表7通過BIAcore測定檢測Ka，Kd和Kd 表8與KDR(CHO KDR)和Flk-1(CHO Flk-1)表達 細胞的結(jié)合 表9VEGF-誘導(dǎo)的KDR(Ba/F3-KDR)和Flk-1 (Ba/F3-Flk)表達細胞的增殖的抑制 表10VEGF-誘導(dǎo)的HUVEC細胞的增殖的抑制 表1權(quán)利要求
1.基本上純的、結(jié)合人KDR的單結(jié)構(gòu)域多肽，該多肽包含約80-約150個氨基酸，其具有包含下組的結(jié)構(gòu)組織
a)至少5-7個分布在至少2個β折疊中的β鏈或β樣鏈，和
b)至少1個連接2個β鏈或β樣鏈的環(huán)部分，該環(huán)部分參與結(jié)合KDR，
其中單結(jié)構(gòu)域多肽以小于1×10-6M的解離常數(shù)(KD)結(jié)合人KDR蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽包含免疫球蛋白可變域。
3.權(quán)利要求2的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述免疫球蛋白可變域選自人VL結(jié)構(gòu)域，人VH結(jié)構(gòu)域和camelid VHH結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求2的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該多肽包含3個參與結(jié)合KDR的環(huán)部分，且其中每個所述的環(huán)部分連接2個β鏈。
5.權(quán)利要求1的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽包含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求5的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域是纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中Fn3結(jié)構(gòu)域以從N-末端至C-末端的順序包含，
a)β鏈或β樣鏈，A；
b)環(huán)，AB；
c)β鏈，B；
d)環(huán)，BC；
e)β鏈C；
f)環(huán)CD；
g)β鏈D；
h)環(huán)DE；
i)β鏈F；
j)環(huán)FG；和
k)β鏈或β樣鏈，G。
8.權(quán)利要求7的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中環(huán)FG參與KDR結(jié)合。
9.權(quán)利要求7的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中環(huán)BC，DE和FG參與KDR結(jié)合。
10.權(quán)利要求9的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中每個β鏈基本上由與SEQ IDNO5的對應(yīng)β鏈序列至少80％相同的氨基酸序列組成。
11.權(quán)利要求10的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中環(huán)AB，CD和EF中的每一個基本上由與SEQ ID NO5的對應(yīng)環(huán)序列至少80％相同的氨基酸序列組成。
12.權(quán)利要求1的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽包含與SEQID NO5的序列至少60％相同的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求5的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該多肽包含3個參與結(jié)合KDR的環(huán)部分，每個環(huán)部分連接2個β或β樣鏈。
14.權(quán)利要求1-13中的任一項的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中參與KDR結(jié)合的環(huán)具有選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的序列。
15.權(quán)利要求1-13中的任一項的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該多肽結(jié)合到能使該多肽在哺乳動物中的清除速度比未修飾的多肽減少超過3倍的部分上。
16.權(quán)利要求15的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述能減少清除速度的部分是聚乙二醇部分。
17.權(quán)利要求16的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述聚乙二醇部分具有2-100kDa的分子量。
18.權(quán)利要求16的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述聚乙二醇部分共價鍵合到該單結(jié)構(gòu)域多肽中的硫醇部分或胺部分。
19.權(quán)利要求1的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該多肽結(jié)合到標(biāo)記部分上。
20.權(quán)利要求1-13中的任一項的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽以小于1×10-7M的解離常數(shù)(KD)結(jié)合到人KDR蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域上，并抑制KDR-介導(dǎo)的VEGF活性。
21.權(quán)利要求1-13中的任一項的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽與VEGF-A的VEGF165同種型相競爭地結(jié)合KDR。
22.權(quán)利要求1-13中的任一項的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽與VEGF-A和VEGF-D相競爭地結(jié)合KDR。
23.權(quán)利要求1-13中的任一項的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽也以小于1×10-6的KD結(jié)合小鼠Flk1的胞外結(jié)構(gòu)域。
24.包含SEQ ID NO192的氨基酸序列的多肽。
25.權(quán)利要求24的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO193的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求24的多肽，其包含SEQ ID NO194的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求26的多肽，其中聚乙二醇部分共價鍵合到93位的半胱氨酸殘基上。
28.權(quán)利要求27的多肽，其中聚乙二醇部分具有約10kDa至約60kDa的分子量。
29.基本上純的多肽，其包含與SEQ ID NO1-4中的任一個的序列至少85％相同的氨基酸序列，其中所述的多肽結(jié)合KDR，并與VEGF-A競爭結(jié)合KDR。
30.權(quán)利要求29的基本上純的多肽，其包含與SEQ ID NO6-183，186-197，和199中的任一個的序列至少85％相同的氨基酸序列。
31.權(quán)利要求30的多肽，其中所述的多肽包含SEQ ID NO6-183，186-197，和199中的任一個的序列。
32.權(quán)利要求29的多肽，其中所述的多肽能抑制VEGF的生物活性。
33.權(quán)利要求29的多肽，其中所述的多肽以50nM或更小的KD結(jié)合所述KDR。
34.權(quán)利要求29的多肽，其中所述多肽以小于1XIO-7M的解離常數(shù)(KD)結(jié)合人KDR蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，并抑制KDR-介導(dǎo)的VEGF活性。
35.治療制劑，其包含權(quán)利要求1-13和24-34中的任一項的多肽，和藥學(xué)上可接受的載體。
36.抑制細胞中的VEGF生物活性的方法，其包含使所述細胞接觸權(quán)利要求20的多肽，接觸量和時間足以抑制所述VEGF生物活性。
37.治療具有VEGF的抑制引起的狀況的對象的方法，所述方法包含向所述對象施用有效量的權(quán)利要求20的多肽，其中所述多肽抑制VEGF的生物活性。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述的狀況是特征在于不適當(dāng)?shù)难苌傻臓顩r。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述的狀況是過度增殖的狀況。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述的狀況選自自身免疫病癥，炎性病癥，視網(wǎng)膜病，和癌癥。
41.檢測樣品中的VEGFR-2的方法，所述方法包含
a)使所述樣品接觸權(quán)利要求1-13和24-34中的任一項的多肽，其中所述的接觸是在允許多肽-VEGFR-2復(fù)合物形成的條件下進行；和
b)檢測所述的復(fù)合物，從而檢測所述樣品中的所述VEGFR-2。
42.權(quán)利要求41的方法，其中使用選自下組的技術(shù)進行所述檢測射線照相術(shù)，免疫測定，熒光檢測，質(zhì)譜，或表面等離振子共振。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述的樣品是生物樣品。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述的生物樣品是從人采取的樣品，且其中所述的VEGFR-2是KDR。
45.權(quán)利要求41的方法，其中用標(biāo)記部分可檢測地標(biāo)記所述多肽。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述的標(biāo)記部分選自放射性部分，熒光部分，發(fā)色部分，化學(xué)發(fā)光部分，和半抗原部分。
47.權(quán)利要求41的方法，其中所述的多肽固定在固體支持物上。
48.具有改進的藥物動力學(xué)性質(zhì)的靶結(jié)合10Fn3多肽，該多肽包含
a)具有約80-約150個氨基酸的10Fn3結(jié)構(gòu)域，其中所述10Fn3結(jié)構(gòu)域的至少1個環(huán)參與靶結(jié)合；和
b)共價地結(jié)合的聚乙二醇(PEG)部分，
其中所述的Fn3多肽以小于100nM的KD結(jié)合靶，且具有在哺乳動物中小于30mL/hr/kg的清除速度。
49.權(quán)利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分結(jié)合到硫醇部分或胺部分上。
50.權(quán)利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分通過定點聚乙二醇化結(jié)合到10Fn3多肽上。
51.權(quán)利要求50的10Fn3多肽，其中PEG部分結(jié)合到Cys殘基上。
52.權(quán)利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分結(jié)合在選自下組的10Fn3多肽上的位置
a)N-末端；
b)N-末端和大多數(shù)N-末端β鏈或β樣鏈之間；
c)位于與靶結(jié)合位點相對的多肽面上的環(huán)；
d)C-末端和大多數(shù)C-末端β鏈或β樣鏈之間；和
e)C-末端。
53.權(quán)利要求48的10Fn3多肽，其中PEG部分具有約2kDa至約100kDa的分子量。
54.權(quán)利要求48的10Fn3多肽，其中10Fn3多肽包含與SEQIDNO5至少60％相同的氨基酸序列。
55.向患者施用10Fn3多肽以達到相對于靜脈內(nèi)施用延遲的釋放的方法，該方法包含皮下施用10Fn3多肽，從而達到相對于靜脈內(nèi)施用向血流中延遲的釋放。
56.權(quán)利要求55的方法，其中10Fn3多肽的皮下施用達到10Fn3多肽的最大血清濃度，其小于通過靜脈內(nèi)施用相同劑量達到的最大血清濃度的一半。
57.權(quán)利要求55的方法，其中10Fn3多肽結(jié)合在增加10Fn3多肽的血清半衰期的部分上。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述部分是聚乙二醇部分。
59.權(quán)利要求55的方法，其中10Fn3多肽包含與SEQ ID NO5至少60％相同的氨基酸序列。
60.基本上純的、結(jié)合預(yù)選人靶蛋白和來自非-人物種的其同源物的單結(jié)構(gòu)域多肽，該多肽包含約80-約150個氨基酸，其具有包含下組的結(jié)構(gòu)組織
a)至少5-7個分布在至少2個β折疊中的β鏈或β樣鏈，和
b)至少1個連接2個β鏈或β樣鏈的環(huán)部分，該環(huán)部分參與結(jié)合預(yù)選人靶蛋白和其同源物，
其中該單結(jié)構(gòu)域多肽以小于5×10-8M的解離常數(shù)(KD)結(jié)合預(yù)選人靶蛋白和其同源物，且其中該同源物與預(yù)選人靶蛋白的至少100個氨基酸的序列至少80％相同。
61.權(quán)利要求60的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽包含免疫球蛋白可變域。
62.權(quán)利要求61的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述免疫球蛋白可變域選自人VL結(jié)構(gòu)域，人VH結(jié)構(gòu)域和camelid VHH結(jié)構(gòu)域。
63.權(quán)利要求61的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述多肽包含3個能參與結(jié)合預(yù)選人靶蛋白和其同源物的環(huán)部分，每個環(huán)部分連接β鏈或β樣鏈。
64.權(quán)利要求60的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中該單結(jié)構(gòu)域多肽包含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
65.權(quán)利要求64的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域是纖連蛋白III型(Fn3)結(jié)構(gòu)域。
66.權(quán)利要求65的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述Fn3結(jié)構(gòu)域以從N-末端至C-末端的順序包含，
a)β鏈或β樣鏈，A；
b)環(huán)，AB；
c)β鏈，B；
d)環(huán)，BC；
e)β鏈C；
f)環(huán)CD；
g)β鏈D；
h)環(huán)DE；
i)β鏈F；
j)環(huán)FG；和
k)β鏈或β樣鏈，G。
67.權(quán)利要求66的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中環(huán)FG參與靶蛋白結(jié)合。
68.權(quán)利要求66的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中環(huán)BC，DE和FG參與靶蛋白結(jié)合。
69.權(quán)利要求66的單結(jié)構(gòu)域多肽，其中每個β鏈或β樣鏈基本上由與SEQ ID NO5的對應(yīng)β鏈序列至少80％相同的氨基酸序列組成。
70.核酸，其包含編碼權(quán)利要求1的多肽的序列。
71.權(quán)利要求70的核酸，其中所述的核酸編碼選自SEQ ID Nos.6-183，186-197，199和241-310中的任一個的多肽。
72.核酸，其包含在嚴格條件下與SEQ ID NO184的核酸序列雜交的核酸序列，且編碼以小于1×10-6M的KD結(jié)合人KDR的多肽。
73.權(quán)利要求72的核酸序列，其中所述的核酸包含選自SEQ IDNO184和SEQ ID NO185的核酸序列。
74.表達載體，其包含可操作地連接到啟動子上的權(quán)利要求71的核酸。
75.細胞，其包含權(quán)利要求72的核酸。
76.生產(chǎn)結(jié)合KDR的多肽的方法，其包含表達包含編碼權(quán)利要求1的多肽的序列的核酸。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述核酸包含編碼選自SEQ ID Nos.6-183，186-197，199和241-310中的任一個多肽的序列。
78.權(quán)利要求76的方法，其中所述核酸包含在嚴格條件下與SEQID NO184的核酸序列雜交的序列。
79.權(quán)利要求76的方法，其中所述核酸在細胞中表達。
80.權(quán)利要求76的方法，其中所述核酸在無細胞系統(tǒng)中表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)－結(jié)合多肽和使用這些多肽抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的生物活性的方法。本發(fā)明還提供了與單結(jié)構(gòu)域結(jié)合多肽有關(guān)的各種改進。
文檔編號C07K14/47GK1946417SQ200480041450
公開日2007年4月11日 申請日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者Y·陳, E·格特馬諾瓦, M·C·賴特, A·哈里斯, A·C·林, J·戈克梅耶 申請人:阿德內(nèi)克休斯治療公司