專利名稱：自身免疫病療法中cd20的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自身免疫病的治療，其中在從患有自身免疫病的患者獲得的樣品中檢測(cè)到CD20。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞是在造血過(guò)程中在骨髓中生成的多種類型白細(xì)胞中的一種。有兩種主要的淋巴細(xì)胞群B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)。本文特別感興趣的淋巴細(xì)胞是B細(xì)胞。
B細(xì)胞在骨髓中成熟，然后離開骨髓并在它們的細(xì)胞表面表達(dá)抗原結(jié)合抗體。當(dāng)幼稚B細(xì)胞初次遇到其膜結(jié)合抗體特異性的抗原后，細(xì)胞開始快速分裂，且其后代分化成為記憶B細(xì)胞和稱做“漿細(xì)胞”的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞具有較長(zhǎng)的壽命，并繼續(xù)表達(dá)與最初的親代細(xì)胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不生成膜結(jié)合抗體，但改為生成可分泌的抗體形式。分泌型抗體是體液免疫的主要效應(yīng)分子。
CD20抗原(也稱做人B淋巴細(xì)胞限制分化抗原，Bp35)是位于前B淋巴細(xì)胞(pre-B)和成熟B淋巴細(xì)胞上、具有約35kD分子量的疏水性跨膜蛋白質(zhì)(Valentine等，J.Biol.Chem.，264(19)11282-11287，1989；和Einfeld等，EMBO J.，7(3)711-717，1988)。該抗原也在超過(guò)90％的B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表達(dá)(Anderson等，Blood，63(6)1424-1433，1984)，但在造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞(pro-B)、正常漿細(xì)胞或其他正常組織上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(Tedder等，J.Immunol.，135(2)973-979，1985)。CD20調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始和分化的激活過(guò)程的早期步驟(Tedder等，如上所述)，并可能作為鈣離子通道發(fā)揮作用(Tedder等，J.Cell.Biochem.，14D195，1990)。
如果CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，則該抗原可用做“靶向”這種淋巴瘤的候選者。本質(zhì)上，這種靶向作用可概括如下對(duì)患者施用對(duì)B細(xì)胞CD20表面抗原特異的抗體，這些抗CD20抗體特異結(jié)合正常和惡性B細(xì)胞的CD20抗原(在表面上)；抗體與CD20表面抗原結(jié)合可導(dǎo)致腫瘤B細(xì)胞的破壞和消減。此外，可將具有破壞腫瘤潛力的化學(xué)試劑或放射性標(biāo)記物與抗CD20抗體偶聯(lián)，使得試劑特異“投遞”至腫瘤B細(xì)胞。不考慮方法，首要目標(biāo)是破壞腫瘤；具體方法可根據(jù)所使用的具體抗CD20抗體來(lái)決定，因此可利用的靶向CD20抗原的方法可能變化相當(dāng)大。
rituximab(RITUXAN)抗體是針對(duì)CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體。Rituximab是在1998年4月7日批準(zhǔn)的美國(guó)專利5,736,137中稱為“C2B8”的抗體(Anderson等)。RITUXAN指示用于治療患有復(fù)發(fā)的或難治的低級(jí)或?yàn)V泡性CD20陽(yáng)性B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用機(jī)制的體外研究表明RITUXAN結(jié)合人補(bǔ)體并通過(guò)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)溶解淋巴樣B細(xì)胞系(Reff等，Blood，83(2)435-445，1994)。此外，它在抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)中具有顯著活性。最近，RITUXAN在氚標(biāo)記胸苷摻入試驗(yàn)中顯示出具有抗增殖作用，并直接誘導(dǎo)凋亡，而其它抗CD19和CD20抗體不顯示這些作用(Maloney等，Blood，88(10)637a，1996)。在試驗(yàn)中還觀察到RITUXAN與化學(xué)療法和毒素之間的協(xié)同作用。具體地說(shuō)，RITUXAN可使耐藥性人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系對(duì)阿霉素、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細(xì)胞毒性作用敏感(Demidem等，Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals，12(3)177-186，1997)。體內(nèi)臨床前研究顯示RITUXAN可能通過(guò)補(bǔ)體和細(xì)胞介導(dǎo)的作用從獼猴的外周血、淋巴結(jié)和骨髓中消減B細(xì)胞(Reff等，Blood，83(2)435-445，1994)。
涉及CD20抗體的專利和專利出版物包括美國(guó)專利5,776,456、5,736,137、6,399,061和5,843,439，以及美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0197255 A1、US 2003/0021781 A1、US 2003/0082172 A1、US 2003/0095963 A1、US2003/0147885 A1(Anderson等)；美國(guó)專利6,455,043 B1和WO 00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO 00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO 00/44788(Braslawsky等)；WO 01/10462(Rastetter，W.)；WO 01/10461(Rastetter和White)；WO 01/10460(White和Grillo-Lopez)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0006404和WO 02/04021(Hanna和Hariharan)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0012665 A1和WO 01/74388(Hanna，N.)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0058029 A1(Hanna，N.)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2003/0103971 A1(Hariharan和Hanna)；美國(guó)專利申請(qǐng)US2002/0009444 A1和WO 01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO 01/97858(White，C.)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0128488 A1和WO 02/34790(Reff，M.)；WO 02/060955(Braslawsky等)；WO 02/096948(Braslawsky等)；WO02/079255(Reff和Davies)；美國(guó)專利6,171,586 B1和WO 98/56418(Lam等)；WO 98/58964(Raiu，S.)；WO 99/22764(Raiu，S.)；WO 99/51642、美國(guó)專利6,194,551B1、美國(guó)專利6,242,195B1、美國(guó)專利6,528,624 B1和美國(guó)專利6,538,124(Idusogie等)；WO 00/42072(Presta，L.)；WO 00/67796(Curd等)；WO 01/03734(Grillo-Lopez等)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0004587A1和WO 01/77342(Miller和Presta)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2002/0197256(Grewal，I.)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2003/0157108 A1(Presta，L.)；美國(guó)專利6,090,365 B1、6,287,537 B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等)；美國(guó)專利5,500,362、5,677,180、5,21,108和6,120,767(Robinson等)；美國(guó)專利6,410,391 B1(Raubitschek等)；美國(guó)專利6,224,866 B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WOO0/67795(Goldenberg)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2003/01339301 A1和WO 00/74718(Goldenberg和Hansen)；WO 00/76542(Golay等)；WO 01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美國(guó)專利6,368,596B1(Ghetie等)；美國(guó)專利申請(qǐng)US2002/0041847 A1(Goldenberg，D.)；美國(guó)專利申請(qǐng)US 2003/0026801 A1(Weiner和Hartmann)；WO 02/102312(Engleman，E.)；美國(guó)專利申請(qǐng)US2003/0068664(Albitar等)；WO 03/002607(Leung，S.)；WO 03/049694和US 2003/0185796 A1(Wolin等)；WO 03/061694(Sing和Siegall)；US2003/0219818 A1(Bohen等)；US 2003/0219433 A1和WO 03/068821(Hansen等)，上述每一篇文章都清楚地引入本文作為參考。還可見(jiàn)美國(guó)專利5,849,898和歐洲專利申請(qǐng)330,191(Seed等)；美國(guó)專利4,861,579和EP332,865 A2(Meyer和Weiss)；USP 4,861,579(Meyer等)和WO 95/03770(Bhat等)。
涉及用Rituximab進(jìn)行治療的出版物包括Perotta和Abuel，″Responseof chronic relapsing ITP of 10years duration to Rituximab″，摘要#3360，Blood，10(1)(1-2部分)88B，1998；Stashi等，″Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura″，Blood，98(4)952-957，2001；Matthews，R.，″Medical Heretics″，New Scientist，2001年4月7日；Leandro等，″Clinicaloutcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocytedepletion″，Ann.Rheum.Dis.，61833-888，2002；Leandro等，″Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritisearly evidence for safety，efficacy and doseresponse.″，Arthritis and Rheumatism，44(9)S370，2001；Leandro等，″Anopen study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus″，Arthritis & Rheumatism，46(1)2673-2677，2002；Edwards和Cambridge，″Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed todeplete B lymphocytes″，Rhematology，40205-211，2001；Edwards等，″B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmunedisotders″，Biochem.Soc.Trans.，30(4)824-828，2002；Edwards等，″Efficacyand safety of Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibodyArandomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.″，Arthritis and Rheumatism，46(9)S197，2002；Levine和Pestronk，″IgMantibody-relatedpolyneuropathiesB-cell depletion chemotherapy usingRituximab″，Neurology，521701-1704，1999；DeVita等，″Efficacy of selectiveB cell blockade in the treatment of rheumatoidarthritis″，Arthritis & Rheum.，462029-2033，2002；Hidashida等，″Treatment of DMARD-Refractory rheumatoidarthritis with rituximab.″，出現(xiàn)在美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)科學(xué)年會(huì)(AnnualScientific Meeting of the American College of Rheumatology)，2002年10月24-29日，New Orleans，LA；Tuscano，J.，″Successful treatment ofInfliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab″，出現(xiàn)在美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)科學(xué)年會(huì)(Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology)，2002年10月24-29日，New Orleans，LA。
Sarwal等，N.Eng.J.Med.，349(2)125-138，2003年7月10日?qǐng)?bào)道了通過(guò)DNA微陣識(shí)別譜鑒定的急性同種異體腎移植排異中的分子異質(zhì)性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及這樣一種認(rèn)識(shí)，即可以根據(jù)取自患者的樣品中存在CD20來(lái)選擇患者進(jìn)行治療。因此，本發(fā)明提供了治療患者自身免疫病的方法，該方法包括(a)對(duì)取自患者的樣品檢測(cè)CD20；和(b)如果在樣品中檢測(cè)到CD20，則對(duì)患者施用治療自身免疫病有效量的CD20拮抗劑。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述I.定義本文中“自身免疫病”是指源自和針對(duì)個(gè)體自身組織的疾病或紊亂。自身免疫病或紊亂的例子包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎)、牛皮癬、皮炎、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死松解(toxic epidermal necrolysis)、全身性硬皮病和硬化癥、與炎性腸道疾病(IBD)有關(guān)的應(yīng)答、Crobn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合癥、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、結(jié)腸炎、腎小球腎炎、過(guò)敏性病癥、濕疹、哮喘、T細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)的病癥和慢性炎性反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、青少年型糖尿病、多發(fā)性硬化、變應(yīng)性腦脊髓炎、細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的與急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)有關(guān)的免疫反應(yīng)、結(jié)核、結(jié)節(jié)病(sarcoidosis)、肉芽腫病包括Wegener氏肉芽腫病、粒細(xì)胞缺乏癥、血管炎(包括ANCA)、再生障礙性貧血、Diamond-Blackfan二氏貧血、免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、純紅細(xì)胞發(fā)育不全(PRCA)(pure red cell aplasia)、因子VIII缺乏、甲型血友病、自身免疫性中性白細(xì)胞減少癥、全血細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少癥、涉及白細(xì)胞性血細(xì)胞滲出的疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥、多器官損傷綜合癥、重癥肌無(wú)力、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體綜合癥、過(guò)敏性神經(jīng)炎、Bechet病(Bechet disease)、Castleman氏綜合癥(Castleman’s syndrome)、Goodpasture氏綜合癥(Goodpasture’ssyndrome)、Lambert-Eaton二氏肌無(wú)力綜合癥(Lambert-Eaton MyasthenicSyndrome)、Reynaud氏綜合癥(Reynaud’s syndrome)、Sjorgen氏綜合癥(Sjorgen’s syndrome)、Stevens-Johnson二氏綜合癥(Stevens-Johnsonsyndrome)、大皰性類天皰瘡、天皰瘡、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、Reiter氏病(Reiter’s disease)、僵人綜合癥(stiff-man syndrome)、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎(giant cell arteriris)、免疫復(fù)合物腎炎、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性甲狀腺功能減退；自身免疫性內(nèi)分泌疾病包括自身免疫性甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis))、亞急性甲狀腺炎、特發(fā)性甲狀腺機(jī)能減退、Addison氏病、Grave氏病、自身免疫性多腺體綜合癥(或多腺體內(nèi)分泌病綜合癥)、I型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和Sheehan氏綜合癥；自身免疫性肝炎、淋巴樣間質(zhì)肺炎(LIV)、梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植)與NSIP、Guillain-Barre二氏綜合癥(Guillain-Barre’s syndrome)、大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(Takayasu’s)動(dòng)脈炎)、中等血管血管炎(包括Kawasaki’s disease和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、強(qiáng)直性脊柱炎、Berger氏病(IgA腎病)、快速進(jìn)展的腎小球腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、口炎性腹瀉(Celiac sprue)(麩質(zhì)腸病(glutenenteropathy))、冷球蛋白血癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)、冠狀動(dòng)脈病等。
“B細(xì)胞”是在骨髓中成熟的淋巴細(xì)胞，包括幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或效應(yīng)B細(xì)胞(漿細(xì)胞)。本文中的B細(xì)胞可以是正常的或非惡性的B細(xì)胞。
“CD20”抗原是在超過(guò)90％來(lái)自外周血或淋巴器官的B細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的一種約35kDa非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，并保持到漿細(xì)胞分化。CD20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞上。文獻(xiàn)中CD20的其它名稱包括“B淋巴細(xì)胞限制抗原”和“Bp35”。例如，Clark等，PNAS(USA)，821766，1985中描述了CD20抗原。
“檢測(cè)CD20”是指評(píng)估樣品是否含有CD20。通常檢測(cè)CD20蛋白質(zhì)，但是檢測(cè)CD20核酸也包含在本文這一短語(yǔ)中。
本文中“CD20核酸”指編碼至少部分CD20蛋白質(zhì)的核酸，包括mRNA和DNA，和/或互補(bǔ)核酸。
“CD20陽(yáng)性B細(xì)胞”指通常在其細(xì)胞表面表達(dá)CD20的B細(xì)胞。
“致病性”細(xì)胞指引起疾病或異常且可能存在于患病組織或細(xì)胞中間或周圍的細(xì)胞。
“拮抗劑”指在結(jié)合B細(xì)胞上的CD20后破壞或消減哺乳動(dòng)物B細(xì)胞和/或干擾一種或多種B細(xì)胞功能(例如通過(guò)減少或阻止由B細(xì)胞引發(fā)的體液反應(yīng))的分子。優(yōu)選的是，拮抗劑能夠在用其治療的哺乳動(dòng)物中消減B細(xì)胞(即降低循環(huán)B細(xì)胞水平)。這種消減可通過(guò)各種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)，諸如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、抑制B細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)B細(xì)胞死亡(如通過(guò)凋亡)。本發(fā)明范圍內(nèi)的拮抗劑包括抗體、合成或天然序列肽、以及與CD20結(jié)合的小分子拮抗劑，任選與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)或融合。優(yōu)選的拮抗劑包括抗體。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體，隨后促使靶細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞NK細(xì)胞只表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92，1991中第464頁(yè)表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利5,500,362或5,821,337中所描述的?？捎糜谶@些測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes等，PNAS(USA)，95652-656，1998中所公開的。
“人效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIlA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于它們的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。激活受體FcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(見(jiàn)Daron，Annu.Rev.Immunol.，15203-234，1997)。FcR的綜述見(jiàn)Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-492，1991；Capel等，Immunomethods，425-34，1994；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.，126330-34l，1995。本文中術(shù)語(yǔ)“FcR”涵蓋其它FcR，包括未來(lái)將會(huì)鑒定的FcR。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體FcRn，它負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等，J.Immunol.，117587，1976和Kim等，J.Immunol.，24249，1994)。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指在存在補(bǔ)體的情況下分子溶解靶細(xì)胞的能力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(如抗體)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202163，1996中所描述的。
“生長(zhǎng)抑制性”拮抗劑指那些阻止或減少表達(dá)與拮抗劑結(jié)合的抗原的細(xì)胞增殖的拮抗劑。例如，拮抗劑可在體外和/或在體內(nèi)阻止或減少B細(xì)胞增殖。
“誘導(dǎo)凋亡”的拮抗劑指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)凋亡測(cè)定法諸如膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破裂和/或膜囊形成(稱作凋亡小體)的測(cè)定，誘導(dǎo)例如B細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡的拮抗劑。
本文中術(shù)語(yǔ)“抗體”使用其最廣泛的含義，具體覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、以及抗體片段，只要它們顯示所需生物學(xué)活性。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
為了本文的目的，“完整抗體”指包含重鏈和輕鏈可變區(qū)以及Fc區(qū)的抗體。
“天然抗體”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的分子量為約150,000道爾頓的異型四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在具有不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，接著是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，而另一端是一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成了界面。
術(shù)語(yǔ)“可變”指可變區(qū)中的某些部分在不同抗體的序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)都包含四個(gè)FR，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接的三個(gè)高變區(qū)連接，而且在某些情況中形成部分β-折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR非常接近地保持在一起，并與其它鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(見(jiàn)Kabat等，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示出多種效應(yīng)子功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和殘余“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab′)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且還能夠交聯(lián)抗原。
“Fy”是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這個(gè)區(qū)域由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在VH-VL二聚體表面確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。本文中Fab’-SH是其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab′)2抗體片段最初是作為成對(duì)Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。
來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種(分型)，稱作κ和λ。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將抗體歸入不同的類別(分類)。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。將與不同抗體類別對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作α、δ、ε、γ和μ。各種類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
“單鏈Fy”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見(jiàn)Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。
術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。通過(guò)使用過(guò)短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448，1993。
術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的變體外，這種變體通常以極少量存在。與典型地包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品不同，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的同一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在它們未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)“單克隆”指示由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并不解釋為需要通過(guò)任何特定方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)最初由Kohler等，Nature，256495，1975描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或者通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備(見(jiàn)例如美國(guó)專利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可使用例如Clackson等，Nature，352624-628，1991和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597，1991中描述的技術(shù)由噬菌體抗體庫(kù)分離。
本文的單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及這種抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物學(xué)活性(美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855，1984)。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)，諸如狒狒、恒河猴或恒河猴)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列以及人恒定區(qū)序列的“靈長(zhǎng)類化(primatized)”抗體(美國(guó)專利5,693,780)。
非人(如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基(供體抗體)替換的免疫球蛋白。在某些情況中，將人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體將包含基本上不少于至少一個(gè)、通常兩個(gè)這樣的可變區(qū)，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR，除了上文所述的FR替代。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones等，Nature，321522-525，1986；Riechmann等，Nature，332323-329，1988；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596，1992。
術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或來(lái)自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重鏈可變區(qū)中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917，1987)?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指本文定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
結(jié)合CD20抗原的抗體的例子包括現(xiàn)在稱作“Rituximab”(“RITUXAN”)的“C2B8”(美國(guó)專利5,736，137，明確引入本文作為參考)；稱作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN的釔[90]標(biāo)記2B8鼠抗體(美國(guó)專利5,736,137，明確引入本文作為參考)；鼠IgG2a“B1”，也稱作“Tositumomab”，任選用131I標(biāo)記以產(chǎn)生“131I-B1”抗體(碘I131 Tositumomab，BEXXARTM)(美國(guó)專利5,595,721，明確引入本文作為參考)；鼠單克隆抗體“1F5″(Press等，Blood，69(2)584-591，1987和“框架修補(bǔ)”或人源化1F5(WO 03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗體(美國(guó)專利5,677,180，明確引入本文作為參考)；人源化2H7；huMax-CD20(Genmab，丹麥)；AME-133(Applied Molecular Evolution)；和可從國(guó)際白細(xì)胞分類研究組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得的單克隆抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等，《Leukocyte Typing III》，McMichael編，第440頁(yè)，牛津大學(xué)出版社，1987)。
本文中術(shù)語(yǔ)“rituximab”或“RITUXAN”指針對(duì)CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國(guó)專利5,736,137(明確引入本文作為參考)中稱作“C2B8”，包括該抗體保持結(jié)合CD20能力的片段。
純粹為了本發(fā)明的目的，“人源化2H7”指包含如下可變輕鏈序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO1)；和如下可變重鏈序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO2)的完整抗體或抗體片段。
當(dāng)人源化2H7抗體是完整抗體時(shí)，優(yōu)選的是它包含如下輕鏈氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSIVTKSFNRGEC(SEQ ID NO3)；和如下重鏈氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTILPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWFSNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO4)。
“分離的”拮抗劑指由其天然環(huán)境的成分鑒別、分離和/或回收的拮抗劑。其天然環(huán)境的污染成分指將會(huì)干擾拮抗劑的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將拮抗劑純化至(1)根據(jù)Lowry方法的測(cè)定，拮抗劑重量超過(guò)95％，最優(yōu)選重量超過(guò)99％，(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式蛋白質(zhì)測(cè)序儀獲得至少15個(gè)N-末端殘基或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)通過(guò)使用考馬斯亮藍(lán)或優(yōu)選銀染色的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達(dá)到同質(zhì)。既然拮抗劑的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的拮抗劑包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位拮抗劑。然而，通常，分離的拮抗劑將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。
本文中的“患者”指人類患者。
“治療”指治療性處理和預(yù)防性措施二者。需要治療的人包括已經(jīng)患病的人以及要預(yù)防疾病的人。因此，哺乳動(dòng)物可能診斷為患有疾病或可能有患病的傾向或容易患病。
表述“有效量”指有效預(yù)防、改善或治療所討論疾病的拮抗劑數(shù)量。
術(shù)語(yǔ)“免疫抑制劑”在本文中用于輔助治療時(shí)指承擔(dān)抑制或掩蓋本文所治療哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。這種試劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見(jiàn)美國(guó)專利4,665,077，本文引用其公開書作為參考)；非類固醇抗炎藥(NSAID)；咪唑硫嘌呤(azathioprine)；環(huán)磷酰胺；溴隱亭(bromocryptine)；達(dá)扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(如美國(guó)專利4,120,649中所述，它掩蓋MHC抗原)；針對(duì)MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇，諸如糖皮質(zhì)類固醇，如強(qiáng)的松(prednisone)、甲基強(qiáng)的松龍和地塞米松；甲氨蝶呤(口服或皮下)；hvdroxycloroquine；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；來(lái)氟米特(leflunomide)；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-γ、-β或-α抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；泛T抗體(pan-T antibodies)，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO 90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；來(lái)自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T細(xì)胞受體(Cohen等，美國(guó)專利5,114,721)；T細(xì)胞受體片段(Offner等，Science，251；430-432，1991；WO 90/11294；Ianeway，Nature，341；482，1989；和WO 9I/01133)；和T細(xì)胞受體抗體(EP 340,109)，諸如 T10B9。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或促使細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意欲包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素或其片段。
“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎?，諸如噻替哌(thiotepa)和環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲類(nitrosureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉霉素、放線菌素、氨茴霉素、氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C(cactinomycin)、加利車霉素、carabicin、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來(lái)霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、多西氟尿啶(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、羥甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春堿酰胺(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；環(huán)磷酰胺；塞替哌(thiotepa)；類紫杉醇類(taxoid)，如紫杉醇paclitaxel(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；異磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)；諾維本(navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維A酸；esperamicins；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質(zhì)的制藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。該定義還包括承擔(dān)調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何物質(zhì)的制藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”指由一種細(xì)胞群釋放的、作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。這種細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。生長(zhǎng)激素也包括在細(xì)胞因子中，諸如人生長(zhǎng)激素、N-甲二磺酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體(生成)激素(LH)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；Mullerian氏抑制性物質(zhì)(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素(activin)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF-β；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor)；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)、和粒細(xì)胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，諸如FNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。
術(shù)語(yǔ)“前體藥物”在用于本申請(qǐng)時(shí)指與母藥(parent drug)相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降那绑w和衍生物形式藥物活性物質(zhì)。參見(jiàn)如Wilman，″Prodrugs in Cancer Chemotherapy″，Biochemical Societv Transactions，14，375-382，615th Meeting Belfast，1986和Stella等，″ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery″，Directed Drug Delivery，Borchardt等編，247-267，Humana Press，1985。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽(酯)前體藥物、含硫代磷酸鹽(酯)前體藥物、含硫酸鹽(酯)前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含β-內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無(wú)細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟胞嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。
“B細(xì)胞惡性腫瘤”指涉及B細(xì)胞的惡性腫瘤。例子包括何杰金氏病，包括淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細(xì)胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)；毛細(xì)胞白血?。活悵{細(xì)胞淋巴細(xì)胞性淋巴瘤；套細(xì)胞淋巴瘤；AIDS或HIV相關(guān)淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤；移植后淋巴增殖紊亂(PTLD)；Waldenstrom氏巨球蛋白血癥(淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤)；粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤；和邊緣區(qū)淋巴瘤/白血病。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)包括但不限于低級(jí)/濾泡NHL、復(fù)發(fā)或難治的NHL、前線低級(jí)NHL、階段III/lV NHL、化療耐受性NHL、小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL、中級(jí)/濾泡NHL、中級(jí)彌漫性NHL、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、攻擊性NHL(aggressive NHL)(包括攻擊性前線NHL(aggressive front-lineNHL)和攻擊性復(fù)發(fā)性NHL)、自體干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)或難治的NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞NHL、高級(jí)小非分裂細(xì)胞NHL、bulky病NHL等。
II.檢測(cè)CD20本發(fā)明提供了治療在取自患者的樣品中檢測(cè)到CD20的自身免疫病的方法。根據(jù)本方法，從患者獲取生物學(xué)樣品，并進(jìn)行分析以評(píng)估樣品中是否存在CD20(蛋白質(zhì)、DNA、RNA)。優(yōu)選的是，評(píng)估(致病性)CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的存在，但是本文設(shè)想檢測(cè)非細(xì)胞抗原，例如循環(huán)CD20或其片段。如果檢測(cè)到CD20，則決定患者適于用CD20拮抗劑進(jìn)行治療。
可通過(guò)各種方法來(lái)檢測(cè)CD20，包括免疫組織化學(xué)(IHC)、免疫染色、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、免疫沉淀、蛋白質(zhì)印跡、熒光原位雜交(FISH)、DNA微陣等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以合適的測(cè)定法形式，優(yōu)選免疫組織化學(xué)法，使用與CD20蛋白結(jié)合的抗體或其它配體檢測(cè)CD20蛋白的存在。然而，本發(fā)明特別希望例如通過(guò)基因概況分析、FISH或其它方法分析所測(cè)樣品中的CD20核酸，包括DNA和RNA，從而測(cè)定CD20的上調(diào)或CD20產(chǎn)量的增加。
可利用結(jié)合CD20的各種抗體檢測(cè)CD20抗原，包括例如C2B8、2B8、B1、1F5、2H7、huMax-CD20、AME-133、L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2、可從Abcam Ltd購(gòu)得的抗體(小鼠單克隆MEM-97、小鼠單克隆L26、山羊多克隆MS4A1、小鼠單克隆BCA-B/20)等。
本文中測(cè)試的生物學(xué)樣品由感興趣的自身免疫病確定。選擇進(jìn)行測(cè)試的自身免疫病的例子包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎-滑膜活組織檢查和/或滑液，狼瘡-淋巴結(jié)(例如扁桃體淋巴結(jié))、骨髓活組織檢查、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，潰瘍性結(jié)腸炎或炎性腸道疾病-內(nèi)窺鏡檢查樣品，自身免疫病的皮膚病學(xué)表現(xiàn)-穿刺活組織檢查、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、淋巴結(jié)，等等。
樣品可以是冷凍的、新鮮的、固定的(如福爾馬林固定的)、離心的和/或包埋的(例如石蠟包埋的)等。
絕大多數(shù)免疫組織化學(xué)方法采用細(xì)胞或組織固定步驟，該步驟使用甲醛或其它交聯(lián)固定劑，然后與一抗一起保溫?？赏ㄟ^(guò)固定保持組織形態(tài)，并防止組織抗原降解?？赏ㄟ^(guò)將組織切片(例如人活組織檢查)浸沒(méi)于固定劑中來(lái)進(jìn)行固定。由于固定不足或固定過(guò)度可降低或消除組織免疫反應(yīng)性，因此需要將固定條件最佳化。校正固定不足的最簡(jiǎn)單方法是將組織切片在載玻片上后固定(post-fit)，然后再開始免疫組織化學(xué)染色。為了恢復(fù)固定過(guò)度組織中的抗原，推薦使用蛋白酶誘導(dǎo)表位修復(fù)(PIER)或熱誘導(dǎo)表位修復(fù)(HIER)技術(shù)。HIER可使用微波爐、高壓鍋、蔬菜蒸鍋、高壓滅菌器或水浴來(lái)進(jìn)行。組織固定后，將它們用石蠟包埋或用OCT化合物覆蓋，并冷凍用于進(jìn)一步切片。石蠟包埋的組織可于室溫使用切片機(jī)切片，而冷凍的組織可于低于0℃的溫度使用恒冷切片機(jī)切片。發(fā)現(xiàn)冷凍的比石蠟包埋的組織對(duì)抗原免疫活性的保存更好(Larsson，L.，《Immunocytochemistry.Theory and Practice》，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1988；和Frost，A.等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.，8236，2000)。
如果檢測(cè)測(cè)定法是免疫組織化學(xué)法，則可依照制造商的說(shuō)明書將樣品暴露于結(jié)合CD20的一抗。洗滌后，將樣品暴露于二抗，它通常與可檢測(cè)標(biāo)記物諸如生物素等偶聯(lián)。再次洗滌后，可依照眾所周知的方法檢測(cè)標(biāo)記物。
如果發(fā)現(xiàn)樣品中存在CD20，則確定從其獲取樣品的患者作為用本文公開的CD20拮抗劑進(jìn)行治療的候選者。用于生成CD20拮抗劑的方法描述如下。
III.拮抗劑的生產(chǎn)本發(fā)明的方法和產(chǎn)品使用或摻入與CD20結(jié)合的拮抗劑。因此，本文將描述用于生成這些拮抗劑的方法。
用于生成或篩選拮抗劑的CD20抗原可以是例如包含所需表位的CD20或其部分的可溶形式。或者/另外，在其表面表達(dá)CD20的細(xì)胞也可用于生成或篩選拮抗劑?？捎糜谏赊卓箘┑钠渌问降腃D20對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
雖然優(yōu)選的拮抗劑是抗體，本文還考慮了除抗體外的拮抗劑。例如拮抗劑可包括任選融合或偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑(諸如本文描述的那些)的小分子拮抗劑?？舍槍?duì)本文感興趣的CD20抗原篩選小分子文庫(kù)，以鑒定與該抗原結(jié)合的小分子。還可對(duì)小分子篩選其拮抗特性和/或與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)。
拮抗劑還可以是通過(guò)理性設(shè)計(jì)或通過(guò)噬菌體展示產(chǎn)生的肽(見(jiàn)例如1998年8月13日出版的WO 98/35036)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的分子可以是根據(jù)抗體的CDR設(shè)計(jì)的“CDR模擬物”或抗體類似物。雖然這些肽自身可具有拮抗性，但任選可將該肽與細(xì)胞毒性劑融合，以增加或增強(qiáng)肽的拮抗特性。
下面的描述例示了用于生產(chǎn)依照本發(fā)明使用的抗體拮抗劑的方法。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來(lái)生成。使用雙功能或衍生劑，例如馬來(lái)酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關(guān)抗原與在免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過(guò)將例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，并將溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，由此將動(dòng)物針對(duì)抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，通過(guò)多個(gè)部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或偶聯(lián)物初始量的l/5-l/10對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗體效價(jià)。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化直到效價(jià)達(dá)到穩(wěn)定。優(yōu)選的是，將動(dòng)物用相同抗原的但與不同蛋白質(zhì)和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行強(qiáng)化。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來(lái)制備。此外，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來(lái)增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了在生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的變體外，這種變體通常以很少量存在。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體的特征即不是分立的或多克隆的抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可通過(guò)最初由Kohler等，Nature，256495，1975描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備(美國(guó)專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物，諸如倉(cāng)鼠，以激發(fā)生成或能夠生成與用于免疫的蛋白質(zhì)特異結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，《MonoclonalAntibodies.Principles and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。
將這樣制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤培養(yǎng)基通常將含有阻止缺乏HGPRT的細(xì)胞生長(zhǎng)的次黃嘌呤、氨基喋呤、和胸苷(HAT培養(yǎng)基)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持選擇的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定地高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如可從Salk Institute CellDistribution Center，San Diege，California USA購(gòu)得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生系，以及可從American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA購(gòu)得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.，1333001，1984；Brodeur等，《Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications》，5l-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可對(duì)雜交瘤細(xì)胞正在生長(zhǎng)的培養(yǎng)基測(cè)定針對(duì)抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射性免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)例如Munson等，Anal.Biochem.，107220，1980的Scatchard分析來(lái)測(cè)定。
在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。
可通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化法，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分離。
編碼單克隆抗體的DNA易于通過(guò)常規(guī)方法分離并測(cè)序(例如使用能夠特異結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細(xì)胞用作這種DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，諸如不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262，1993和Plückthun，Immunol.Revs.，130151-188，1992。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從使用McCafferty等，Nature，348552-554，1990中描述的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體文庫(kù)中分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628，1991和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597，1991分別描述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物描述了通過(guò)鏈改組(Marks等，Bio/Technology，10779-783，1992)，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266，1993)，生成高親和力(nM范圍)的人抗體。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的常規(guī)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來(lái)的可行替換方法。
還可以修飾DNA，例如通過(guò)替代即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源鼠序列(美國(guó)專利4,8l6,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，816851，1984)，或通過(guò)共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列。
通常，用這種非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區(qū)，或者用它們替代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，它包含對(duì)一種抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已經(jīng)描述了用于將非人抗體人源化的方法。優(yōu)選的是，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jones等，Nature，321522-525，1986；Riechmann等，Nature，332323-327，1988；Verhoeyen等，Science，2391534-1536，1988)，通過(guò)用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567)，其中本質(zhì)上少于整個(gè)人可變區(qū)用來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來(lái)自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基所替代。
用于制備人源化抗體的人可變區(qū)的選擇，包括輕鏈和重鏈，對(duì)于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區(qū)序列對(duì)已知的人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人構(gòu)架區(qū)(FR)(Sims等，J.Immunol.，1512296，1993；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901，1987)。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈可變區(qū)亞群的所有人抗體的共有序列衍生的特定構(gòu)架區(qū)。同一構(gòu)架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285，1992；Presta等，J.Immunol.，1512623，1993)。
更為重要的是，抗體在人源化后保持對(duì)抗原的高親和力以及其它有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過(guò)使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來(lái)制備人源化抗體。通?？色@得三維免疫球蛋白模型，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力提高。通常，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)地涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
(iv)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在這種種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見(jiàn)例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551，1993；Jakobovits等，Nature，362255-258，1993；Bruggermann等，Year in Immuno.，733，1993；和美國(guó)專利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature，348552-553，1990)可用于在體外從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因全集生成人抗體和抗體片段。根據(jù)這一技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因的讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼顯示那些特性的抗體基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行；有關(guān)綜述參見(jiàn)例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology，3564-571，1993。V基因區(qū)段的數(shù)種來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature，352624-628，1991從衍生自免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫(kù)分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體?？杀举|(zhì)上依照Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597，1991或Griffith等，EMBOJ.，12725-734，1993描述的技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集，并分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見(jiàn)美國(guó)專利5,565,332和5,573,905。
還可通過(guò)體外激活B細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)來(lái)生成人抗體。
(v)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)衍生這些片段(參見(jiàn)例如Morimoto等，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods，24107-117，1992和Brennan等，Science，22981，1985)。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可從上文討論的抗體噬菌體文庫(kù)分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab′-SH片段，并通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology，10163-167，1992)。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab′)2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)熟練技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見(jiàn)WO 93/16185；美國(guó)專利5,571,894和美國(guó)專利5,587,458。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如美國(guó)專利5,641,870中描述的抗體。這種線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合CD20抗原的兩種不同表位。其它這種抗體可結(jié)合CD20并進(jìn)一步結(jié)合第二種B細(xì)胞表面標(biāo)志物?；蛘撸笴D20結(jié)合臂可與結(jié)合白細(xì)胞上引發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcγR)，諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂組合，使得細(xì)胞防御機(jī)制集中于B細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒性劑定位于B細(xì)胞。這些抗體擁有CD20結(jié)合臂以及結(jié)合細(xì)胞毒性劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻毒素A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異性抗體)。
用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的常規(guī)生成是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature，305537-539，1983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些四源雜交瘤(quadromas)生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化非常麻煩，且產(chǎn)量低。WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659，1991中公開了類似的方法。
根據(jù)一種不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結(jié)合所必須的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比率沒(méi)有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個(gè)載體。
在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
還描述了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)出雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553，1992。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融合與兩種不同抗體的Fab′部分連接。抗體同型二聚體在鉸鏈區(qū)還原，形成單體，然后重新氧化，形成抗體異型二聚體。這種方法也可用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448，1993描述的“雙抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替換機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭相連的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，該接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的VH和VL區(qū)不得不與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH區(qū)配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(jiàn)Gruber等，J.Immunol.，1525368，1994。
希望得到具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.，14760，1991。
IV.拮抗劑的偶聯(lián)物和其它修飾任選將本發(fā)明的方法中所使用的或本發(fā)明的產(chǎn)品中所包含的拮抗劑與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成這種拮抗劑-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物的化療劑。
本發(fā)明還希望得到拮抗劑與一種或多種小分子毒素形成的偶聯(lián)物，諸如加利車霉素、美登素(美國(guó)專利5,208,020)、單端孢菌毒素和CC1065。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將拮抗劑與一個(gè)和多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(例如每個(gè)拮抗劑分子偶聯(lián)約1個(gè)至約10個(gè)美登素分子)。例如可將美登素轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，后者可還原為May-SH3并與經(jīng)修飾拮抗劑反應(yīng)(Chari等，Cancer Research，52127-131，1992)產(chǎn)生美登木素生物堿-拮抗劑偶聯(lián)物。
或者，將拮抗劑與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子偶聯(lián)。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等，Cancer Research，533336-3342，1993和Lode等，Cancer Research，5822925-2928，1998)。肽通過(guò)基因融合與兩種不同抗體的Fab′部分連接?？贵w同型二聚體在鉸鏈區(qū)還原，形成單體，然后重新氧化，形成抗體異型二聚體。這種方法也可用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448，1993描述的“二抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替換機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭相連的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，該接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的VH和VL區(qū)不得不與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH區(qū)配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(jiàn)Gruber等，J.Immunol.，1525368，1994。
希望得到具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.，14760，1991。
IV.拮抗劑的偶聯(lián)物和其它修飾任選將本發(fā)明的方法中所使用的或本發(fā)明的產(chǎn)品中所包含的拮抗劑與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成這種拮抗劑-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物的化療劑。
本發(fā)明還希望得到拮抗劑與一種或多種小分子毒素形成的偶聯(lián)物，諸如加利車霉素、美登素(美國(guó)專利5,208,020)、單端孢菌毒素和CC1065。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將拮抗劑與一個(gè)和多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(例如每個(gè)拮抗劑分子偶聯(lián)約1個(gè)至約10個(gè)美登素分子)。例如可將美登素轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，后者可還原為May-SH3并與經(jīng)修飾拮抗劑反應(yīng)(Chari等，Cancer Researeh，52127-131，1992)產(chǎn)生美登木素生物堿-拮抗劑偶聯(lián)物。
或者，將拮抗劑與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子偶聯(lián)。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θ11(Hinman等，Cancer Research，533336-3342，1993和Lode等，Cancer Research，582925-2928，1998)。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質(zhì)、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白質(zhì)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(neomycin)和單端孢菌毒素(tricothecenes)。還可參見(jiàn)例如1993年10月28日出版的WO 93/21232。
本發(fā)明還希望得到與具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶和DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)偶聯(lián)的拮抗劑。
有多種放射性同位素可用于生成放射性偶聯(lián)拮抗劑。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備拮抗劑和細(xì)胞毒性劑的偶聯(lián)物，諸如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己胺-1-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺酯、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯甲?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等，Science，2381098，1987中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與拮抗劑偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見(jiàn)WO 94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research，52127-131，1992)。
或者，可例如通過(guò)重組技術(shù)或肽合成法來(lái)制備包含拮抗劑和細(xì)胞毒性劑的融合蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將拮抗劑與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)，用于腫瘤的預(yù)定位，其中對(duì)患者施用拮抗劑-受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒性劑(例如放射性核苷)偶聯(lián)的“配體”(例如生物素)。
還可將本發(fā)明的拮抗劑與前體藥物活化酶偶聯(lián)，后者將前體藥物(例如肽基化療劑，參見(jiàn)WO 81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥。參見(jiàn)例如WO88/07378和美國(guó)專利4,975,278。
這種偶聯(lián)物的酶成分包括能夠以這樣一種方式作用于前體藥物從而將其轉(zhuǎn)化為更具有活性的細(xì)胞毒性形式的任何酶。
可用于本發(fā)明方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；將無(wú)毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和I)；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸替代的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物切割酶類諸如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；可將在氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D(zhuǎn)化成游離藥物的青霉素酰胺酶諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘撸墒褂镁哂忻富钚缘目贵w，本領(lǐng)域也稱作“抗體酶”，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(參見(jiàn)例如Massey，Nature，328457-458，1987)?？扇绫疚乃鲋苽滢卓箘?抗體酶偶聯(lián)物，用于將抗體酶投遞至腫瘤細(xì)胞群。
可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將本發(fā)明的酶與拮抗劑共價(jià)結(jié)合，諸如使用上文討論的異雙功能交聯(lián)劑?；蛘?，可使用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建包含與本發(fā)明酶的至少功能活性部分連接的本發(fā)明拮抗劑的至少抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見(jiàn)例如Neuberger等，Nature，312604-608，1984)。
本文還設(shè)想了拮抗劑的其它修飾。例如，可將拮抗劑與多種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種連接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物?？贵w片段，諸如與一個(gè)和多個(gè)PEG分子連接的Fab’是本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方案。
本發(fā)明公開的拮抗劑還可配制成脂質(zhì)體?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備包含拮抗劑的脂質(zhì)體，諸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688，1985；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030，1980；美國(guó)專利4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日出版的WO 97/38731中所述。美國(guó)專利5,013,556中公開了具有延長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體。
可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物通過(guò)反相蒸發(fā)法生成特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠過(guò)具有設(shè)定孔徑的濾器，產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。可如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288，1982中所述，將本發(fā)明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見(jiàn)Gabizon等，J.National Cancer Inst.，81(19)1484，1989。
設(shè)想了本文描述的蛋白質(zhì)或肽拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可能需要改進(jìn)拮抗劑的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過(guò)將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円朕卓箘┖怂峄蛲ㄟ^(guò)肽合成法來(lái)制備拮抗劑的氨基酸序列變體。這些修飾包括例如拮抗劑氨基酸序列中的殘基刪除、和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有所需特性，可進(jìn)行刪除、插入和替代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可能改變拮抗劑的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
可用于鑒定拮抗劑中作為優(yōu)選突變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱作“丙氨酸掃描突變”，由Cunningham和Wells，Science，2441081-1085，1989描述。這里鑒定了一個(gè)或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選的是丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過(guò)在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲對(duì)替代顯示功能敏感性的氨基酸位置。這樣，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點(diǎn)處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)突變，并對(duì)表達(dá)的拮抗劑變體篩選所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基到包含上百或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或與細(xì)胞毒性多肽融合的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變體包括在拮抗劑N-或C-末端融合酶或提高拮抗劑的血清半衰期的多肽。
另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在拮抗劑分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用不同殘基替代。最感興趣在抗體拮抗劑中進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也考慮了FR改變。保守替代在表1中顯示為“優(yōu)選替代”。如果這些替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，那么可以引入表1中稱為“例示取代”的更實(shí)質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。
表1
對(duì)拮抗劑生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾可通過(guò)選擇在保持(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積這幾方面的效果上顯著不同的替代來(lái)完成。根據(jù)共有的側(cè)鏈特性，將天然存在的殘基分為以下各組(1)疏水性的正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；(2)中性親水性的半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；(3)酸性的天冬氨酸、谷氨酸；(4)堿性的天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；(5)影響鏈取向的殘基甘氨酸、脯氨酸；和
(6)芳香族的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守替代需要用這些類別之一中的一個(gè)成員交換另一個(gè)類別的。
任何不涉及保持拮抗劑正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨酸，以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性和預(yù)防異常交聯(lián)。相反地，可向拮抗劑中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)拮抗劑是抗體片段諸如Fv片段時(shí))。
特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改進(jìn)的生物學(xué)特性。產(chǎn)生這些替代變體的一種便利方法是使用噬菌體展示進(jìn)行的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III的產(chǎn)物的融合體。然后如本文所公開的對(duì)噬菌體展示的變體篩選它們的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變來(lái)鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。這些接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這種變體，如本文所述篩選該組變體，可選擇在一種或多種相關(guān)試驗(yàn)中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)。
拮抗劑的另一類氨基酸變體改變了拮抗劑的原始糖基化樣式。這種改變包括刪除在拮抗劑中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)糖類模塊，和/或添加拮抗劑中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
多肽的糖基化典型的是N-連接的或O-連接的。N-連接是指糖類模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將糖類模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。這樣，多肽中這兩種三肽序列其中任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見(jiàn)的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
向拮抗劑中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上文描述的三肽序列便利地完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。這種改變還可通過(guò)向原始拮抗劑序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。
在抗體包含F(xiàn)c區(qū)時(shí)，可改變附著其上的糖類。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)US2003/0157108 A1，Presta，L中描述了具有成熟糖類結(jié)構(gòu)的抗體，該結(jié)構(gòu)缺乏附著于抗體Fc區(qū)的巖藻糖。WO 03/011878，Jean-Mairet和美國(guó)專利6,602,684，Umana等中提到了在附著于抗體Fc區(qū)的糖類中具有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO 97/30087，Patel等中報(bào)告了在附著于抗體Fc區(qū)的低聚糖中具有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于具有附著于其Fc區(qū)的更改糖類的抗體參見(jiàn)WO 98/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。
編碼拮抗劑氨基酸序列變體的核酸分子可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過(guò)對(duì)早期制備的變體或非變體形式拮抗劑進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。
可能需要在效應(yīng)子功能方面修飾本發(fā)明拮抗劑，例如增強(qiáng)拮抗劑的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過(guò)在抗體拮抗劑的Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。這樣產(chǎn)生的同型二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron等，J.Exp.Med.，1761191-1195，1992和Shopes，B.，J.Immunol.，1482918-2922，1992。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體還可使用如Wolff等，Cancer Research，532560-2565，1993中描述的異雙功能交聯(lián)劑制備?；蛘?，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，并因此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見(jiàn)Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design，3219-230，1989。WO 00/42072(Presta，L.)描述了在存在人效應(yīng)細(xì)胞的條件下具有改善的ADCC功能的抗體，其中抗體在其Fc區(qū)中具有氨基酸替代。
WO 99/51642、美國(guó)專利6,194,551 B1、美國(guó)專利6,242,195 B1、美國(guó)專利6,528,624 B1和美國(guó)專利6,538,124(Idusogie等)中描述了具有改變的Clq結(jié)合和/和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的抗體。這些抗體在其Fc區(qū)的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334其中一個(gè)和多個(gè)具有氨基酸替代。
為了提高拮抗劑的血清半衰期，可如美國(guó)專利5,739,277中所述將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入拮抗劑(尤其是抗體片段)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。WO 00/42072(Presta，L.)中也描述了在其Fc區(qū)中具有氨基酸替代且具有提高的血清半衰期的抗體。
還設(shè)想了具有三個(gè)或更多(優(yōu)選四個(gè))功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的改造抗體(美國(guó)專利申請(qǐng)US2002/0004587 A1，Miller等)。
V.藥物制劑制備依照本發(fā)明使用的拮抗劑的治療用制劑，即將具有所需純化程度的拮抗劑與任選的制藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980)，以凍干制劑或水溶液的形式貯存?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，還包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化乙烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如FWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例示性抗CD20抗體制劑描述于WO 98/56418，明確引入本文作為參考。該出版物描述了一種液體多劑量制劑，該制劑包含40mg/mL rituximab、25mM醋酸鹽、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇、0.02％聚山梨醇酯20，pH 5.0，它在2-8℃具有最少2年的儲(chǔ)存保存期。另一種感興趣的抗CD20制劑在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL二水合檸檬酸鈉、0.7mg/mL聚山梨醇酯80、和注射用無(wú)菌水、pH 6.5中包含10mg/mL rituximab。
適于皮下施用的凍干制劑描述于美國(guó)專利6,267,958(Andya等)。這種凍干制劑可用合適的稀釋液復(fù)水成為高蛋白濃度，且復(fù)水后的制劑可皮下將以與優(yōu)良醫(yī)學(xué)實(shí)踐相一致的形式進(jìn)行配制、服用和施用。在此內(nèi)容中考慮的因素包括治療的具體疾病或紊亂、治療的具體哺乳動(dòng)物、患者個(gè)體的臨床狀況、疾病或紊亂的起因、藥劑的投遞部位、施藥方法、施藥方案以及醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。施用拮抗劑的治療有效量將由這些考慮事項(xiàng)決定。
作為一般性建議，腸胃外施用拮抗劑的每劑有效量范圍為約20mg/m2至10,000mg/m2患者身體，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)劑量。完整抗體的例示性靜脈內(nèi)劑量方案包括375mg/m2每周×4、1000mg×2(例如在第1天和第15天)、或1g×3。
如上所述，然而，拮抗劑的這些建議量受到大量治療學(xué)判斷的支配。在選擇適當(dāng)劑量和方案中的關(guān)鍵因素是如上所示獲得的結(jié)果。例如，對(duì)于治療發(fā)展中的和急性的疾病最初可能需要相對(duì)較高的劑量。為了獲得最有效的結(jié)果，根據(jù)疾病或紊亂，應(yīng)盡可能地在接近疾病或紊亂的最初征兆、診斷、表現(xiàn)、或發(fā)生時(shí)，或者在疾病或紊亂的消除過(guò)程中施用拮抗劑。
可通過(guò)任何合適的手段施用拮抗劑，包括腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、和鼻內(nèi)，如果需要局部免疫抑制處理，則還有傷口內(nèi)施藥。腸胃外輸液包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施藥。另外，拮抗劑可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)脈動(dòng)輸液施用，例如用下降劑量的拮抗劑。優(yōu)選通過(guò)注射給藥，最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于施藥是短時(shí)間的還是長(zhǎng)時(shí)間的。
可與本發(fā)明的拮抗劑一起施用其它化合物，諸如細(xì)胞毒性劑、化療劑、免疫抑制劑和/或細(xì)胞因子。聯(lián)合施用包括使用分開的制劑或單一的藥物制劑的共施用，以及以任一次序依序施用，其中優(yōu)選地是有一段時(shí)間兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。
除對(duì)患者施用蛋白質(zhì)拮抗劑外，本申請(qǐng)?jiān)O(shè)想通過(guò)基因療法來(lái)施用拮抗劑。這種編碼拮抗劑的核酸的施用涵蓋在表述“施用有效量的拮抗劑”中。關(guān)于使用基因療法產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體參見(jiàn)例如1996年3月14日出版的WO96/07321。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者細(xì)胞，即體內(nèi)和離體。對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要拮抗劑的部位將核酸直接注射到患者體內(nèi)。對(duì)于離體治療，采集患者細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞或者直接施用于患者，或者例如裝入多孔膜內(nèi)并植入患者體內(nèi)(參見(jiàn)施用拮抗劑的有效量將由這些考慮事項(xiàng)決定。
作為一般性建議，腸胃外施用拮抗劑的每劑有效量范圍為約20mg/m2至10,000mg/m2患者身體，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)劑量。完整抗體的例示性靜脈內(nèi)劑量方案包括375mg/m2每周×4、1000mg×2(例如在第1天和第15天)、或1g×3。
如上所述，然而，拮抗劑的這些建議量受到大量治療學(xué)判斷的支配。在選擇適當(dāng)劑量和方案中的關(guān)鍵因素是如上所示獲得的結(jié)果。例如，對(duì)于治療發(fā)展中的和急性的疾病最初可能需要相對(duì)較高的劑量。為了獲得最有效的結(jié)果，根據(jù)疾病或紊亂，拮抗劑的施用應(yīng)盡可能地接近疾病或紊亂的最初征兆、診斷、表現(xiàn)、或發(fā)生，或者在疾病或紊亂的消除過(guò)程中。
可通過(guò)任何合適的手段施用拮抗劑，包括腸胃外、局部、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)和/或傷口內(nèi)施藥。腸胃外輸液包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施藥。還研究了鞘內(nèi)施藥。另外，拮抗劑可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)脈動(dòng)輸液施用，例如用下降劑量的拮抗劑。優(yōu)選地通過(guò)靜脈內(nèi)輸液給藥。
可與本發(fā)明的拮抗劑一起施用其它化合物，諸如細(xì)胞毒性劑、化療劑、免疫抑制劑和/或細(xì)胞因子。例如，CD20拮抗劑可與下列各項(xiàng)聯(lián)合，即糖皮質(zhì)激素類/強(qiáng)的松/甲基強(qiáng)的松(糖皮質(zhì)激素類)、靜脈內(nèi)免疫球蛋白(γ球蛋白)、遠(yuǎn)距離鈷治療法、血漿置換、左旋甲狀腺素、環(huán)孢菌素A、促生長(zhǎng)素抑制素類似物、細(xì)胞因子拮抗劑、抗代謝物、免疫抑制劑、細(xì)胞毒性劑(如苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、咪唑硫嘌呤)、眼眶放射療法、眼眶減壓、復(fù)原性手術(shù)、放射碘、甲狀腺切除術(shù)等。聯(lián)合施用包括使用分開的制劑或單一的藥物制劑的共施用，以及以任一次序依序施用，其中優(yōu)選地是有一段時(shí)間兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。
除對(duì)患者施用蛋白質(zhì)拮抗劑外，本申請(qǐng)?jiān)O(shè)想通過(guò)基因療法來(lái)施用拮抗劑。這種編碼拮抗劑的核酸的施用涵蓋在表述“施用有效量的拮抗劑”中。關(guān)于使用基因療法產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體參見(jiàn)例如1996年3月14日出版的WO96/07321。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者細(xì)胞，即體內(nèi)和離體。對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要拮抗劑的部位將核酸直接注射到患者體內(nèi)。對(duì)于離體治療，采集患者細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞或者直接施用于患者，或者例如裝入多孔膜內(nèi)并植入患者體內(nèi)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,892,538和5,283,187)。有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至目的宿主的體外培養(yǎng)細(xì)胞還是體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。常用于離體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒或腺伴隨病毒)和基于脂類的系統(tǒng)(可用于脂類介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂類有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在有些情況中，需要提供具有靶向靶細(xì)胞的試劑的核酸源，諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時(shí)，與胞吞作用相關(guān)細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝入，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、和靶向細(xì)胞內(nèi)定位和增加細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。例如Wu等，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414，1990中描述了受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述參見(jiàn)Anderson等，Science，256808-813，1992。還可參見(jiàn)WO 93/25673及其引用的參考文獻(xiàn)。
VII.產(chǎn)品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了裝有可用于治療上文所述疾病或狀況的物質(zhì)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包括一種容器以及該容器上或與該容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。該容器可以用各種材料諸如玻璃或塑料制成。該容器裝有有效治療選定疾病或狀況的組合物，并可具有無(wú)菌存取口(例如該容器可以是具有皮下注射器針頭可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液包或小管)。該組合物中的至少一種活性劑是結(jié)合CD20的拮抗劑。標(biāo)簽或包裝插頁(yè)表明該組合物用于治療在取自患病患者的樣品中檢測(cè)出CD20的自身免疫病。該產(chǎn)品還可包括第二容器，該容器裝有制藥學(xué)可接受的稀釋緩沖液，諸如注射用制菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。該產(chǎn)品還可包括商業(yè)和使用者立場(chǎng)上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
下面的非限制生實(shí)施例闡明了本發(fā)明的更多細(xì)節(jié)。將說(shuō)明書中所有引用的公開內(nèi)容明確引入本文作為參考。
實(shí)施例1類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在患者允許的情況下，從患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者獲得滑膜活組織檢查和/或滑液樣品。依照熟知的方法，可將細(xì)胞冷凍或固定，且可將液體離心。依照制造商的說(shuō)明書，使用CD20抗體，諸如結(jié)合CD20的L26(Abcam Ltd)，通過(guò)免疫組織化學(xué)法(IHC)評(píng)估樣品中致病性CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的存在。如果檢測(cè)到CD20陽(yáng)性B細(xì)胞，則用Rituximab(從Genentech購(gòu)得)或人源化的2H7(見(jiàn)上文)以選自375mg/m2每周×4、1000mg×2(在第1天和第15天)、或1g×3的服藥方案對(duì)患者進(jìn)行治療。
患者還可接受伴隨的MTX(10-25mg/周，經(jīng)口或腸胃外)，以及皮質(zhì)類固醇方案，后者由注入CD20抗體前30分鐘靜脈內(nèi)施用甲基強(qiáng)的松100mg、在第2-7天經(jīng)口施用強(qiáng)的松60mg、在第8-14天經(jīng)口施用30mg、至第16天回到基線劑量組成?；颊哌€可接受作為單一劑量或者作為分開的日常劑量給予的葉酸(5mg/周)。在整個(gè)治療期間，患者任選地繼續(xù)接受任何背景皮質(zhì)類固醇(10mg/天強(qiáng)的松或等價(jià)物)。
第一個(gè)終點(diǎn)可以是在第24周具有ACR20反應(yīng)的患者比例，使用用于比較組間差異并針對(duì)類風(fēng)濕因子和部位進(jìn)行了調(diào)整的Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)檢驗(yàn)法。
潛在的第二個(gè)終點(diǎn)包括1.在第24周具有ACR50和70反應(yīng)的患者比例。這可如關(guān)于第一個(gè)終點(diǎn)所述進(jìn)行分析。
2.篩選到第24周的疾病活動(dòng)得分(Disease Activity Score)(DAS)的變化。這可使用ANOVA模型進(jìn)行評(píng)估，以基線DAS、類風(fēng)濕因子、和處理作為模型中的項(xiàng)目。
3.第24周的分類DAS效應(yīng)器(EULAR反應(yīng))。這可使用針對(duì)類風(fēng)濕因子進(jìn)行了調(diào)整的CMH檢驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)估。
4.在ACR核心組(SJC、TJC、患者和醫(yī)生的總體評(píng)估、HAQ、疼痛、CRP和ESR)中篩選的變化。可報(bào)告這些參數(shù)的描述性統(tǒng)計(jì)。
5.在SF-36中篩選的變化?？蓤?bào)告8個(gè)領(lǐng)域的得分以及心理和身體要素得分的描述性統(tǒng)計(jì)。另外，心理和身體要素得分可進(jìn)一步加以分類和分析。
6.改良的Sharp放射顯影總分(modified Sharp radiographic total score)、糜爛得分(erosin score)和連接間隙縮小得分(joint space narrowing score)的變化。這可適當(dāng)?shù)厥褂眠B續(xù)的或分類的方法學(xué)進(jìn)行分析。
探索性終點(diǎn)和分析可包括適當(dāng)?shù)厥褂枚蜻B續(xù)重復(fù)測(cè)定模型對(duì)達(dá)到第8、12、16、20、24周及再以后的ACR(20/50/70和ACR n)和DNS反應(yīng)變化進(jìn)行評(píng)估?？稍诘?4周和再以后對(duì)包括不具有糜爛發(fā)展的患者比例在內(nèi)的探索性放射顯影分析進(jìn)行評(píng)估。
更進(jìn)一步的探索性終點(diǎn)(例如全部臨床反應(yīng)、無(wú)病時(shí)期)將作為延長(zhǎng)觀察期的部分進(jìn)行描述性分析。
在FACIT-F疲勞中篩選(Screen in FACIT-F fatigue)的變化將以描述性統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析。
依據(jù)上述任何一個(gè)或多個(gè)終點(diǎn)，如上文所述，在具有CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的患者中使用CD20抗體治療RA將獲得有益的臨床反應(yīng)。
實(shí)施例2狼瘡狼瘡是具有多種不同器官特異表現(xiàn)的一種常見(jiàn)、慢性、復(fù)發(fā)性異源疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的特征為自身免疫性和產(chǎn)生自身抗體。當(dāng)前的療法(強(qiáng)的松，霉酚酸酯、CNI、cytoxan)常常是有效的，但可引起大量發(fā)病并且是非特異性的。
在得到患者允許的情況下，從狼瘡患者體內(nèi)獲得淋巴結(jié)(如扁桃腺的)或骨髓活組織檢查或外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。依照熟練病理學(xué)家熟知的技術(shù)，可將細(xì)胞冷凍或固定。例如如實(shí)施例1所述，使用IHC分析法檢測(cè)在活組織檢查樣品或PBMC中的致病性CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的存在。如果檢測(cè)到CD20陽(yáng)性B細(xì)胞，則使用Rituximab或人源化2H7以選自375mg/m2每周×4、1000mg×2(在第1和第15天)、或1g×3的服藥方案對(duì)患者進(jìn)行治療?？贵w任選地與其它藥物聯(lián)合，諸如一種或多種免疫抑制劑、甲氨蝶呤、強(qiáng)的松、Cytoxan、霉酚酸酯(CellCept)、環(huán)磷酰胺、咪唑硫嘌呤、hydroxyclorocuine、CNI、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD40L抗體、人重組DNA酶、TNF抑制劑(Infliximab，Etanercept)、LJP-394、抗C5a抗體、抗IL-10抗體、BlyS抑制劑、CTLA-4Ig、LL2IgG、Lymphostat-B、氯喹(Plaquenil)等。治療具有CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的狼瘡患者將在任何一個(gè)或多個(gè)疾病活性指數(shù)中獲得改善，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指數(shù)(SystemicLupus Erythematosus Disease Activity Index)(SLDAI)、不列顛群島狼瘡評(píng)估組(British Isles Lupus Assessment Group，BILAG)總體得分、系統(tǒng)性狼瘡活性測(cè)量(Systemic Lupus Activity Measure)(SLAM)等(Strand等，J.Rheumatol.，26490-497，1999)。
實(shí)施例3潰瘍性結(jié)腸炎或炎性腸道疾病在美國(guó)估計(jì)有500,000潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者，他們?cè)馐苤粩鄰?fù)發(fā)的結(jié)腸粘膜炎癥。臨床癥狀包括直腸出血、頻繁的腸活動(dòng)和全身癥狀，例如發(fā)燒、體重減輕和貧血(Podolsky，D.，NEJM，347417-429，2002)。具有輕微UC的患者的癥狀包括直腸炎、直腸乙狀結(jié)腸炎、遠(yuǎn)端結(jié)腸炎、間歇性直腸出血、粘膜脫落(mucus passage)、輕微腹瀉、腹痛。具有中等嚴(yán)重程度疾病的患者可能經(jīng)歷的癥狀包括左側(cè)結(jié)腸炎、頻繁的血性軟便(10次/天)、霉菌性貧血(mold anemia)、低燒和伴隨營(yíng)養(yǎng)維持的腹痛(abdominal painwith nutrition maintained)。在遭受嚴(yán)重疾病的UC患者中觀察到的癥狀包括泛結(jié)腸炎、超過(guò)10次大便/天、嚴(yán)重痙攣、高燒、需要輸血的出血、體重減輕、毒性巨結(jié)腸和穿孔(伴隨50％的死亡率)。
大多數(shù)醫(yī)生在UC處理中采用漸進(jìn)式治療方案。一線治療通常包括口服和/或局部5-ASA。二線治療包括口服和/或局部類固醇，但是50％首次使用類固醇的患者形成依賴性或在1年中復(fù)發(fā)。三線治療通過(guò)施用免疫抑制劑來(lái)進(jìn)行(如咪唑硫嘌呤、6-巰基嘌呤、環(huán)孢菌素)。最后，四線治療是進(jìn)行手術(shù)(完全結(jié)腸切除術(shù))。
在活性UC的組織學(xué)切片中觀察到淋巴集合體中存在B細(xì)胞(Onuma等，Clin.Exp.Immunol.，121466-471，2000)。在UC患者中還觀察到IgG、IgM和IgA增加以及血漿細(xì)胞增加(MacDermott等，Gastroenterology，81844，1981)。
通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查法(例如結(jié)腸鏡檢查、乙狀結(jié)腸鏡檢查等)由中度到嚴(yán)重潰瘍性結(jié)腸炎或炎性腸道疾病(IBD)患者獲得樣品。使用實(shí)施例1中的分析法檢測(cè)樣品中的致病性CD20陽(yáng)性B細(xì)胞。如果檢測(cè)到CD20陽(yáng)性B細(xì)胞，則使用Rituximab或人源化2H7以選自375mg/m2每周×4、1000mg×2(在第1和第15天)或1g×3的服藥方案對(duì)患者進(jìn)行治療。除CD20抗體外，患者還可以口服和/或局部5-ASA、口服和/或局部類固醇、一種或多種免疫抑制劑(例如咪唑硫嘌呤、6-巰基嘌呤、環(huán)孢菌素)、MLN-02、抗生素、美沙拉秦(mesalamine)、強(qiáng)的松、TNF抑制劑(如Remicade、Infliximab)、可的松軟膏、氫化可的松灌腸劑、磺胺水楊嗪(sulfasalazine)、alsalazine、巴柳氮(balsalazide)、甲強(qiáng)龍(methylprednisolone)、氫化可的松、ACTH、靜脈內(nèi)皮質(zhì)類固醇、GelTex、Visilizumab、OPC-6535、CBP 1011、沙利度胺(thalidomide)、ISIS 2302、BXT-51072、Repifermin(KGF-2)、RPD-58、安特甘(Antegren)、FK-506、Rebif、Natalizumab等進(jìn)行治療。
根據(jù)對(duì)受檢者的功能評(píng)價(jià)、大便頻率、直腸出血、和/或醫(yī)生的總體評(píng)價(jià)，如上所述治療具有CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的患者，使得中度或嚴(yán)重UC患者與對(duì)照相比潰瘍性結(jié)腸炎或IBD的癥狀改善，以及優(yōu)選地癥狀消退。
實(shí)施例4皮膚病或自身免疫病的皮膚病學(xué)表現(xiàn)從患有皮膚疾病(諸如牛皮癬或天皰瘡)的患者和/或顯示自身免疫病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡或脈管炎)的皮膚病學(xué)表現(xiàn)的患者，獲得穿刺活組織檢查樣品、PBMC或淋巴結(jié)樣品。使用實(shí)施例1的IHC分析法檢測(cè)樣品中的CD20陽(yáng)性B細(xì)胞。如果檢測(cè)到CD20陽(yáng)性B細(xì)胞，則使用Rituximab或人源化2H7以選自375mg/m2每周×4、1000mg×2(在第1和第15天)或1g×3的服藥方案對(duì)患者進(jìn)行治療。CD20抗體療法可任選地與用于治療所討論疾病的一種或多種其它藥物聯(lián)合，諸如CD11a抗體(RaptivaTM)、免疫抑制劑等。通過(guò)治療具有CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的患者改善所治療疾病的癥狀。
權(quán)利要求
1.治療患者自身免疫病的方法，該方法包括(a)對(duì)取自患者的樣品檢測(cè)CD20；和(b)如果在樣品中檢測(cè)到CD20，則對(duì)患者施用治療自身免疫病有效量的CD20拮抗劑。
2.權(quán)利要求1所述的方法，所述拮抗劑包括抗體。
3.權(quán)利要求2所述的方法，所述抗體未與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)。
4.權(quán)利要求2所述的方法，所述抗體包括rituximab。
5.權(quán)利要求2所述的方法，所述抗體包括人源化的2H7。
6.權(quán)利要求2所述的方法，所述抗體已與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)。
7.權(quán)利要求1所述的方法，所述患者患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
8.權(quán)利要求7所述的方法，所述樣品取自滑膜活組織檢查或滑液。
9.權(quán)利要求1所述的方法，所述患者患有狼瘡。
10.權(quán)利要求9所述的方法，所述樣品取自淋巴結(jié)活組織檢查、骨髓活組織檢查或外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。
11.權(quán)利要求1所述的方法，所述患者患有潰瘍性結(jié)腸炎或炎性腸道疾病(IBD)。
12.權(quán)利要求11所述的方法，所述樣品是內(nèi)窺鏡檢查樣品。
13.權(quán)利要求1所述的方法，所述患者具有皮膚病或自身免疫病的皮膚病學(xué)表現(xiàn)。
14.權(quán)利要求13所述的方法，所述疾病選自牛皮癬、天皰瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡和脈管炎。
15.權(quán)利要求13所述的方法，所述樣品是穿刺活組織檢查樣品、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)或淋巴結(jié)樣品。
16.權(quán)利要求1所述的方法，所述方法基本上由對(duì)哺乳動(dòng)物施用拮抗劑組成。
17.權(quán)利要求1所述的方法，在步驟(a)中檢測(cè)CD20蛋白。
18.權(quán)利要求1所述的方法，在步驟(a)中檢測(cè)CD20核酸。
19.治療患者自身免疫病的方法，該方法包括(a)對(duì)取自患者的樣品檢測(cè)CD20陽(yáng)性B細(xì)胞，和(b)如果在樣品中檢測(cè)到CD20陽(yáng)性B細(xì)胞，則對(duì)患者施用治療自身免疫病有效量的CD20抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及在取自患者的樣品中檢測(cè)到CD20的自身免疫病的治療。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1917901SQ200480041917
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者保羅·G·布魯尼塔 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司