專利名稱：靶定的免疫原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于改進(jìn)免疫方案的試劑和方法。例如，將免疫原性氨基酸序列導(dǎo)向MHC呈遞途徑的氨基酸序列。
背景技術(shù)：
盡管基于肽的疫苗有許多優(yōu)點(diǎn)(安全、易于生產(chǎn))，但是它們顯示出有限的免疫原性。這部分是由于外源肽不能有效進(jìn)入I類MHC呈遞途徑。從而，可以增強(qiáng)肽向MHC遞送的策略具有增加基于肽的疫苗的功效的潛力。一種策略是將免疫原性序列連接到“蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”(PTD)，已經(jīng)表明所述結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)和肽越過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。示例性PTD包括HIT-Tat、細(xì)胞穿透肽(CPP)、Trojan載體、觸角足同源域和人period-1蛋白。
在一種方法中，抗原性肽附著到來(lái)自HIV-1 tat的短陽(yáng)離子肽(即，殘基49-57)以形成融合綴合物。已經(jīng)表明抗原呈遞細(xì)胞(“APC”)，如樹突細(xì)胞的暴露可加工ova-tat綴合物，從而導(dǎo)致抗原特異的CD8+T細(xì)胞的刺激(Kim，等人J Immunol 1997 Aug 15；159(4)1666-8；Shibagaki，等人J Immunol 2002 Mar 1；168(5)2393-401)。這也已經(jīng)對(duì)人黑素瘤抗原TRP2得到了證明(Wang，等人J Clin Invest 2002 Jun；109(11)1463-70)。將tat肽綴合到全長(zhǎng)蛋白質(zhì)后證明了相反的證據(jù)(Leifert，等人Gene Ther2002 Nov；9(21)1422-8)。
在另一方法中，將觸角足同源域(AntpHD)與CTL表位融合并且表明其增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞反應(yīng)性(Chikh，等人J Immunol 2001Dec 1；167(11)6462-70；Pietersz，等人Vaccine 2001 Jan 8；19(11-12)1397-405；Schutze-Redelmeier，等人J Immunol 1996 Jul15；157(2)650-5)。已經(jīng)表明可以使用具有最多達(dá)50個(gè)氨基酸的抗原性序列的AntpHD。
在其他研究中，已經(jīng)表明來(lái)自人period-1蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)序列(hPER1，序列SRRHHCRSKAKRSRHH)有效越過(guò)細(xì)胞膜。因此，它是吸引人的抗原遞送載體候選物。如下面詳細(xì)描述的，hPER1實(shí)際上增強(qiáng)抗原呈遞和T細(xì)胞反應(yīng)性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.通過(guò)hPER1綴合物體外敏化靶細(xì)胞進(jìn)行肽特異裂解。
圖2.用hPER1綴合物肽體外誘導(dǎo)人T細(xì)胞應(yīng)答。
圖3.用hPER1綴合物肽不用佐劑體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。
圖4.靜脈內(nèi)(i.v.)注射肽脈沖的DC后C57BL/6小鼠中的CTL應(yīng)答。用經(jīng)所指示的肽脈沖的5×105個(gè)骨髓來(lái)源的DC靜脈內(nèi)免疫小鼠。免疫后一周從接種的動(dòng)物收獲脾細(xì)胞，用SIINFEKL肽再刺激5天，并在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定中用SIINFEKL肽脈沖的靶細(xì)胞測(cè)試CTL活性。
圖5.皮下(s.c.)注射肽后HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠中的CTL應(yīng)答。將小鼠用50μg所指示的肽皮下免疫并在第一次注射后第21和42天加強(qiáng)免疫。在免疫后63天收獲來(lái)自免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，用天然gp100-154肽再刺激5天，并在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定中用gp100-154肽脈沖的靶細(xì)胞測(cè)試CTL活性。
圖6.轉(zhuǎn)基因A2/Kb小鼠中hPER1-FVYVW-154介導(dǎo)CTL應(yīng)答可以通過(guò)不同的免疫途徑產(chǎn)生。所示結(jié)果代表每組的四只個(gè)別小鼠的平均值。
圖7.用綴合SIINFEKL表位的hPER1或者Tat肽體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。用通過(guò)DEVWEL接頭序列結(jié)合于Tat或者h(yuǎn)PER1的SIINFEKL肽皮下免疫小鼠。該圖中所示結(jié)果代表每組的四只個(gè)別小鼠的平均值。與IFA中的陽(yáng)性對(duì)照SIINFEKL相比，hPER1-DEVWEL-SIINFEKL得到最佳的CTL應(yīng)答。
圖8.輔助CD4乙型肝炎肽的存在對(duì)于產(chǎn)生針對(duì)CD8肽的CTL應(yīng)答是必需的。用從50納摩爾到1納摩爾的不同劑量的hPER1-FVYVW-154肽用或者不用輔助肽鼻內(nèi)接種A2/Kb小鼠。不存在輔助肽時(shí)，10納摩爾hPER1-FVYVW-154不誘導(dǎo)顯著細(xì)胞毒性。
圖9.不存在輔助肽時(shí)，用較高的肽劑量免疫可以在小鼠中誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。用不同劑量的hPER1-SGQL-SIINFEKL用或者不用輔助肽皮內(nèi)免疫C57BL/6小鼠。
圖10.在不同接頭序列存在下，用結(jié)合SIINFEKL的hPER1進(jìn)行無(wú)佐劑的肽免疫后體內(nèi)誘導(dǎo)免疫性。結(jié)果顯示了每組的4只個(gè)別小鼠的平均值。FVYVW接頭已經(jīng)產(chǎn)生了最顯著的CTL殺傷，其與存在不完全弗氏佐劑(IFA)時(shí)的SIINFEKL免疫相當(dāng)。
圖11.OVA(SIINFEKL)肽呈遞的體外分析。將來(lái)自C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞用10μg/ml所指示的肽在37℃脈沖1小時(shí)，洗滌，并溫育0、4、8、24或30小時(shí)。使用轉(zhuǎn)導(dǎo)肽脈沖的細(xì)胞與bGAL肽預(yù)溫育以阻斷任何細(xì)胞表面結(jié)合。然后通過(guò)ELISPOT測(cè)試細(xì)胞誘導(dǎo)從SIINFEKL特異T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。大于300/孔的點(diǎn)數(shù)不能計(jì)數(shù)。*＝未測(cè)試的樣品。
圖12.NP肽呈遞的體外分析。將來(lái)自C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞用10μg/ml所指示的肽在37℃脈沖1小時(shí)，洗滌，并溫育0、24、72或120小時(shí)。通過(guò)ELISPOT測(cè)試細(xì)胞誘導(dǎo)從NP-特異T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。
圖13.hPER1-FVYVW-gp100-154肽免疫后長(zhǎng)期免疫性的誘導(dǎo)。僅用gp100-154肽或者結(jié)合hPER1-FVYVW皮下免疫3周或者3個(gè)月后A2/Kb小鼠中的CTL應(yīng)答。結(jié)果顯示了單個(gè)小鼠(4只小鼠/組)。hPEr1-FVYVW-154免疫后分別在4/4或者3/4小鼠中觀察到短期(3周)以及長(zhǎng)期(3個(gè)月)T細(xì)胞應(yīng)答。相比而言，僅用154免疫不產(chǎn)生顯著CTL應(yīng)答。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生和利用靶定的免疫原的試劑和方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將免疫原綴合到氨基酸序列，所述序列將免疫原靶向MHC用于呈遞。使用本文提供的試劑和方法，可以增強(qiáng)免疫方案，從而導(dǎo)致宿主的增強(qiáng)的免疫性。
詳述本發(fā)明提供了用優(yōu)選將肽導(dǎo)向MHC呈遞途徑的氨基酸序列(本文中稱作“靶向序列”)將免疫原靶向MHC途徑的方法。該靶向策略可以用于例如基于肽的免疫方案中，以用于在樹突細(xì)胞中表達(dá)抗原，用于核酸疫苗，和基于載體(即，病毒、細(xì)菌)的接種。為了描述本發(fā)明，將連接到靶向氨基酸序列的免疫原性氨基酸序列稱作“靶定的免疫原”。術(shù)語(yǔ)“靶定的免疫原”包括其片段、變體或者衍生物。
靶向序列可以包括，例如，本領(lǐng)域已知的任意轉(zhuǎn)導(dǎo)序列。優(yōu)選來(lái)自觸角足、TAT、VP22或hPER1蛋白的序列(即，靶向序列)。更優(yōu)選的靶向序列包括例如TATGYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO.1)AntPRQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO.2)PER1-1SRRHHCRSKAKRSRHH(SEQ ID NO.3)PER1-2RRHHRRSKAKRSR(SEQ ID NO.4)在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位結(jié)合到hPER1轉(zhuǎn)導(dǎo)序列以形成靶定的免疫原(或者“hPER1-CTL綴合物”)。優(yōu)選對(duì)宿主施用靶定的免疫原導(dǎo)致抗免疫原免疫應(yīng)答，其大于僅用該免疫原得到的免疫應(yīng)答(即，增加的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答)。
適宜的免疫原還可以包括例如，腫瘤抗原(TA)的肽序列。術(shù)語(yǔ)“TA”包括腫瘤相關(guān)抗原(TAA)和腫瘤特異抗原(TSA)，其中癌性細(xì)胞是抗原的來(lái)源。TAA是在腫瘤細(xì)胞表面上以高于正常細(xì)胞上觀察到的量表達(dá)的抗原或者在胎兒發(fā)育期間在正常細(xì)胞上表達(dá)的抗原。TSA是腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的抗原并且不在正常細(xì)胞上表達(dá)。TA還包括TAA或者TSA、其抗原性或者免疫原性片段，和保留它們的抗原性和/或免疫原性的修飾形式。通常將TA根據(jù)它們的表達(dá)模式、功能或者遺傳來(lái)源分成5類癌-睪丸(CT)抗原(即，MAGE，NY-ESO-1)；黑素細(xì)胞分化抗原(即，Melan A/MART-1，酪氨酸酶，gp100)；突變抗原(即，MUM-1，p53，CDK-4)；超表達(dá)的‘自身’抗原(即，HER-2/neu，p53)；和病毒抗原(即，HPV，EBV)。適宜的TA包括例如，gp100(Cox等人，Science，264716-719(1994))、MART-1/Melan A(Kawakami等人，J.Exp.Med.，180347-352(1994))、gp75(TRP-1)(Wang等人，J.Exp.Med.，1861131-1140(1996))、酪氨酸酶(Wolfel等人，Eur.J.Immunol.，24759-764(1994))、NY-ESO-1(WO 98/14464；WO 99/18206)、黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom等人，J.Immunol.，1301467-1472(1983))、MAGE家族抗原(即，MAGE-1、2、3、4、6和12；Van der Bruggen等人，Science，2541643-1647(1991)；美國(guó)專利號(hào)6,235,525)、BAGE家族抗原(Boel等人，Immunity，2167-175(1995))、GAGE家族抗原(即，GAGE-1、2；Van der Eynde等人，J.Exp.Med.，182689-698(1995)；美國(guó)專利號(hào)6,013,765)、RAGE家族抗原(即，RAGE-1；Gaugler等人，Immunogenetics，44323-330)(1996)；美國(guó)專利號(hào)5,939,526)、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶-V(Guilloux等人，J.Exp.Med.，1831173-1183(1996))、p15(Robbins等人，J.1mmunol.，1545944-5950(1995))、β-連環(huán)蛋白(Robbins等人，J.Exp.Med.，1831185-1192(1996))、MUM-1(Coulie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927976-7980(1995))、依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶-4(CDK4)(Wolfel等人，Science，2691281-1284(1995))、p21-ras(Fossum等人，Int.J.Cancer，5640-45(1994))、BCR-abl(Bocchia等人，Blood，852680-2684(1995))、p53(Theobald等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211993-11997(1995))、p185HER2/neu(erb-B1；Fisk等人，J.Exp.Med.，1812109-2117(1995))、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)(Harris等人，Breast Cancer Res.Treat，291-2(1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong等人，J.Natl.Cancer Inst.，85982-990(1995)、美國(guó)專利號(hào)5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP 263933；EP 346710；和EP 784483)；癌相關(guān)的突變粘蛋白(即，MUC-1基因產(chǎn)物；Jerome等人，J.Immunol.，1511654-1662(1993))；EBV的EBNA基因產(chǎn)物(即，EBNA-1；Rickinson等人，Cancer Surveys，1353-80(1992))；人乳頭瘤病毒的E7，E6蛋白質(zhì)(Ressing等人，J.Immunol，1545934-5943(1995))；前列腺特異抗原(PSA；Xue等人，The Prostate，3073-78(1997))；前列腺特異膜抗原(PSMA；Israeli，等人，Cancer Res.，541807-1811(1994))；獨(dú)特型表位或者抗原，例如，免疫球蛋白獨(dú)特型或者T細(xì)胞受體獨(dú)特型(Chen等人，J.Immunol.，1534775-4787(1994))；KSA(美國(guó)專利號(hào)5,348,887)、驅(qū)動(dòng)蛋白2(Dietz，等人Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7；275(3)731-8)、HIP-55、TGFβ-1抗細(xì)胞凋亡因子(Toomey，等人Br J Biomed Sci 2001；58(3)177-83)、腫瘤蛋白D52(Bryne J.A.，等人，Genomics，35523-532(1996))、H1FT、NY-BR-1(WO01/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87和NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic and Bioinformatic Approaches to theIdentification of Human Tumor Antigens，in Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，New York，NY)，包括野生型、修飾的、突變的TA以及其免疫原性片段和衍生物。這些TA的任一種可以單獨(dú)使用或者與一種或多種靶定的免疫原組合用于共免疫方案中。
許多適宜的TA來(lái)源的肽序列適于用于實(shí)踐本發(fā)明。優(yōu)選的TA來(lái)源的肽序列在下面顯示，它們的任一種都可以連接靶向序列，如TAT、AntP、hPER1-1或者h(yuǎn)PER1-2
gp100-280-288(9V)YLEPGPVTV (SEQ ID NO5)gp100-154-162KTWGQYWQV (SEQ ID NO6)MART-1 32ILTVILGVL (SEQ.ID.NO.7)MART-1 31GILTVILGV (SEQ.ID.NO.8)MART-1 99NAPPAYEKL (SEQ.ID.NO.9)MART-1 1 MPREDAHFI (SEQ.ID.NO.10)MART-1 56ALMDKSLHV (SEQ ID.NO.11)MART-1 39VLLLIGCWY (SEQ.ID.NO.12)MART-1 35VILGVLLLI (SEQ.ID.NO.13)MART-1 61SLHVGTQCA (SEQ.ID.NO.14)MART-1 57LMDKSLHVG (SEQ.ID.NO.15)MAGE-A3 115 ELVHFLLLK (SEQ ID NO16)MAGE-A3 285 KVLHHMVKI (SEQ ID NO17)MAGE-A3 276 RALVETSYV (SEQ ID NO18)MAGE-A3 105 FQAALSRKV (SEQ ID NO19)MAGE-A3 296 GPHISYPPL (SEQ ID NO20)MAGE-A3 243 KKLLTQHFV (SEQ ID NO.21)MAGE-A3 24 GLVGAQAPA (SEQ ID NO.22)MAGE-A3 301 YPPLHEWVL (SEQ ID NO.23)MAGE-A3 71 LPTTMNYPL (SEQ ID NO.24)Tyr 171 NIYDLFVWM (SEQ ID NO25)Tyr 444 DLGYDYSYL (SEQ ID NO26)Tyr 57 NILLSNAPL (SEQ ID NO27)TRP-1 245SLPYWNFAT (SEQ ID NO28)TRP-1 298TLGTLCNST (SEQ ID NO29)TRP-1 481IAVVGALLL (SEQ ID NO30)TRP-1 181NISIYNYFV (SEQ ID NO31)TRP-1 439NMVPFWPPV (SEQ ID NO32)額外適宜的免疫原包括來(lái)自感染性生物的那些免疫原，所述感染性生物包括細(xì)菌、病毒、寄生物等等。例如，百日咳抗原如百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳桿菌粘附素(pertactin)、凝集原或者從它們衍生的肽與靶向序列如hPER1-1或者h(yuǎn)PER1-2融合后可以用作疫苗。類似地，來(lái)自如本領(lǐng)域已知的除其他以外的致病生物如棒桿菌(Corynebacterium)(即，白喉棒桿菌)、梭菌(Clostridium)(即，破傷風(fēng)梭菌)、奈瑟氏球菌(Neisseria)(即，腦膜炎奈瑟氏球菌)、鏈球菌(Streptococcus)、嗜血菌(Hemophilus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原也可以使用。
在一些實(shí)施方案中，可以用插入靶向序列和免疫原序列之間的接頭序列連接靶向序列和免疫原性肽序列。適宜的接頭包括例如，在肽所來(lái)源的全長(zhǎng)親代多肽中天然存在于所述肽序列的N-末端的氨基酸序列。例如，在全長(zhǎng)gp100多肽內(nèi)gp100肽序列KTWGQYWQV天然地在其N末端具有序列FVYVW。因此，F(xiàn)VYVW可以用于連接gp100肽與靶向序列。其他適宜的接頭可以用設(shè)計(jì)與MHC分子相互作用的肽的標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)計(jì)，如本領(lǐng)域已知的。
一些實(shí)施方案還可以包括本發(fā)明的肽序列的衍生物。一種類型的衍生物是其中一個(gè)氨基酸序列用另一個(gè)替代的序列。替代可以是保守的，或者非保守的，或者其任意組合。對(duì)多肽序列的保守氨基酸修飾(和對(duì)編碼核苷酸的相應(yīng)修飾)可以產(chǎn)生具有類似于親代多肽的功能和化學(xué)特征的多肽。例如，“保守氨基酸替代”可以涉及將天然氨基酸殘基用非天然殘基替代從而對(duì)該位置的氨基酸殘基的大小、極性、電荷、疏水性或者親水性有很小的影響或者沒(méi)有影響，并且，尤其不導(dǎo)致減小的免疫原性。適宜的保守氨基酸替代在表I中顯示。
表I
技術(shù)人員將能夠用公知的技術(shù)確定免疫原性靶的適宜的變體。為了鑒定分子中可以改變而不破壞生物活性(即，MHC結(jié)合、免疫原性)的區(qū)域，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以靶向認(rèn)為對(duì)于該活性不重要的區(qū)域。例如，當(dāng)來(lái)自相同物種或者其他物種的具有相似活性的免疫原性靶是已知的時(shí)候，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以比較多肽與此類相似的多肽的氨基酸序列。通過(guò)進(jìn)行此類分析，人們可以鑒定保守的殘基和分子部分。將明白相對(duì)于此類相似免疫原性靶不保守的分子區(qū)域中的改變將較不可能不利地影響多肽的生物活性和/或結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將還已知，甚至在相對(duì)保守的區(qū)域中，人們也可以用化學(xué)相似的氨基酸替代天然發(fā)生的殘基而保留活性。因此，甚至對(duì)生物活性或者結(jié)構(gòu)重要的區(qū)域也可以進(jìn)行保守氨基酸替代而不破壞免疫原性靶的生物活性或者不會(huì)不利地影響它的結(jié)構(gòu)。
在一些實(shí)施方案中，將編碼所述肽序列的核酸分子插入到表達(dá)載體中，如下文更詳細(xì)地討論的。在此類實(shí)施方案中，所述肽序列由對(duì)應(yīng)于氨基酸序列的核苷酸編碼。編碼多種氨基酸的核苷酸的特定組合是本領(lǐng)域公知的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的多種參考文獻(xiàn)中描述的(即，Lewin，B.Genes V，Oxford University Press，1994)，如下面的表II中所示表II
編碼本發(fā)明的多種肽的示例性DNA序列在下面顯示TAT (SEQ ID NO.33)GGCTACGGCAGGAAGAAGAGGAGGCAGAGGAGGAGGAntP (SEQ ID NO.34)AGGCAGATCAAGATCTGGTTCCAGAACAGGAGGATGAAGTGGAAGAAGPER1-1(SEQ ID NO.35)AGCAGGAGGCACCACTGCAGGAGCAAGGCCAAGAGGAGCAGGCACCACPER1-2(SEQ ID NO.36)AGGAGGCACCACAGGAGGAGCAAGGCCAAGAGGAGCAGGgp100-280-288(9V)TACCTGGAGCCCGGCCCCGTGACCGTG (SEQ ID NO.37)gp100-154-162AAGACCTGGGGCCAGTACTGGCAGGTG (SEQ ID NO.38)
MART-1 32 ATCCTGACAGTGATCCTGGGAGTCTTA (SEQ ID NO39)MART-1 31 GGCATCCTGACAGTGATCCTGGGAGTC (SEQ ID NO40)MART-1 99 AATGCTCCACCTGCTTATGAGAAACTC (SEQ ID NO42)MART-1 1 ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC (SEQ ID NO43)MART-1 56 GCCTTGATGGATAAAAGTCTTCATGTT (SEQ ID NO44)MART-1 39 GTCTTACTGCTCATCGGCTGTTGGTAT (SEQ ID NO45)MART-1 35 GTGATCCTGGGAGTCTTACTGCTCATC (SEQ ID NO46)MART-1 61 AGTCTTCATGTTGGCACTCAATGTGCC (SEQ IDNO47)MART-1 57 TTGATGGATAAAAGTCTTCATGTTGGC (SEQ ID NO48)MAGE-A3 115GAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAG (SEQ ID NO.49)MAGE-A3 285AAAGTCCTGCACCATATGGTAAAGATC (SEQ.ID.NO.50)MAGE-A3 276AGGGCCCTCGTTGAAACCAGCTATGTG (SEQ ID.NO.51)MAGE-A3 105TTCCAAGCAGCACTCAGTAGGAAGGTG (SEQ ID.NO.52)MAGE-A3 296GGACCTCACATTTCCTACCCACCCCTG (SEQ.ID.NO.53)MAGE-A3 243AAGAAGCTGCTCACCCAACATTTCGTG (SEQ ID.NO.54)MAGE-A3 24 GGCCTGGTGGGTGCGCAGGCTCCTGCT (SEQ ID NO55)MAGE-A3 301TACCCACCCCTGCATGAGTGGGTTTTG (SEQ ID.NO.56)MAGE-A3 71 CTCCCCACTACCATGAACTACCCTCTC(SEQ.ID.NO.57)TYR 171AATATTTATGACCTCTTTGTCTGGATG (SEQ ID NO58)TYR 444GATCTGGGCTATGACTATAGCTATCTA (SEQ ID NO59)TYR 57 AATATCCTTCTGTCCAATGCACCACTT (SEQ ID NO60)TRP-1 245 TCCCTTCCTTACTGGAATTTTGCAACG (SEQ ID NO61)TRP-1 298 ACCCTGGGAACACTTTGTAACAGCACC (SEQ ID NO62)TRP-1 481 ATAGCAGTAGTTGGCGCTTTGTTACTG (SEQ ID NO63)TRP-1 181 AACATTTCCATTTATAACTACTTTGTT (SEQ ID NO64)TRP-1 439 AACATGGTGCCATTCTGGCCCCCAGTC (SEQ ID NO65)下面顯示了示例性免疫原性靶的氨基酸和DNA序列，所述免疫原性靶包括代表靶向序列的第一個(gè)氨基酸和代表免疫原(T細(xì)胞表位)的第二個(gè)氨基酸序列
hPER1-1-gp100(280-288)S R R H H C R S K A K R S R HAGC AGG AGG CAC CAC TGC AGG AGC AAG GCC AAG AGG AGC AGGCACH Y L E P G P V T VCAC TAC CTG GAG CCC GGC CCC GTG ACC GTG (SEQ ID NO66)hPER1-2-gp100(154-162)R R H H R R S K A K R S RAGG AGG CAC CAC AGG AGG AGC AAG GCC AAG AGG AGC AGGK T W G Q Y W Q VAAG ACC TGG GGC CAG TAC TGG CAG GTG (SEQ ID NO67)hPER1-2-F-gp100(154-162)R R H H R R S K A K R S RAGG AGG CAC CAC AGG AGG AGC AAG GCC AAG AGG AGC AGGF V Y V W K T W G Q Y W Q VTTC GTG TAC GTG TGG AAG ACC TGG GGC CAG TAC TGG CAG GTG(SEQ ID NO68)靶定的免疫原可以與佐劑和/或細(xì)胞因子組合施用以加強(qiáng)免疫應(yīng)答。示例性佐劑在下面的表III中顯示
表III免疫原性佐劑的類型
一種或多種細(xì)胞因子也可以是實(shí)踐本發(fā)明中適宜的共刺激組分，作為多肽或者由本發(fā)明的組合物內(nèi)包含的核酸編碼(Parmiani，等人Immunol Lett 2000 Sep15；74(1)41-4；Berzofsky，等人NatureImmunol.1209-219)。適宜的細(xì)胞因子包括例如，白細(xì)胞介素-2(IL-2)(Rosenberg，等人Nature Med.4321-327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(Pardoll，1992；Harries，等人J.Gene Med.2000 Jul-Aug；2(4)243-9；Rao，等人J.Immunol.1563357-3365(1996)綜述)、IL-15(Xin，等人Vaccine，17858-866，1999)、IL-16(Cruikshahk，等人J.Leuk Biol.67(6)757-66，2000)、IL-18(J.Caneer Res.Clin.Oncol.2001.127(12)718-726)、GM-CSF(CSF(Disis，等人Blood，88202-210(1996))、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或者干擾素-γ(INF-γ)。如本領(lǐng)域已知的，其他細(xì)胞因子也可以適于實(shí)踐本發(fā)明。
趨化因子也可以用于輔助誘導(dǎo)或者增強(qiáng)免疫應(yīng)答。例如，已經(jīng)表明包含與腫瘤自身抗原融合的CXCL10(IP-10)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性(Biragyn，等人Nature Biotech.1999，17253-258)。趨化因子CCL3(MIP-1α)和CCL5(RANTES)(Boyer，等人Vaccine，1999，17(Supp.2)S53-S64)也可以用于實(shí)踐本發(fā)明。其他適宜的趨化因子是本領(lǐng)域已知的。
在一些實(shí)施方案中，靶定的免疫原可以用作核酸分子，其單獨(dú)或者作為遞送載體如病毒載體的部分使用。在這些情況中，有利的是組合靶定的免疫原與本發(fā)明組合物中的一種或多種共刺激組分，如細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞因子或者趨化因子。例如共刺激組分可以包括在組合物中作為多肽或者編碼該多肽的核酸。適宜的共刺激分子包括，例如，結(jié)合CD28家族成員(即，CD28，ICOS；Hutloff，等人Nature1999，397263-265；Peach，等人J Exp Med 1994，1802049-2058)的多肽，如CD28結(jié)合多肽B7.1(CD80；Schwartz，1992；Chen等人，1992；Ellis，等人J.Immunol.，156(8)2700-9)和B7.2(CD86；Ellis，等人J.Immunol.，156(8)2700-9)；結(jié)合整聯(lián)蛋白家族成員(即，LFA-1(CD11a/CD18)；Sedwick，等人J Immunol 1999，1621367-1375；Wülfing，等人Science 1998，2822266-2269；Lub，等人Immunol Today 1995，16479-483)、包括ICAM家族的成員(即，ICAM-1、-2或-3)的多肽；結(jié)合CD2家族成員(即，CD2，信號(hào)傳導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子(CDw150或“SLAM”；Aversa，等人J Immunol 1997，1584036-4044)的多肽，如CD58(LFA-3；CD2配體；Davis，等人Immunol Today 1996，17177-187)或SLAM配體(Sayos，等人Nature 1998，395462-469)；結(jié)合熱穩(wěn)定抗原(HSA或CD24；Zhou，等人Eur J Immunol 1997，272524-2528)的多肽；結(jié)合TNF受體(TNFR)家族成員(即，4-1BB(CD137；Vinay，等人Semin Immunol 1998，10481-489))的多肽、OX40(CD134；Weinberg，等人Semin Immunol 1998，10471-480；Higgins，等人JImmunol 1999，162486-493)、和CD27(Lens，等人Semin Immunol.1998，10491-499))如4-1BBL(4-1BB配體；Vinay，等人SeminImmunol 1998，10481-48；DeBenedette，等人J Immunol 1997，158551-559)、TNFR結(jié)合的因子-1(TRAF-1；4-1BB配體；Saoulli，等人J Exp Med 1998，1871849-1862，Arch，等人Mol Cell Biol 1998，18558-565)、TRAF-2(4-1BB和OX40配體；Saoulli，等人J Exp Med1998，1871849-1862；Oshima，等人Int Immunol 1998，10517-526，Kawamata，等人J Biol Chem 1998，2735808-5814)、TRAF-3(4-1BB和OX40配體；Arch，等人Mol Cell Biol 1998，18558-565；Jang，等人Biochem Biophys Res Commun 1998，242613-620；KawamataS，等人J Biol Chem 1998，2735808-5814)、OX40L(OX40配體；Gramaglia，等人J Immunol 1998，1616510-6517)、TRAF-5(OX40配體；Arch，等人Mol Cell Biol 1998，18558-565；Kawamata，等人J Biol Chem 1998，2735808-5814)和CD70(CD27配體；Couderc，等人Cancer Gene Ther.，5(3)163-75)。CD154(CD40配體或“CD40L”；Gurunathan，等人J.Immunol.，1998，1614563-4571；Sine，等人Hum.Gene Ther.，2001，121091-1102)也是適宜的。不同于共刺激分子本身的刺激基序也可以整合入編碼TA的核酸中，如CpG基序(Gurunathan，等人Ann.Rev.Immunol.2000，18927-974)。使用本文描述的試劑和方法，其他刺激基序或共刺激分子也可以用于治療和/或預(yù)防癌癥。
這些共刺激組分的任一種可以單獨(dú)或者與其他試劑組合使用。例如，已經(jīng)表明CD80、ICAM-1和LFA-3的組合(“TRICOM”)可以加強(qiáng)抗癌免疫應(yīng)答(Hodge，等人Cancer Res.595800-5807(1999)。其他有效的組合包括例如，IL-12+GM-CSF(Ahlers，等人J.Immunol.，1583947-3958(1997)；Iwasaki，等人J.Immunol.1584591-4601(1997))、IL-12+GM-CSF+TNF-α(Ahlers，等人Int.Immunol.13897-908(2001))、CD80+IL-12(Fruend，等人Int.J.Cancer，85508-517(2000)；Rao，等人，如前)和CD86+GM-CSF+IL-12(Iwasaki，如前)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道用于實(shí)施本發(fā)明的額外的組合。
本領(lǐng)域還已知可以阻斷抑制性或者負(fù)調(diào)節(jié)免疫機(jī)制，從而導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。例如，已經(jīng)表明用抗-CTLA-4(Shrikant，等人Immunity，1996，14145-155；Sutmuller，等人J.Exp.Med.，2001，194823-832)、抗-CD25(Sutmuller，如前)、抗-CD4(Matsui，等人J.Immunol.，1999，163184-193)、融合蛋白IL13Ra2-Fc(Terabe，等人Nature Immunol.，2000，1515-520)和它們的組合(即，抗-CTLA-4和抗-CD25，Sutmuller，如前)治療上調(diào)抗腫瘤免疫應(yīng)答。此外，技術(shù)人員將知道可以用以調(diào)節(jié)此類機(jī)制的額外試劑或者方法。這些試劑和方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他試劑和方法可以用于實(shí)踐本發(fā)明。
表達(dá)載體也可以適于用于實(shí)踐本發(fā)明。表達(dá)載體通常包含與編碼多肽的異源核酸序列(“編碼序列”)可操作地連接的側(cè)翼序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽由代表靶向序列的第一個(gè)氨基酸序列和代表免疫原(即，T細(xì)胞表位)的第二個(gè)氨基酸序列組成。側(cè)翼序列優(yōu)選能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯并且可操作地連接編碼序列?！翱刹僮鞯剡B接”指出該核酸序列如此配置從而實(shí)現(xiàn)它們的通常功能。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子可操作地連接該編碼序列。側(cè)翼序列不必與編碼序列鄰接，只要它正確發(fā)揮功能即可。從而，例如，在啟動(dòng)子序列和編碼序列之間可以存在間插的非翻譯但是轉(zhuǎn)錄的序列，并且仍然可以認(rèn)為啟動(dòng)子序列可操作地連接編碼序列。側(cè)翼序列可以是同源的(即，來(lái)自與宿主細(xì)胞相同的物種和/或株)、異源的(即，來(lái)自不同于宿主細(xì)胞物種或者株的物種)、雜合的(即，來(lái)自一種以上來(lái)源的側(cè)翼序列的組合)，或者合成的。側(cè)翼序列還可以是正常發(fā)揮功能以調(diào)節(jié)宿主基因組中編碼多肽的核苷酸序列的表達(dá)的序列。
在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選側(cè)翼序列是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其驅(qū)動(dòng)靶細(xì)胞中高水平的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以包含例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、阻遏元件，或者它們的組合。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以是組成型的或者組織-或者細(xì)胞類型特異性的(即，該區(qū)域在一種類型的組織或者細(xì)胞中與另一種類型的組織或者細(xì)胞中相比驅(qū)動(dòng)更高水平的轉(zhuǎn)錄)。同樣地，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的來(lái)源可以是任意原核或者真核生物、任何脊椎動(dòng)物或者無(wú)脊椎動(dòng)物，或者任何植物，前提是側(cè)翼序列在宿主細(xì)胞機(jī)器中是有功能的并且可以由宿主細(xì)胞機(jī)器激活。在本發(fā)明的實(shí)踐中可以利用多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。
適宜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)除其他的以外包括CMW啟動(dòng)子(即，CMV立即早期啟動(dòng)子)；來(lái)自真核生物基因(即，雌激素誘導(dǎo)型雞卵清蛋白基因、干擾素基因、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型酪氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶基因和胸苷激酶基因)的啟動(dòng)子；和主要早期和晚期腺病毒基因啟動(dòng)子；SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290304-10)；勞斯肉瘤病毒(RSV)的3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)中所含的啟動(dòng)子(Yamamoto，等人，1980，Cell 22787-97)；單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)啟動(dòng)子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781444-45)；金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等人，1982，Nature 29639-42)；原核生物表達(dá)載體，如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，753727-31)；或tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8021-25)。組織和/或細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括，例如，在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等人，1984，Cell 38639-46；Ornitz等人，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology7425-515)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature 315115-22)；在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等人，1984，Cell 38647-58；Adames等人，1985，Nature 318533-38；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；睪丸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中的小鼠乳癌病毒控制區(qū)(Leder等人，1986，Cell 45485-95)；肝臟中的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1268-76)；肝臟中的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.，51639-48；Hammer等人，1987，Science 23553-58)；肝臟中的α-1抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1161-71)；髓樣細(xì)胞中的β-珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等人，1985，Nature 315338-40；Kollias等人，1986，Cell 4689-94)；腦中的少突膠質(zhì)細(xì)胞中的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等人，1987，Cell 48703-12)；骨骼肌中肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature 314283-86)；和下丘腦中促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(Mason等人，1986，Science 2341372-78)，和黑素瘤細(xì)胞中的酪氨酸酶啟動(dòng)子(Hart，I.Semin Oncol 1996 Feb；23(1)154-8；Siders，等人Cancer Gene Ther 1998 Sep-Oct；5(5)281-91)。本領(lǐng)域已知其他適宜的啟動(dòng)子。
編碼靶定的免疫原的核酸分子可以作為病毒和非病毒載體的部分施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，用DNA載體向患者遞送編碼靶定的免疫原和/或相關(guān)分子(即，共刺激分子、細(xì)胞因子或者趨化因子)的核酸。在這種情況下，可以用多種策略提高此類機(jī)制的效率，包括，例如，使用自我復(fù)制性病毒復(fù)制子(Caley，等人1999.Vaccine，173124-2135；Dubensky，等人2000.Mol.Med.6723-732；Leitner，等人2000.Cancer Res.6051-55)、密碼子最優(yōu)化(Liu，等人2000.Mol.Ther.，1497-500；Dubensky，如前；Huang，等人2001.J.Virol.754947-4951)、體內(nèi)電穿孔(Widera，等人2000.J.Immunol.1644635-3640)、整合編碼共刺激分子、細(xì)胞因子和/或趨化因子的核酸(Xiang，等人1995.Immunity，2129-135；Kim，等人1998.Eur.J.Immunol.，281089-1103；Iwasaki，等人1997.J.Immunol.1584591-4601；Sheerlinck，等人2001.Vaccine，192647-2656)、整合刺激基序，如CpG(Gurunathan，如前；Leiter，如前)、靶向內(nèi)吞的或者遍在蛋白加工途徑的序列(Thomson，等人1998.J.Virol.722246-2252；Velders，等人2001.J.Immunol.1665366-5373)、引發(fā)-加強(qiáng)方案(prime-boost regimens)(Gurunathan，如前；Sullivan，等人2000.Nature，408605-609；Hanke，等人1998.Vaccine，16439-445；Amara，等人2001.Science，29269-74)、蛋白酶體敏感切割位點(diǎn)，和使用粘膜遞送載體，如沙門氏菌(Salmonella)(Darji，等人1997.Cell，91765-775；Woo，等人2001.Vaccine，192945-2954)。其他方法是本領(lǐng)域已知的，一些方法在下文描述。
已經(jīng)成功用于將核酸導(dǎo)入宿主的多種病毒載體除其他的以外包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒和痘病毒.本領(lǐng)域?qū)⒗斫獗绢I(lǐng)域可以利用許多此類病毒載體.用本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍可得到的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)可以構(gòu)建本發(fā)明的載體。此類技術(shù)可以見(jiàn)普通分子生物學(xué)參考文獻(xiàn)，如Molecular CloningA LaboratoryManual(Sambrook，等人，1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)、Gene Expression Technology(Methods in Enzymology，Vol.185，編者D.Goeddel，1991.Academic Press，San Diego，CA)，和PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Innis，等人1990.Academic Press，San Diego，CA)。
優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒衍生物以及鼠或者鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。適宜的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例包括例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳癌病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和勞斯肉瘤病毒(RSV)。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以整合多種外源核酸序列。由于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒是有缺陷的，所以它們需要幫助來(lái)產(chǎn)生感染性病毒顆粒。該幫助可以由例如編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因的輔助細(xì)胞系提供。適宜的輔助細(xì)胞系除其他的以外包括ψ2、PA317和PA12。用此類細(xì)胞系產(chǎn)生的載體病毒體可以用于感染組織細(xì)胞系，如NIH 3T3細(xì)胞，以產(chǎn)生大量嵌合的逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒體?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)方法(即，注射)或者通過(guò)將“生產(chǎn)者細(xì)胞系”植入靶細(xì)胞群體附近來(lái)施用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Culver，K.，等人，1994，Hum.Gene Ther.，5(3)343-79；Culver，K.，等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，59685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.Gene Ther.，4(1)39-69)。將生產(chǎn)者細(xì)胞系工程改造以產(chǎn)生病毒載體和在靶細(xì)胞的附近釋放病毒顆粒。一部分釋放的病毒顆粒與靶細(xì)胞接觸并感染那些細(xì)胞，從而向靶細(xì)胞遞送本發(fā)明的核酸。注射靶細(xì)胞后，發(fā)生載體核酸的表達(dá)。
腺病毒載體已經(jīng)被證明尤其可用于向真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移(Rosenfeld，M.，等人，1991，Science，252(5004)431-4；Crystal，R.，等人，1994，Nat.Genet.，8(1.)42-51)、研究真核基因表達(dá)(Levrero，M.，等人，1991，Gene，101(2)195-202)、疫苗開(kāi)發(fā)(Graham，F(xiàn).和Prevec，L.，1992，Biotechnology，20363-90)和用于動(dòng)物模型中(Stratford-Perricaudet，L.，等人，1992，BoneMarrow Transplant.，9(Suppl.1)151-2；Rich，D.，等人，1993，Hum.Gene Ther.，4(4)461-76)。對(duì)不同組織體內(nèi)施用重組Ad的實(shí)驗(yàn)途徑除其他的以外包括氣管內(nèi)滴注(Rosenfeld，M.，等人，1992，Cell，68(1)143-55)、注射到肌肉(Quantin，B.，等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)2581-4)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz，J.，和Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)2812-6)和趨實(shí)體(stereotactic)接種到腦(Le Gal La Salle，G.，等人，1993，Science，259(5097)988-90)。
腺伴隨病毒(AAV)表現(xiàn)出高水平感染性、寬宿主范圍和整合到宿主細(xì)胞基因組中的特異性(Hermonat，P.，等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(20)6466-70)。1型單純皰疹病毒(HSV-1)是另一種吸引人的載體系統(tǒng)，由于它的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)而特別用于神經(jīng)系統(tǒng)中(Geller，A.，等人，1991，Trends Neurosci.，14(10)428-32；Glorioso，等人，1995，Mol.Biotechnol.，4(1)87-99；Glorioso，等人，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49675-710)。
痘病毒是另一種有用的表達(dá)載體(Smith，等人1983，Gene，25(1)21-8；Moss，等人，1992，Biotechnology，20345-62；Moss，等人，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，15825-38；Moss，等人1991.Science，2521662-1667)。已表明有用的痘病毒除其他的以外包括牛痘、NYVAC、禽痘(avipox)、禽痘、金絲雀痘、ALVAC和ALVAC(2)。
NYVAC(vP866)來(lái)自痘苗病毒的哥本哈根(Copenhagen)疫苗株，這通過(guò)缺失基因組的編碼已知的或者潛在毒力因子的6個(gè)非必需區(qū)得到(見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,364,773和5,494,807).還將缺失基因座工程改造為用于插入外來(lái)基因的受體基因座。缺失的區(qū)域?yàn)樾剀占っ富?TK；J2R)vP410；出血區(qū)(u；B13R+B14R)vP553；A型內(nèi)含體區(qū)(ATI；A26L)vP618；血凝素基因(HA；A56R)vP723；宿主范圍基因區(qū)(C7L-K1L)vP804；和大亞基核糖核苷酸還原酶(14L)vP866。NYVAC是基因工程化的痘苗病毒株，其通過(guò)特異缺失編碼與毒性和宿主范圍相關(guān)的基因產(chǎn)物的18個(gè)可讀框產(chǎn)生。已經(jīng)表明NYVAC可用于表達(dá)TA(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)6,265,189)。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)，NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB保藏在ATCC，保藏號(hào)分別為VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914。
基于ALVAC的重組病毒(即，ALVAC-1和ALVAC-2)也適合用于實(shí)踐本發(fā)明(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,756,103)。除了ALVAC(2)基因組包含處于牛痘啟動(dòng)子控制下的牛痘E3L和K3L基因外，ALVAC(2)與ALVAC(1)相同(美國(guó)專利號(hào)6,130,066；Beattie等人，1995a，1995b，1991；Chang等人，1992；Davies等人，1993)。已經(jīng)證明ALVAC(1)和ALVAC(2)都可以用于表達(dá)外源DNA序列，如TA(Tartaglia等人，1993a，b；美國(guó)專利號(hào)5,833,975)。ALVAC已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，美國(guó)，ATCC保藏號(hào)為VR-2547。
另一種有用的痘病毒載體是TROVAC。TROVAC是指減毒的禽痘，其是從禽痘病毒的FP-1疫苗株得到的噬菌斑克隆的分離物，所述疫苗株已經(jīng)許可用于接種1天齡的小雞。TROVAC同樣根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在ATCC，保藏號(hào)2553。
“非病毒”質(zhì)粒載體也可以適于某些實(shí)施方案。優(yōu)選的質(zhì)粒載體與細(xì)菌、昆蟲和/或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞相容。此類載體包括，例如，PCR-II、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT公開(kāi)號(hào)WO 90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)以及Bluescript質(zhì)粒衍生物(高拷貝數(shù)的基于COLE1-的噬菌粒，Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)、設(shè)計(jì)用于克隆Taq-擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的PCR克隆質(zhì)粒(例如，TOPOTMTA cloning試劑盒、PCR2.1質(zhì)粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。細(xì)菌載體也可以用于本發(fā)明。這些載體包括例如，志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、卡介苗(BCG)和鏈球菌屬(Streptococcus)(見(jiàn)例如，WO 88/6626；WO 90/0594；WO 91/13157；WO 92/1796；和WO 92/21376)。許多其他非病毒質(zhì)粒表達(dá)載體和系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的并且可以用于本發(fā)明。
其他遞送技術(shù)也可以足夠?qū)嵤┍景l(fā)明，所述技術(shù)包括例如，DNA-配體復(fù)合體、腺病毒-配體-DNA復(fù)合體、直接注射DNA、CaPO4沉淀、基因槍技術(shù)、電穿孔和膠態(tài)分散體系統(tǒng)。膠態(tài)分散體系統(tǒng)包括大分子復(fù)合體、納米膠囊、小球體、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、微團(tuán)、混合微團(tuán)和脂質(zhì)體。本發(fā)明的優(yōu)選的膠態(tài)系統(tǒng)是脂質(zhì)體，其是用作體外和體內(nèi)遞送載體的人工膜囊。RNA、DNA和完整病毒體可以被囊化在水性內(nèi)部并以生物活性形式遞送到細(xì)胞(Fraley，R.，等人，1981，Trends Biochem.Sci.，677)。脂質(zhì)體的組成通常是磷脂，特別是高相變溫度磷脂的組合，通常與類固醇，特別是膽固醇組合。也可以使用其他磷脂或者脂質(zhì)。脂質(zhì)體的物理特征取決于pH、離子強(qiáng)度和二價(jià)陽(yáng)離子的存在。用于脂質(zhì)體生產(chǎn)的脂質(zhì)的實(shí)例包括磷脂?；衔?，如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。尤其有用的是二?；字８视停渲兄|(zhì)部分含有14-18個(gè)碳原子，尤其16-18個(gè)碳原子，并且是飽和的。闡明性磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)的任一種完成本發(fā)明的靶定的免疫原向宿主的施用。可以根據(jù)藥劑學(xué)的常規(guī)方法加工包含靶定的免疫原的組合物以產(chǎn)生藥物試劑用于施用于患者，包括人和其他哺乳動(dòng)物(即，產(chǎn)生“藥物組合物”)。優(yōu)選以含有例如給定量的DNA、病毒載體顆粒、多肽或者肽的劑量單位的形式制備藥物組合物。用于人或者其他哺乳動(dòng)物的適宜的日劑量可以依賴于患者的狀況和其他因素而變，但是再次可以用常規(guī)方法確定。
藥物組合物可以經(jīng)口、腸胃外、通過(guò)吸入噴霧、直腸或者局部地以含有常規(guī)可藥用載體、佐劑和媒介物的劑量單位制劑施用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“可藥用載體”或者“生理學(xué)可接受的載體”是指適于作為藥物組合物完成或者增強(qiáng)核酸、多肽或者肽的遞送的一種或多種制劑材料?！八幬锝M合物”是包含治療有效量的核酸或多肽的組合物。術(shù)語(yǔ)“有效量”和“治療有效量”各自指用于誘導(dǎo)或者增強(qiáng)有效免疫應(yīng)答的核酸或者多肽的量。優(yōu)選本發(fā)明的組合物提供宿主中抗腫瘤免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)或者增強(qiáng)，它保護(hù)宿主免于患腫瘤和/或允許宿主從身體消除現(xiàn)有腫瘤。
對(duì)于經(jīng)口施用，藥物組合物可以是幾種形式的任一種，其中包括，例如，膠囊、片劑、懸浮液或者液體?？梢宰鳛榕c適宜的載體(包括鹽水、葡萄糖或者水)的組合物注射施用液體。本文所用的術(shù)語(yǔ)腸胃外的包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、輸注或者腹膜內(nèi)施用。用于經(jīng)直腸施用藥物的栓劑可以通過(guò)將藥物與適宜的在常溫下為固體但是在直腸溫度下為液體的非刺激性賦形劑如可可脂和聚乙二醇混合來(lái)制備。
用本發(fā)明的組合物免疫宿主或者另外治療病癥或者疾病的劑量方案基于多種因素，包括患者的疾病類型、年齡、體重、性別、醫(yī)學(xué)狀況、狀況的嚴(yán)重性、施用途徑和所用的具體化合物。從而，劑量方案可以有很大變動(dòng)，但是可以用標(biāo)準(zhǔn)方法常規(guī)地確定。
盡管本發(fā)明的組合物可以作為唯一活性藥劑施用，但是它們也可以與一種或多種其他組合物或者試劑組合使用。當(dāng)作為組合施用時(shí)，可以將單獨(dú)組分配制為在相同或不同時(shí)間施用的分開(kāi)的組合物，或者可以將各組分組合為一種組合物。
還提供了包含本發(fā)明的組合物的試劑盒。試劑盒可以包含單獨(dú)的容器，其含有適宜的載體、稀釋劑或者賦形劑。試劑盒還可以包括額外的抗癌、抗腫瘤或者抗瘤劑和/或減小或者減輕抗瘤、抗腫瘤或者抗癌劑的不良作用的試劑用于共同或者順序施用。此外，試劑盒可以包括關(guān)于混合或組合各成分和/或關(guān)于施用的說(shuō)明書。
從為了闡明而給出的下面的實(shí)施例將更好的理解本發(fā)明和它的許多優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例實(shí)施例1制備免疫原性靶肽通過(guò)Bio-Synthesis Incorporated(Lewisville，Texas)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成所有肽。
為了證明表位綴合系統(tǒng)的可行性，將細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位綴合到多種轉(zhuǎn)導(dǎo)序列。選擇下面的轉(zhuǎn)胞吞肽用于連接到表位TATGYGRKKRRQRRRhPER1-1SRRHHCRSKAKRSRHHhPER1-2RRHHRRSKAKRSRAntPHD RQIKIWFQNRRMKWKK某些表位肽用接頭序列連接到轉(zhuǎn)胞吞序列。從天然發(fā)現(xiàn)直接處于表位序列的N-末端的序列選擇接頭，或者基于已知的免疫學(xué)參數(shù)選擇接頭。所選的接頭序列在下面顯示OVALEQLE(天然的)DEVWEL(合成的)NP 366-374 RGVQI(天然的)gp100(154-162) FVYVW(天然的)選擇一些表位，如下所示OVASIINFEKLNP 366-374 ASNENMETM(Rotzschke et al.1990Nature 348252)gp100(280-288(9V)) YLEPGPVTV(Parkhurst et al.1996J.Immunol.1572539)gp100(154-162) KTWGQYWQV(Kawakami et al.1995.
J.Immunol.1543961)然后通過(guò)組合上述轉(zhuǎn)胞吞肽、接頭序列和表位肽合成幾種免疫原性靶，如下所示
TAT-OVA肽GYGRKKRRQRRR-SIINFEKLGYGRKKRRQRRR-LEQLE-SIINFEKLGYGRKKRRQRRR-DEVWEL-SIINFEKLhPER1-OVA肽RRHHRRSKAKRSRSIINFEKLRRHHRRSKAKRSR-LEQLE-SIINFEKLRRHHRRSKAKRSR-SGQL-SIINFEKLRRHHRRSKAKRSR-DEVWEL-SIINFEKLRRHHRRSKAKRSR-FVYVW-SIINFEKLhPER1-NP肽RRHHRRSKAKRSR-ASNENMETMRRHHRRSKAKRSR-RGVQI-ASNENMETMRRHHRRSKAKRSR-FVYVW-ASNENMETMhPER1-1-gp100(280-288)SRRHHCRSKAKRSRHH-YLEPGPVTVhPER1-2-gp100(154-162)RRHHRRSKAKRSR-KTWGQYWQVRRHHRRSKAKRSR-FVYVW-KTWGQYWQVAntPHD-gp100RQIKIWFQNRRMKWKK-KTWGQYWQVRQIKIWFQNRRMKWKK-FVYVW-KTWGQYWQV然后在免疫學(xué)測(cè)定中測(cè)試這些肽，如下文所述。
實(shí)施例2免疫學(xué)測(cè)試A.hPER1-CTL表位綴合物當(dāng)與細(xì)胞體外溫育時(shí)可以形成CTL靶結(jié)構(gòu)。
為了確定hPER1-CTL綴合物是否可以形成CTL靶結(jié)構(gòu)，將51Cr標(biāo)記的RMA細(xì)胞用10-11g/ml NP肽(ASNENMETM)或hPER1-NP肽(RRHHRRSKAKRSRASNENMETM)脈沖，或者不處理(無(wú)肽)并在37℃溫育1小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞并在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)鉻釋放測(cè)定中測(cè)試CTL識(shí)別，其中使用從用流感病毒免疫的C57BL/6小鼠的脾臟得到的T細(xì)胞。圖1A證明RMA靶細(xì)胞當(dāng)與10pg/ml hPER1-NP肽溫育時(shí)可以對(duì)于CTL-介導(dǎo)的裂解敏化。
此外，將51Cr標(biāo)記的P815-A2/Kb細(xì)胞用10-6g/ml 280-9V肽(YLEPGPVTV)或hPER1-280-9V(RRHHRRSKKAKRSRYLEPGPVTV)脈沖，或者不處理(無(wú)肽)并在37℃溫育1小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞并在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)鉻釋放測(cè)定中測(cè)試CTL識(shí)別，其中使用從用不完全弗氏佐劑中的280-9V肽免疫的HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟得到的T細(xì)胞。如所指出的，在該測(cè)定中包括5μg/ml布雷菲德菌素A(BFA)以阻斷新生的I類MHC分子的表面表達(dá)。圖1B證明用10-6g/mlhPER1-280-9V肽可以敏化P815-A2/Kb靶細(xì)胞。如果用布雷菲德菌素A處理hPER1-280-9V脈沖的靶細(xì)胞，則CTL殺傷水平降低，所述布雷菲德菌素A阻斷新合成的MHC分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。
這些實(shí)驗(yàn)證明hPER1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)遞送提供了鼠T細(xì)胞的增加的敏化。同樣地，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)證明在人CTL中的該效果。
B.hPER1-CTL表位綴合物在人T細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中是免疫原性的在IL-2(50U/ml)、IL-7(10ng/ml)、LPS(10μg/ml)、CD40-配體表達(dá)性3T3細(xì)胞和肽(10μg/ml 280-9V或hPER1-280-9V)的存在下培養(yǎng)來(lái)自HLA-A2-陽(yáng)性患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在第11、22和32天，通過(guò)在IL-2(50U/ml)和IL-7(10ng/ml)的存在下進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)再次刺激細(xì)胞并用肽(100μg/ml 280-9V或hPER1-280-9V)對(duì)自體的CD40-配體激活的PBMC脈沖3小時(shí)。在第42天，在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定中測(cè)試培養(yǎng)物的CTL活性，其中使用用280-9V肽或者對(duì)照A2-結(jié)合肽脈沖的C1R-A2靶細(xì)胞。圖2證明通過(guò)用hPER1-280-9V重復(fù)體外刺激可以誘導(dǎo)280-9V特異的人CTL。
C.不存在佐劑時(shí)hPER1-CTL表位肽綴合物在體內(nèi)是免疫原性的圖3證明了在I-Ab-限制的T輔助表位(100μg)存在下，用100μg154、hPER1-154、280-9V或hPER1-280-9V皮下免疫HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠(每組4只)的結(jié)果。在第14和28天類似地加強(qiáng)免疫小鼠。在第42天，用適當(dāng)?shù)囊吧碗捏w外單獨(dú)再刺激脾細(xì)胞(每組2只小鼠)6天，然后通過(guò)ELISPOT測(cè)試IFN-γ分泌(圖3A)或用肽脈沖的C1R-A2細(xì)胞進(jìn)行CTL測(cè)定(圖3B)。在第57天，類似地測(cè)試每組中剩余小鼠。顯示了來(lái)自每組的平均應(yīng)答。
圖3A證明不存在佐劑時(shí)，用hPER1-154(加上T-輔助肽)免疫HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠可以誘導(dǎo)154-特異的IFN-γ應(yīng)答。用野生型親本肽進(jìn)行類似免疫不能誘導(dǎo)應(yīng)答。如圖3B中所示，通過(guò)用hPER1-154或者h(yuǎn)PER1-280-9V免疫可以誘導(dǎo)肽特異的CTL應(yīng)答，而用野生型親本肽免疫后沒(méi)有誘導(dǎo)應(yīng)答。
成熟的樹突細(xì)胞(DC)是有效的抗原呈遞細(xì)胞，已經(jīng)表明它們?cè)谛∈笾徐o脈內(nèi)注射后產(chǎn)生有力的CTL應(yīng)答。因此，我們測(cè)試了轉(zhuǎn)胞吞肽在基于DC的疫苗的背景下產(chǎn)生CTL應(yīng)答的能力。來(lái)自鼠骨髓的樹突細(xì)胞在體外成熟，僅用SIINFEKL或者用或者不用接頭綴合到Tat或者h(yuǎn)PER1的SIINFEKL脈沖，并在C57BL/6小鼠的尾靜脈中靜脈內(nèi)注射。免疫后一周，體外再次刺激后，測(cè)試來(lái)自接種動(dòng)物的脾細(xì)胞的CTL活性。如圖4中所示，所有SIINFEKL脈沖的DC都能夠產(chǎn)生有力的CTL應(yīng)答，而用不相關(guān)的肽(TRP2)脈沖的DC是非免疫原性的。用hPER1-OVA脈沖的DC比用天然SIINFEKL肽或者h(yuǎn)PER1-LEQLE-SIINFEKL脈沖的DC產(chǎn)生更強(qiáng)的應(yīng)答。類似地，TAT-LEQLE-SIINFEKL肽比沒(méi)有接頭的TAT-SIINFEKL的免疫原性更低，這與下述體外觀察相一致。
此外，在HLA-A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠(Sherman品系)僅用gp100-154肽或者用或不用接頭FVYVW綴合到hPER1或AntpHD的gp100-154皮下免疫后，評(píng)估所述小鼠中的CTL應(yīng)答。在第21和42天加強(qiáng)免疫小鼠，并在第63天從接種的動(dòng)物收獲脾細(xì)胞并在體外再次刺激5天后測(cè)試CTL活性。如圖5中所示，僅154肽甚至在不完全弗氏佐劑的存在下也不能產(chǎn)生有效CTL應(yīng)答。當(dāng)與AntpHD-154或hPER1-154結(jié)合時(shí)，觀察到弱應(yīng)答，其隨著接頭序列FVYVW的存在而增加。然而，當(dāng)表位綴合到hPER1和接頭序列FVYVW時(shí)，觀察到最有力的活性。
在實(shí)施圖6和13中描述的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)特定途徑用50納摩爾(如果沒(méi)有另外指出)肽加上50納摩爾小鼠中的乙型肝炎表位作為輔助CD4肽，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。第一次注射后3周，用相同的方案進(jìn)行加強(qiáng)，且之后三周，收獲脾臟并將其勻漿為單一懸浮液。將全部脾細(xì)胞與0.5μg/ml表位肽置于培養(yǎng)物中并在37℃溫育5天。Ficoll處理以純化活細(xì)胞后在培養(yǎng)的第5天進(jìn)行CTL測(cè)定。所用的對(duì)照是匹配的Kb或者A2結(jié)合肽。結(jié)果證明這些靶定的免疫原當(dāng)皮內(nèi)、皮下或者鼻內(nèi)施用時(shí)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(圖6)。
圖7中的結(jié)果證明i)Tat和hPer1都可以比僅用該肽誘導(dǎo)更高水平的CTL，和ii)與Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)序列相比，hPER1轉(zhuǎn)導(dǎo)序列至少優(yōu)于OVA肽SIINFEKL。如圖7中所示，在所有測(cè)試的E∶T比率下施用hPER1-DEVWEL-SIINFEKL與Tat-DEVWEL-SIINFEKL相比誘導(dǎo)更高水平的細(xì)胞毒性。
如圖8中所示，輔助CD4乙型肝炎肽的包括在一些情況中對(duì)于用免疫原性靶產(chǎn)生免疫性是重要的。在輔助肽的存在下用hPER1-FVYVW-154肽接種小鼠誘導(dǎo)顯著的T細(xì)胞細(xì)胞毒性。不存在輔助肽時(shí)接種誘導(dǎo)低得多水平的細(xì)胞毒性。有趣的是，如圖9中所示，增加免疫原性靶的量克服了對(duì)輔助肽的依賴性。
圖10證明不存在佐劑時(shí)施用的靶定的免疫原與和佐劑一起施用未綴合的肽一樣有效。不用佐劑，皮下施用免疫原性靶hPER1-FVYVW-SIINFEKL和hPER1-DEVWEL-SIINFEKL。將OVA肽(SIINFEKL)與不完全弗氏佐劑一起施用。如圖所示，免疫原性靶和IFA中的OVA肽的細(xì)胞毒性水平是相當(dāng)?shù)?。此外，接頭序列的性質(zhì)可以顯著增加產(chǎn)生CTL的潛能或者能力。而接頭FVYWV是最佳接頭，接頭DEVWEL及然后是SGQL誘導(dǎo)較低水平的細(xì)胞毒性。這些觀察表明接頭的性質(zhì)是體內(nèi)誘導(dǎo)CTL的重要因素。
D.hPER1表位綴合延長(zhǎng)了肽呈遞和免疫應(yīng)答為進(jìn)一步研究CTL表位偶聯(lián)到hPER1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的效果，開(kāi)發(fā)了下面的體外測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞與肽溫育后抗原呈遞的動(dòng)力學(xué)。在圖11中，來(lái)自C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞與不同的基于OVA的肽在37℃溫育1小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞以除去任何殘留的游離肽，并在培養(yǎng)基中37℃下溫育0、4、8、24或者30小時(shí)。然后通過(guò)ELISPOT測(cè)試細(xì)胞刺激從SIINFEKL特異的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力。結(jié)果表明用天然OVA肽脈沖的細(xì)胞在24小時(shí)時(shí)失去了它們的刺激能力，而用hPER1-SGQL-SIINFEKL或TAT-DEVWEL-SIINFEKL脈沖的細(xì)胞甚至在30小時(shí)后活性也沒(méi)有減小。不存在接頭序列時(shí)，OVA與hPER1或者TAT的綴合也相對(duì)于天然OVA肽增強(qiáng)了抗原呈遞，盡管它們的活性低于含有定制設(shè)計(jì)的接頭的肽。摻入作為接頭的天然OVA側(cè)翼序列(LEQLE)的hPER1和TAT綴合物沒(méi)有顯示出相對(duì)于天然肽的改善。
圖12闡明了用NP系統(tǒng)進(jìn)行的相似分析。這里，天然NP肽在24小時(shí)溫育后顯示出活性損失。然而，用hPER1-NP或hPER1-RGVQI-NP肽脈沖的細(xì)胞保持它們刺激T細(xì)胞的能力5天以上，這是該測(cè)定的極限?？傊@些數(shù)據(jù)證明hPER1可以延長(zhǎng)抗原呈遞持續(xù)時(shí)間，并且可以通過(guò)適當(dāng)接頭的設(shè)計(jì)進(jìn)一步最優(yōu)化。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)靶定的免疫原能夠誘導(dǎo)持久的免疫學(xué)記憶。如圖13中所示，僅用154肽免疫在施用后3周或者3個(gè)月時(shí)不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。相反，hPER1-FVYVW-154誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，其可以在施用后至少3個(gè)月都是可檢測(cè)的。該結(jié)果表明施用靶定的免疫原與免疫記憶應(yīng)答有關(guān)，而未綴合的肽卻并非這樣。
表IV概述了在小鼠中進(jìn)行的免疫原性實(shí)驗(yàn)。從此處給出的結(jié)果可以得出免疫原性靶可以用于產(chǎn)生特異并且強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。
表IV體內(nèi)免疫原性研究概述
序列表TAT GYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO.1)AntP RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO.2)PER1-1 SRRHHCRSKAKRSRHH (SEQ ID NO.3)PER1-2 RRHHRRSKAKRSR (SEQ ID NO.4)gp100-280-288(9V) YLEPGPVTV (SEQ ID NO5)gp100-154-162 KTWGQYWQV (SEQ ID NO6)MART-1 32 ILTVILGVL (SEQ.ID.NO.7)MART-1 31 GILTVILGV (SEQ.ID.NO.8)MART-1 99 NAPPAYEKL (SEQ.ID.NO.9)MART-1 1 MPREDAHFI (SEQ.ID.NO.10)MART-1 56 ALMDKSLHV (SEQ.ID.NO.11)MART-1 39 VLLLIGCWY (SEQ.ID.NO.12)MART-1 35 VILGVLLLI (SEQ.ID.NO.13)MART-1 61 SLHVGTQCA (SEQ.ID.NO.14)MART-1 57 LMDKSLHVG (SEQ.ID.NO.15)MAGE-A3 115ELVHFLLLK (SEQ ID NO16)MAGE-A3 285KVLHHMVKI (SEQ ID NO17)MAGE-A3 276RALVETSYV (SEQ ID NO18)MAGE-A3 105FQAALSRKV (SEQ ID NO19)MAGE-A3 296GPHISYPPL (SEQ ID NO20)MAGE-A3 243KKLLTQHFV (SEQ ID NO.21)MAGE-A3 24 GLVGAQAPA (SEQ ID NO.22)MAGE-A3 301YPPLHEWVL (SEQ ID NO.23)MAGE-A3 71 LPTTMNYPL (SEQ ID NO.24)Tyr 171NIYDLFVWM (SEQ ID NO25)Tyr 444DLGYDYSYL (SEQ ID NO26)Tyr 57 NILLSNAPL (SEQ ID NO27)TRP-1 245 SLPYWNFAT (SEQ ID NO28)TRP-1 298 TLGTLCNST (SEQ ID NO29)TRP-1 481 IAVVGALLL (SEQ ID NO30)TRP-1 181 NISIYNYFV (SEQ ID NO31)TRP-1 439 NMVPFWPPV (SEQ ID NO32)
TAT(SEQ ID NO.33)GGCTACGGCAGGAAGAAGAGGAGGCAGAGGAGGAGGAntP(SEQ ID NO.34)AGGCAGATCAAGATCTGGTTCCAGAACAGGAGGATGAAGTGGAAGAAGPER1-1(SEQ ID NO.35)AGCAGGAGGCACCACTGCAGGAGCAAGGCCAAGAGGAGCAGGCACCACPER1-2(SEQ ID NO.36)GGCAGGAGGCACCACAGGAGGAGCAAGGCCAAGAGGAGCAGGgp100-280-288(9V)(SEQ ID NO.37)TACCTGGAGCCCGGCCCCGTGACCGTGgp100-154-162(SEQ ID NO.38)AAGACCTGGGGCCAGTACTGGCAGGTGMART-1 32 ATCCTGACAGTGATCCTGGGAGTCTTA (SEQ ID NO39)MART-1 31 GGCATCCTGACAGTGATCCTGGGAGTC (SEQ ID NO40)MART-1 99 AATGCTCCACCTGCTTATGAGAAACTC (SEQ ID NO42)MART-1 1 ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC (SEQ ID NO43)MART-1 56 GCCTTGATGGATAAAAGTCTTCATGTT (SEQ ID NO44)MART-1 39 GTCTTACTGCTCATCGGCTGTTGGTAT (SEQ ID NO45)MART-1 35 GTGATCCTGGGAGTCTTACTGCTCATC (SEQ ID NO46)MART-1 61 AGTCTTCATGTTGGCACTCAATGTGCC (SEQ IDNO47)MART-1 57 TTGATGGATAAAAGTCTTCATGTTGGC (SEQ ID NO48)MAGE-A3 115GAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAG (SEQ ID NO.49)MAGE-A3 285AAAGTCCTGCACCATATGGTAAAGATC (SEQ.ID.NO.50)MAGE-A3 276AGGGCCCTCGTTGAAACCAGCTATGTG (SEQ ID.NO.51)MAGE-A3 105TTCCAAGCAGCACTCAGTAGGAAGGTG (SEQ ID.NO.52)MAGE-A3 296GGACCTCACATTTCCTACCCACCCCTG (SEQ.ID.NO.53)
MAGE-A3 243AAGAAGCTGCTCACCCAACATTTCGTG (SEQ ID.NO.54)MAGE-A3 24 GGCCTGGTGGGTGCGCAGGCTCCTGCT (SEQ ID NO55)MAGE-A3 301TACCCACCCCTGCATGAGTGGGTTTTG (SEQ ID.NO.56)MAGE-A3 71 CTCCCCACTACCATGAACTACCCTCTC(SEQ.ID.NO.57)TYR 171AATATTTATGACCTCTTTGTCTGGATG (SEQ ID NO58)TYR 444GATCTGGGCTATGACTATAGCTATCTA (SEQ ID NO59)TYR 57 AATATCCTTCTGTCCAATGCACCACTT (SEQ ID NO60)TRP-1 245 TCCCTTCCTTACTGGAATTTTGCAACG (SEQ ID NO61)TRP-1 298 ACCCTGGGAACACTTTGTAACAGCACC (SEQ ID NO62)TRP-1 481 ATAGCAGTAGTTGGCGCTTTGTTACTG (SEQ ID NO63)TRP-1 181 AACATTTCCATTTATAACTACTTTGTT (SEQ IDNO64)TRP-1 439 AACATGGTGCCATTCTGGCCCCCAGTC (SEQ ID NO65)hPER1-1-gp100(280-288)AGC AGG AGG CAC CAC TGC AGG AGC AAG GCC AAG AGG AGC AGGCACCAC TAC CTG GAG CCC GGC CCC GTG ACC GTG (SEQ ID NO66)hPER1-2-gp100(154-162)AGG AGG CAC CAC AGG AGG AGC AAG GCC AAG AGG AGC AGG AAGACC TGG GGC CAG TAC TGG CAG GTG (SEQ ID NO67)hPER1-2-F-gp100(154-162)AGG AGG CAC CAC AGG AGG AGC AAG GCC AAG AGG AGC AGG TTCGTG TAC GTG TGG AAG ACC TGG GGC CAG TAC TGG CAG GTG (SEQID NO68)
權(quán)利要求
1.多肽，其基本上由連接到包含細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的第二個(gè)氨基酸序列的包含hPER1的轉(zhuǎn)導(dǎo)序列的第一個(gè)氨基酸序列組成，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)序列是RRHHRRSKAKRSR。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中在第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸序列之間插入接頭序列。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述接頭序列與第二個(gè)氨基酸序列天然發(fā)生。
4.權(quán)利要求2的多肽，其中所述接頭序列不與第二個(gè)氨基酸序列天然發(fā)生。
5.權(quán)利要求1的多肽，其中所述第二個(gè)氨基酸序列來(lái)自腫瘤抗原、傳染物的抗原或者自身免疫抗原。
6.組合物，其包含可藥用載體中的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽。
7.免疫宿主的方法，其包括對(duì)該宿主施用權(quán)利要求6的組合物。
8.免疫宿主的方法，其包括將權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽或者組合物與樹突細(xì)胞混合以產(chǎn)生負(fù)荷肽的樹突細(xì)胞并對(duì)宿主施用該負(fù)荷肽的樹突細(xì)胞。
9.分離的重組DNA分子，其包含與編碼hPER1的轉(zhuǎn)導(dǎo)序列的第二個(gè)DNA序列連接的編碼細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的第一個(gè)DNA序列，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)序列是RRHHRRSKAKRSR。
10.權(quán)利要求21的DNA分子，其中將編碼接頭氨基酸序列的DNA序列插入第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸序列之間。
11.權(quán)利要求22的DNA分子，其中所述接頭氨基酸序列與第二個(gè)氨基酸序列天然發(fā)生。
12.權(quán)利要求11的DNA分子，其中所述接頭序列不與第二個(gè)氨基酸序列天然發(fā)生。
13.權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)的DNA分子，其中所述第一個(gè)氨基酸序列來(lái)自腫瘤抗原、傳染物的抗原或者自身免疫抗原。
14.組合物，其包含權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)的重組DNA分子。
15.免疫宿主的方法，其包括通過(guò)皮下、皮內(nèi)或者鼻內(nèi)途徑施用基本上由第一個(gè)氨基酸序列組成的多肽，所述多肽包含施用的權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的多肽、重組DNA或者組合物。
16.權(quán)利要求16的方法，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位來(lái)自腫瘤抗原、傳染物或者自身免疫抗原。
17.免疫宿主的方法，其包括通過(guò)皮下、皮內(nèi)或者鼻內(nèi)途徑施用基本上由權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的多肽、重組DNA或者組合物組成的靶定的免疫原。
18.免疫宿主的方法，其包括通過(guò)皮下、皮內(nèi)或者鼻內(nèi)途徑施用靶定的免疫原，該免疫原基本上由連接到包含細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的第二個(gè)氨基酸序列的包含hPER1的轉(zhuǎn)導(dǎo)序列的多肽組成。
19.免疫宿主的方法，其包括通過(guò)皮下、皮內(nèi)或者鼻內(nèi)途徑施用靶定的免疫原，該免疫原基本上由包含連接到編碼hPER1的轉(zhuǎn)導(dǎo)序列的第二個(gè)DNA序列的重組DNA的編碼細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位的第一個(gè)DNA序列的重組DNA分子組成。
20.免疫宿主的方法，其包括通過(guò)皮下、皮內(nèi)或者鼻內(nèi)途徑施用包含權(quán)利要求18的多肽或者權(quán)利要求19的重組DNA分子的組合物。
21.權(quán)利要求17-20任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位來(lái)自腫瘤抗原、傳染物或者自身免疫抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生和利用靶定的免疫原的試劑和方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將免疫原綴合到將該免疫原靶向MHC呈遞途徑的氨基酸序列。使用本文提供的試劑和方法，可以增強(qiáng)免疫方案，從而導(dǎo)致增加的宿主免疫性。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1921889SQ200480042153
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者A·R·昂格爾, D·薩爾哈, S·加利錢 申請(qǐng)人:圣諾菲·帕斯圖爾公司