專(zhuān)利名稱(chēng)：核心2GlcNAc－T抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及已知的和新型的化合物作為UDP-GlcNAcGalβ1，3GalNAc-R(GlcNAc→GalNAc)β1，6-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(核心2β1，6 N-乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶，核心2GlcNAc-T-EC 2.4.1.102)抑制劑的用途。
這種抑制劑可應(yīng)用于治療由核心2GlcNAc-T活性提高引起的疾病，具體的說(shuō)有炎性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病性心肌病、癌癥(包括癌癥轉(zhuǎn)移的治療和預(yù)防)或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
本發(fā)明發(fā)明人已確認(rèn)，如在本文描述的測(cè)定中所測(cè)量出的，本文描述的化合物可抑制葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性和葡萄糖誘導(dǎo)的人白細(xì)胞與培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。將這些化合物(下文稱(chēng)核心2GlcNAc-T抑制劑)給予患者，可通過(guò)抑制上述疾病狀態(tài)中的核心2GlcNAc-T活性提高，來(lái)預(yù)防或治療核心2O-聚糖和唾液酸化路易斯血型抗原X(sialyl Lewisx)的異常形成。
通過(guò)N-乙酰葡萄胺(GalNAc)連接到待糖基化蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基引發(fā)糖基化后，接著的O-聚糖加工步驟是延長(zhǎng)、分支和末端修飾。
O-聚糖延長(zhǎng)和分支的必需步驟由同源糖基轉(zhuǎn)移酶家族的多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶同種型催化。取決于有哪些糖基隨后連接到此最初GlcNAc殘基，O-聚糖可劃分為四種主要亞類(lèi)(

圖1)。核心1結(jié)構(gòu)通過(guò)添加半乳糖形成Galβ1-3GalNAc-αSer/Thr而形成。核心2結(jié)構(gòu)需要核心1結(jié)構(gòu)作為底物，通過(guò)添加GlcNAc形成Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc-αSer/Thr而形成。核心3結(jié)構(gòu)通過(guò)添加GlcNAc形成GlcNAcβ1-3GalNAc-αSer/Thr而形成。核心4結(jié)構(gòu)需要核心3結(jié)構(gòu)作為底物，通過(guò)添加GlcNAc形成GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc-αSer/Thr而形成。對(duì)核心GalNAc結(jié)構(gòu)的其它修飾也有發(fā)現(xiàn)，但似乎不常見(jiàn)。所有這些核心結(jié)構(gòu)通過(guò)半乳糖基化、唾液酸化、巖藻糖基化、硫酸化或延長(zhǎng)進(jìn)一步修飾，最終形成O-聚糖。
已知有三種形式的核心2GlcNAc-T。核心2GlcNAc-TI在白血病細(xì)胞中鑒定出，核心2GlcNAc-T II在黏蛋白分泌組織中鑒定出，第三種形式稱(chēng)核心2GlcNAc-T III，為胸腺相關(guān)類(lèi)型。
已知細(xì)胞表面O-聚糖在介導(dǎo)發(fā)育和某些疾病狀態(tài)中的細(xì)胞間相互作用中起到關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)糖基化模式在很大程度上由糖基轉(zhuǎn)移酶的活性和特異性決定，如高爾基體中表達(dá)的核心2GlcNAc-T(1-2)。核心2GlcNAc-T在O-連接聚糖的生物合成中起到關(guān)鍵作用(3-4)，代表了帶多聚乳糖胺的O-連接糖類(lèi)(即重復(fù)Galβ1-4GlcNAcβ1-3，與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的一種結(jié)構(gòu))延長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)步驟(5-6)。
已將核心2GlcNAc-T活性的變化與各種疾病狀態(tài)，如T細(xì)胞激活、癌癥、轉(zhuǎn)移、髓母細(xì)胞性白血病、心肌機(jī)能障礙和炎癥聯(lián)系起來(lái)(7-18)。核心2GlcNAc-T的調(diào)節(jié)據(jù)認(rèn)為極其重要，因?yàn)檫@種酶將乳糖胺結(jié)構(gòu)添加到基本核心寡糖及隨后的巖藻糖和唾液酸修飾，會(huì)導(dǎo)致形成Lewisx、sialyl-sialyl Lewisa和Lewisx糖基，它們構(gòu)成作為細(xì)胞黏著蛋白的選凝素的配體。此選凝素-配體相互作用在許多過(guò)程中起到重要的作用。
炎癥是身體對(duì)感染或某些其它形式的創(chuàng)傷作出反應(yīng)的一般方式。炎癥過(guò)程中的一個(gè)主要事件是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞從血流遷移到受感染或受損傷區(qū)域。一旦到了損傷部位，這些細(xì)胞即負(fù)責(zé)將外來(lái)因子隔離、破壞和清除。
急性炎癥的特征是持續(xù)時(shí)間短(幾分鐘至幾天)，其對(duì)于健康來(lái)說(shuō)是必需的，但有時(shí)炎癥過(guò)程并沒(méi)有在適當(dāng)時(shí)候結(jié)束，而正是這樣造成了問(wèn)題。慢性炎癥的特征有持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(幾天、幾個(gè)星期、幾個(gè)月甚至幾年)、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、組織破壞和修復(fù)以及血管增殖和纖維樣變性。炎癥也可由身體的正常成分不適當(dāng)?shù)赜|發(fā)，其在常見(jiàn)疾病如哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎性腸病中起作用。
已知許多細(xì)胞黏著分子參與炎癥過(guò)程。在炎癥部位，白細(xì)胞首先黏著于血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后進(jìn)行外滲過(guò)程。據(jù)假定，選凝素在白細(xì)胞初始黏著于內(nèi)皮細(xì)胞中起到關(guān)鍵作用。選凝素及其碳水化合物配體介導(dǎo)的細(xì)胞黏著導(dǎo)致白細(xì)胞在內(nèi)皮內(nèi)層(linings)上粘連和滾動(dòng)。這隨后導(dǎo)致繼發(fā)的牢固黏著。在初始刺激的幾小時(shí)內(nèi)，嗜中性粒細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入組織中，且可繼續(xù)變移多天。在某些發(fā)炎病癥中，組織損害由血管的直接損傷而造成，由嗜中性粒細(xì)胞隨后向組織中的募集而擴(kuò)大。
O-聚糖的表達(dá)減少了細(xì)胞間相互作用，這是因?yàn)檫@些加合物體積大的緣故。在所有這些病癥中，核心2O-聚糖的表達(dá)均由轉(zhuǎn)錄水平的核心2GlcNAc-T調(diào)節(jié)。抗原介導(dǎo)的外周T細(xì)胞和B細(xì)胞激活的特征是核心2GlcNAc-T活性提高，CD43上出現(xiàn)分支的O-聚糖(白涎蛋白)(19-20)。
白細(xì)胞外滲、淋巴細(xì)胞運(yùn)輸和其它過(guò)程涉及核心2GlcNAc-T所合成的O-聚糖。具體的說(shuō)，以sialyl Lewisx終止的細(xì)胞表面O-聚糖結(jié)構(gòu)參與白細(xì)胞向炎癥部位的募集。核心2GlcNAc-T對(duì)T細(xì)胞發(fā)育并不重要，但據(jù)顯示這種酶的過(guò)量表達(dá)完全阻斷骨髓譜系的發(fā)育。還據(jù)報(bào)告核心2O-聚糖的過(guò)量表達(dá)影響T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用(TB相互作用)。這種T-B相互作用對(duì)于體液免疫應(yīng)答來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的，其通過(guò)T細(xì)胞上的CD40配體(CD40L)與B細(xì)胞上的CD40的結(jié)合(CD40L-CD40相互作用)來(lái)介導(dǎo)。這種相互作用誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖。據(jù)顯示核心2O-聚糖的過(guò)量表達(dá)造成CD40L-CD40相互作用明顯減少。
有可能通過(guò)阻斷活化白細(xì)胞表面上的sialyl Lewisx合成，從而中斷白細(xì)胞與選凝素的相互作用，來(lái)有效地阻斷白細(xì)胞侵入的初始步驟的發(fā)生。因此，可降低核心2GlcNAc-T活性的核心2GlcNAc-T抑制劑在炎癥調(diào)節(jié)中具有效用。
動(dòng)脈粥樣硬化是機(jī)制未明的進(jìn)行性炎性疾病。循環(huán)白細(xì)胞向內(nèi)皮特別是動(dòng)脈分支和分叉處的內(nèi)皮的募集和黏著，是已知在動(dòng)脈粥樣化形成中出現(xiàn)的最早事件之一。然后白細(xì)胞上的整聯(lián)蛋白造成細(xì)胞間更強(qiáng)的連接。白細(xì)胞變移到內(nèi)皮下空間中，在這里它們開(kāi)始累積于血管內(nèi)膜中。單核細(xì)胞在氧化的低密度脂蛋白(LDL-oxLDL)存在下開(kāi)始轉(zhuǎn)化成活化巨噬細(xì)胞，這些活化巨噬細(xì)胞通過(guò)其清除受體吸收修飾類(lèi)型的脂蛋白，從而分化成泡沫細(xì)胞。對(duì)死于急性冠狀動(dòng)脈綜合征的患者的動(dòng)脈粥樣硬化冠狀動(dòng)脈進(jìn)行的組織學(xué)分析證明，在不穩(wěn)定或破裂的動(dòng)脈粥樣斑塊中存在泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞(49)。
在人動(dòng)脈粥樣硬化中已鑒定出至少三種白細(xì)胞黏著分子——E-選凝素、ICAM-1和VCAM-1(50，51)。此外，與正常血管不同的是，P選凝素由動(dòng)脈粥樣病斑中的上皮細(xì)胞過(guò)度表達(dá)，而已發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈內(nèi)腔中的E-選凝素(52)和ICAM-1(53)表達(dá)在有單核白細(xì)胞積累的動(dòng)脈節(jié)段中增高。第三種黏著分子VCAM-1已在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型中檢測(cè)出，且已顯示其在動(dòng)脈粥樣斑塊的內(nèi)膜中比在人冠狀動(dòng)脈的非動(dòng)脈粥樣硬化節(jié)段中更為普遍。
Chibber等(54)評(píng)估了核心2GlcNAc-T在白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著提高方面的重要性，發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者的白細(xì)胞中此酶的活性顯著提高。但是，迄今為止還沒(méi)有證據(jù)證明，動(dòng)脈粥樣硬化患者的循環(huán)白細(xì)胞中核心2GlcNAc-T活性提高。本發(fā)明發(fā)明人現(xiàn)已證明，動(dòng)脈粥樣硬化患者的循環(huán)白細(xì)胞中核心2GlcNAc-T酶活性確實(shí)提高，這提示能夠降低核心2GlcNAc-T活性的化合物將可用于治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，或者可用于防止動(dòng)脈粥樣斑塊在接受介入治療后的患者中重新出現(xiàn)。
雖然糖尿病性心肌病的臨床癥狀已得到鑒定，但其發(fā)病機(jī)理卻未確定。糖尿病性心肌病的定義描述糖尿病患者肌細(xì)胞的明確缺陷(例如導(dǎo)致心肌肥大和心舒張機(jī)能障礙的纖維樣變性)，也描述在糖尿病發(fā)病過(guò)程中發(fā)展的心臟相關(guān)變化。
現(xiàn)有強(qiáng)有力的證據(jù)提示，核心2GlcNAc-T活性提高是通常在糖尿病動(dòng)物和患者心臟組織中觀察到的復(fù)合糖增多的直接原因。為支持這一論斷，最近顯示在糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的心臟中，核心2GlcNAc-T活性提高造成類(lèi)似于在糖尿病多年患者的心臟中觀察到的病理狀況。研究是用存在由心臟肌球蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的核心2GlcNAc-T表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的。在第4個(gè)月，觀察到左心室明顯肥大，心臟全面肥大(16-17)。
核心2分支和核心2GlcNAc-T活性的明顯變化與惡性轉(zhuǎn)化、白血病和癌(21，33-36)有關(guān)。轉(zhuǎn)染T24H-ras的大鼠成纖維細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞在它們變成轉(zhuǎn)移瘤的過(guò)程中表達(dá)核心2O-聚糖(33)。
有眾多證據(jù)說(shuō)明核心2GlcNAc-T參與癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移。例如，高度轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞既比其低轉(zhuǎn)移性對(duì)等物表達(dá)更多的sialylLewisx，又比轉(zhuǎn)移性欠佳的細(xì)胞更堅(jiān)固地黏著E-選凝素。腫瘤細(xì)胞中的sialyl Lewisx表達(dá)與腫瘤進(jìn)展之間有很強(qiáng)的相關(guān)性(34)。此外，sialylLewisx在核心2O-聚糖中的表達(dá)與淋巴和靜脈侵入之間也存在很好的相關(guān)性。
最新的發(fā)現(xiàn)提示，核心2GlcNAc-T與α1，3-Fuc-T一起導(dǎo)致選凝素介導(dǎo)的口腔癌轉(zhuǎn)移(35)。此外，蛋白質(zhì)印跡分析揭示了主要約150kDa的糖蛋白的存在，所述糖蛋白攜有被sLex陽(yáng)性pre-B白血病細(xì)胞系中的抗sLex單克隆抗體所識(shí)別的α-連接寡糖。核心2GlcNAc-T與CD15表達(dá)之間的這種相關(guān)性提示，核心2GlcNAc-T是人pre-B淋巴樣細(xì)胞中sialyl Lewisx細(xì)胞表面表達(dá)的調(diào)節(jié)物。這些結(jié)果表明，原位雜交檢測(cè)出的核心2GlcNAc-T mRNA反映肺腺癌的惡性潛力，因?yàn)榱馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后的最有影響的因素。
通過(guò)轉(zhuǎn)染1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶而在小鼠黑素瘤B16-FI中表達(dá)sialylLewisx，也證實(shí)了sialyl LewisX在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要性。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞靜脈注射到小鼠中，形成大量的肺腫瘤節(jié)結(jié)，而母體B16-FI細(xì)胞則幾乎沒(méi)有形成腫瘤。
sialyl Lewisa、sialyl LewisX(兩者均為選凝素配體碳水化合物結(jié)構(gòu))的表達(dá)和核心2GlcNAc-T活性的提高，均與結(jié)腸直腸癌的惡性密切相關(guān)(36)。最近，Numahata(37)證明，原發(fā)性膀胱癌中的sialyl LewisX表達(dá)是侵入性和轉(zhuǎn)移性后果的預(yù)報(bào)因素。尚沒(méi)有其它迄今研究過(guò)的碳水化合物表位具有同等的預(yù)測(cè)價(jià)值。最近US 2004/0033521公開(kāi)說(shuō)，核心2GlcNAc-T在肝和胃腫瘤樣品及在結(jié)腸癌和肝轉(zhuǎn)移樣品中均過(guò)量表達(dá)。另外，WO 04/093662證明，核心2GlcNAc-T在前列腺癌、睪丸癌和膀胱癌中有提高。隨著核心2GlcNAc-T水平提高，疾病轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)也增加。
因此，預(yù)期核心2GlcNAc-T抑制劑將減少O-聚糖(例如攜有sialylLewisx的O-聚糖)的產(chǎn)生，從而減少癌癥侵入和轉(zhuǎn)移，可用于治療其中核心2GlcNAc-T表達(dá)超過(guò)該組織類(lèi)型正常水平的癌癥。
糖尿病性視網(wǎng)膜病是威脅視力的進(jìn)行性糖尿病并發(fā)癥(38)，其特征有毛細(xì)血管阻塞、微血管病斑形成和接近視網(wǎng)膜缺血區(qū)域的視網(wǎng)膜新血管形成(39-40)。
最近發(fā)現(xiàn)，核心2GlcNAc-T活性提高是糖尿病性視網(wǎng)膜病中白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著增加和毛細(xì)血管阻塞的直接原因(41)。而且現(xiàn)已證明，葡萄糖升高和糖尿病血清提高了核心2GlcNAc-T的活性和人白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏著。這通過(guò)依賴(lài)于PKCβ2的核心2GlcNAc-T磷酸化而發(fā)生(42-43)。這種涉及核心2GlcNAc-T磷酸化的調(diào)節(jié)機(jī)制也存在于從I型和II型糖尿病患者分離的多形核白細(xì)胞(PMN)中。
通過(guò)特異性抑制劑LY379196抑制PKCβ2激活減弱核心2GlcNAc-T的絲氨酸磷酸化，防止其活性提高，從而防止白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著增加。這種抑制劑證實(shí)，降低核心2GlcNAc-T活性提供了防止白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著增加和防止糖尿病或高血糖引起的視網(wǎng)膜病中毛細(xì)血管阻塞的方法。
胡蘆巴千百年來(lái)一直被用來(lái)治療糖尿病。這種植物含有許多活性成分，例如香豆素、皂苷和糖苷類(lèi)。許多研究(44)已證明了胡蘆巴在動(dòng)物和人類(lèi)中的降血糖特性。這些降血糖特性已被歸因于具有有效促胰島素活性的氨基酸4-羥基異亮氨酸(45-46)。
本發(fā)明發(fā)明人現(xiàn)已確定，某些化合物是核心2GlcNAc-T的抑制劑。這些化合物中有些可從胡蘆巴種子和從其它植物來(lái)源獲得。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供治療與核心2GlcNAc-T酶活性提高有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給予有需要的患者有效量的式I化合物。優(yōu)選所述疾病是炎性疾病、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、糖尿病性心肌病、心肌機(jī)能障礙、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
癌癥包括白血病、口腔癌、肺癌如肺腺癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、肝癌、胃腫瘤、結(jié)腸腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、乳腺癌、肺腫瘤、口腔癌和其中核心2GlcNAc-T表達(dá)超過(guò)該組織類(lèi)型正常水平的任何癌癥。
優(yōu)選核心2GlcNAc-T抑制劑包含糖衍生的取代基。術(shù)語(yǔ)糖衍生的取代基指某種糖類(lèi)，其中任選一個(gè)或多個(gè)氫和/或一個(gè)或多個(gè)羥基已被-R、-OR、-SR、-NR(其中R是甲基、乙基或丙基)取代，形成衍生物。
糖類(lèi)包括但不限于單糖、二糖、三糖、四糖和多糖。
單糖包括但不限于阿拉伯糖、木糖、來(lái)蘇糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、核酮糖、木酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、阿洛酮糖、景天庚酮糖、脫氧核糖、巖藻糖、鼠李糖、2-脫氧-葡萄糖、異鼠李糖、阿比可糖、葡糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺、神經(jīng)氨酸、胞壁酸、N-乙酰葡萄胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰胞壁酸、O-乙酰神經(jīng)氨酸、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、果糖醛酸、塔格糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、唾液酸和古洛糖醛酸。
優(yōu)選核心2GlcNAc-T抑制劑包含至少一個(gè)糖衍生的取代基；更優(yōu)選核心2GlcNAc-T抑制劑包含至少兩個(gè)糖衍生的取代基。
優(yōu)選各糖衍生的取代基獨(dú)立是單糖、二糖、三糖或四糖；更優(yōu)選各糖衍生的取代基獨(dú)立是單糖或三糖。
優(yōu)選核心2GlcNAc-T抑制劑是式I化合物或其藥物可接受鹽、酯或互變異構(gòu)體形式或衍生物 其中R1是-OH、C1-6烷氧基、-NR8R9或式IIa單糖 優(yōu)選R1是-OH、-NR8R9或式IIa單糖；更優(yōu)選R1是-NR8R9或式IIa單糖；最優(yōu)選R1是式IIa單糖；R2是-OH、C1-6烷氧基或式IIb單糖 優(yōu)選R2是-OH或式III單糖；更優(yōu)選R2是-OH或式III單糖；最優(yōu)選R2是-OH；R3是-OH、C1-6烷氧基或式IIc單糖 優(yōu)選R3是-OH或式IIc單糖；更優(yōu)選R3是式IIc單糖；最優(yōu)選R3是葡萄糖；R4是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R4是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選R4是-CH2OH或-CH3；最優(yōu)選R4是-CH2OH；
R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R5是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選R5是-CH3、-C2H5、-CH2OH或-C2H4OH；最優(yōu)選R5是-CH3；R6是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R6是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選R6是-CH2OH或-CH3；最優(yōu)選R6是-CH2OH；R7是C2-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R7是C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；更優(yōu)選R7是-CH2OH或C1-6烷氧基甲基；最優(yōu)選R7是-CH2OH；R8是H、C1-6烷基或C1-6?；粌?yōu)選R8是H或C1-6烷基；更優(yōu)選R8是H或CH3；最優(yōu)選R8是H；R9是H、C1-6烷基或C1-6?；?；優(yōu)選R9是H或C1-6?；?；更優(yōu)選R9是H或-COCH3；最優(yōu)選R9是-COCH3；Z是甾族基團(tuán)。
優(yōu)選式I化合物是式III化合物 其中R4是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選-CH2OH或-CH3；最優(yōu)選-CH2OH；R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R5是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選R5是-CH3、-C2H5、-CH2OH或-C2H4OH；最優(yōu)選R5是-CH3；R7是C2-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R7是C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；更優(yōu)選R7是-CH2OH或C1-6烷氧基甲基；最優(yōu)選R7是-CH2OH。
更優(yōu)選的是以下式III化合物，其中R4是C1-6羥基烷基或C1-6烷基；R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基；R7是C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基。
更優(yōu)選的是以下化合物，其中R4是-CH2OH或-CH3；R5是-CH3；和R7是-CH3OH。
最優(yōu)選的式III化合物是以下式I化合物，其中R1是鼠李糖；R2是-OH；R3是葡萄糖；R4是-CH2OH。
最優(yōu)選的是以下式I化合物，其為式IV
本發(fā)明還提供以下化合物，其中式I化合物是式V化合物 其中R1是-OH、C1-6烷氧基或NR8R9或式IIa單糖 優(yōu)選R1是-OH或NR8R9；更優(yōu)選R1是NR8R9；R4是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R4是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選R4是C1-6烷基；最優(yōu)選-CH3；R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R5是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選R5是-CH3或-CH2OH；最優(yōu)選R5是-CH3；R6是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；優(yōu)選R6是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；更優(yōu)選R6是-CH2OH或-CH3；最優(yōu)選R6是-CH2OH；R8是H、C1-6烷基或C1-6?；粌?yōu)選R8是H或C1-6烷基；更優(yōu)選R8是H或CH3；最優(yōu)選R8是H；R9是H、C1-6烷基或C1-6酰基；優(yōu)選R9是H或C1-6?；?；更優(yōu)選R9是H或-COCH3；最優(yōu)選R9是-COCH3；Z是甾族基團(tuán)。
優(yōu)選的式V化合物是以下化合物，其中R1是-OH、C1-6烷氧基或-NR8R9；
R4是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；R6是C1-6烷基或C1-6羥基烷基；R8是H、C1-6烷基或C1-6?；籖9是H、C1-6烷基或C1-6?；?br> 更優(yōu)選的式IV化合物是以下化合物，其中R1是-NH-C1-6?；?；R4是C1-6烷基或-CH2OH；R6是C1-6羥基烷基。
最優(yōu)選的是以下式IV化合物，其為式Galβ1→3(6-脫氧)GalNAcα-Z。
式I化合物包含甾族基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“甾族基團(tuán)”指包含式VI所示四環(huán)環(huán)狀系統(tǒng)的基團(tuán) 優(yōu)選甾族基團(tuán)通過(guò)其3-位連接到分子的其余部分。例如上述式I化合物優(yōu)選是下式所示化合物 甾族基團(tuán)可以是膽甾烷、5α-孕甾烷、雄甾烷、雌甾烷、膽甾醇、膽甾烷、黃體酮、糖皮質(zhì)甾體、鹽皮質(zhì)甾體、雄激素如脫氫表雄酮或其7-酮基類(lèi)似物、膽汁酸或其它甾體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，甾體核心是其本身是有益的或中性的甾體。所謂中性的是指所述甾體本身已被判定適合在人類(lèi)或動(dòng)物中使用。所謂有益的是指如果單獨(dú)給予的話所述甾體對(duì)人類(lèi)或動(dòng)物具有好處。
甾族基團(tuán)可以是可從植物來(lái)源衍生的甾體皂苷元，或者是本身可通過(guò)化學(xué)修飾從所述植物甾體皂苷元衍生的甾體皂苷元。
在一個(gè)實(shí)施方案中，甾族基團(tuán)是式VII的甾體皂苷元 其中R12是H、OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R12是H或-OH；最優(yōu)選R12是H；R13是H、-OH、＝O或C1-6烷基；優(yōu)選R13是H或-OH；最優(yōu)選R13是H；R14是H、-OH或C1-6烷基，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；優(yōu)選R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH，或者R15和R33一起是＝O；優(yōu)選R15是H，或者R15和R33一起是＝O；更優(yōu)選R15是H；R16是H、OH或＝O；優(yōu)選R16是H或＝O；更優(yōu)選R16是H；R17是H、OH或＝O；優(yōu)選R17是H或-OH；更優(yōu)選R17是H；R18是H、OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；優(yōu)選R18是H、OH、C1-6烷氧基；更優(yōu)選R18是H或OH；最優(yōu)選R18是H；R19是H、OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R19是H、OH或C1-6烷基；更優(yōu)選R19是H、OH或C1-6烷基；最優(yōu)選R19是C1-6烷基；尤其R19是-CH3；R20是H、OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；優(yōu)選R20是H、-OH或C1-6烷氧基；更優(yōu)選R20是-OH或C1-6烷氧基；最優(yōu)選R20是-OH；
R21是H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基或式VIII基團(tuán) 優(yōu)選R21是式VIII基團(tuán)；R22是H、OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R22是H、OH或C1-6烷氧基；更優(yōu)選R22是H或OH、-OCH3或-O-C2H5；最優(yōu)選R22是H；R23是H、OH、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基；優(yōu)選R23是C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基；更優(yōu)選R23是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或＝CH2；最優(yōu)選R23是-C2H4OH、-CH2OH、C1-6烷基或＝CH2；甚至更優(yōu)選R23是-C2H4OH、-CH2OH、-C2H5、-CH3或＝CH2，尤其R23是-CH3或＝CH2；R24是H、C1-6烷基、C1-6?；騿翁荕S；優(yōu)選R24是C1-6烷基、C1-6?；騿翁荕S；更優(yōu)選R24是C1-6?；騿翁荕S；最優(yōu)選R24是單糖MS；R28和R29相同或不同，是H或OH；優(yōu)選R28是H，R29是-OH；更優(yōu)選R28和R29均是H；R32是H、OH或＝O；優(yōu)選R32是H或OH；最優(yōu)選R32是H；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；優(yōu)選R33是H，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；MS選自阿拉伯糖、木糖、來(lái)蘇糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、核酮糖、木酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、阿洛酮糖、景天庚酮糖、脫氧核糖、巖藻糖、鼠李糖、2-脫氧-葡萄糖、異鼠李糖、阿比可糖、葡糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺、神經(jīng)氨酸、胞壁酸、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰胞壁酸、O-乙酰神經(jīng)氨酸、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、果糖醛酸、塔格糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、唾液酸和古洛糖醛酸；優(yōu)選MS選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰-半乳糖胺和唾液酸；最優(yōu)選MS是葡萄糖；Y是N或O；優(yōu)選Y是O。
優(yōu)選的式VII甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R21是式VIII，Y是O。
更優(yōu)選的式VII甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R12是H、-OH；R13是H或-OH；R14是H或-OH，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H，或者R15和R33一起是＝O；R18是H、-OH或C1-6烷氧基；R19是C1-6烷基；R20是H、-OH或C1-6烷氧基；R28是H；R32是H、-OH或＝O；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
最優(yōu)選的是以下式VII甾體皂苷元，其中R12、R13、R15和R28各自表示H；R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R16是H或＝O；R17是H或-OH；R18是H或-OH；R19是H或C1-6烷基；
R21是式VIII；R22是H、-OH或C1-6烷氧基；R24是C1-6烷基、C1-6?；蚱咸烟?；R29是H或-OH；R32是H或-OH。
最優(yōu)選的式VII甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R12、R13、R15、R16、R17、R22、R28各自表示H；R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R20是-OH或C1-6烷氧基；R21是式VIII；R23是-CH3或＝CH2；R24是C1-6?；蚱咸烟?；R29是H或-OH；R32是H。
最優(yōu)選的式VII甾體皂苷元選自以下 其中
R18是H或OH；R20是OH或C1-6烷氧基；R24是葡萄糖或C1-6酰基；R29是H或OH。
尤其優(yōu)選的其中甾族基團(tuán)是式VII的式I化合物是胡蘆巴皂苷IVa、糖苷F、shatavarin I、化合物3、pardarinoside C，它們的結(jié)構(gòu)在表1中總結(jié)。
表1胡蘆巴皂苷IVa、糖苷F、shatavarin I、化合物3和pardarinosideC的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)
在每種情況下，連接到甾族基團(tuán)3-位的糖基是
或者甾族基團(tuán)可以是式VIII的甾體皂苷元
其中R12是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R12是H或-OH；最優(yōu)選R12是H；R13是H、-OH、＝O或C1-6烷基；優(yōu)選R13是H或-OH；最優(yōu)選R13是H；R14是H、-OH或C1-6烷基，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；優(yōu)選R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH，或者R15和R33一起是＝O；優(yōu)選R15是H，或者R15和R33一起是＝O；更優(yōu)選R15是H；R16是H、-OH或＝O；優(yōu)選R16是H或＝O；更優(yōu)選R16是H；R17是H、-OH或＝O；優(yōu)選R17是H或-OH；更優(yōu)選R17是H；R18是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；優(yōu)選R18是H、-OH、C1-6烷氧基；更優(yōu)選R18是H或OH；最優(yōu)選R18是H；R19是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R19是H、OH或C1-6烷基；更優(yōu)選R19是C1-6烷基；尤其R19是-CH3；R20是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；優(yōu)選R20是H、-OH或C1-6烷氧基；更優(yōu)選R20是-OH或C1-6烷氧基；最優(yōu)選R20是-OH；R27是H、-OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6羥基烷基；優(yōu)選R27是H、C1-6烷基或C1-6烷氧基；更優(yōu)選R27是H或C1-6烷基；最優(yōu)選R27是甲基、乙基或丙基；R28和R29相同或不同，是H或-OH；優(yōu)選R28和R29均是H；R32是H、-OH或＝O；優(yōu)選R32是H或-OH；最優(yōu)選R32是H；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；優(yōu)選R33是H，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
優(yōu)選的式IX甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R12是H或-OH；
R13是H或-OH；R14是H或-OH，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH；R16是H、-OH或＝O；R17是H、-OH或＝O；R18是H或-OH；R27是C1-6烷基；R28和R29相同或不同，各自表示H或-OH；R32是H、-OH或＝O。
更優(yōu)選式IX甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R12是H或-OH；R13是H或-OH；R14是H或-OH，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH；R16是H或＝O；R17是H、-OH；R18是H或-OH；R27是C1-6烷基；R28和R29相同或不同，各自表示H或-OH；R32是H或-OH。
更優(yōu)選式IX甾體皂苷元是以下通式IXa所示的甾體皂苷元
其中甾族基團(tuán)是式IX的最優(yōu)選式I化合物是 其可從希洛依百合(Lilium macklineae)分離(59)。
另外優(yōu)選的一組甾體皂苷元是式XI的甾體皂苷元 其中R12是H、OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R12是H或-OH；最優(yōu)選R12是H；R13是H、-OH、＝O或C1-6烷基；優(yōu)選R13是H或-OH；最優(yōu)選R13是H；R14是H、-OH或C1-6烷基，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；優(yōu)選R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH，或者R15和R33一起是＝O；優(yōu)選R15是H，或者R15和R33一起是＝O；更優(yōu)選R15是H；R16是H、-OH或＝O；優(yōu)選R16是H或＝O；更優(yōu)選R16是H；
R17是H、-OH或＝O；優(yōu)選R17是H或-OH；更優(yōu)選R17是H；R18是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；優(yōu)選R18是H、OH、C1-6烷氧基；更優(yōu)選R18是H或-OH；最優(yōu)選R18是H；R19是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R19是H、-OH或C1-6烷基；更優(yōu)選R19是H、-OH或C1-6烷基；最優(yōu)選R19是C1-6烷基；尤其R19是-CH3；R25是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；優(yōu)選R25是H或-OH；更優(yōu)選R25是H；R26是H、-OH、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基；優(yōu)選R26是C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基；更優(yōu)選R26是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或＝CH2；最優(yōu)選R26是-C2H4OH、-CH2OH、C1-6烷基或＝CH2；甚至更優(yōu)選R26是-C2H4OH、-CH2OH、-C2H5、-CH3或＝CH2，尤其R26是-CH3或＝CH2；R28和R29相同或不同，是H或-OH；優(yōu)選R28和R29均是H；R31是H或-OH；優(yōu)選R31是H；R32是H、-OH或＝O；優(yōu)選R32是H或-OH；最優(yōu)選R32是H；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；優(yōu)選R33是H，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R34是H或-OH；優(yōu)選R34是H；X是O、S或NH；優(yōu)選X是O或NH；更優(yōu)選X是O。
優(yōu)選的式XI甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R12是H或-OH；R13是H或-OH；R14是H或-OH，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15、R18、R28和R29相同或不同，各自表示H或-OH；
R16是H、OH或＝O；R17是H、-OH或＝O；R18是H、-OH或C1-6烷氧基；R19是H或C1-6烷基；R26是H、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基；R29是H或-OH；R31是H或-OH；R32是H、-OH或＝O；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R34是H或-OH。
更優(yōu)選的式XI甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R12、R13、R15和R28各自表示H；R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R16是H或＝O；R17是H或-OH；R18是H或-OH；R19是H或C1-6烷基；R26是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或＝CH2；R28是H；R29是H或-OH；R32是H或-OH；R33是H，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
最優(yōu)選的式XI甾體皂苷元是以下甾體皂苷元，其中R12、R13、R15、R16、R17、R25、R28、R31、R32和R34各自表示H；
R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R18是H或-OH；R19是C1-6烷基；R26是C1-6烷基或＝CH2；R29是H或-OH；R32是H；R33是H，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
最優(yōu)選的式XI甾體皂苷元選自以下 尤其優(yōu)選的式XI甾體皂苷元是薯蕷皂苷元、亞莫皂苷元、提果皂甙元、新提果皂甙元、菝葜皂甙元、異菝葜皂甙元、龍舌蘭皂苷元(hecogenin)、澳洲茄胺或番茄苷元。
其中甾族基團(tuán)是式XI的尤其優(yōu)選式I化合物是Shatavarin IV、(25R)shatavarin IV、deltonin、槲果素(balanitin)VI、Mimaki和Sahida(58)的化合物12。
Shatavarin IV是菝葜皂甙元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷。
化合物12是澳洲茄胺3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷。
Deltonin是(3β，25R)-螺甾-5-烯-3-基-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖苷。
槲果素VI是(3β，25S)-螺甾-5-烯-3-基-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖苷。
尤其優(yōu)選的式I化合物是結(jié)合優(yōu)選甾族基團(tuán)和優(yōu)選糖基的化合物。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供式I化合物在制備藥物中的用途，該藥物用于治療與核心2GlcNAc-T酶活性提高有關(guān)的病癥。所述病癥的實(shí)例在本文中的本發(fā)明第一方面中描述。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供包含式I化合物的藥物組合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)核心2GlcNAc-T抑制劑指核心2GlcNAc-T酶的抑制劑，優(yōu)選指包含本文所述核心2GlcNAc-T酶活性的制品將UDP-6[′H]-N-乙酰葡糖胺摻入產(chǎn)物中的能力，如本文描述的測(cè)定中所測(cè)。
本文所用術(shù)語(yǔ)糖苷元指其中糖部分不存在的式I化合物。所述化合物可在糖部分所占有的位置具有其它取代基。特別是為呋甾烷醇皂苷的糖苷元當(dāng)糖基化時(shí)可如同對(duì)等的螺甾烷醇皂苷處于環(huán)閉合狀態(tài)。
在本文用于結(jié)構(gòu)中的簡(jiǎn)略記號(hào) 用來(lái)表示以下結(jié)構(gòu) 在本文用于結(jié)構(gòu)中的簡(jiǎn)略記號(hào) 表示以下結(jié)構(gòu) 本文所用的簡(jiǎn)略記號(hào)Glc是葡萄糖，Rha是鼠李糖。
為避免產(chǎn)生疑問(wèn)，術(shù)語(yǔ)C1-6?；侵?CO-C1-6烷基。
附圖簡(jiǎn)述圖1是說(shuō)明O-聚糖核心結(jié)構(gòu)的生物合成的示意性流程圖。
圖2a圖示說(shuō)明核心2GlcNAc-T酶活性可被葡萄糖誘導(dǎo)。將人白細(xì)胞(U937)在37℃下暴露于正常(5.8mM)和高葡萄糖(15mM)24小時(shí)。然后將細(xì)胞裂解，測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性。數(shù)據(jù)以平均值±s.e.m.表示，n＝28，星號(hào)表示顯著性差異(P＜0.05)。
圖2b圖示說(shuō)明從胡蘆巴種子制備的粗提取物F1抑制葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性。將人白細(xì)胞(U937)在胡蘆巴提取物(1∶1000稀釋?zhuān)籒-F，G-F)存在下暴露于正常(N，5.8mM；n＝3)和高葡萄糖(G，15mM；n＝3)。溫育24小時(shí)后，測(cè)量白細(xì)胞細(xì)胞裂解液中的核心2GlcNAc-T活性。核心2GlcNAc-T的活性以pmole/h/mg蛋白質(zhì)表示。
圖2c圖示說(shuō)明從胡蘆巴種子制備的粗提取物F1抑制人白細(xì)胞(U937)對(duì)培養(yǎng)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏著。將白細(xì)胞暴露于高葡萄糖(15mM)后，通過(guò)用羧基熒光素標(biāo)記白細(xì)胞，測(cè)量白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著水平。數(shù)據(jù)以平均值±s.e.m表示，n＝3，星號(hào)表示顯著性差異(P＜0.05)。
圖3圖示說(shuō)明從胡蘆巴種子制備的粗提取物F1抑制核心2GlcNAc-T活性。將人白細(xì)胞(U937)在37℃下暴露于15mM葡萄糖24小時(shí)，測(cè)量粗胡蘆巴種子提取物(G-F1；1∶1000稀釋)存在下白細(xì)胞細(xì)胞裂解液中的核心2GlcNAc-T活性。核心2GlcNAc-T活性水平通過(guò)測(cè)定核心2寡糖的形成(β1，6-連接的GalNAc連接到Galβ1，3GlcNAc接納體)來(lái)測(cè)量。數(shù)據(jù)以三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±s.e.m.表示。
圖4是說(shuō)明胡蘆巴種子的提取和胡蘆巴種子提取物的后續(xù)純化的示意性流程圖。
圖5圖示說(shuō)明粗胡蘆巴種子提取物F1和從粗提取物F1純化的次級(jí)分(sub-fraction)F2對(duì)人白細(xì)胞(U937)中葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性的抑制作用。將細(xì)胞在存在和不存在次級(jí)分F1和F2時(shí)暴露于高葡萄糖(15mM)。溫育24小時(shí)后，測(cè)定白細(xì)胞細(xì)胞裂解液中的核心2GlcNAc-T活性。數(shù)據(jù)以?xún)蓚€(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示。
圖6a和6b圖示說(shuō)明通過(guò)硅膠急驟層析法(Biotage)從粗提取物F1純化的次級(jí)分F8-F15對(duì)人白細(xì)胞(U937)中葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性的抑制作用。將細(xì)胞在各次級(jí)分存在下暴露于高葡萄糖(G，15mM)。溫育24小時(shí)后，測(cè)定白細(xì)胞細(xì)胞裂解液中的核心2GlcNAc-T活性。數(shù)據(jù)以平均值±s.e.m.表示，n＝3，星號(hào)表示顯著性差異(P＜0.05)。
圖7圖示說(shuō)明次級(jí)分F13的水相抑制人白細(xì)胞(U937)中葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性。將次級(jí)分F9和F13與二氯甲烷徹底混合，將水相過(guò)濾除菌，用于基于細(xì)胞的核心2GlcNAc-T活性測(cè)定中。將人白細(xì)胞在存在和不存在次級(jí)分F9和F13的水相下暴露于高D-葡萄糖(15mM)。數(shù)據(jù)以?xún)蓚€(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示。
圖8圖示說(shuō)明通過(guò)HPLC從次級(jí)分F13的水相純化出的保留時(shí)間F18.7-F41.1的各次級(jí)分對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性的抑制作用。將人白細(xì)胞(U937)在存在和不存在保留時(shí)間F18.7-F41.1的各HPLC次級(jí)分下暴露于高D-葡萄糖(15mM)。給出的數(shù)據(jù)來(lái)自一個(gè)實(shí)驗(yàn)。沒(méi)有檢測(cè)次級(jí)分G20.24、G20.69、G22.2、G39.9和G41.1(圖8中沒(méi)有用柱形表示)對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性的抑制作用。
圖9圖示說(shuō)明保留時(shí)間F19.13和F19.37的各HPLC次級(jí)分的抑制作用。將人白細(xì)胞(U937)在存在和不存在保留時(shí)間F19.13和F19.37的各次級(jí)分(1∶1000稀釋)下暴露于高D-葡萄糖(15mM)24小時(shí)。數(shù)據(jù)以平均值±s.e.m.表示，n＝3，星號(hào)表示顯著性差異(P＜0.05)。
圖10圖示說(shuō)明通過(guò)HPLC從次級(jí)分F13的水相純化出的保留時(shí)間F20.01、F20.29和F20.55的各次級(jí)分對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性的抑制作用。將人白細(xì)胞(U937)在存在和不存在保留時(shí)間F20.01、F20.29和F20.55的各次級(jí)分下暴露于高D-葡萄糖(15mM)，24小時(shí)后測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性。數(shù)據(jù)是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖11圖示說(shuō)明在無(wú)細(xì)胞測(cè)定中次級(jí)分F20.55抑制核心2GlcNAc-T。將人白細(xì)胞(U937)在37℃下暴露于15mM葡萄糖24小時(shí)后，將細(xì)胞裂解，然后暴露于加熱(H，100℃)和非加熱(NH)的次級(jí)分F20.55(1∶500稀釋)。在37℃下暴露30分鐘后，測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性。核心2GlcNAc-T活性水平通過(guò)測(cè)定核心2寡糖的形成(β1，6-連接的GalNAc連接到Gal-1，3-GlcNAc接納體)來(lái)測(cè)量。數(shù)據(jù)以三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±s.e.m.表示。
圖12a和12b圖示說(shuō)明高葡萄糖提高培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜血管細(xì)胞(即毛細(xì)血管周細(xì)胞(圖13a)和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖13b))中的核心2GlcNAc-T活性。將近乎鋪滿(mǎn)的培養(yǎng)物在37℃下暴露于正常葡萄糖(N，5.8mM)和高葡萄糖(G，15mM)24小時(shí)。將細(xì)胞裂解，測(cè)定細(xì)胞裂解液中的核心2GlcNAc-T活性。數(shù)據(jù)以平均值±s.e.m.表示(n＝3-4)，星號(hào)表示顯著性差異(P＜0.05)。
圖13a和13b圖示說(shuō)明胡蘆巴種子的粗提取物F1防止培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜血管細(xì)胞(即毛細(xì)血管周細(xì)胞(圖14a)和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖14b))中葡萄糖誘導(dǎo)的毒性。將細(xì)胞在存在(N-F，G-F)和不存在(N，G)胡蘆巴種子提取物下暴露于正常(N，5.8mM)和高葡萄糖(G，25mM)。溫育4天后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目。數(shù)據(jù)以平均值±s.em.表示，n＝18個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，星號(hào)表示顯著性差異(P＜0.05)。
圖14圖示說(shuō)明從胡蘆巴種子分離出的五種化合物的結(jié)構(gòu)。
圖15a和15b圖示說(shuō)明純化的胡蘆巴皂苷IVa、糖苷F和shatavarinIV在無(wú)細(xì)胞(圖15a)和基于細(xì)胞(圖15b)的試驗(yàn)中對(duì)核心2GlcNAc-T活性的作用。
在無(wú)細(xì)胞的試驗(yàn)中，將BB大鼠的心臟裂解液在存在和不存在20ng/ml的各化合物下溫育。在37℃下溫育1小時(shí)后，測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性，以pmole/h/mg蛋白質(zhì)表示。結(jié)果是3-5個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值。
在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中，將人白細(xì)胞(U937細(xì)胞)在存在和不存在20ng/ml的試驗(yàn)化合物下暴露于8pg/ml的人重組TNF-α。溫育24小時(shí)后，測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性，以pmole/h/mg蛋白質(zhì)表示。
本發(fā)明現(xiàn)將參照以下非限制性參考實(shí)施例和圖表進(jìn)行描述。根據(jù)這些描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員能想到落入本權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的更多實(shí)施方案。
發(fā)明詳述實(shí)驗(yàn)方法式I化合物可從多種植物提取。這方面參考文獻(xiàn)(僅作舉例)見(jiàn)Yoshikawa等(55)、Sasheda等(59)、Akhov等(60)、Joshi和Dev(61)、Ravikumar等(56)、Vasil′eva和Paseshnichenko(62)、Shimomura等(57)、Sharma和Sharma(63)、Petit等(64)、Mimaki和Sashida(58)及Hostettman(65)，以及其中的參考文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。
或者，所述化合物可通過(guò)常規(guī)的有機(jī)化學(xué)方法和技術(shù)合成。這方面的參考文獻(xiàn)見(jiàn)碳水化合物和甾體化學(xué)教科書(shū)，如“Essentials ofCarbohydrdate Chemistry and Biochemistry”，Thisbe K.Lindhorst著，(2000)Wiley；“Carbohydrdates in Chemistry and Biology”，Beat Ernst，Gerald W.Hart和Pierre Sinay編輯，(2000)Wiley；“Essentials ofCarbohydrdate Chemistry”，John F.Robyt著，(1998)Springer Verlag；“Carbohydrdate Chemistry”，Hassan S.El Khadem著，(1988)；“Carbohydrdate Building Blocks”，Mikael Bols著，(1996)；“GlycochemistryPrinciples，Synthesis，and Applications”，P.G.Wang和CR.Bertozzi編輯，(2001)Marcel Dekker，N.Y.和“CarbohydrdateChemistry”，the Royal Society of Chemistry Stafff著，(1989)CRC Press。
本發(fā)明化合物可從市售的糖苷元制備，或者通過(guò)從胡蘆巴種子或從其它植物來(lái)源分離糖苷元或其它前體、隨后對(duì)前體進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)制備。
技術(shù)人員例如會(huì)知道多種螺甾烷醇和呋甾烷醇糖苷元來(lái)源，如薯蕷皂苷元、亞莫皂苷元、提果皂甙元、新提果皂甙元、菝葜皂甙元、異菝葜皂甙元、龍舌蘭皂苷元、澳洲茄胺或番茄苷元(例如見(jiàn)Hostettman及其中的參考文獻(xiàn)(65))。
具體的說(shuō)，對(duì)于從薯蕷皂苷元合成具有2，4分支寡糖部分的螺甾烷醇皂苷的方法，參見(jiàn)Du等2003(73)。這篇參考文獻(xiàn)還進(jìn)一步提及其它糖基化甾體的合成，例如從膽固醇合成。所公開(kāi)的方法可用來(lái)合成以下化合物，其中甾體被化學(xué)法糖基化，形成式I化合物。
對(duì)于其它的參考文獻(xiàn)，有關(guān)三糖取代的螺甾烷醇皂苷的合成見(jiàn)Li等(66)，有關(guān)各種三糖和四糖取代的螺甾烷醇皂苷的合成見(jiàn)Deng等(67)，有關(guān)呋甾烷醇皂苷的合成及螺甾烷醇皂苷和呋甾烷醇皂苷的互變的方法見(jiàn)Li等(68)、Yu等(69)、Yu等(70)，還有Yu和Tao(71)、Cheng等(72)及Du等(73)。這些參考文獻(xiàn)還提供有關(guān)單糖羥基烷基的衍生化的信息和更多參考文獻(xiàn)。
Paulsen等(48)中給出了合成Galβ1-3(6-脫氧)GalNAcα-綴合物的方法。技術(shù)人員可改動(dòng)這些方法并將其與本文所提及的其它方法組合，以合成其它式I化合物。
細(xì)胞培養(yǎng)如前所述(48)，從剛屠宰牛的眼睛解剖得到的牛視網(wǎng)膜建立牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)和周細(xì)胞(BRP)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將分離出的視網(wǎng)膜在無(wú)血清極限必需培養(yǎng)基(MEM，Gibco，Paisley，英國(guó))中勻漿，濾過(guò)85μm尼龍網(wǎng)，將截留的微血管用膠原酶-分散酶(1mg/ml)在37℃下消化30分鐘(BRP)和90分鐘(BREC)，濾過(guò)53μm尼龍網(wǎng)。對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)的生長(zhǎng)，將消化過(guò)的微血管接種于涂布有明膠的組織培養(yǎng)瓶中，并維持于補(bǔ)充有10％混合人血清、2mM谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的MEM中。對(duì)于周細(xì)胞(BRP)的生長(zhǎng)，將所述微血管接種于含補(bǔ)充有10％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。使用傳代2-3次的細(xì)胞。通過(guò)用抗因子VIII相關(guān)抗原的抗體和3G5-周細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行免疫染色，并采用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
人白細(xì)胞細(xì)胞系(U937)在補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI中培養(yǎng)。
基于細(xì)胞的核心2GlcNAc-T活性測(cè)定為研究胡蘆巴抑制核心2GlcNAc-T的藥理學(xué)潛力，測(cè)量在37℃下暴露于正常(5.8mM)和高葡萄糖(15mM)24小時(shí)的白細(xì)胞中的酶活性。所述細(xì)胞溫育后進(jìn)行裂解，并在-20℃下冷凍，以備用于測(cè)量核心2GlcNAc-T。同時(shí)還測(cè)量培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞(BRP)和內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)中的核心2GlcNAc-T活性。
核心2GlcNAc-T活性的無(wú)細(xì)胞測(cè)定本測(cè)定使用固定化于Sepharose珠上的核心2GlcNAc-T。為進(jìn)行核心2GlcNAc-T免疫沉淀以及進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，使用抗核心2GlcNAc-T的多克隆抗體。在冰上使細(xì)胞于以下裂解緩沖液中裂解20mM Tris-HCL、pH 7.4/1％Triton X-100、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.2mM釩酸鈉、1mM PMSF、1μg/ml抑蛋白酶肽(aprotinin)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽。將裂解液在4℃下溫育20分鐘，不斷攪拌，離心除去不溶物(4℃下14,000g離心5分鐘)。將澄清的裂解液在4℃下與葡萄球菌A蛋白-Sepharose CL-4B綴合第一抗體一起溫育2小時(shí)，不斷攪拌。免疫沉淀物用含0.5％Triton X-100的Tris緩沖鹽水(10mM Tris-HCL，pH 7.4，150mM NaCl)洗滌，并用于在存在和不存在潛在抑制劑下進(jìn)行的核心2GlcNAc-T測(cè)量。
核心2GlcNAc-T活性的測(cè)量為測(cè)量核心2GlcNAc-T活性，將白細(xì)胞用PES洗滌，冷凍，于0℃下在0.9％Triton X-100中裂解。2GlcNAc-T的活性如前所述(41)進(jìn)行測(cè)量。簡(jiǎn)單地說(shuō)，反應(yīng)在含有以下成分的反應(yīng)混合物中進(jìn)行50mM 2(N-嗎啉代)乙磺酸(MES，Sigma，Dorset，英國(guó))，pH 7.0、1mMUDP-6[′H]-N-乙酰葡糖胺(16,000dpm/nmol，NEN Life Science Products，Hounslow，英國(guó))、0.1M GlcNAc(Sigma，Dorset，OK)、1mM Galβ1-3GalNAcα-對(duì)硝基苯酚(Sigma，Dorset，英國(guó))作為底物，16μl細(xì)胞裂解液(100-200μg蛋白質(zhì))，終體積為32μl。將所述混合物在37℃溫育1小時(shí)后，用1ml用冰預(yù)冷的蒸餾水終止反應(yīng)，然后在C18Sep-Pak柱(Waters-Millipore，Watford，英國(guó))上處理。用20ml蒸餾水洗滌柱子后，用5ml甲醇洗脫產(chǎn)物。樣品的放射性在液體閃爍β-計(jì)數(shù)器(LKB-Wallac，倫敦，英國(guó))中計(jì)數(shù)。在不加入接納體的情況下測(cè)量?jī)?nèi)源核心2GlcNAc-T活性。比活性以pmole/h/mg細(xì)胞蛋白質(zhì)表示。在每種情況下，蛋白質(zhì)濃度均用BioRad蛋白質(zhì)測(cè)定法(BioRad，Hertfordshire，英國(guó))進(jìn)行測(cè)定。
白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著測(cè)定白細(xì)胞黏著內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)用羧基熒光素(Molecular Probe，英國(guó))標(biāo)記來(lái)檢測(cè)。這種測(cè)定法是既定的(41)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)狀態(tài)，為羧基熒光素標(biāo)記的白細(xì)胞(U937)的黏著提供內(nèi)皮細(xì)胞表面。白細(xì)胞經(jīng)處理后離心(14000g離心1分鐘)，用無(wú)血清RPML洗滌兩次。然后將細(xì)胞重懸于含50μg/ml羧基熒光素的1ml無(wú)血清RPML中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算白細(xì)胞，以將已知數(shù)目的白細(xì)胞加入到內(nèi)皮細(xì)胞中。在37℃下溫育30分鐘后，通過(guò)用無(wú)血清RPML洗滌除去非黏著白細(xì)胞，將平皿用3.7％福爾馬林(PBS中)固定。采用熒光顯微鏡檢術(shù)在10個(gè)隨機(jī)高倍視野(×100)中計(jì)數(shù)連接的白細(xì)胞。結(jié)果以黏著白細(xì)胞/視野的百分?jǐn)?shù)表示。
葡萄糖毒性將BRP和BREC接種于3cm組織培養(yǎng)皿中，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中37℃下溫育24小時(shí)。然后將細(xì)胞在含正常葡萄糖(5.8mM)或高葡萄糖(25mM)的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在存在和不存在各胡蘆巴次級(jí)分下溫育。溫育4天后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果以對(duì)照(5.8mM葡萄糖)的百分?jǐn)?shù)表示。處理后，保存其中一些細(xì)胞，以測(cè)量核心2GlcNAc-T活性。
粗胡蘆巴種子提取物的生物活性如圖2a所示，人白細(xì)胞(U937)暴露于高D-葡萄糖24小時(shí)顯著提高了其中的核心2GlcNAc-T活性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，從胡蘆巴種子制備的粗提取物具有抑制人白細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性(圖2b)和白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著(圖2c)的潛力。白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏著通過(guò)將已知數(shù)目的用羧基熒光素染色的白細(xì)胞加入到單層視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中來(lái)測(cè)量。連接的白細(xì)胞隨后在熒光顯微鏡下選取10個(gè)隨機(jī)視野來(lái)計(jì)數(shù)。
圖3所示結(jié)果通過(guò)將人白細(xì)胞(U937)暴露于高D-葡萄糖24小時(shí)而獲得。暴露后，將細(xì)胞裂解，與粗胡蘆巴種子提取物F1一起溫育，溫育30分鐘后測(cè)量核心2GlcNAc-T活性。
胡蘆巴種子提取物的制備和純化實(shí)施例1如下獲得胡蘆巴種子提取物(見(jiàn)圖4)。將胡蘆巴種子(印度產(chǎn)胡蘆巴種子，作為Methi種子獲自FUDCO，184Ealing Road，Wembley，Middlesex，英國(guó))在錘磨機(jī)中磨碎，濾過(guò)尼龍網(wǎng)。所得820g深黃色粉末通過(guò)在索氏萃取器中用己烷連續(xù)洗滌8小時(shí)來(lái)脫脂。然后將植物物料干燥，用乙醇連續(xù)萃取8小時(shí)。過(guò)濾除去固體殘余物，真空濃縮乙醇，得半固體棕色粗提取物，標(biāo)記為F1(65g)。由于此粗提取物F1似乎含有殘油，取其50g與冷己烷(500ml)一起振搖。濾出己烷可溶性物質(zhì)，除去己烷溶劑，得F3(15.4g)，而不溶性殘余物收集于濾紙上，干燥，得F2(27g)。
現(xiàn)使用市售試劑盒(Biotage)進(jìn)行正相硅膠急驟層析。將F2(5g)吸收到硅膠(5g)上并裝入樣品桶(barrel)中，所述樣品桶通過(guò)短管與裝有硅膠KP-Sil的主層析柱(20cm×4cm)連接。用極性不斷增強(qiáng)的一系列溶劑將樣品洗脫到層析柱上并通過(guò)層析柱，所述溶劑由石油醚(40/60)、氯仿、甲醇和丙酮的不同混合物組成。用TLC檢測(cè)洗脫出的各次級(jí)分，將類(lèi)似的次級(jí)分集中，得到七個(gè)主要洗脫次級(jí)分F8-F14，分別代表極性不斷增強(qiáng)的化合物。除去硅膠，用100％甲醇振搖，過(guò)濾，干燥，得殘余物，標(biāo)記為F15。表2給出各次級(jí)分的重量和大概的洗脫溶劑。
表2用急驟層析法將次級(jí)分F2分離成次級(jí)分F8-F15
純化的胡蘆巴種子提取物的生物活性對(duì)這些純化的次級(jí)分抑制白細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性的潛力進(jìn)行了檢測(cè)。首先證明了次級(jí)分F2能抑制白細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的核心2GlcNAc-T活性(圖5)。另外的實(shí)驗(yàn)證明在次級(jí)分F13和F14中存在核心2GlcNAc-T抑制劑(圖6a和6b)。
然后分析次級(jí)分F9和F13。用1ml二氯甲烷萃取次級(jí)分F9和F13的含水整分試樣(0.5ml)，除去水相，通過(guò)濾過(guò)0.22μm濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后用于基于細(xì)胞的核心2GlcNAc-T活性測(cè)定中。將人白細(xì)胞在存在和不存在次級(jí)分F9和F13的水相下暴露于高D-葡萄糖(15mM)。圖7中給出的結(jié)果顯示在次級(jí)分F13的水相中存在核心2GlcNAc-T抑制劑。
通過(guò)HPLC將次級(jí)分F13的水相純化成次級(jí)分F18.7-F41.1(以它們的HPLC保留時(shí)間作代號(hào))。將次級(jí)分F13的水相直接注射到在反相條件下操作的HPLC(Hewlett Packard 1050^100系列)上。在十八碳鍵合(octadecyl-bonded)柱上用甲醇/水流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)分離。用在22nm固定波長(zhǎng)下操作的UV檢測(cè)器檢測(cè)從柱中洗脫出的各成分。這些成分在質(zhì)譜儀檢測(cè)器出來(lái)的層析圖上顯示為各個(gè)峰。將這樣獲得的各次級(jí)分真空濃縮至干，重新溶解于磷酸緩沖鹽水(PBS)中，過(guò)濾除菌。進(jìn)行基于細(xì)胞的核心2GlcNAc-T活性測(cè)定，結(jié)果提示在次級(jí)分F19-F20.03中存在核心2GlcNAc-T抑制劑(見(jiàn)圖8和9)。
隨后，類(lèi)似地通過(guò)在反相條件下操作的HPLC，在苯基鍵合(phenyl-bonded)柱上，用甲醇/水流動(dòng)相將更大量的次級(jí)分F13水相純化成保留時(shí)間分別為20，01、20.29和20.55的各次級(jí)分，它們分別等于上述次級(jí)分F19.13、F19.37和F19.44。基于細(xì)胞的核心2GlcNAc-T活性測(cè)定確證在F20，01、F20.29和F20.55這些次級(jí)分中存在核心2GlcNAc-T抑制劑(圖10a)。用無(wú)細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)，證明了核心2GlcNAc-T被HPLC純化出的次級(jí)分F20.55所抑制(圖11)。將人白細(xì)胞(U937)在37℃下暴露于15mM葡萄糖24小時(shí)后，將細(xì)胞裂解，然后暴露于加熱(H，100℃)和非加熱(NH)的次級(jí)分F20.55(1∶500稀釋)。在37℃下暴露30分鐘后，測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性。如圖11所示，在無(wú)細(xì)胞測(cè)定中發(fā)現(xiàn)次級(jí)分F20.55直接抑制核心2GlcNAc-T。對(duì)次級(jí)分F20.55進(jìn)行加熱僅稍微改變對(duì)核心2GlcNAc-T的抑制水平。
核心2GlcNAc-T抑制劑的結(jié)構(gòu)分析次級(jí)分F20.55中的核心2GlcNAc-T抑制劑已通過(guò)將樣品溶于CD3OD中進(jìn)行NMR分析得到鑒定。進(jìn)行了以下NMR實(shí)驗(yàn)1D質(zhì)子，2D DQF-COSY(1H-1H相關(guān))[8小時(shí)]，2D編輯的HSQC(1H-13C多重編輯的一鍵相關(guān)(one-bond correlation with multiplicity editing))[22小時(shí)]，2D TOCSY(1H-1H接力相關(guān))[2×8小時(shí)]。
表3和4給出次級(jí)分F20.55中的核心2GlcNAc-T抑制劑的1H和13C NMR數(shù)據(jù)。
表31H NMR數(shù)據(jù)(樣品于氘吡啶中)
表413C NMR數(shù)據(jù)(樣品于氘吡啶中)糖苷元部分糖部分
目的化合物鑒定為胡蘆巴皂苷IVa，是已知的胡蘆巴種子成分(55)。
胡蘆巴皂苷IVa、原薯蕷皂苷、化合物3和糖苷F的批量制備將粉碎的種子(360g，產(chǎn)自Deep Foods，Inc.，Union，NJ 07083，美國(guó))依次用庚烷(2×700ml)、丙酮(4×600ml)和MeOH(4×600ml)分別回流煮沸2小時(shí)進(jìn)行萃取。將各提出物過(guò)濾，真空蒸發(fā)至干，通過(guò)LC/MS分析是否存在先前所報(bào)道的來(lái)自這種植物的呋甾烷醇皂苷(55，74，75)。發(fā)現(xiàn)甲醇提取物(82g，占種子的22.7％(w/w))含有目標(biāo)化合物。
用庚烷和丙酮對(duì)種子進(jìn)行初始萃取除去了大部分的低極性物質(zhì)，使得后續(xù)的層析得到改善?？赏ㄟ^(guò)使甲醇提取物在丁醇和水之間分配實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的脫脂。但是，由于甲醇提取物含有極性較低的物質(zhì)，可通過(guò)用苯乙烯樹(shù)脂如Diaion(或SP207、HP20SS、SP207SS，均可獲自Sigma-Aldrich)樹(shù)脂進(jìn)行固相萃取獲得富集的含皂苷級(jí)分，而不必使提取物進(jìn)行進(jìn)一步的脫脂。
將MeOH提取物(CDXA-13-132-1，81.2g)溶于水-MeOH(6∶4,400ml)中，加樣到Diaion HP20(Supelco Diaion HP 20,350g，5.0×30cm)上，用水-MeOH(4∶6,600ml)、MeOH(2L)和丙酮(2L)洗脫。收集到250ml的各級(jí)分。用HPLC分析所述各級(jí)分，合并具有類(lèi)似組成的級(jí)分，得到7個(gè)集合體(pool)(CDXA-13-133F1～F7)。發(fā)現(xiàn)集合體CDXA-13-133-F5(22.5g，占提取物的27.7％w/w)含有大部分的所需皂苷。
將此集合體(22.0g)在正相硅膠(445g，Merck silica gel 60，70-230目，0.0763-0.200mm，5.0×30cm)上進(jìn)行層析，用以下組成的二氯甲烷-MeOH-水系統(tǒng)各3La)80∶20∶3、b)75∶25∶3、c)70∶30∶3和d)65∶35∶3進(jìn)行洗脫。收集到250ml的各級(jí)分，用HPLC分析，合并成11個(gè)集合體(CDXA-13-137-F1～F11)。
將級(jí)分F6和F7合并，干燥(10.0g，45％)，在C8硅膠(350g，Phenomenex Luna C8(2)，5μm，100A，5.0×28cm)上層析，用以下組成的MeOH-水系統(tǒng)a)4∶6(800ml)、b)5∶5(2L)、c)55∶45(5L)6∶4(1L)、d)65∶35(1L)、e)7∶3(1L)、f)8∶2(1L)和MeoH(1L)進(jìn)行洗脫。用HPLC分析各級(jí)分，合并，得到29個(gè)集合體(CDXA-13-138-F1～F29)。收集到250ml的各級(jí)分。
將級(jí)分F13～F16干燥(1.155g，11.6％)，用Gilson半制備型HPLC系統(tǒng)進(jìn)行反相HPLC純化，所述HPLC系統(tǒng)由155型紫外光/可見(jiàn)光檢測(cè)器、321型泵和215型自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)(liquid handler)組成。
層析條件層析柱Phenomenex Luna C18(2)，5μm，150×21.2mm流動(dòng)相乙腈-水(28∶72)上樣量各級(jí)分每次注射15mg檢測(cè)UV 205nm共收集到五個(gè)峰P1～P5(圖**1～5)，通過(guò)將它們的1H、13C NMR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)告的胡蘆巴皂苷IVa及其25(S)異構(gòu)體——糖苷F的數(shù)據(jù)相比較進(jìn)行鑒定。還檢測(cè)出另一種類(lèi)似的化合物—化合物3。這種化合物以前沒(méi)有被描述過(guò)。
NMR譜在D5吡啶中記錄。質(zhì)子譜在Varian Inova VXRs-300儀上于300MHz處記錄，碳譜在Varian Inova 400儀上于100MHz處記錄。
質(zhì)譜在Finnigan LCQ Deca儀上以APCI模式記錄。
峰1，胡蘆巴皂苷Iva白色固體(90mg，占種子的0.025％w/w)。
1H NMR(吡啶-d5，400MHz，δ)0.90(3H，s，18-H3)，1.04(3H，d，J＝6.8Hz，27-H3)，1.07(3H，s，19-H3)，1.34(3H，d，J＝6.8Hz，21-H3)，1.79(3H，s，J＝6.0Hz，Rha-6″-H3)，3.88(1H，m，3-H)，4.09(2H，m，16-H2)，4.84(1H，d，J＝7.6Hz，Glc-1″″-H)，4.97(1H，重疊，Glc-1′-H)，5.16(1H，d，J＝7.6Hz，Glc-1-H)，5.29(1H，d樣，6-H)，6.29(1H，br s，Rha-1″-H).
峰2，化合物C/原薯蕷皂苷白色固體(120mg，0.033％)。
1HNMR(吡啶-d5，400MHz，δ)0.90(3H，s，18-H3)，1.04(3H，d，J＝6.8Hz，27-H3)，1.07(3H，s，19-H3)，1.34(3H，d，J＝6.8Hz，21-H3)，1.66(3H，s，J＝6.0Hz，Rha-6-H3)，1.79(3H，，s，J＝6.0Hz，Rha-6″-H3)，3.88(1H，m，3-H)，4.09(2H，m，16-H2)，4.84(1H，d，J＝8.0Hz，Glc-1″″-H)，4.97(1H，重疊，Glc-1′-H)，5.90(1H，br s，Rha-1-H)，5.321H，d樣，6-H)，6.45(1H，br s，Rha-1″-H).
峰3，化合物3白色固體(30mg，0.008％)。
1H NMR(吡啶-d5，400MHz，δ)0.89(3H，s，18-H3)，1.06(3H，s，19-H3)，1.34(3H，d，J＝6.4Hz，21-H3)，1.66(3H，s，J＝6.0Hz，Rha-6-H3)，1.79(3H，s，J＝6.0Hz，Rha-6″-H3)，3.88(1H，m，3-H)，4.84(1H，d，J＝8.0Hz，Glc-1″″-H)，4.97(1H，重疊，Glc-1′-H)，5.32 1H，d樣，6-H)，5.90(1H，br s，Rha-1-H)，6.45(1H，br s，Rha-1″-H).
峰4，糖苷F白色固體(120mg，0.033％)。
1H NMR(吡啶-d5，400MHz，δ)0.90(3H，s，18-H3)，1.00(3H，d，J＝6.4Hz，27-H3)，1.06(3H，s，19-H3)，1.35(3H，d，J＝6.4Hz，21-H3)，1.79(3H，s，J＝6.0Hz，Rha-6-H3)，3.88(1H，m，3-H)，3.97(2H，m，16-H2)，4.84(1H，d，J＝7.6Hz，Glc-1″″-H)，4.97(1H，重疊，Glc-1′-H)，5.16(1H，d，J＝7.6Hz，Glc-1-H)，5.29(1H，d樣，6-H)，6.29(1H，br s，Rha-1″-H).
表5.峰1～5的13C NMR數(shù)據(jù)(于吡啶-d5中，100MHz)
表六.總結(jié)
上表五種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖15中給出。
其它化合物從長(zhǎng)刺天門(mén)冬(Asparagus racemosus)(56)分離的Shatavarin IV(圖15)和從刺蒺藜(Tribulus terrestris)分離的原薯蕷皂苷(也可從胡蘆巴分離，為(55)的化合物C)均由Chromadex inc.2952S.Daimler St.Santa Ana(美國(guó)加州)提供。原薯蕷皂苷也可從上述胡蘆巴制品分離，為峰2，符合公布的原薯蕷皂苷NMR質(zhì)譜。
胡蘆巴皂苷IVa、糖苷F、原薯蕷皂苷和shatavarin IV的生物活性無(wú)細(xì)胞測(cè)定將BB大鼠的心臟裂解液在存在和不存在20ng/ml的每種化合物下溫育。在37℃下溫育1小時(shí)后，測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性，以pmole/h/mg蛋白質(zhì)表示。結(jié)果是3-5個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果在圖15a中顯示。
在無(wú)細(xì)胞測(cè)定中，胡蘆巴皂苷IVa及其25(R)異構(gòu)體糖苷F和shatavarin IV是具有高度活性的核心2GlcNAc-T抑制劑，而其中4-位的葡萄糖被鼠李糖取代的原薯蕷皂苷沒(méi)有活性。
基于細(xì)胞的測(cè)定將人白細(xì)胞(U937細(xì)胞)在存在和不存在20ng/ml的試驗(yàn)化合物下暴露于8pg/ml的人重組TNF-α。溫育24小時(shí)后，測(cè)量核心2GlcNAc-T的活性，以pmole/h/mg蛋白質(zhì)表示。結(jié)果在圖15b中顯示。
在無(wú)細(xì)胞的測(cè)定中，胡蘆巴皂苷IVa和糖苷F是具有高度活性的核心2GlcNAc-T抑制劑，而原薯蕷皂苷沒(méi)有活性。
核心2GlcNAc-T抑制劑胡蘆巴皂苷IVa與糖尿病性視網(wǎng)膜病已發(fā)現(xiàn)，葡萄糖水平升高會(huì)顯著提高培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜血管細(xì)胞即毛細(xì)血管周細(xì)胞(BRP)和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)中的核心2GlcNAc-T活性(圖13)。將近乎鋪滿(mǎn)的培養(yǎng)物在37℃下暴露于正常葡萄糖(N，5.8mM)和高葡萄糖(G，15mM)24小時(shí)。將細(xì)胞裂解，測(cè)定細(xì)胞裂解液中的核心2GlcNAc-T活性。
還已進(jìn)一步證明，胡蘆巴種子提取物具有逆轉(zhuǎn)培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞(BRP)和內(nèi)皮細(xì)胞(BREC)中葡萄糖誘導(dǎo)的毒性(圖14)的潛力。將細(xì)胞在存在(N-F，G-F)和不存在(N，G)胡蘆巴種子提取物下暴露于正常(N，5.8mM)和高15葡萄糖(G，25mM)。溫育4天后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目。發(fā)現(xiàn)胡蘆巴種子提取物的確能逆轉(zhuǎn)培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的毒性。但是，尚未確定胡蘆巴種子提取物是否通過(guò)使核心2GlcNAc-T活性正常化而逆轉(zhuǎn)葡萄糖誘導(dǎo)的毒性。
胡蘆巴種子提取物對(duì)視網(wǎng)膜血管細(xì)胞的這種保護(hù)作用是意義重大的，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜血管細(xì)胞的損害是早期糖尿病性視網(wǎng)膜病的特征。人類(lèi)的糖尿病性視網(wǎng)膜病大體上是一種血管疾病，主要影響毛細(xì)血管。已報(bào)告的先期超微結(jié)構(gòu)和顯微變化有視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基膜增厚和周細(xì)胞變性，這兩方面均損害毛細(xì)血管壁的完整性。周細(xì)胞變性在基膜鞘中留下染色很淡的區(qū)室，稱(chēng)為周細(xì)胞“影(ghost)”。周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的損害導(dǎo)致無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管的形成。
治療包含本文描述的式I化合物的藥物可通過(guò)口服或胃腸外途徑給藥，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、透皮、呼吸道(氣霧劑)、直腸、陰道和局部(包括口腔和舌下)給藥。對(duì)于口服給藥，本發(fā)明化合物通常以片劑或膠囊劑的形式、作為散劑或顆粒劑或作為含水溶液劑或混懸劑提供。
供口服使用的片劑包含與藥物可接受賦形劑混合的活性成分，所述賦形劑例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和磷酸鈣和乳糖，而玉米淀粉和海藻酸則是合適的崩解劑。粘合劑可包括淀粉和明膠，而潤(rùn)滑劑如果存在的話可以是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如有需要，片劑可用甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯之類(lèi)的物質(zhì)作包衣，以延遲在胃腸道中的吸收。供口服使用的膠囊劑包括硬膠囊(其中活性成分與固體稀釋劑混合)和軟膠囊(其中活性成分與水或油如花生油、液狀石蠟或橄欖油混合)。
供直腸給藥的制劑可呈現(xiàn)為具有合適基質(zhì)的栓劑，所述基質(zhì)包括例如可可脂或水楊酸酯。
適合陰道給藥的制劑可呈現(xiàn)為陰道栓劑、棉塞、霜?jiǎng)?、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑，它們除包含活性成分外，還包含本領(lǐng)域公知適當(dāng)?shù)妮d體。
對(duì)于肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)使用，本發(fā)明化合物通常以緩沖至適當(dāng)pH和等滲性的無(wú)菌含水溶液劑或混懸劑的形式提供。合適的含水介質(zhì)包括林格溶液和等滲氯化鈉。本發(fā)明的含水混懸劑可包含懸浮劑如纖維素衍生物、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和黃芪膠，以及濕潤(rùn)劑如卵磷脂。含水混懸劑的合適防腐劑包括對(duì)羥基苯甲酸乙酯和正丙酯。
本發(fā)明的胡蘆巴種子提取物和核心2GlcNAc-T抑制劑也可呈現(xiàn)為脂質(zhì)體制劑。
一般來(lái)說(shuō)，合適的核心2GlcNAc-T抑制劑劑量在每天每公斤接受者體重0.01-10mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選在每天每公斤體重0.2-1.0mg的范圍內(nèi)。所需劑量?jī)?yōu)選每天一次給予，但也可以以二、三、四、五、六次或更多次分劑量在一天中以適當(dāng)間隔時(shí)間給予。這些分劑量可以以單位劑型給予，每一單位劑型含有例如10-1500mg，優(yōu)選20-1000mg，最優(yōu)選50-700mg的活性成分。
參考文獻(xiàn)1.Colley K.J.，“Golgi localization of glycosyltransferasesmorequestion than answers”(糖基轉(zhuǎn)移酶在高爾基體中的定位疑問(wèn)多，答案少)，Glycobiology 7，1-13(1997)2.Varki A.，“Biological roles of oligosaccharidesall of the theoriesare correct”(寡糖的生物學(xué)角色所有的理論都是正確的)，Glycobiology3，97-130(1993)3.Williams D.et al.，“Mucin synthesis.Detection in caninesubmaxillary glands of an N-acteylglucosaminyltransferase which acts onmucin substrates”(黏蛋白合成。犬頜下腺中作用于黏蛋白底物的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè))，J.Biol.Chem.255，11247-11252(1980)4.Schachter H.et al.，“Composition，Structure and Function”(組成、結(jié)構(gòu)與功能)in Glyconjugates，eds.Allen H.J.and Kisailus E.C.，pages263-332，Marcel Dekker，New York(1992)5.Leferte S.et al.，“Glycosylation-dependent collagen-bindingactivities of two membrane glycoproteins in MDAY-D2 tumour cells”(MDAY-D2腫瘤細(xì)胞中兩種膜糖蛋白的依賴(lài)于糖基化的膠原結(jié)合活性)，Cancer Res.48，4743-4748(1988)6.Ellies L.G.et al.，“Core 2 oligosaccharide biosynthesisdistinguishes between selectin ligands essential for leukocyte homing andinflammation”(核心2寡糖生物合成區(qū)別白細(xì)胞歸巢和炎癥所必需的選凝素配體)，Immunity 9，881-890(1998)7.Brockhausen I.et al.，“Biosynthesis of O-glycans in leukocytesfrom normal donors and from patients with leukemiaincrease in O-glycancore 2UDP-GlcNAcGal[β]3GalNAc[α]-R(GalNAc to GalNAc)[β](1，6)-N-acetylglucosaminyltransferase in leukemic cells”(正常供體和白血病患者的白細(xì)胞中O-聚糖的生物合成白血病細(xì)胞中O-聚糖核心2UDP-GlcNAcGal[β]3GalNAc[α]-R(GalNAc→GalNAc)[β](1，6)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶增加)，Cancer Res.51，1257-1263(1991)
8.Renkonen J.et al.，“Core 2 betal，6-N-acetylglucosammyl-transferases and alphal，3-fucosyltransferases regulate the synthesis of O-glycans on selectin ligands on oral cavity carcinoma cells”(核心2 β1，6-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶和α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)口腔癌細(xì)胞選凝素配體上的O-聚糖合成)，APMIS 109，500-506(2001)9.Machida E.et al.，“Clinicopathological significance of core 2betal，6-N-acetylglucosaminyltransferase messenger RNA expressed in thepulmonary adenocarcinoma determmed by in situ hybridization”(原位雜交測(cè)定的肺腺癌中所表達(dá)核心2β1，6-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶信使RNA的臨床病理學(xué)重要性)，Cancer Res.61，2226-2231(2001)10.Dalziel M.et al.，“The relative activities of the C2GnT1 andST3Gal-I glycosyltransferases determine O-glycan structure and expressionof a tumor-associated epitope on MUCl”(C2GnTl和ST3Gal-I糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)活性決定MUCl上腫瘤相關(guān)表位的O-聚糖結(jié)構(gòu)和表達(dá))，Biol.Chem.276，11007-11105(2001)11.Perandio M.et al.，“Severe impairment ofleukocyte rolling invenules of core 2glucosaminyltransferase-deficient mice”(核心2葡糖胺轉(zhuǎn)移酶缺陷小鼠小靜脈中白細(xì)胞滾動(dòng)的嚴(yán)重?fù)p害)，blood 97，3812-3819(2001)12.Yousefi S.et al.，“Increased UDP-GlcNAcGal[beta]1-3GalNAc-R(GalNAc to GalNAc)[beta]-(1，6)-acetylglucosaminyltransferase activityin metastic murine tumour cell lines”(轉(zhuǎn)移鼠腫瘤細(xì)胞系增高增強(qiáng)的UDP-GlcNAcGal[β]1-3GalNAc-R(GalNAc→GalNAc)[β]-(1，6)-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性)，J.Biol.Chem.266，1772-1782(1991)13.Higgins E.A.et al.，“Aberrant O-linked oligosaccharidebiosynthesis and platelets from patients with the Wiskott-Aldrichsyndrome”(異常O-連接寡糖生物合成與Wiskott-Aldrich綜合征患者的血小板)，J.Biol.Chem.266，6280-6290(1991)14.Piller F.et al.，“Human T-lymphocyte activation is associated withchanges in O-glycans biosynthesis”(人T淋巴細(xì)胞激活與O-聚糖生物合成的變化有關(guān))，J.Biol.Chem.263，15146-15150(1988)15.Koya D.et al.，“Overexpression of core 2N-acetylglycosaminyl-transferase enhances cytokine actions and induces myocardium intransgenic mice”(核心2N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞因子作用和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌)，F(xiàn)ASEB 13，2329-2337(1999)16.Nishio Y.et al.，“Identification and characterization of a generegulating enzymatic glycosylation which is induced by diabetes andhyperglycemia specifically in rat cardiac tissue”(大鼠心臟組織糖尿病和高血糖特異性誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)酶促糖基化的基因的鑒定和表征)，J.Clin.Invest.96，1759-1767(1995)17.Tsuboi S.et al.，“Roles of O-linked oligosaccharides in immuneresponses”(O-連接寡糖在免疫反應(yīng)中的作用)，Bioassays 23，46-53(2001)18.Tsuboi S.et al.，“Branched O-linked oligosaccharides ectopicallyexpressed in transgenic mice reduce primary T-cell immune responses”(轉(zhuǎn)基因小鼠中異位表達(dá)的分支O-連接寡糖減少初次T細(xì)胞免疫反應(yīng))，EMBO J.16，6364-6373(1997)19.Tsuboi S.et al.，“Roles of O-linked oligosaccharides in immuneresponses”(O-連接寡糖在免疫反應(yīng)中的作用)，Bioassays 23，46-53(2001)20.Piller F.et al.，“Human T-lymphocyte activation is associated withchanges in O-glycans biosynthesis”(人T淋巴細(xì)胞激活與O-聚糖生物合成的變化有關(guān))，J.Biol.Chem.263，15146-15150(1998)21.Tsuboi S.et al.，“Overexpression of branched O-linkedoligosaccharides on T cell surface glycoproteins impairs humoral immuneresponses in transgenic mice”(T細(xì)胞表面糖蛋白上分支O-連接寡糖的過(guò)量表達(dá)損害轉(zhuǎn)基因小鼠的體液免疫反應(yīng))，J.Biol.Chem.273(46)，30680-30687(1998)
22.Maemura K.et al.，“Poly-N-acetyllactosaminyl O-glycansattached to Leukosialin.The presence of sialyl Le(x)structures in O-glycans”(連接白涎蛋白的聚-N-乙酰半乳糖胺O-聚糖。O-聚糖中sialylLe(x)結(jié)構(gòu)的存在)，J.Biol.Chem.267(34)，24379-24386(1992)23.Nakamura M.et al.，“Simultaneous core 2betal→6N-acetylglucosaminyltransferase up-regulation and sialyl-Le(X)expressionduring activation of human tonsillar B lymphocytes”(人扁桃體B淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中的同時(shí)核心2β1→6N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶正調(diào)節(jié)和sialyl-Le(X)表達(dá))，F(xiàn)EBS lett.463(1-2)，125-128(1999)24.Wilkins P.P.et al.，“Structures of the O-glycans on P-selectinglycoprotein ligand-1 from HL-60cells”(HL-60細(xì)胞P-選凝素糖蛋白配體-1上的O-聚糖結(jié)構(gòu))，J.Biol.Chem.271(31)，18732-18742(1996)25.Ohmori K.et al.，“A distinct type of sialyl Lewis X antigendefined by a novel monoclonal antibody is selectively expressed on helpermemory T cells”(由新型單克隆抗體所規(guī)定的獨(dú)特類(lèi)型sialyl Lewis X抗原在輔助記憶T細(xì)胞上選擇性表達(dá))，Blood 82(9)，2797-805(1993)26.Kumamoto K.et al.，“Specific detection of sialyl Lewis Xdeterminant carried on the mucin GlcNAcbetal→6GalNAcalpha corestructure as a tumor-associated antigeh”(黏蛋白GlcNAcβ1→6GalNAcα核心結(jié)構(gòu)上攜帶的作為腫瘤相關(guān)抗原的sialyl Lewis X決定簇的特異性檢測(cè))，Biochem.Biophys.Res.Commun.247(2)，514-517(1998)27.Varki A.“Biological roles of oligosaccharidesall of the theoriesare correct”(寡糖的生物學(xué)角色所有的理論都是正確的)，Glycobiology3，97-130(1993)28.Walz G.et al.，“Recognition by ELAM-1 of the sialvl-Lexdeterminant on myeloid and tumor cells”(ELAM-1對(duì)骨髓和腫瘤細(xì)胞上的sialyl-Lex決定簇的識(shí)別)，Science 250(4984)，1132-1135(1990)29.Majuri M.L et al.，“Recombinant E-selectin-protein mediatestumor cell adhesion via sialyl-Le(a)and sialyl-Le(x)”(重組E-選凝素-蛋白質(zhì)通過(guò)sialyl-Le(a)和sialyl-Le(x)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞黏附)，Biochem.Biophys.Res.Commun.182(3)，1376-82(1992)30.Takada A.et al.，“Contribution of carbohydrate antigens sialylLewis A and sialyl Lewis X to adhesion of human cancer cells to vascularendothelium”(碳水花合物抗原sialyl Lewis A和sialyl Lewis X對(duì)人癌細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮的影響)，Cancer Res.53(2)，354-361(1991)31.Yousefi S.et al.，“Acetylglucosaminyltransferase activity inmetastic murine tumour cell lines”(轉(zhuǎn)移鼠腫瘤細(xì)胞系中的乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性)，J.Biol.Chem.266，1772-1782(1991)32.Beaum P.V.et al.，“Expression of core 2beta-1，6-N-acetylglucos-aminytransferase in a human pancreatic cancer cell line results in alteredexpression of MUC 1tumour-associated epitopes”(人胰腺癌細(xì)胞系中核心2β-1，6-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)導(dǎo)致MUC1腫瘤相關(guān)表位表達(dá)改變)，J.Biol.Chem.274，24641-24648(1999)33.Saitoh et al.，“Expression of aberrant O-glycans attached to leuko-sialin in diffferentiation-deficient HL-60cells”(連接到分化缺陷型HL-60細(xì)胞中白涎蛋白的異常O-聚糖的表達(dá))，Cancer Res.51(11)，2854-2862(1991)34.Brockhausen et al.，al.，“Biosynthesis of O-glycans in leukocytesfrom normal donors and from patients with leukemiaincrease in O-glycancore 2 UDP-GlcNAcGal[beta]3GalNAc[alpha]-R(GalNAc to GalNAc)[beta](1，6)-N-acetylglucosaminyltransferase in leukemic cells”(正常供體和白血病患者的白細(xì)胞中O-聚糖的生物合成白血病細(xì)胞中O-聚糖核心2UDP-GlcNAcGal[β]3GalNAc[α]-R(GalNAc→GalNAc)[β](1，6)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶增加)，Cancer Res.51，1257-1263(1991)35.Renkonen J.et al.，“Core 2beta1，6-N-acetylglucosaminyl-transferases and alpha 1，3-fucosyltransferases regulate the synthesis of O-glycans on selectin ligands on oral cavity carcinoma cells”(核心2β1，6-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶和α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)口腔癌細(xì)胞選凝素配體上的O-聚糖合成)，APMIS 109，500-506(2001)36.Shimodaira K.et al.，“Carcinoma-associated expression of core 2beta-1，6-N-acetylglucosaminyltransferase gene in human colorectal cancerrole of O-glycans in tumor progression”(人結(jié)腸直腸癌中核心2β-1，6-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶基因的癌相關(guān)表達(dá)O-聚糖在腫瘤進(jìn)展中的作用)，Cancer Res.1；57(23)，5201-5216(1997)37.Numahata K.et al.，“A distinct type of sialyl Lewis X antigendefined by a novel monoclonal antibody is selectively expressed on helpermemory T cells”(由新型單克隆抗體所規(guī)定的獨(dú)特類(lèi)型sialyl Lewis X抗原在輔助記憶T細(xì)胞上選擇性表達(dá))，Blood 82(9)，2797-805(2002)38.Klein R.，et al.，“The Winconsin epidemiology study of diabeticretinopathy X.Four-year incidence and progression of diabetic retinopathywhen age at diagnosis is 30 or more years”(糖尿病性視網(wǎng)膜病X的Winconsin流行病學(xué)研究。診斷時(shí)年齡在30歲或以上的糖尿病性視網(wǎng)膜病的四年發(fā)生和進(jìn)展)，Arch.Ophthalmol.107，244-250(1989)39.Davis M.D.，“Diabetic retinopathy-a clinical overview”(糖尿病性視網(wǎng)膜病—臨床評(píng)述)，Diabetes Care 15，1844-1873(1993)40.Kohner E.M.et al.，“Diabetic retinopathy”(糖尿病性視網(wǎng)膜病)in Diabetic Angiopathy，ed.Tooke J.E.，pages 233-247，Oxford UniversityPress(1999)41.Chibber R.et al.，“Activity of core 2GalNAc-(beta l，6)transferase，is higher in polymorphonuclear leukocytes from diabetic patients comparedto age-matched control subjects”(糖尿病患者的多形核白細(xì)胞中核心2GalNAc-(β1，6)轉(zhuǎn)移酶活性比年齡相當(dāng)?shù)膶?duì)照對(duì)象更高)，Diabetes 49，1724-1730(2000)42.Koya D.et al.，“Protein kinase C activation and the developmentof diabetic complications”(蛋白激酶C激活與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展)，Diabetes 47，859-866(1989)43.Meier M.et al.，“Protein kinase C activation and itspharmacological inhibition in vascular disease”(血管疾病中蛋白激酶C激活及其藥理學(xué)抑制)，Vasc.Med.5，173-185(2000)44.Sharma R.D.et al.，“Effect of fenugreek seeds on blood glucoseand serum lipids in type I diabetes”(胡蘆巴種子對(duì)I型糖尿病血液葡萄糖和血清脂質(zhì)的作用)，Eur.J.Clin.Nutr.44，301-306(1990)45.Broca C.et al.，“4-Hydroxyisoleucineeffects of synthetic andnatural analogues on insulin secretion”(4-羥基異亮氨酸合成和天然類(lèi)似物對(duì)胰島素分泌的作用)，Eur.J.Pharmacol.390(3)，339-345(2000)46.Sauvaire Y.et al.，“4-Hydroxyisoleucinea novel amino acidpotentiator of insulin secretion”(4-羥基異亮氨酸胰島素分泌的新型氨基酸增效劑)，Diabetes 47(2)，206-210(1998)47.Kuhns W.et al.，(1993)Processing O-glycan core 1，Galβ1-3GalNAcα-R.Specificities of core 2UDP-GlcNAcGalβ1-3GalNAc-R(GalNAc to GalNAc)β6-N-acetylaminotransferase and CMP sialic acidGalβ1-3GalNAc-Rα3sialyltransferase.(O-聚糖核心1，Galβ1-3GalNAcα-R的加工。核心2UDP-GlcNAcGalβ1-3GalNAc-R(GalNAc→GalNAc)β6-N-乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶和CMP唾液酸Galβ1-3GalNAc-Rα3唾液酸轉(zhuǎn)移酶的特異性)Glycoconjugate Journal 10 381-39448.Paulsen H.et al.，Leibigs Ann.Chem.747-758.(1992)49.Mulvihill N.T.et al.，Inflammation in acute coronary syndromes.(急性冠狀動(dòng)脈綜合征中的炎癥)Heart.87(3)201-4.(2002).
50.Guray U.et al.，Poor coronary collateral circulation is associatedwith higher concentrations of soluble adhesion molecules in patients withsingle-vessel disease.(單血管疾病患者冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)不良與可溶性黏著分子濃度升高有關(guān))Coron Artery Dis.15(7)413-7(2004)51.Guray U.et al.，Levels of soluble adhesion molecules in variousclinical presentations of coronary atherosclerosis.(冠狀動(dòng)脈硬化各種臨床表現(xiàn)中的可溶性黏著分子水平)Int J Cardiol.200496(2)235-40.
52.O′Brien KD et al.，Neovascular expression of E-selectin，intercellular adhesion molecule-1，and vascular cell adhesion molecule-1 inhuman atherosclerosis and their relation to intimal leukocyte content.(人動(dòng)脈硬化癥中E-選凝素、細(xì)胞間黏著分子-1和血管細(xì)胞黏著分子-1的新血管表達(dá)及它們與血管內(nèi)膜白細(xì)胞含量的關(guān)系)Circulation.15；93(4)672-82.(1996).
53.Davies MJ et al.，The expression of the adhesion moleculesICAM-1，VCAM-1，PECAM，and E-selectin in human atherosclerosis(人動(dòng)脈硬化癥中黏著分子ICAM-1、VCAM-1、PECAM和E-選凝素的表達(dá)).J Pathol.171(3)223-9(1993).
54.Chibber R et al.，Activity of the glycosylating enzyme，core 2GlcNAc(β1，6)transferase，is higher in leukocytes from diabetic patientscompared with age-matched control subjectsrelevance to capillaryocclusion in diabetic retinopathy(糖尿病患者白細(xì)胞的糖基化酶核心2GlcNAc(β1，6)轉(zhuǎn)移酶活性比年齡相當(dāng)?shù)膶?duì)照對(duì)象更高與糖尿病性視網(wǎng)膜病中毛細(xì)血管阻塞的相關(guān)性).Diabetes；49(10)1724-30(2000).
55.Yoshikawa M.et al.，Medicinal Foodstuffs.VIII.Fenugreek seed.(2)Structures of six new furostanol saponins，trigoneosides Iva，Va，Vb，VI，VIIb，and VIIIb from the seeds of indian Trigonella foenum-graecumL.(藥用食物.VIII.胡蘆巴種子.(2)印度Trigonella foenum-graecum L.種子的六種新呋甾烷醇型皂苷——胡蘆巴皂苷Iva、Va、Vb、VI、VIIb和VIIIb的結(jié)構(gòu))Heterocycles 47，397-405(1998)56.Ravikumar P.R.et al.，Dev.Chemistry of Ayurvedic crude drugspart VI-(Shatavari-1)Structure of shatavarin-IV(shatavarin-IV的結(jié)構(gòu)).Indian J.Chem.26B，1012-1017(1987).
57.Shimomura H.et al.，Steroidal saponins，Pardarinoside A-G fromthe bulbs of Lilium pardarinum.(Lilium pardarinum鱗莖的甾體皂苷元Pardarinoside A-G)Phytochemistry 28，3163-3170(1989).
58.Mimaki Y et al.，Steroidal saponins and alkaloids from the bulbsof Lilium brownii var.colchesteri.(Lilium brownii var.colchesteri鱗莖的甾體皂苷元和生物堿)Chemical & Pharmaceutical Bulletin 38(11)，3055-9(1990).
59.Sashida Y et al.，Studies on the chemical constituents of the bulbsof Lilium mackliniae.(Lilium mackliniae鱗莖化學(xué)成分的研究)Chemical& Pharmaceutical Bulletin 39(9)，2362-8(1991)60.Akhov L.S.et al.，Structure of steroidal saponins fromunderground parts of Allium nutans L.(Allium nutans L.地下部分的甾體皂苷元的結(jié)構(gòu))Journal of Agricultural and Food Chemistry 47(8)，3193-3196(1999)61.Joshi J.et al.，Chemistry of Ayurvedic crude drugs part VIII-Shatavari-2Structure elucidation of bioactive shatavarin I and otherglycosides.(生物活性shatavarin I和其他糖苷的結(jié)構(gòu)解析)Indian J.Chem.27B，12-16(1988).
62.Vasil′eva I.S.et al.，Composition and biologiucal activity ofsteroid glycosides from cell suspensions of dioscorea deltoideawall.(dioscorea deltoidea壁細(xì)胞懸液的甾族糖苷的組成和生物活性)Appl.Biochem.Microbiol.31，206-209(1995).
63.Sharma et al.，Oligofurostanosides from Asparagus curillusleaves.(Asparagus curillus葉的oligofurostanoside)Phytochemistry.33(3)683-6.(1993).
64.Petit G.et al.，Isolation and structure of cytostatic steroidalsaponins from the African medicinal plant Balanites aegyptica.(非洲藥用植物Balanites aegyptica的細(xì)胞靜止甾體皂苷元的分離和結(jié)構(gòu))Journal ofnatural products 54，1491-1502.
65.Hostettman K.Saponins(皂苷).Cambridge University Press UK.(1995).
66.Li C et al.，Synthesis of diosgenyl alpha-L-rhamnopyranosyl-(1-->2)-[beta-D-glucopyranosyl-(1-->3)-[beta-D-glucopyranoside(gracillin)and related saponins.(薯蕷皂苷α-L-吡喃鼠李糖基-(1-->2)-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-[β-D-吡喃葡糖苷(gracillin)和相關(guān)皂苷的合成)CarbohydrRes.；306(1-2)189-95.(1998).
67.Deng S et al.，Synthesis of three diosgenyl saponinsdioscin，polyphyllin D，and balanitin 7.(三種薯蕷皂苷dioscin、polyphyllin D和balanitin 7的合成)Carbohydr Res.；30；317(1-4)53-62.(1999)68.Li B et al.，An improved synthesis of the saponin，polyphyllinD.(polyphyllin D皂苷的改進(jìn)合成法)Carbohydr Res.；9；3311-7.(2001).
69.Yu B et al.，al.，A“double random”strategy for the preparation ofsaponln libraries.(制備皂苷文庫(kù)的“雙隨機(jī)”策略)J Comb Chem.；3(5)404-6.(2001).
70.Yu B.，et al.，al.，The first synthetic route to furostan saponins.(呋甾烷皂苷的第一合成途徑)Tetrahedron letters，42，77-79(2001).
71.Yu B et al.，Glycosyl trifluoroacetimidates.2.Synthesis of dioscinand xiebai saponin I.(薯蕷素和薤白皂苷I的合成)J Org Chem.；13；67(25)9099-102(2002).
72.Cheng MS et al.，Total synthesis of methyl protodioscina potentagent with antitumot activity.(具有抗腫瘤活性的有效藥劑——甲基原薯蕷素的總合成)J Org Chem.；2；68(9)3658-62(2003)73Du Y et al.，Synthesis of saponins using partially protected donors.(用部分保護(hù)的供體合成皂苷)Org Lett.；2；5(20)3627-30.(2003).
74.Yoshikawa et al.，Medicinal foodstuffs.IV.Fenugreek seed.(1)structures of trigoneosides Ia，Ib，IIa，IIb，IIIa and IIIb，new furostanolsaponins from the seeds of Indian Trigonella foenum-graecum L.(藥用食物.IV.胡蘆巴種子.(1)印度Trigonella foenum-graecum L.種子的新呋甾烷醇型皂苷——胡蘆巴皂苷Ia、Ib、IIa、IIb、IIIa和IIIb的結(jié)構(gòu))ChemPharm Bull(Tokyo)；45(1)81-7(1997).
75.Murakami T et al.，Medicinal foodstuffs.XVII.Fenugreek seed.(3)structures of new furostanol-type steroid saponins，trigoneosides Xa，Xb，XIb，XIIa，XIIb，and XIIIa，from the seeds of EgyptianTrigonellafoenum-graecum L.(藥用食物.XVII.胡蘆巴種子.(3)埃及Trigonellafoenum-graecum L.種子的新呋甾烷醇型皂苷——胡蘆巴皂苷Xa、Xb、XIb、XIIa、XIIb和XIIIa的結(jié)構(gòu))Chem Pharm Bull(Tokyo)；48(7)994-1000(2000).
權(quán)利要求
1.一種治療與核心2GlcNAc-T酶活性提高有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括給予有需要的患者有效量的式I化合物或其藥物可接受鹽、酯或互變異構(gòu)體形式或衍生物 其中R1是-OH、C1-6烷氧基、-NR8R9或式IIa單糖 R2是-OH、C1-6烷氧基或式IIb單糖 R3是-OH、C1-6烷氧基或式IIc單糖 R4是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R6是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R7是C2-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R8是H、C1-6烷基或C1-6?；籖9是H、C1-6烷基或C1-6?；?；Z是甾族基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1所述的治療方法，其中R1是式IIa單糖。
3.權(quán)利要求2所述的治療方法，其中R5是C1-6烷基或C1-6羥基烷基。
4.權(quán)利要求2所述的治療方法，其中R5是-CH3、-C2H5、-CH2OH或-C2H4OH。
5.權(quán)利要求1所述的治療方法，其中R3是式IIc單糖。
6.權(quán)利要求5所述的治療方法，其中R7是C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基。
7.權(quán)利要求5所述的治療方法，其中R7是-CH2OH或C1-6烷氧基甲基。
8.權(quán)利要求5所述的治療方法，其中R7是-CH2OH。
9.權(quán)利要求1所述的治療方法，其中式I化合物是式III化合物 其中R4是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R7是C2-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基。
10.權(quán)利要求9所述的治療方法，其中R4是C1-6烷基、C1-6羥基烷基。
11.權(quán)利要求9所述的治療方法，其中R4是-CH2OH或-CH3。
12.權(quán)利要求9所述的治療方法，其中R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基。
13.權(quán)利要求9所述的治療方法，其中R5是-CH3、-C2H5、-CH2OH或-C2H4OH。
14.權(quán)利要求9所述的治療方法，其中R7是C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基。
15.權(quán)利要求9所述的治療方法，其中R7是-CH2OH或C1-6烷氧基甲基。
16.權(quán)利要求9所述的治療方法，其中R7是-CH2OH。
17.權(quán)利要求9所述的方法，其中式III化合物是以下式I化合物，其中R1是鼠李糖；R2是-OH；R3是葡萄糖；R4是CH2OH。
18.權(quán)利要求9所述的方法，其中式III化合物是式IV化合物
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中式I化合物是式V化合物 其中R1是OH、C1-6烷氧基或NR8R9，或式IIa單糖；R4是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R5是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R6是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或C1-6烷氧基-C1-6烷基；R8是H、C1-6烷基或C1-6?；?；R9是H、C1-6烷基或C1-6?；籞是甾族基團(tuán)。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中R1是OH或NR8R9。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中R1是NR8R9；R8是H、C1-6烷基或C1-6?；?；R9是H、C1-6烷基或C1-6酰基。
22.權(quán)利要求19所述的方法，其中R1是NR8R9；R8是H；R9是H、C1-6烷基或C1-6?；?。
23.權(quán)利要求19所述的方法，其中R1是NR8R9；R8是H；R9是C1-6?；?。
23.權(quán)利要求19所述的方法，其中R1是NR8R9；R8是H；R9是-COCH3。
24.權(quán)利要求19所述的方法，其中式IV化合物是Galβ1→3(6-脫氧)GalNAcα-Z。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述甾族基團(tuán)是式VII基團(tuán) 其中R12是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R13是H、-OH、＝O或C1-6烷基；R14是H、-OH或C1-6烷基，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH，或者R15和R33一起是＝O；R16是H、-OH或＝O；R17是H、-OH或＝O；R18是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R19是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R20是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R21是H、-OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基或式VIII基團(tuán) R22是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R23是H、-OH、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基；R24是H、C1-6烷基、C1-6?；騿翁荕S；R28和R29相同或不同，是H或OH；R32是H、-OH或＝O；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；MS選自阿拉伯糖、木糖、來(lái)蘇糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、核酮糖、木酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、阿洛酮糖、景天庚酮糖、脫氧核糖、巖藻糖、鼠李糖、2-脫氧-葡萄糖、異鼠李糖、阿比可糖、葡糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺、神經(jīng)氨酸、胞壁酸、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰胞壁酸、O-乙酰神經(jīng)氨酸、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、果糖醛酸、塔格糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸、唾液酸和古洛糖醛酸；Y是N或O。
26.權(quán)利要求25的方法，其中Y是O。
27.權(quán)利要求25的方法，其中R21是式VIII基團(tuán)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中R24是C1-6烷基、C1-6?；騿翁荕S。
29.權(quán)利要求27的方法，其中R24是C1-6酰基或單糖MS。
30.權(quán)利要求27的方法，其中R24是單糖MS。
31.權(quán)利要求28、29或30中任一項(xiàng)的方法，其中MS選自葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、N-乙酰-葡糖胺、N-乙酰-半乳糖胺和唾液酸。
32.權(quán)利要求28、29或30中任一項(xiàng)的方法，其中MS是葡萄糖。
33.權(quán)利要求27的方法，其中R23是C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基。
34.權(quán)利要求27的方法，其中R23是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或＝CH2。
35.權(quán)利要求27的方法，其中R23是-C2H4OH、-CH2OH、C1-6烷基或＝CH2。
36.權(quán)利要求27的方法，其中R23是-C2H4OH、-CH2OH、-C2H5、-CH3或＝CH2。
37.權(quán)利要求27的方法，其中R23是-CH3。
38.權(quán)利要求27的方法，其中R23是＝CH2。
39.權(quán)利要求27的方法，其中R22是H、-OH或C1-6烷氧基。
40.權(quán)利要求27的方法，其中R22是H。
41.權(quán)利要求25的方法，其中R19是H、-OH或C1-6烷基。
42.權(quán)利要求25的方法，其中R12是H、-OH；R13是H或-OH；R14是H或-OH，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H，或者R15和R33一起是＝O；R18是H、-OH或C1-6烷氧基；R19是C1-6烷基；R20是H、-OH或C1-6烷氧基；R32是H、-OH或＝O；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
43.權(quán)利要求25的方法，其中R16是H或＝O；R17是H或-OH；R18是H或-OH；R20是-OH或C1-6烷氧基。
44.權(quán)利要求25的方法，其中所述甾族基團(tuán)選自 其中R18是H或-OH；R20是-OH或C1-6烷氧基；R24是葡萄糖或C1-6?；?；R29是H或-OH。
45.權(quán)利要求1的方法，其中所述式I化合物選自胡蘆巴皂苷，為(3β，25S)-26-(β-D-吡喃葡糖基氧基)-22-羥基呋甾-5-烯-3-基-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷，糖苷F，為(3β)-26-(β-D-吡喃葡糖基氧基)-22-羥基呋甾-5-烯-3-基-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷，Shatavarin I，化合物3，pardarinoside C。
46.權(quán)利要求1的方法，其中所述甾族基團(tuán)是式VIII基團(tuán) 其中R12是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R13是H、-OH、＝O或C1-6烷基；R14是H、-OH或C1-6烷基，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH，或者R15和R33一起是＝O；R16是H、-OH或＝O；R17是H、-OH或＝O；R18是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R19是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R20是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R27是H、-OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6羥基烷基；R28和R29相同或不同，是H或OH；R32是H、-OH或＝O；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
47.權(quán)利要求46的方法，其中R27是H、C1-6烷基或C1-6烷氧基。
48.權(quán)利要求46的方法，其中R27是H或C1-6烷基。
49.權(quán)利要求46的方法，其中R19是H、-OH或C1-6烷基。
50.權(quán)利要求46的方法，其中R20是-OH或C1-6烷氧基。
51.權(quán)利要求46的方法，其中R12是H或-OH；R13是H或-OH；R14是H或-OH，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H，或者R15和R33一起是＝O；R16是H、-OH或＝O；R17是H、-OH或＝O；R18是H、-OH或C1-6烷氧基；R19是C1-6烷基；R32是H、-OH或＝O；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
52.權(quán)利要求46的方法，其中所述甾族基團(tuán)的化合物是式IXa化合物
53.權(quán)利要求46的方法，其中所述式I化合物是下式化合物
54.權(quán)利要求1的方法，其中所述甾族基團(tuán)是式XI 其中R12是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R13是H、-OH、＝O或C1-6烷基；R14是H、-OH或C1-6烷基，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H或-OH，或者R15和R33一起是＝O；R16是H、-OH或＝O；R17是H、-OH或＝O；R18是H、-OH、C1-6烷氧基或C1-6烷基；R19是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R25是H、-OH、C1-6烷基或C1-6烷氧基；R26是H、-OH、C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基；R28和R29相同或不同，是H或-OH；R31是H或-OH；R32是H、-OH或＝O；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R34是H或-OH；X是O、S或NH。
55.權(quán)利要求54的方法，其中X是O或NH。
56.權(quán)利要求54的方法，其中X是O。
57.權(quán)利要求54的方法，其中R26是C1-6烷基、C1-6羥基烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、＝CH2或＝CH-C1-6烷基。
58.權(quán)利要求54的方法，其中R26是C1-6烷基、C1-6羥基烷基或＝CH2。
59.權(quán)利要求54的方法，其中R26是-C2H4OH、-CH2OH、C1-6烷基或＝CH2。
60.權(quán)利要求54的方法，其中R26是-C2H4OH、-CH2OH、-C2H5、-CH3或＝CH2。
61.權(quán)利要求54的方法，其中R26是-CH3或＝CH2。
62.權(quán)利要求54的方法，其中R19是H、-OH、C1-6烷基。
63.權(quán)利要求54的方法，其中R19是C1-6烷基。
64.權(quán)利要求54的方法，其中R12是H或-OH；R13是H或-OH；R14是H，或者R14和R33一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R15是H，或者R15和R33一起是＝O；R18是H或-OH；R25是H或-OH；R28和R29是H；R31是H或-OH；R33是H，或者R33和R15一起是＝O，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵；R34是H或-OH。
65.權(quán)利要求54的方法，其中R15是H；R16是H或-OH；R17是H或-OH；R32是H或-OH；R33是H，或者R33和R14一起表示連接相鄰碳原子的雙鍵的第二鍵。
66.權(quán)利要求54的方法，其中所述式XI甾族基團(tuán)選自
67.權(quán)利要求54的方法，其中所述式XI甾族基團(tuán)選自薯蕷皂苷元、亞莫皂苷元、提果皂甙元、新提果皂甙元、菝葜皂甙元、異菝葜皂甙元、龍舌蘭皂苷元、澳洲茄胺或番茄苷元。
68.權(quán)利要求1的方法，其中所述式I化合物選自Shatavarin IV，為菝葜皂甙元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷，化合物12，為澳洲茄胺3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷，Deltonin，為(3β，25R)-螺甾-5-烯-3-基-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷，槲果素VI，為(3β，25S)-螺甾-5-烯-3-基-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡糖苷。
69.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是炎性疾病、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、炎性腸病、糖尿病性心肌病、心肌機(jī)能障礙、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
70.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是白血病、口腔癌、肺癌如肺腺癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、肝癌、胃腫瘤、結(jié)腸腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、乳腺癌、肺腫瘤、口腔癌和其中核心2GlcNAc-T表達(dá)超過(guò)該組織類(lèi)型正常水平的任何癌癥。
71.權(quán)利要求1-69中任一項(xiàng)的方法中公開(kāi)的化合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療與核心2GlcNAc-T酶活性提高有關(guān)的病癥。
72.權(quán)利要求71所述的用途，其中所述病癥是炎性疾病、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、炎性腸病、糖尿病性心肌病、心肌機(jī)能障礙、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
73.權(quán)利要求68所述的用途，其中所述病癥是白血病、口腔癌、肺癌如肺腺癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、肝癌、胃腫瘤、結(jié)腸腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、乳腺癌、肺腫瘤、口腔癌和其中核心2GlcNAc-T表達(dá)超過(guò)該組織類(lèi)型正常水平的任何癌癥。
74.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-69中任一項(xiàng)的方法中公開(kāi)的化合物。
75.一種下式的化合物
76.權(quán)利要求75所述的式XII化合物在治療中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及已知的和新型的化合物作為UDP－GlcNAcGalβ1,3GalNAc－R(GlcNAc→GalNAc)β1,6－N－乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(核心2β1,6 N－乙酰氨基轉(zhuǎn)移酶，核心2GlcNAc－T－EC 2.4.1.102)抑制劑的用途。這種抑制劑可應(yīng)用于治療由核心2GlcNAc－T活性提高引起的疾病，具體地說(shuō)有炎性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病性心肌病、癌癥(包括癌癥轉(zhuǎn)移的治療和預(yù)防)或糖尿病性視網(wǎng)膜病。
文檔編號(hào)C07H3/00GK1917886SQ200480041735
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
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